JP2002519068A

JP2002519068A - 組換えアデノ−随伴ウィルスを生産するための組換えヘルペスウィルス

Info

Publication number: JP2002519068A
Application number: JP2000558224A
Authority: JP
Inventors: ハイルブロンレギーネ; シェッタークリスティアン
Original assignee: ハイルブロンレギーネ
Priority date: 1998-07-06
Filing date: 1998-09-01
Publication date: 2002-07-02
Also published as: EP1093524A1; CA2332623A1; IL140743A0; WO2000001834A1; US20060263883A1; DE19830141A1; CA2332623C; IL140743A; EP1093524B1; US7037723B1; DE59812583D1

Abstract

(57)【要約】ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を有する組換えヘルペスウィルスならびに高力価、高い感染性のアデノ−随伴ウィルスベクター調製物の製法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、組換えヘルペスウィルス、その製法ならびに高力価の感染アデノ−
随伴ウィルスベクター調製物の製法に関する。

【０００２】数多くの遺伝病が公知であるが、このために効果的な治療は今日まで見出され
ていない。遺伝病を治療するための１つの可能な方法は、遺伝子病を修正するこ
とができる特定の遺伝子を患者のゲノム中に挿入することであり、その結果、前
記遺伝子は患者のＤＮＡ中に存在し、かつそこで複製できる。

【０００３】修正する所望の遺伝子を細胞中に挿入するために、ベクターを使用することが
でき、その際にアデノ−随伴ウィルス（ＡＡＶ）をベースとする遺伝子治療用の
ウィルス性ベクターは、他のウィルス性ベクター系に対して、かなりの利益を有
する。ＡＡＶは非常に安定であるが、しかし非病原性ウィルスである。さらに、
これは幅広い組織親和性を有し、かつ増殖細胞と同様に休止細胞中も効率的に染
色体を組込む能力を有する。

【０００４】ウィルス性ベクター系として、大抵はアデノ−随伴ウィルスタイプ２（ＡＡＶ
-２)をベースとするＡＡＶベクターが使用される [Carter, Curr. Opinion. Bio
tech. 3(1992) 533; Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Imm. 158(1992) 97]。
ＡＡＶ-２は、広く蔓延するヒトウィルスであり、その際、大抵は幼年期に起き
る一次感染の際には、病原性は誘導されない。ＡＡＶ-２がガン遺伝子の可能性
を備えているらしいという示唆もない。ＡＡＶ-２の高い安定性に基づいて、こ
のウィルスは、費用のかかる精製方法でも感染力を失うことない。

【０００５】ＡＡＶ−２は、２つの遺伝子を有する小さな一本鎖のＤＮＡウィルスである：
４個の重複する調節タンパク質、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２および両方のタン
パク質のＣ−末端がスプライスングされた変異体、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ４０
をコードするｒｅｐ−遺伝子である。Ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶ遺伝子制御、
DNA−複製およびウィルスパッケージングに利用される。ｃａｐ−遺伝子は、３
個のウィルス−カプシドタンパク質をコードする。両方の遺伝子ｒｅｐおよびｃ
ａｐは、“複製の起点”として利用される１４５bpの長さの逆方向反復配列によ
りフランキングされている。これらは、DNA−複製のためのＣｉｓにおいて、ホ
スト細胞ゲノム中のウィルスパッケージングおよび組込みに必要である唯一のＡ
ＡＶＤＮＡ配列であり、その結果、約４．７ｋｂの長さの外部配列をそれぞれ
のベクター中へクローニングさせることができる。

【０００６】ＡＡＶは、複製欠損性であり、かつヘルパーウィルスとの同時感染の効果的な
増殖に必要である。ヘルパーウィルスなしに、ＡＡＶは高頻度でホスト細胞ゲノ
ム中に組み込まれ、その際、染色体１９（q13.3-qter）上の特殊な遺伝子座が著
しく有利である。従って、組込みはウィルス性または細胞性のDNA−複製に依存
しない。上記の利点に基づき、ＡＡＶベクターは、非増殖細胞中への遺伝子の導
入および安定な組込みに理想的な必要条件を提供する。遺伝子治療には、通常は
異種の所望の遺伝子産物をコードするＤＮＡを有する組換えＡＡＶベクターが使
用される。しかし、異種のＤＮＡのＡＡＶベクター中への挿入により、ｒｅｐお
よびｃａｐ発現が阻害されてしまう。従って、組換えＡＡＶベクターを増殖させ
るために、このタンパク質を発現するタンパク質もしくは系を外側から供給しな
くてはならない。

【０００７】この増殖は、例えば組換えＡＡＶベクターとヘルパープラスミドを用いるアデ
ノウィルス感染細胞のコトランスフェクションにより行うことができ、その際Ａ
ＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子は、アデノウィルスタイプ５の複製起
源（“Origins of Replication”）によりフランキングされる。ヘルパープラス
ミドは、アデノウィルス感染細胞中で複製され、その結果ＡＡＶベクターを増殖
するために十分な量のＲｅｐおよびＣａｐが提供される。ｒｅｐ−およびｃａｐ
−発現構築物は、ＡＡＶベクターと共通のＤＮＡ-配列を有さず、その結果、相
同的組換えにより感染した野生型ＡＡＶのベクター調製物が生じ得ない（Samuls
ki et al., J. Virol. 63 (1989), 3822）。しかし、これらの系の欠点は、１ml
当たりに１０^４〜１０^６の感染粒子を有する達成可能なウィルス力価は、１ｍｌ
当たりに１０^１２まで達成できる野生型ＡＡＶの場合よりも著しく低いことであ
る。さらに、新たな細胞上のそれぞれのバッチは、ＡＡＶベクターおよびｒｅｐ
−およびｃａｐ−発現ヘルパープラスミドを用いてコトランスフェクションさせ
、引き続きアデノウィルスで感染させなくてならない、それというのもヘルパー
プラスミドはウィルスとしてパッケージングされず、ひいては感染によりうつす
ことができないからである。

【０００８】 J. Conway 等[J. Virol. 71 (11) (1997), 8780-8789]は、ＲｅｐおよびＣａ
ｐを発現する単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）タイプ１アンプリコンを用いる
組換えＡＡＶタイプ２の複製およびパッケージング方法を記載している。ＨＳＶ
-アンプリコンは、ＨＳＶ−カバー（Huellen）中にパッケージングされており、
従って野生型−ＨＳＶの存在だけで増殖することができる。野生型ＨＳＶおよび
パッケージングされたアンプリコンの相対比は、共通の増殖の際に予測不可能で
ありかつ殆ど調節することができない。両方のウィルス集団を精製により相互に
分離する方法はない、それというのも、両方に共通のカバーは、本質的に物理化
学的特性を有するからである。さらに、成長に関して欠点を有するアンプリコン
が既に数回の継代後にもはや検出不可能な量でしか存在しないという問題が生じ
る。従って、それぞれのｒＡＡＶ−調製物用にアンプリコン−プラスミドを新た
にトランスフェクションし、かつ野生型ＨＳＶを用いて感染させる場合にアンプ
リコン系は再現可能に使用できるにすぎない。しかし、それぞれの増殖サイクル
用にアンプリコンプラスミドを新たにトランスフェクションしなくてはならない
結果となり、このことは、まさしく上記のパッケージング系の欠点である。

【０００９】自己複製しないプラスミドを使用ことに関連する欠点をＡＡＶ−遺伝子ｒｅｐ
およびｃａｐが十分に高い量で発現する安定な細胞系を樹立化することにより解
決することが試みられている。しかしＲｅｐは有毒であるため、Ｒｅｐ７８また
はＲｅｐ６８を発現する機能性がある安定な細胞クローンの形成は、非常に困難
である。

【００１０】 WO 95/06743には、ヘルパーウィルスとしてアデノウィルス構築物を使用する
組換えＡＡＶの製法が記載されており、その際に、ヘルパーウィルスとしてＡＡ
Ｖのｒｅｐ−およびｃａｐ−遺伝子を有する組換えインサートを含むアデノウィ
ルス構築物が使用されている。Ｒｅｐタンパク質の発現は、ＡＡＶで感染した細
胞中でアデノウィルス感染を阻止し、その結果、高力価の調整物を得ることがで
きない。WO 95/06743には、アデノウィルスベクターの代わりにヘルペスウィル
スベクターの使用が記載されている。ただし、野生型に復帰しないＡＡＶ−遺伝
子領域を有する安定な組換えヘルペスウィルスを製造することができるが、追試
可能な方法は記載されていない。

【００１１】従って、本発明の課題は、臨床規模において使用するのに必要な組換えＡＡＶ
−ベクターを高力価の調製物として有するシステムを提供することである。本発
明のもう１つの課題は、先行技術の課題が少なくとも部分的に取り除かれたＡＡ
Ｖ−ベクターを増殖するためのヘルパー調製物を提供することである。

【００１２】これらの課題は、ＡＡＶ−遺伝子ｒｅｐおよびｃａｐが十分に高い量で発現さ
れ、かつＡＡＶ−ベクターが感染により増殖することができる本発明による安定
な細胞系により解決された。

【００１３】本発明は、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）のｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子
、例えばＡＡＶ−２のｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子またはその機能的に同等
な遺伝子が作動的に発現制御配列と結合して有することを特徴とする組換えヘル
ペスウィルスに関する。有利には、前記ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子は、ゲ
ノム中でヘルペスウィルスが適当な場所に組み込まれているインサート上に存在
する。

【００１４】本発明による組換えヘルペスウィルスは、ＡＡＶの効果的な増殖に必要なヘル
パー機能を有し、その上ＲｅｐおよびＣａｐをコードするＡＡＶの領域を十分な
量で発現させることができ、その結果、細胞培養中でのＡＡＶベクターの増殖お
よびパッケージングが組換えＨＳＶ（ｒＨＳＶ）で同時感染する際に可能となる
。

【００１５】発現制御配列として、標的細胞中でｒｅｐおよびｃａｐの十分な発現を供給す
る全ての配列、例えば相同のＡＡＶ−発現制御配列、例えばＡＡＶp5プロモータ
ー、または異種のプロモーター、例えば真核細胞性またはウィルス性プロモータ
ーが適当である。構成性または調整可能な発現制御配列を使用することができる
。ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子は、共通の制御下で１つの発現制御配列であ
るかまたはそれぞれの制御下で別々（同時または異なる）の発現制御配列であっ
てもよい。

【００１６】意外にも、ヘルパーウィルス、特にＨＳＶは、ＡＡＶ−Ｒｅｐ−タンパク質の
高い発現に対して耐性であることが確認された。ヘルパーウィルス依存性のＡＡ
Ｖ−ベクターの増殖用のヘルパーウィルスとして必要なヘルペスウィルス中へｒ
ｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を組込むことにより、ＡＡＶ−増殖に必要なすべ
ての機能を有しかつベクター増殖のために必要なＡＡＶ−タンパク質を大量に製
造することができる構築物が得られる。このような系を用いて、例えば遺伝子治
療用に臨床規模において必要であるような感染性ＡＡＶ−ベクターを大規模に製
造することができる。従って、例えばプラスミドを使用する場合には、組換えＡ
ＡＶの形成は、もはやトランスフェクション効果に依存しない。

【００１７】本発明によるヘルペスウィルスは、遺伝子的に安定であり、かつ有利には野生
型への復帰を示さない。従って、プラーク精製の際に、複数の連続する希釈工程
の後、例えば３回、有利に５回および特に有利に７回の希釈工程の後でも明白な
野生型への復帰は見出されない。このことは、組込まれたカセットが安定のまま
であることを示す。本発明によるヘルペスウィルスのもう１つの利点は、高い力
価で、例えば相応するヘルペスウィルス−野生型の５％≧、特に１０％≧、殊に
有利には２０％≧の力価で培養することができることであり、その際、力価は、
細胞放出ウィルス（Cell-Release-Virus:CRV）−力価として有利に測定される。

【００１８】本発明による組換えヘルペスウィルスは、さらに有利には、その発現力がｒｅ
ｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子の組込みと関連するリポーター遺伝子を有する。レ
ポーター遺伝子は、適当な発現制御配列、例えばＳＶ４０-プロモーターまたは
他のプロモーター、例えばＨＳＶ-またはＡＡＶ-プロモーターと作動的に結合し
ている。有利には、レポーター遺伝子は、非抗生物質耐性遺伝子、特に有利には
、例えば視覚的に検出可能なポリペプチド、例えばＬａｃＺまたはＧＦＰ（グリ
ーン蛍光タンパク質）を直接にコードする遺伝子である。レポーター遺伝子を発
現することにより、もはや組換えヘルペスウィルスを含んではならないＡＡＶ−
調整物の純度を監視することができる。さらに、野生型−ヘルペスウィルスを有
する不純物に対して、組換えヘルペスウィルス調製物の純度の制御も可能である
。

【００１９】原則として、ヘルペスウィルス族（Herpesviridae）のそれぞれのメンバーは
、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子の挿入により、本発明による組換え
ヘルペスウィルスに変えることができる。例えば、適当なヘルペスウィルスは、
単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウィスル（ＣＭＶ）、仮性狂犬
病ウィルス（ＰＲＶ）およびエプスタイン・バーウィルス（ＥＢＶ）である。特
に有利には、単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）および特にＨＳＶ-タイプ１であ
る。有利には、１つの制限部位を有するヘルペスウィルス、例えば、U_ｓ−領域
中のポジション143969（ポジションのナンバリングは、McGeoch et al., Nucl.
Acids Res. 14 (1986), 1727-1745により行われた）に単に１つのＸｂａｌ-部位
を有する、例えばＨＳＶ-タイプ１突然変異体１８０２(Rixon et al., J. Gen.
Virol. 71 (1990), 2934-2939)を使用する。

【００２０】ヘルペスウィルスは、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を重要ではな
い領域、例えばＵ_Ｓ−または／およびU_Ｌ−領域中に含むことができる。有利に
は、複製欠損性のヘルペスウィルス突然変異体も使用する。このために、ｒｅｐ
遺伝子または／およびｃａｐ遺伝子を、ヘルペスウィルスの複製に必要であるが
ＡＡＶ−複製には必要ではないヘルペスウィルスゲノムの領域中に挿入すること
ができる。また、初めから相応するヘルペスウィルス−複製遺伝子が既に欠失し
ているヘルペスウィルス突然変異体を使用することができる。例えば、ＨＳＶ−
複製に絶対的に重要であるが、ＡＡＶ−複製には不必要であるＵＬ９遺伝子が挙
げられる（Weindler et al., J. Virol. 65 (1991), 2476-2483）。さらに、Imm
ediate Early Protein ICP27をコードするＵＬ５４遺伝子も適当である。これら
の遺伝子もまたＡＡＶ−複製には不必要である。ＵＬ５４遺伝子の欠損は、ＵＬ
９遺伝子における突然変異とは対照的に、相応する突然変異体であるが、しかし
完全に複製欠損性ではないヘルペスウィルスの複製サイクルの延長を生じる。さ
らに、突然変異または／および欠失が同様の効果を有する、すなわちヘルペスウ
ィルス−複製サイクルを延長もしくは完全に遮断する他の挿入用のヘルペスウィ
ルス−遺伝子を挙げることもできる。

【００２１】有利には、組換えヘルペスウィルスは、ＡＡＶの逆方向反復配列（ＩＴＲ）を
完全に含まず、特に有利にはＡＡＶのＩＴＲ配列の部分を完全に含まない。

【００２２】さらなる改良は、ｒｅｐ遺伝子または／およびｃａｐ遺伝子、特にｒｅｐ遺伝
子のための抑制可能な発現制御配列を使用することにより達成できる。このため
の例は、テトラサイクリン[Gossen und Bujard, Proc. Natl. Sci. USA (1992),
5547-5551]を添加するかまたはエクジソン[No. et al., Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA (1996), 3346-3351]を添加することにより抑制可能な発現制御配列であ
る。また、“early”および“late”ヘルペスウィルスタンパク質、例えばＨＳ
Ｖの発現をコントロールするプロモーターを使用することができる。

【００２３】本発明のもう１つの課題は、組換えヘルペスウィルスの製法であり、その際、
ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子は、ヘルペスウィルスのゲノム中に安
定に組込まれる。このために、ヘルペスウィルス−ＤＮＡは、有利には１つ以上
の所望の場所で切断され、かつｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子含有のＤＮＡ断
片、例えばプラスミドはヘルペスウィルス−ＤＮＡ中にライゲーションされる。
切断は、有利には制限酵素、例えばＸｂａｌを用いて実施される。また、ｒｅｐ
遺伝子およびｃａｐ遺伝子は、相同的組換えによりヘルペスウィルスゲノム中へ
挿入することもできる。従って、ｒｅｐ−ｃａｐ−構築物は、ヘルペスウィルス
ゲノム中に挿入する予定のＤＮＡ配列に一致するかまたは少なくとも高い相同性
を有するフランキング配列を有していなくてはならない。

【００２４】本発明のもう１つの課題は、本発明による組換えヘルペスウィルスから由来し
かつアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）のｒｅｐ遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子
ならびにヘルペスウィルスから由来し、組換えアデノ随伴ウィルスベクターの増
殖に必要なヘルパー機能がそれぞれ発現制御配列と作動的に結合して含有する核
酸である。これらの核酸は、有利にはベクター上に存在し、特に有利には真核性
ベクター上に存在する。

【００２５】本発明は、本発明による組換えヘルペスウィルスを有するもう１つのウィルス
性組成物を含む。このような組成物は、特に野生型−ヘルペスウィルスを含まな
いことを特徴とする。

【００２６】ここで使用されているようなウィルスの概念は、ビリオンとしても理解される
。

【００２７】本発明による組換えヘルペスウィルスおよびベクターは、高力価の感染性ｒＡ
ＡＶ−ベクター調製物の製造に有利に使用される。従って、本発明は、次の：（ａ）異種のＤＮＡ−インサートを含むアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）をベース
とするウィルス性ベクターを作成し、（ｂ）ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を発現制御配列と作動的に結合
して有している組換えヘルペスウィルスを作成し、（ｃ）（ａ）からのＡＡＶ−ベクターおよび（ｂ）からの組換えヘルペスウィル
スを、例えば感染、または／およびＤＮＡ−トランスフェクションにより細胞中
へ導入し、（ｄ）ＡＡＶ−ベクターを増殖させ、かつ（ｅ）感染性ＡＡＶ−ベクター調製物を得る工程を含む感染性ＡＡＶ−ベクター調製物の製法を含む。

【００２８】組換えヘルペスウィルス（もしくはビリオン）の代わりに、ＡＡＶのｒｅｐ遺
伝子およびｃａｐ遺伝子ならびにＡＡＶの複製およびパッケージングに必要なヘ
ルパー機能を有する、相応するベクターを使用することもできる。

【００２９】有利には、細胞を組換えＡＡＶ−ベクターを用いてトランスフェクションさせ
るかまたは感染させ、かつ引き続き組換えヘルペスウィルスで感染させる。特に
有利には、ＡＡＶ−ベクターと同様にヘルペスウィルスも感染により細胞中に導
入する、それというものこの方法により望ましくない異常な組換えの発生の進行
を抑えることができるからである。本発明による方法のために、複製可能な組換
えヘルペスウィルスを使用することができる。しかし、有利には、制限不可能で
あるかまたは単に制限的に複製可能であるにすぎない組換えヘルペスウィルスを
使用し、このことは、さらにＡＡＶの収率を高める。本発明による方法を用いて
、高力価の感染性ＡＡＶベクター調製物、特にパッケージングされたｒＡＡＶ−
調製物を得ることができる。

【００３０】ＡＡＶ−増殖に必要なヘルパー機能を有しならびにＲｅｐおよびＣａｐタンパ
ク質の高められた量を製造する、本発明による組換えヘルペスウィルス（ビリオ
ン）またはベクターを用いて、一般的に使用可能な種々の細胞系を含める真核細
胞の感染により、ＡＡＶ−ベクターを増殖させることができる。従って、本発明
のもう１つの課題は、本発明による組換えヘルペスウィルスまたはベクターを有
する細胞である。細胞は、有利には哺乳類の細胞、特に永続的に培養可能な細胞
である。例えば、げっ歯類細胞、例えばＢＨＫ−細胞、例えばＢＨＫ21である。
しかし、他の細胞、例えばベロ細胞またはヒーラ（ＨｅＬａ）細胞のようなヒト
の細胞を使用することもできる。

【００３１】細胞は、ウィルス、ベクターまたはビリオンを染色体外の形で１種以上のコピ
ー中で有することができる。このような細胞は、例えば感染により得られる。ま
た、ウィルス、ベクターまたはビリオンは、細胞のゲノム中に組み込まれて存在
することもできる。有利には、細胞はウィルスを用いた感染により生産される。

【００３２】さらに、細胞は、他の組換えＡＡＶ−ベクター、特に臨床的に作用するポリペ
プチドをコードする異種のDNA−インサートを有するＡＡＶ−ベクターを含むこ
とができる。ＡＡＶ−ベクターは、染色体外に存在するかまたは細胞のゲノム中
に導入されて潜在的に存在することができる。従って、ＡＡＶ−ベクターは、組
換えヘルペスウィルスで感染する際に遊離され、かつＡＡＶ−ベクター感染の後
に複製される。

【００３３】本発明による組換えヘルペスウィルスを用いた哺乳類細胞の感染は、ｒｅｐ遺
伝子およびｃａｐ遺伝子の高い発現を生じ、その際、ＡＡＶ−野生型と単純ヘル
ペスウィルスとの同時感染の収率は比較が可能である。

【００３４】最終的に、本発明は、ＡＡＶ−ベクターをトランスフェクションによりホスト
細胞中に導入し、異常な不所望の組換えの出現の著しい低下が見出される公知の
方法に対してなお改善された感染性ＡＡＶ−ベクター調製物の製法に関する。こ
の方法は、ＡＡＶ−ベクターおよび任意のヘルパーウィルス、例えばアデノウィ
ルス、ヘルペスウィルス、特に本発明によるｒｅｐ/ｃａｐ発現ヘルペスウィル
スを細胞中へ導入し、細胞をＡＡＶ−ベクターの増殖に適当な条件下で培養し、
かつ感染性ＡＡＶ−ベクター調製物を細胞および／または培養上澄み液から得る
ことを含み、その際、前記方法はＡＡＶ−ベクターおよびヘルパーウィルスの両
方を感染により細胞中に導入することを特徴とする。

【００３５】本発明を添付した図および以下の実施例によりさらに説明する。

【００３６】図１は、本発明によるｒＨＳＶ／ＡＡＶのゲノム構造を表す。HSV-1 １８０２
中のＸｂａｌ-部位のポジション143969は、McGeochet al., Nucl. Acids Res. N
o. 14(1986), 1727-1745)によるナンバリングである。ＡＡＶ−ゲノムのナンバ
リングは、遺伝子バンク寄託番号 JO1901により行われた。

【００３７】図２は、ｒＨＳＶ／ＡＡＶを用いたＢＨＫ−細胞の感染後の短い（Ａ）または
長い（Ｂ）ＡＡＶ−Ｒｅｐ-タンパク質の発現を表す。

【００３８】図３は、ｒＨＳＶ／ＡＡＶを用いたＢＨＫ−細胞の感染後の短い（Ａ）または
長い（Ｂ）ＡＡＶ−Ｃａｐ-タンパク質の発現を表す。

【００３９】図４は、免疫蛍光法によりｒＨＳＶ／ＡＡＶで感染させたＢＨＫ−細胞中のＲ
ｅｐまたはＣａｐタンパク質および組立てられたＡＡＶカプシドの局在化を表す
。

【００４０】図５は、複製中心アッセイの結果を表し、その中で従来の方法と本発明による
方法が比較されている。

【００４１】図６は、粗製ライセート中のｒＡＡＶ／ＧＦＰの感染性力価アッセイの結果を
表す。

【００４２】実施例１．材料および方法１．１細胞培養ＢＨＫ-２１-細胞（Stoker et al.,Nature, 203(1964), 1355-1357; ECACC No
. 8501143）を単層として、１０％ＮＣＳ：(Newborn Calf Serum)(Gibco BRL-No
. 16010-084)、１×Tryptose ホスフェート肉汁（Gibco BRL-No. 18060-02）お
よびPen/Strep (Seromed)を有するＧ-ＭＥＭ（Gibco BRL No. 21710-025）中で
、３７℃、５％ＣＯ_２で培養した。ＢＨＫ-細胞を回転フラスコ（Falcon 850cm
^３、No. 3027）中で培養するために、５０ｍｌ体積の培地を使用しかつフラスコ
を３７℃、５％ＣＯ_２で０．８回転/分で回転させた。回転フラスコ中で成長す
るＢＨＫ-２１-細胞を感染させるために、完全なＧ-ＭＥＭ１５ｍｌに体積を減
少させた。ＢＨＫ-２１-細胞を新たな培養の前に１５継代まで培養した。

【００４３】ヒーラ細胞およびベロ細胞を１０％ＦＣＳ（Seromede No. SO115）およびPen/
Strep(Seromed)を有するＤ−ＭＥＭ（Gibco No. 21855-025）中で培養した。

【００４４】１．２感染性ＨＳＶおよびｒＨＳＶ調整物の製造野生型−または組換え単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）を例１で記載したよう
な回転フラスコ中で約２×１０^８ＢＨＫ-２１-細胞を感染させることにより培養
し、感染の多重度（ＭＯＩ）０．００２で増殖させた。感染経過は、細胞変性効
果（ＣＰＥ）を細胞培養中で増加させることにより監視した。感染の３日後に、
大多数の細胞は完全なＣＰＥを示し、かつ細胞培地中で振盪することにより収集
することができた。４℃で1500×gで１０分間遠心分離した後に、ウィルスを細
胞不含の上澄液（CRV; Cell-Released-Virus）から得、アリコート中で分離しか
つ−８０℃で凍結させた。

【００４５】細胞ペレットをＰＢＳ（燐酸塩緩衝溶液）中で再懸濁させかつ４℃で１分間振
盪した。４℃で2000×gで１０分間遠心分離した後に、上澄液を細胞随伴ウィル
ス（CAV）として得、アリコート中で分離しかつ−８０℃で凍結させた。

【００４６】１．３ＨＳＶ−ビリオンの精製ＨＳＶ−ビリオンを製造するために、回転フラスコ中で１．２で記載したよう
に培養したＢＨＫ−細胞を感染させた。遠心分離後に、ＣＲＶ含有の透明な上澄
液を遠心分離試験管中に移した。ビリオンを遠心分離により４℃で23000×gで２
時間ペレット化し、これをBeckman SW28-Rotorを使用して13500回転／分に相応
させた。ウィルスペレットをフェノールレッド（ＭＥＭ-ＰＲ）なしにＭＥＭ１
ｍｌ中で再懸濁させかつ振盪により４℃（30秒×３）でホモジナイスした。懸濁
液を直線状のフィコール勾配（ＭＥＭ-ＰＲ中5%＋15% w/v）でBeckman SW28 Ult
raclear試験管中で４℃で12000回転／分（19000×g）で２時間遠心分離した。

【００４７】照射の際に、濃縮されたビリオン−バンドが試験管の中央で目視可能であった
。ビリオン−バンドの上方は、損傷した粒子を含有する分散バンドが目視できた
。ビリオン−バンドを２１または２３ゲージ針を備えた試験管の打点により収集
し、新たにBeckman SW28 Ultraclear 試験管中に移しかつＭＥＭ-ＰＲを用いて
最終体積３５ｍｌに希釈した。次にビリオンを遠心分離により４℃で22200回転
／分（65000×g）で２時間ペレット化した。このペレットをＭＥＭ-ＰＲ中で再
懸濁し、かつ−８０℃で貯蔵した。ウィルス性ＤＮＡを製造するために、ペレッ
トを３００μｌＴＥ−緩衝液中で再懸濁し、かつさらに処理するために１．５ｍ
ｌ試験管中へ移した。

【００４８】また、ＨＳＶ-ビリオンをＣｓＣｌ−勾配の使用下に精製した。

【００４９】１．４ＨＳＶ-ＤＮＡの製造１．３により得られ３００μｌＴＥ中で再懸濁させたビリオンペレットにＳＤ
Ｓ（最終濃度０．２％）およびプロテイナーゼＫ（最終濃度３００μg/ml）を添
加した。バッチを少なくとも３７℃で１時間インキュベートした。酢酸ナトリウ
ムｐＨ９．２を添加後に、０．３Ｍの最終濃度およびフェノール／クロロホルム
抽出液 [2×フェノール／ＣＩＡ（クロロホルム−イソアミルアルコール）、１
×ＣＩＡ］、２体積エタノールを添加後に遠心分離することによりDNAを調整し
た。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、かつTE（Tris-EDTA-緩衝液
、10mM Tris HCl、1mM EDTA）中で再懸濁させた。

【００５０】１．５プラスミドｐｓｕｂ２０１ｌａｃの製造ｌａｃＺ遺伝子をＳＶ４０プロモーターの制御下に有する（Rixon et al., J.
Gen. Virol. 71 (1990) 2931-2939）ｐＣＨ１１０（Pharmacia）をベースとす
るプラスミドｐＦＪ３をＢａｍＨＩで切断し、かつ脱リン酸化した。ｒｅｐ遺伝
子およびｃａｐ遺伝子およびプロモーターｐ５、ｐ１９およびｐ４０を含むが逆
方向末端反復配列（ITR）を含まない、アデノ随伴ウィルスタイプ２（遺伝子
バンクNo. JO19901）の配列191-4485を有するｐｓｕｂ２０１のＸｂａｌ断片（S
amulski et al., J. Virol. 61(1987), 3096-3101）をｐＦＪ３中に挿入し、ｐ
ｓｕｂ２０１ｌａｃを得た。

【００５１】１．６プラークアッセイ予備同時感染させたＢＨＫ-２１細胞をＨＳＶＣＲＶまたはＣＡＶ調整物の
種々の希釈液を用いて感染させた。３７℃で１時間吸着した後に、細胞をＰＢＳ
で洗浄しかつ０．５％Sea-Plaque-Agar、５％NCS、Pen/Strep および１×Trypto
se-ホスフェート肉汁を有するG-MEMを用いて加えた。３７℃、５％ＣＯ_２で３日
間インキュベートした後にプラークを数え、力価を測定した。

【００５２】１．７Ｘ−Ｇａｌ−染色感染したかまたは感染していない細胞を１５０mM ＮａＣｌ、１５mMリン酸ナ
トリウム、ｐＨ７．３を用いてＰＢＳ中で１回洗浄した。２％ホルムアルデヒド
および０．２％グルタルアルデヒドを有する冷たいＰＢＳ中で５分間インキュベ
ーションすることにより細胞を固定した。固定剤を除去するために、細胞をＰＢ
Ｓで洗浄した。最終的に、細胞を１ｍｇ／ｍｌＸ−Ｇａｌ、５ｍＭフェロシア
ン化カリウム、５ｍＭフェリシアン化カリウム、２ｍＭＭｇＣｌ_２を有するＸ
−Ｇａｌ−染色溶液をＰＢＳ中に加えた。着色された細胞を通常の方法で、青色
が目視できるまで３７℃で数時間インキュベーションした。

【００５３】１．８ウェスタンブロット法 LaemmliによりNatur, 227(1970) 680-685に記載されているようにウェスタン
ブロット法を実施した。細胞がなおプレートに付着している間または細胞を収集
した後に、細胞を２回ＰＢＳで洗浄し、かつ１５ｍｌ試験管中でペレット化した
。１×１０^５細胞当たりに１×ＳＤＳプローブ緩衝液（50mM Tris-Cl, pH 6.8
; 1% β−メルカプトエタノール；２％ＳＤＳ；０．１％ブロモフェノー
ルブルー; 10% グリセリン）１００μlを添加した後に、この懸濁液を１．５ｍ
ｌ反応容器中へ移した。プローブを沸騰水中で１０分間インキュベートし、氷上
で冷却し、かつ−８０℃で貯蔵した。分析のために、それぞれのプローブ３０μ
lまでを１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（SDS-PAGE）上に加えた。電気
泳動後に、ゲルをトリス-グリシン溶液（25mM Tris−塩基；95% mM グリシン；1
0% メタノール）中で１５分間平衡化した。タンパク質を半乾燥させたブロッテ
ィング装置および１ｍＡ／ｃｍ^２の使用下にニトロセルロース膜（Schleicher u
nd Schuell, BA85, No. 401196）上に転写した。移行およびタンパク質量を調節
するために、膜をポンソー-Ｓ（Sigma）を用いて着色した。膜をＰＢＳ、０．３
％Tween-20、１０％脂肪不含のミルクパウダー中で室温で３０分間または４℃で
一晩ブロッキングした。

【００５４】抗体を相応するＰＢＳ、０．３％Tween-20、１０％脂肪不含のミルクパウダー
中で希釈させ、かつ室温で少なくとも１時間または４℃で一晩インキュベートし
た。Ｒｅｐ−検出のために、モノクロナール抗体３０３．９および７６．３（1:
10希釈）を使用した（Kleinschmidt et al., Virology 206 (1995) 254-262; Wi
stuba et al., J. Virol. 69(1995), 5311-5319）。Ｃａｐ（VP）−タンパク質
を検出するために、抗体Ｂ１（1:10希釈）を使用した（上記のWistuba et al.,
(1995)）。フィルターをＰＢＳ、０．３％Tween-20を用いて室温で３回洗浄した
。ＡＡＶ−カプシド構築物を検出するために、抗体Ａ２０（Wistuba et al., J.
Viol. 71(1996), 1341-1352）を使用した。

【００５５】二次抗体、通常の抗マウス抗体ペルオキシダーゼ−結合物をＰＢＳ、０．３％
Tween-20、１０％脂肪不含のミルクパウダー中で希釈し、かつフィルターを用い
て室温で３０分から１時間インキュベートした。検出されたタンパク質をＥＣＬ
キットにより製造者（Amersham Life Science, RPN 2106）の指示に従って目視
可能にした。

【００５６】１．９免疫蛍光法細胞をカバーガラス上で培養し、かつＭＯＩ１のＨＳＶまたはｒＨＳＶで感
染させた。感染の２４時間後に、カバーガラスを３回ＰＢＳ（燐酸緩衝塩溶液）
を用いて洗浄し、５分間氷冷させたメタノール中でインキュベートしかつ再度Ｐ
ＢＳを用いて洗浄した。ブロックするためにカバーガラスを１０％ＮＣＳを有す
るＰＢＳ中で３０分間インキュベーションした。次に、通常１０％ＮＣＳを有す
るＰＢＳ中で１：１に希釈されたそれぞれの検出−抗体（１．８を参照のこと）
を用いて１時間、湿室中でインキュベーションした。ＰＢＳを用いて３回洗浄し
た後に、カバーガラスを希釈されたフルオレセインイソチオシアネート（FITC）
標識した抗−マウス抗体を用いてさらに３０分間インキュベーションした。ＰＢ
Ｓを用いる３回の洗浄工程の後に、カバーガラスを蛍光顕微鏡で分析した。

【００５７】１．１０ｒＡＡＶの製造ｒＡＡＶベクターを製造するために、従来の方法（同時感染）ならびに本発明
によるｒＨＳＶ／ＡＡＶ−系を使用した。試験は、野生型ＨＳＶタイプ１菌株１
８０２または本発明によるｒＨＳＶ／ＡＡＶで感染させたＢＨＫ-２１細胞を用
いて実施した。レポータータンパク質ＧＦＰ（グリーン蛍光タンパク質）を発現
するｒＡＡＶ−ＧＦＰ-（ＵＦ５）を使用した（Zolotukhin et al., J. Viol. 7
0(1996), 4646-4654）。末端繰り返し単位によってフランキングされているｒＡ
ＡＶゲノムを含んでいるプラスミド調整物を、これを試験で使用する前に、末端
繰り返しに関する完全性を検査した。

【００５８】５．５ｃｍプレート上で培養したＢＨＫ-２１細胞を、ｒＡＡＶ-ＧＦＰ（Ｕ
Ｆ５）プラスミドＤＮＡ１０μｇおよびΔＴＲＤＮＡ（ｒｅｐ／ｃａｐ-発
現プラスミド）１０μｇを用いる従来の方法のために、または単にｒＡＡＶ-Ｇ
ＦＰ（ＵＦ５）ＤＮＡ１０μｇを用いる本発明による方法のために、トランスフ
ェクションした。１晩３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベーションした後に、Ｇ-
ＭＥＭ完全培地を添加する前に細胞を無血清Ｇ-ＭＥＭで２回、ＰＢＳで１回洗
浄した。次に細胞を、ＭＯＩ１のｗｔＨＳＶ-１（従来の方法）かまたはＭＯ
Ｉ０．０１〜１のｒＨＳＶ／ＡＡＶ（本発明による方法）で６〜１２時間感染
させた。３７℃で１時間吸着させた後、細胞を１回ＰＢＳで洗浄しかつ完全なＧ
-ＭＥＭを添加した。感染された細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で完全なCPE（通常２
〜３日）までインキュベーションした。回収するために、プレートを−８０℃で
凍結させかつ解凍後に細胞を１５ｍｌ試験管中に移した。さらに２回の液体窒素
中での凍結サイクルおよび解凍の後に、細胞性の断片を４℃で1500×gで１５分
間遠心分離により除去した。透明な上澄み液を粗製ライセートとして収集しかつ
ヘルパーウィルスをインキュベーションにより５６℃で１５〜３０分間失活させ
た。このライセートを直接に分析するかまたはさらにＣｓＣｌ−勾配で精製した
。

【００５９】１．１１物理的ｒＡＡＶ粒子数の測定物理的ｒＡＡＶ粒子数をドットブロッティング−分析により測定した。ＣｓＣ
ｌ−勾配画分または粗製ライセートから得られるプローブを有するｒＡＡＶ５μ
ｌに、１０×ＤＮアーゼ１−反応緩衝液（500mM Tris-Cl, pH7.5; 100mM MgCl
_２; 500μg/ml BSA）２０μl、DNアーゼ１（12U）５μｌおよびＨ_２Ｏ１７０μ
ｌを添加した。３７℃で１時間インキュベーションした後に、プロテイナーゼＫ
−緩衝液（20mM Tris-Cl, pH 8.0, 20mM EDTA, pH 8.0, 1% SDS）２００μlおよ
びプロテイナーゼＫ１００μｇを２回添加した。さらに３７℃で１時間インキュ
ベーションした後に、３Ｍ酢酸ナトリウム（pH9.2）1/10体積を添加し、かつプ
ローブをフェノール抽出（1×フェノール、１フェノール／ClA, 1×ClA）した。
グリコーゲン４０μｇおよび１００％エタノール２．５体積を添加後に、-８０
℃で３０分間インキュベーションした。最終的に、ＤＮＡを最大速度で３０分間
遠心分離することによりペレット化した。ペレットを７０％エタノールで１回洗
浄、乾燥させ、かつ引き続き０．４Ｍ NaOH ４００μｌ、１０mM EDTA溶液中で
再懸濁させた。

【００６０】標準としてｒＡＡＶベクターＤＮA（40〜0.3プラスミド125ng）の一連の２倍
希釈液を２０μｌ体積中で製造し、かつ０．４M NaOH、１０mM EDTA溶液を混合
した。全てのプローブを１００℃で５分間インキュベーションし、かつ即座に氷
上で冷却した。ドットブロッティング装置の使用下に、プローブを遺伝子スクリ
ーン−プラスメンブレン（NEN Light Science Products）上に移し、かつＤＮＡ
をフィルター上でＵＶ−照射により結合させた。上記のChurch等により６５℃で
０．２５Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液、pH7.2、1mM EDTA、7% SDSおよび１％ BSA中
でハイブリダイゼーションを実施した。３０分後に、ハイブリダイゼーション２
時間まで、膜をｒＡＡＶ-ＧＦＰの[α−^３２Ｐ]ｄＣＴＰ-標識した７３１bpのＮ
ｏｔＩ-断片に１晩ハイブリダイズさせた。フィルターを６５℃で洗浄緩衝液１
（20mM 燐酸ナトリウム緩衝液、pH7.2; 2.5% SDS; 0.25% BSA; 1mM EDTA）を用
いて３回、さらに洗浄緩衝液２（20mM 燐酸ナトリウム緩衝液、pH7.2; 1% SDS;1
mM EDTA）を用いて３回洗浄した。フィルターをＸ線フィルム上に露出した後に
、斑点を切り取り、かつシンチレーションカウンター中で分析した。物理的粒子
数は、２本鎖ｒＡＡＶ−プラスミドＤＮＡを標準として使用しながら計算した。

【００６１】１．１２複製中心アッセイによるｒＡＡＶ−調製物の感染性力価の測定複製中心アッセイを実施するために、ｒＡＡＶが一次感染細胞から遊離し、か
つ二次感染が培養中に広がる前に細胞を回収した。約５×１０^４ヒーラ−細胞を
１２ウェルプレートのくぼみ１つ当たりに添加した。１晩インキュベーションし
た後に、ｗｔＡＡＶを検出するためにアデノウィルス（ＭＯＩ＝２０）を単独に
用いるか、またはｒＡＡＶを検出するためにアデノウィルス（ＭＯＩ＝２０）お
よびｗｔＡＡＶ（ＭＯＩ＝４）を用いて細胞を感染させた。吸着の１時間後に、
細胞を洗浄しかつライセートを有するｒＡＡＶ-ＧＦＰ１００μｌで感染させた
。１時間後に、新たな培地１ｍｌを添加した。次に、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベーションし、かつ遠心分離によりペレット化した。なお粘
着性の細胞をトリプシン処理しかつペレット化した細胞と結合させた。細胞を再
懸濁し、かつ真空装置の使用下にニトロセルロースフィルター上に移した。ニト
ロセルロースフィルターのハイブリダイゼーションをホルムアミド溶液（5×SSC
; 50% ホルムアミド；5×Denhardt; 50mM 燐酸ナトリウム緩衝液、pH7.2; 0.1%
SDS; 0.1 mg/ml 酵母tRNA）中、４２℃で、ｒＡＡＶ-ＧＦＰの[α−^３２Ｐ]ｄＣ
ＴＰ-標識した７３１ｂｐＮｏｔＩ-断片またはＡＡＶｒｅｐの[α−^３２Ｐ]
ｄＣＴＰ-標識した１４６５ｂｐ-断片を用いて実施した。

【００６２】２．結果２．１組換えＨＳＶ／ＡＡＶの製造出発材料として、単に１つのＸｂａｌ-部位をU_ｓ−領域のポジション143969（
上記のMcGeoch et al.によるナンバリング）に有するＨＳＶ-タイプ１突然変異
体1082（Rixon et al., J. Gen. Virol. 71 (1990) 2931-2939）を使用した。こ
のポジションは、異種の配列の組込みに適当である、それというのも一方で、オ
ープンリーディングフレームに影響がなく、他方でこの領域中のポジション５に
ある遺伝子が細胞培養におけるウィルス増殖に重要であるからである。ｒＨＳＶ
を製造する方法は、図１に記載されている。

【００６３】ｐｓｕｂ２０１ｌａｃを、完全な８．４ｋｂの長さの発現カセットを切り取る
ためにＸｂａｌを用いて切断した。引き続き、ゲル精製した発現カセットをＨＳ
Ｖ-１１８０２のＸｂａｌ-部位中にライゲーションした。このために、ＨＳＶ
ＤＮＡを完全にＸｂａｌを用いて切断した。Ｘｂａｌ−切断したＨＳＶＤＮ
Ａ１μｇをｐｓｕｂ２０１ｌａｃの精製したＸｂａｌ-断片１μｇと２０μｌ体
積中でライゲーションした。次に、ライゲーションしたＨＳＶ１８０２／ｐｓ
ｕｂ２０１ｌａｃをＢＨＫ-２１細胞中で以下の方法の使用下にトランスフェク
ションさせた。１ｍｌＨＢＳ、ニシンの精子ＤＮＡ（10μg/μl）１μlおよび
ライゲーションしたＨＳＶ１８０２／ｐｓｕｂ２０１ｌａｃ（1μg）１０μｇ
を混合した。引き続き、２ＭＣａＣｌ_２７０μｌを滴加した。成長培地の除去
後に、該溶液をＢＨＫ-細胞上に注いだ。３７℃で４０分間インキュベーション
した後に、完全なＧ-ＭＥＭ（５％ＮＣＳ含有）４ｍｌを添加しかつ細胞をさら
に２００分間インキュベーションした。培地を除去した後に、無血清Ｇ-ＭＥＭ
で細胞を１回洗浄した。次に、トランスフェクションした細胞を２０％ＤＭＳＯ
１ｍｌを用いてＨＢＳ中で室温で４時間処理した。ＤＭＳＯ溶液を除去しかつ細
胞を再度無血清Ｇ-ＭＥＭで洗浄した。５％ＮＣＳを有するＧ-ＭＥＭを添加後に
、プラークが目視可能になりかつウィルスが回収されるまで細胞を３日間培養し
た。ＣＲＶおよびＣＡＶの生産を例１．２に記載したように行った。

【００６４】ＣＡＶ−プラークアッセイを１．６に従って実施した。３日後に目視可能なプ
ラークを分離し、かつ５％ＮＣＳを有するＰＢＳ２００μｌ中に移した。３サイ
クルの凍結および解凍の後、細胞を感染させるために該懸濁液を使用し、該細胞
を次いで組換え単純ヘルペスウイルスの存在に関してβ−Ｇａｌ−染色およびア
デノ随伴ウイルスタンパク質ＲｅｐもしくはＣａｐの発現により分析した。陽性
プラークを選択し、かつその後の別のプラークアッセイ−サイクルにより精製し
た。均質で純粋な組換え分離株が既にサイクル４の後で得られた時でさえ、別の
プラーク精製サイクルを実施し、残りの野生型単純ヘルペスウイルスによるごく
わずかな汚染さえも回避した。全ての陽性プラークはウエスタンブロット分析で
ＲｅｐもしくはＣａｐ発現において同一のパターンを示した。

【００６５】野生型ＨＳＶの存在は種々の大きさの細胞培養シャーレを組換えウイルスで感
染させ、かつ引き続きＸ−Ｇａｌを染色することにより感染の約１２時間後に試
験した。その際、感染した細胞の未染色の領域により示される野生型ＨＳＶの形
成を観察することはできなかった。

【００６６】組換えＨＳＶを、ここではｒＨＳＶ／ＡＡＶとも呼ぶが、ＢＨＫ−２１回転フ
ラスコ中で１〜２×１０^７ＰＦＵ／ｍｌのＣＲＶ−力価まで培養したが、これと
比較して野生型ＨＳＶ−１１８０２を使用した場合には約１×１０^８ＰＦＵ／
ｍｌまでであった。全てのｒＨＳＶ／ＡＡＶ−調製物の純度をＸ−Ｇａｌ−染色
（１．７を参照のこと）により分析した。ごくわずかな感染の多重度を有する複
数のサイクルによるｒＨＳＶ／ＡＡＶの増殖の場合でさえ、組換えＨＳＶから野
生型ＨＳＶへの復帰は観察されなかった。この実験条件下で場合により存在する
野生型−ＨＳＶはｒＨＳＶ／ＡＡＶを上回って増殖し、これは上記の力価の記載
から明らかであるように、わずかな増殖の不利点を有する。この場合、分離した
ｒＨＳＶ／ＡＡＶは安定しており、かつ増殖能力がある。ｒＨＳＶ／ＡＡＶ調製
物のアリコートは１９９７年１１月１０日にEuropean Collection of Cell Cult
ures CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OIG, UKに寄託されており、かつ一時的
なアクセス番号Ｖ９７１１１３０２を有する。

【００６７】２．２ｒＨＳＶ／ＡＡＶで感染させたＢＨＫ細胞中でのＡＡＶＲｅｐ−タ
ンパク質の発現プラーク精製の間の分析の際にすでにＡＡＶ−タンパク質はｒＨＳＶ／ＡＡＶ
を用いた細胞の感染後に発現することが明らかになった。より正確な時間経過お
よび発現度の分析のためにＢＨＫ−２１細胞を感染の多重度（ＭＯＩ）１のｒＨ
ＳＶ／ＡＡＶを用いて感染させ、かつ感染後、記載の時間において回収した。Ａ
ＡＶＲｅｐ７８およびＲｅｐ５２はｒＨＳＶ／ＡＡＶを用いた感染後すでに４
時間でＢＨＫ−２１細胞中で検出可能であった（図２Ａ）。感染の８時間後（８
ｈ p.i.）、４つのＲｅｐ−タンパク質全ては目視可能であり、その際、その割
合はＡＡＶ野生型およびＨＳＶ−１１８０２の同時感染と比較可能であった。
Ｒｅｐ−タンパク質の発現は極めて高く、かつヘルパーウイルスの存在下での増
殖性野生型ＡＡＶ感染の範囲であった。

【００６８】この結果は基準ＡＡＶプロモーターを有する組み込まれたＡＡＶ配列がＨＳＶ
に特異的なタンパク質、例えば組み込まれていない野生型ゲノムによりヘルパー
ウイルスを用いた同時感染の後に調整されることを示している。この結果はさら
に増殖性ＨＳＶ生存サイクル自体はＲｅｐ−タンパク質の極めて高い含有率によ
り顕著に阻害されないことを示している。

【００６９】ＨＳＶを用いた感染は極めて急速にホスト細胞の代謝作用を引き継ぎ、かつ最
終的に細胞を溶解するので、感染のその後の段階でＲｅｐ−タンパク質の存在を
試験した。その結果（図２Ｂ）は、Ｒｅｐ−タンパク質の発現が感染の１６〜２
４時間後にプラトーに到達し、かつＲｅｐ自体は感染後に極めて遅い段階（７２
時間）でまだ検出可能であることを示している。

【００７０】２．３Ｃａｐ−タンパク質の発現効果的なパッケージングのためにアデノ随伴Ｃａｐ−タンパク質の高い発現率
が必要である。従ってＢＨＫ−２１細胞におけるＡＡＶＣａｐ−発現の時間経
過を、ｒＨＳＶ／ＡＡＶを用いた感染後に分析した（図３）。ＡＡＶＶＰ３タ
ンパク質はすでに感染後０時間で検出可能であった（図３Ａ）ので、該タンパク
質をｒＨＳＶ／ＡＡＶ−ビリオンへ組み込むことができる。ｐ．ｉ．６〜８時間
の間にＡＡＶＶＰタンパク質の蓄積が判明し、その際、感染の１２時間後に、
ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の量はＨＳＶ−１の存在下での野生型ＡＡＶ感染と
区別できなかった（図３Ａ）。その際、Ｒｅｐ−タンパク質、特にＲｅｐ７８お
よびＲｅｐ５２が感染細胞中に充分な含有率で存在している場合、相応するＡＡ
ＶＶＰタンパク質の相応する発現をまず誘発した（図２Ａ）。ＶＰタンパク質
の発現は感染から感染後７２時間までは高かった（図３Ｂ）。

【００７１】総じて、ｒＨＳＶ／ＡＡＶを用いたＢＨＫ−２１細胞の感染後に、その割合に
おいて野生型ＡＡＶおよびＨＳＶ−１の同時感染と比較可能な大量のＶＰ−タン
パク質が存在することを確認することができる。

【００７２】ＡＡＶ−タンパク質であるＣａｐおよびＲｅｐの発現もまたｒＨＳＶ／ＡＡＶ
感染したヒーラ−もしくはベロ細胞中で見いだされた。

【００７３】２．４ＡＡＶキャプシド構造の検出免疫蛍光分析法によりＡＡＶＣａｐ−タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ
３の発現がパッケージングのために充分であるかどうかを試験した。Ｒｅｐに特
異的な抗体（１．８）の使用下にｒＨＳＶ／ＡＡＶ感染させたＢＨＫ−２１細胞
の集中的な核染色および細胞質染色を観察した（図４）。Ｃａｐに特異的な抗体
（１．８）の使用下に強度がやや小さい類似の染色パターンが判明した（図４）
。ＡＡＶ−キャプシドに特異的な抗体Ａ２０（１．８）を用いてもｒＨＳＶ／Ａ
ＡＶ感染させた細胞中で陽性のシグナルを検出することができた（図４）。

【００７４】２．５ｒＨＳＶ／ＡＡＶを用いた組換えアデノ随伴ウイルスベクターのパッ
ケージング組換えＨＳＶ／ＡＡＶは組換えアデノ随伴ウイルスベクターの複製およびパッ
ケージングを支援するが、このことはｌａｃＺ−もしくはＧＦＰ−形質導入アデ
ノ随伴ベクターの使用下で示された。

【００７５】粒子の実際の数の決定のためにＢＨＫ−２１−もしくはベロ−細胞をｒＡＡＶ
−ＧＦＰ（ＵＦ５）またはｒＡＡＶ−ＧＦＰおよびΔＴＲを用いてトランスフェ
クションし、かつ引き続きｒＨＳＶ／ＡＡＶを用いるか、またはＨＳＶ−１１
８０２を用いて上記の通りに感染させた。粗製ライセート中の粒子数をドットブ
ロッティング(Dotblot)により決定した。従来の方法の使用下での８×１０^３粒
子／細胞と比較して、本発明によるｒＨＳＶ／ＡＡＶの使用下で１×１０^４ｒＡ
ＡＶ−ＧＦＰ−タンパク質／細胞が形成された。

【００７６】このために１４ｃｍの培養シャーレをＵＦ５１００μｇまたはＵＦ５および
ΔＴＲそれぞれ５０μｇを用いてトランスフェクションした。トランスフェクシ
ョンした細胞を、ＭＯＩ１の組換えＨＳＶ／ＡＡＶを用いるか、またはＨＳＶ
−１変種１８０２を用いて感染させた。ライセートをｐ．ｉ．３日で製造し、か
つ物理的なｒＡＡＶ−ＧＶＰ−粒子の数に関して分析した。ハイブリダイゼーシ
ョン緩衝液（Church et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 81, (1984) 1991-1
995）中のｒＡＡＶ−ＧＦＰの［α−^３２Ｐ］ｄＣＴＰ−標識した７３１ｂｐ
Ｎｏｔｌ−断片上へ膜をハイブリダイゼーションし、かつ６５℃でインキュベー
ションした。洗浄後にフィルタを露出させ、かつ斑点を切り抜いた。該斑点をパ
ッカードシンチレーションカウンター中でカウントし、かつ粒子数を標準液の使
用下に算出した。

【００７７】結果を以下の表に記載する。

【００７８】

【表１】

【００７９】２．５ｒＨＳＶ／ＡＡＶ−調製物の純度および安定性ＡＡＶ−ベクター産生の間の野生型ＡＡＶ（ｗｔＡＡＶ）の形成は珍しいもの
ではなく（例えば Muzyczka, Curr. Topics. Microbiol. Immunol. 158 (1992)
97-129を参照のこと）、かつ従ってパッケージングの際に慎重に試験しなくては
ならない。特にベクターを大規模に製造する場合には、野生型ＡＡＶの形成を制
限し、かつ制御しなくてはならない。ｒＨＳＶ／ＡＡＶ中に組み込まれたＡＡＶ
配列は、該配列が逆方向末端反復配列 (invertierten terminalen Repetitionen
: ITR)の配列要素を有していないように構成されていた。その結果としてｒＨＳ
Ｖ／ＡＡＶと使用されるＡＡＶ−ＧＦＰ（ＵＦ５）との間には配列のオーバーラ
ップが存在せず、このことはｗｔＡＡＶの形成につながりうる組換え現象の可能
性を最小化する。ｗｔＡＡＶがその他の方法、例えば非相同組換えにより形成さ
れることを排除するために、感染性のｒＡＡＶ−ＧＦＰおよびｗｔＡＡＶのため
の粗製パッケージングライセートを複製中心アッセイにおいて分析した。物理的
な粒子を測定するドットブロッティングとは対照的に、複製中心アッセイは感染
性で増殖能力のある粒子のみを示す。

【００８０】２つの異なった濃度のＵＦ５（１０μｇもしくは２０μｇ）またはＵＦ５およ
びΔＴＲそれぞれ１０μｇをヒーラ−細胞４×１０^５中でリン酸カルシウム法の
使用下にトランスフェクションした。トランスフェクションの約２０時間後にＭ
ＯＩ１のｒＨＳＶを用いて細胞を感染させる（ＵＦ５単独に関して）か、また
はＭＯＩ３のｒＨＳＶを用いてアデノウイルスを感染させた（ＵＦ５／ΔＴＲ
に関して）。細胞をｐ．ｉ．４０時間で回収し、かつ凍結／解凍サイクルで３回
処理した。５６℃で３０分のインキュベーション（ヘルパーウイルスの不活性化
のため）の後、細胞の砕片を遠心分離によりペレット化し、かつ清澄な上澄み液
を回収した。複製中心アッセイを実施するために１２−ウェル−プレート中で培
養したヒーラ−細胞をアデノウイルス（ＭＯＩ＝２０）のみを用いて、またはア
デノウイルス（ＭＯＩ＝２０）とｗｔＡＡＶ（ＭＯＩ＝４）とを用いて感染させ
た。引き続き該細胞を予め製造したそれぞれの粗製ライセート１００μｌを用い
て感染させた。該細胞を２４時間後に回収し、再懸濁させ、かつ真空装置を用い
てニトロセルロース膜上に移した。フィルターをｇｆｐに特異的なプローブを用
いてハイブリダイゼーションし、ｒＡＡＶ−感染した細胞を検出し、かつ新たに
形成したｗｔＡＡＶにより感染させた細胞を目視可能にするために並行してｒｅ
ｐに特異的なプローブを用いてハイブリダイゼーションした。

【００８１】その結果は、ｒＨＳＶ／ＡＡＶをＵＦ５と一緒に使用することは、感染に関し
てアデノウイルスで感染した従来のＵＦ５およびΔＴＲのコトランスフェクショ
ンと同様に能力のある組換えＡＡＶ−ベクターを形成するために充分であること
を示している（図５）。アデノウイルスで感染させたか、またはアデノウイルス
とｗｔＡＡｖとで感染させたヒーラ−細胞の使用は野生型ＡＡＶの形成を示す。
この実験において従来の方法の使用下でのｗｔＡＡＶの形成は極めて高かった。
これとは対照的に新規のｒＨＳＶ／ＡＡＶバッチによればハイブリダイゼーショ
ンによりｒｅｐに特異的なプローブにおいて示されるように実質的にｗｔＡＡＶ
粒子は形成されなかった。このことはサザンブロット分析法によっても確認され
たが、この場合、種々のパッケージング調製物中でｗｔＡＡＶの複製型は発見さ
れなかった。

【００８２】２．７ｒＨＳＶ／ＡＡＶを用いた感染による感染性ｒＡＡＶ−ＧＦＰ−粒子
の製造感染性ｒＡＡＶ−ＧＦＰ粒子の力価を決定した。通常、感染性ｒＡＡＶ−ＧＦ
Ｐ粒子は物理的な粒子数よりも約１×１０^３少ない。このためにリン酸カルシウ
ム法により得られたＢＨＫ−２１−細胞からの粗製ライセートを感染性力価アッ
セイの使用下に９６ウェルプレート中で分析した。

【００８３】ｗｔＡＡＶまたはｒＡＡＶの感染性の力価の決定のために、ヒーラ−細胞を９
０μｌ／ウェルの体積で９６−ウェル−プレート中に添加した。ＡＡＶ含有の調
製物１０μｌを第一列のくぼみに添加し、混合し、かつその後の７工程の各工程
のために連続的に１０倍に希釈した。１２〜２４時間のインキュベーションの後
にトランスフェクションした細胞をアデノウイルス（ＭＯＩ＝１０〜２０）を単
独で用いて感染させ、ｗｔＡＡＶを分析するか、あるいはｒＡＡＶの力価を決定
する場合にはアデノウイルス（ＭＯＩ＝１０〜２０）とｗｔＡＡＶ（ＭＯＩ＝４
）とを用いて感染させる。細胞が完全なＣＰＥを示したら該細胞を３回凍結およ
び解凍した。感染性の細胞ライセートをGene Screen^（Ｒ）膜上へ移した。湿っ
たワットマン紙の層上で５分間該膜を変性させ、０．５ＭＮａＯＨ、１．５Ｍ
ＮａＣｌ中に浸漬し、かつ２０ＸＳＳＣ／０．５ＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．５中
で５分間のインキュベーションにより中和した後でＤＮＡを該膜上でＵＶ架橋さ
せた。該膜を上記のChurch等による相応するプローブを用いたハイブリダイゼー
ションのために使用し、かつｒＡＡＶまたはｗｔＡＡＶ力価を算出した。

【００８４】結果を図６に記載し、かつ第２表にまとめる。

【００８５】

【表２】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明によるｒＨＳＶ／ＡＡＶのゲノム構造を表す。

【図２】図２は、ｒＨＳＶ／ＡＡＶを用いたＢＨＫ−細胞の感染後の短い（Ａ）または
長い（Ｂ）ＡＡＶ−Ｒｅｐ-タンパク質の発現を表す。

【図３】図３は、ｒＨＳＶ／ＡＡＶを用いたＢＨＫ−細胞の感染後の短い（Ａ）または
長い（Ｂ）ＡＡＶ−Ｃａｐ-タンパク質の発現を表す。

【図４】図４は、免疫蛍光法によりｒＨＳＶ／ＡＡＶで感染させたＢＨＫ−細胞中のＲ
ｅｐまたはＣａｐタンパク質および組立てられたＡＡＶカプシドの局在化を表す
。

【図５】図５は、複製中心アッセイの結果を表す。

【図６】図６は、粗製ライセート中のｒＡＡＶ／ＧＦＰの感染性力価アッセイの結果を
表す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年１０月１６日（２０００．１０．１６）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１４

【補正方法】変更

【補正内容】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続きＦターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 CA07 DA02 EA02 FA02 GA11 HA01 HA17 4B065 AA90X AA95Y AB01 BA02 CA24 CA44 4C084 AA13 MA01 NA14 ZB322 ZB332

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】発現制御配列と作動的に結合するアデノ−随伴ウィルス（Ａ
ＡＶ）のｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を有することを特徴とする、組換えヘ
ルペスウィルス。
【請求項２】野生型への復帰を示さない、請求項１に記載の組換えヘルペ
スウィルス。
【請求項３】さらにリポーター遺伝子を有する、請求項１または２に記載
の組換えヘルペスウィルス。
【請求項４】単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウィスル（
ＣＭＶ）、仮性狂犬病ウィルス（ＰＲＶ）およびエプスタイン・バーウィルス（
ＥＢＶ）を含むヘルペスウィルス科およびその他のヘルペスウィルス科のメンバ
ーのグループから選択される、請求項１から３までのいずれか１項に記載の組換
えヘルペスウィルス。
【請求項５】単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）である、請求項４に記載の
組換えヘルペスウィルス。
【請求項６】ＨＳＶ-１突然変異体１８０２である、請求項５に記載の組
換えヘルペスウィルス。
【請求項７】完全にまたは部分的に複製欠損性の突然変異体である、請求
項１から６までのいずれか１項に記載の組換えヘルペスウィルス。
【請求項８】インサートが、ＡＡＶの完全なＩＴＲ-配列を有していない
、請求項１から７までのいずれか１項に記載の組換えヘルペスウィルス。
【請求項９】ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子がヘルペスウィル
スのＵ_ＬまたはＵ_Ｓ−領域中に挿入されている、請求項１から８までのいずれか
１項に記載の組換えヘルペスウィルス。
【請求項１０】ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をヘルペスウィ
ルスのゲノム中に安定に組込む、請求項１から９までのいずれか１項に記載の組
換えヘルペスウィルスの製法。
【請求項１１】ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を制限切断／ライゲーシ
ョンまたは相同的組換えによってヘルペスウィルスのゲノム中に組込む、請求項
１０に記載の方法。
【請求項１２】１つの制限部位を有するＨＳＶ−突然変異体を使用する、
請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】完全にまたは部分的に複製欠損性のＨＳＶ−突然変異体を
使用する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】ＡＡＶ−ウィルスの複製に必要なヘルペスウィルスゲノム
のヘルパー機能および前記ヘルペスウィルスゲノムに挿入された形でアデノ−随
伴ウィルス（ＡＡＶ）のｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を、それぞれ発現制御
配列と作動的に結合して有する核酸。
【請求項１５】請求項１４に記載の核酸を有することを特徴とする、ベク
ター。
【請求項１６】請求項１から９までのいずれか１項に記載の組換えヘルペ
スウィルスを有するウィルス性組成物。
【請求項１７】野生型−ヘルペスウィルスを含まない、請求項１６に記載
の組成物。
【請求項１８】次の：（ａ）アデノ−随伴ウィルス（ＡＡＶ）をベースとするウィルス性ベクターを作
成し、（ｂ）請求項１から９までのいずれか１項に記載の組換えヘルペスウィルスを作
成し、（ｃ）（ａ）のＡＡＶ−ベクターおよび（ｂ）の組換えヘルペスウィルスを細胞
中へ導入し、（ｄ）ＡＡＶ−ベクターを増殖させ、かつ（ｅ）感染性ＡＡＶ−ベクター調製物を得る工程を含む、感染性ＡＡＶ−ベクター調製物の製法。
【請求項１９】ＡＡＶ−ベクターおよび組換えヘルペスウィルスを感染に
より細胞中に導入する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】パッケージングされたｒＡＡＶ−調製物を得る、請求項１
８または１９に記載の方法。
【請求項２１】複製可能な組換えヘルペスウィルスを使用する、請求項１
８から２０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】複製不可能な組換えヘルペスウィルスを使用する、請求項
１８から２０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】請求項１から９までのいずれか１項に記載の組換えヘルペ
スウィルスまたは請求項１５に記載のベクターを有することを特徴とする、細胞
。
【請求項２４】組換えヘルペスウィルスまたはベクターを感染により導入
する、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２５】さらに組換えＡＡＶ−ベクターを有する、請求項２３また
は２４に記載の細胞。
【請求項２６】ＡＡＶ−ベクターが治療に効果的なポリペプチドをコード
する異種のＤＮＡ−インサートを有する、請求項２５に記載の細胞。
【請求項２７】ＢＨＫ細胞、ベロ細胞またはヒーラ細胞である、請求項２
３から２６までのいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２８】ＡＡＶ−ベクターおよびヘルパーウィルスを細胞中に導入
し、ＡＡＶ−ベクターを増殖し、かつ感染性ＡＡＶ−ベクター調製物を細胞また
は／および培養上澄み液から得る感染性ＡＡＶ−ベクター調製物の製法において
、ＡＡＶ−ベクターおよびヘルパーウィルスを感染により細胞中へ導入すること
を特徴とする、感染性ＡＡＶ−ベクター調製物の製法。