JP2000508173A

JP2000508173A - サイトメガロウイルスを検出するためおよびウイルス遺伝子発現のモジュレーターを同定するためのレポーター細胞株系

Info

Publication number: JP2000508173A
Application number: JP9536398A
Authority: JP
Inventors: ウ，ジュン; エス．バーボサ，ミゲル; エム．スト，カーラ
Original assignee: シグナルファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1996-04-10
Filing date: 1997-04-08
Publication date: 2000-07-04
Also published as: DE69715672D1; WO1997038139A1; ATE224459T1; CA2250967A1; US5945276A; AU720485B2; EP0954613B1; DE69715672T2; AU2443997A; ES2186889T3; EP0954613A1

Abstract

(57)【要約】サイトメガロウイルス感染を検出するため、およびサイトメガロウイルス遺伝子発現のモジュレーターを同定するための細胞株および方法が開示される。細胞株は、サイトメガロウイルスプロモーターの制御下にレポーター遺伝子を有する、組込みプラスミドを有する。このような細胞株は、例えば、生物学的サンプルにおいてHCMV感染を特異的に同定するために使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】サイトメガロウイルスを検出するためおよびウイルス遺伝子発現のモジュレーターを同定するためのレポーター細胞株系技術分野本発明は、一般に、サイトメガロウイルス感染の検出に関する。より具体的には、本発明は、サンプル中のサイトメガロウイルスを検出するため、およびサイトメガロウイルス遺伝子発現のモジュレーターを同定するために有用である細胞株に関する。発明の背景ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)は、代表的には新生児および免疫無防備の成人において、広範囲の疾患を誘導し得るヘルペスウイルスファミリーの偏在するメンバーである。米国において、全出生児のほぼ１％が、先天性ＨＣＭＶ感染に関連し、感染の約５〜１０％で、重大な神経学的欠損が生じる。骨髄移植レシピエントにおいて、ＨＣＭＶ肺炎に起因する死亡率は、４０％と高い傾向がある。さらに、散在性ＨＣＭＶ感染は、免疫無防備患者(例えば、ＡＩＤＳ患者)において一般的であり、胃腸炎および視覚切迫(sight-threatening)脈絡網膜炎のような病的状態としばしば関連する。ウイルスゲノムは、感染性ビリオンを形成するためにエンベロープを有するキャプシド内にパッケージされた、約230塩基対の大きな二本鎖DNA分子からなる。増殖性感染は種および細胞に特異的であり、そしてウイルス遺伝子の強固に連携した発現が必要である。この連続するウイルス遺伝子発現は、３つの速度論的クラス、即時（ＩＥ）；初期（Ｅ）；および後期（Ｌ）に分割される。ＩＥ遺伝子産物（これは、ゲノムの４つの領域に位置する）は、ウイルス感染直後に合成され、その発現については宿主因子に主に依存する。ＩＥ転写の本質的部位（主要ＩＥ転写単位として知られる）は、ゲノムの大きな独特な（ＵＬ）成分中に存在する（例えば、Throwerら、J.Virol．70:91-100,1996；Klucherら、Mol.Cell.Bi o．13:1238-1250,1993；Arltら、J.Virol．68:4117-4125,1994を参照）。初期遺伝子（例えば、DNAポリメラーゼのホモログ）は、ウイルスDNA複製の前に転写され（例えば、ErtlおよびPowell．J.Virol．66:4126-4133,1992；Stenbergら、J. Virol．63:2699-2708,1989;Heら、J.Virol．66:1098-1108，1992を参照）、そして後期遺伝子（ウイルスゲノムの大部分を構成する）は、ウイルスDNA複製後にのみ豊富に転写される（例えば、DeptoおよびStenberg，J.Virol．66:3241-3246 ,1992；Geballeら、J.Virol 57:864-874,1986；LeachおよびMocarski、J.Virol ．63:1783-1791,1989を参照）。ＨＣＭＶ感染を首尾良く処置するために、高感度で正確な診断試験が要求される。ほとんどの現在のアッセイには免疫蛍光技術が含まれるが、これは扱いにくく、しばしば感受性が足りない。より迅速な細胞ベースのアッセイが、米国特許第5,418,132号に記載されているが、このアッセイは、異なるヘルペスウイルス間を識別できない。HCMV感染を迅速および特異的に検出する診断法の開発は、ＨＣＭＶ感染の診断および処置を容易にする。さらに、ウイルス遺伝予発現のインヒビターを同定することへの従来のアプローチ（代表的には、全動物もしくは全組織の使用を包含する）は、労働集約的および時間消耗的である。プラークアッセイを含む技術はより迅速であるが、なお終了には約２週間を必要とする。細胞ベースのウイルスアッセイは、有用な治療薬剤の同定において、より高い効率および感度について可能性を有する。したがって、ＨＣＭＶ感染を診断するため、およびサイトメガロウイルス遺伝子発現のモジュレーターを同定するための改良法に関する、当該分野における必要性が存在する。本発明は、これらの必要性を充たし、さらに他の関連する利点を提供する。発明の要旨簡単に述べると、本発明は、サンプル中のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染を検出するため、およびＣＭＶ遺伝子発現のモジュレーターを同定するための細胞株および方法を提供する。１つの局面において、サンプル中のサイトメガロウイルスを検出するための方法が提供される。この方法は、（ａ）サンプルを細胞と接触させる工程であって、この細胞が、サイトメガロウイルスプロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子で安定に形質転換されている、工程；および（ｂ）サンプルの非存在下で予め決定したレベルに対して、上記レポーター遺伝子の発現レベルを決定し、それによってそのサンプル中のサイトメガロウイルスを検出する工程、を包含する。好ましい実施態様において、サイトメガロウイルスプロモーターは、主要即時プロモーター、polプロモーター、およびpp2 8プロモーターからなる群より選択される。別の局面において、本発明は、サイトメガロウイルス遺伝子発現のモジュレーターについてスクリーニングする方法を提供する。この方法は、（ａ）候補モジュレーターを細胞と接触させる工程であって、この細胞が、サイトメガロウイルスプロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子で安定に形質転換されている、工程；および（ｂ）モジュレーターの非存在下で予め決定した発現レベルに対して、上記レポーター遺伝子の発現レベルを決定し、このことからサイトメガロウイルス遺伝子発現を阻害もしくは誘導するその候補モジュレーターの能力を評価する工程、を包含する。なお別の局面において、サンプル中のサイトメガロウイルスを検出するためのキットが提供される。このキットは、（ａ）細胞株であって、サイトメガロウイルスプロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子で安定に形質転換されている、細胞株；および（ｂ）上記レポーター遺伝子の発現を検出するための所定量の試薬、を含む。さらなる局面において、ＣＭＶ感染について治療の有効性をモニターするための方法が提供される。この方法は、（ａ）ＣＭＶに感染した患者を候補治療に曝す工程；（ｂ）この患者から得られたサンプルを細胞に接触させる工程であって、この細胞が、サイトメガロウイルスプロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子で安定に形質転換されている、工程；および（ｃ）上記患者から得られた第２のサンプルと接触させた細胞について予め決定した発現レベルに対して、上記レポーター遺伝子の発現レベルを決定し、このことからこの候補治療の有効性をモニターする工程であって、第２のサンプルはこの候補治療の前に得られる、工程、を包含する。なお別の局面において、本発明は、薬剤耐性ＣＭＶを検出するための方法を提供する。この方法は、（ａ）ＣＭＶに感染した患者から得られたサンプルを薬剤に曝す工程；（ｂ）このサンプルを細胞に接触させる工程であって、この細胞が、サイトメガロウイルスプロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子で安定に形質転換されている、工程；および（ｃ）上記患者から得られた第２のサンプルと接触させた細胞について予め決定した発現レベルに対して、上記レポーター遺伝子の発現レベルを決定し、このことから薬剤耐性ＣＭＶを同定する工程であって、第２のサンプルはこの薬剤に曝されない工程、を包含する。本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照して明らかになる。本明細書中で開示されるすべての参考文献は、それぞれが個別に援用されるように、これら全体が参考として援用される。図面の簡単な説明図１は、ＨＣＭＶゲノム内でのpol、pp28、およびMIEPプロモーターの位置を示す概略図である。図２は、代表的なＣＭＶプロモーター/レポーター遺伝子構築物(pp28-luc、po l-luc、およびMIEP-luc)を示す概略図である。図３は、代表的なMIEP-luc安定細胞株におけるウイルス感染の際の、ルシフェラーゼ誘導の速度論的分析の結果を示すグラフである。ルシフェラーゼ活性は、ＨＣＭＶ感染あり（カラム８〜１４）およびなし（カラム１〜７）で、４時間、６時間、８時間、２４時間、２日、４日、および５日に示された。図４は、代表的なpol-luc安定細胞株におけるウイルス感染の際の、ルシフェラーゼ誘導の速度論的分析の結果を示すグラフである。ルシフェラーゼ活性は、ＨＣＭＶ感染あり（カラム８〜１４）およびなし（カラム１〜７）で、４時間、６時間、８時間、２４時間、２日、４日、および５日に示された。図５は、代表的なpp28-luc安定細胞株におけるウイルス感染の際の、ルシフェラーゼ誘導の速度論的分析の結果を示すグラフである。ルシフェラーゼ活性は、ＨＣＭＶ感染あり（カラム８〜１４）およびなし（カラム１〜７）で、４時間、６時間、８時間、２４時間、２日、４日、および５日に示された。図６は、非感染非トランスフェクト細胞（レーン１）、感染のみの細胞（レーン２）、トランスフェクトのみの細胞（レーン３）、ならびにトランスフェクトした、ＨＣＭＶ感染細胞で感染後２４時間（レーン４）、４８時間（レーン５）および７２時間（レーン６）から単離したmRNAを用いた、プローブとしてルシフェラーゼ（パネルＢ）およびpp28（パネルＡ）遺伝子フラグメントを使用した、ノーザンブロット分析の結果を示すオートラジオグラムである。図７、パネルＡは、ウイルスDNA複製インヒビターの非存在下（カラム１）、２００μg/mLのホスホノ酢酸(phosphonoacetic acid)存在下（カラム２）、および４００μg/mLのホスホノ酢酸存在下（カラム３）でのＨＣＭV感染４８時間後、MIRP-luc細胞において検出されるルシフェラーゼ活性を示すグラフである。パネルＢは、ウイルスDNA複製インヒビターの非存在下（レーン１）、２００μg/m Lのホスホノ酢酸存在下（レーン２）、および４００μg/mLのホスホノ酢酸存在下（レーン３）でのＨＣＭＶ感染４８時間後、MIRP-luc細胞から調製されたmRNA を使用したノーザン分析の結果を示すオートラジオグラムである。このブロットを、矢印で示されるように、ルシフェラーゼmRNA、IE特異的mRNA、およびβアクチンmRNAに対してプローブさせた。パネルＣは、ウイルスDNA複製インヒビターの非存在下（レーン４）、２００μg/mLのホスホノ酢酸存在下（レーン５）、および４００μg/mLのホスホノ酢酸存在下（レーン６）でのＨＣＭＶ感染４８時間後、MIRP-luc細胞から調製されたタンパク質溶解物を使用したウェスタン分析の結果を示すオートラジオグラムである。このブロットを、矢印で示されるように、ルシフェラーゼおよびIEタンパク質に対して特異的な抗体でプローブした。図８、パネルＡは、ウイルスDNA複製インヒビターの非存在下（カラム１）、２００μg/mLのホスホノ酢酸存在下（カラム２）、および４００μg/mLのホスホノ酢酸存在下（カラム３）でのＨＣＭＶ感染４８時間後、pol-luc細胞において検出されるルシフェラーゼ活性を示すグラフである。パネルＢは、ウイルスDNA 複製インヒビターの非存在下（レーン１）、２００μg/mLのホスホノ酢酸存在下（レーン２）、および４００μg/mLのホスホノ酢酸存在下（レーン３）でのＨＣＭＶ感染４８時間後、pol-luc細胞から調製されたmRNAを使用したノーザン分析の結果を示すオートラジオグラムである。このブロットを、矢印で示されるように、ルシフェラーゼmRNA、pol特異的mRNA、およびβアクチンmRNAに対してプローブさせた。パネルＣは、ウイルスDNA複製インヒビターの非存在下（レーン４）、２００μg/mLのホスホノ酢酸存在下（レーン５）、および４００μg/mLのホスホノ酢酸存在下（レーン６）でのＨＣＭＶ感染４８時間後、pol-luc細胞から調製されたタンパク質溶解物を使用したウェスタン分析の結果を示すオートラジオグラムである。このブロットを、矢印で示されるように、ルシフェラーゼに対して特異的な抗体でプローブした。図９、パネルＡは、ウイルスDNA複製インヒビターの非存在下（カラム１）、２００μg/mLのホスホノ酢酸存在下（カラム２）、および４００μg/mLのホスホノ酢酸存在下（カラム３）でのＨＣＭＶ感染４８時間後、pp28-luc細胞において検出されるルシフェラーゼ活性を示すグラフである。パネルＢは、ウイルスDNA 複製インヒビターの非存在下（レーン１）、２００μg/mLのホスホノ酢酸存在下（レーン２）、および４００μg/mLのホスホノ酢酸存在下（レーン３）でのＨＣＭＶ感染４８時間後、pp28-luc細胞から調製されたmRNAを使用したノーザン分析の結果を示すオートラジオグラムである。このブロットを、矢印で示されるように、ルシフェラーゼmRNA、pp28 mRNA、およびβアクチンmRNAに対してプローブさせた。パネルＣは、ウイルスDNA複製インヒビターの非存在下（レーン４）、２００μg/mLのホスホノ酢酸存在下（レーン５）、および４００μg/mLのホスホノ酢酸存在下（レーン６）でのＨＣＭＶ感染４８時間後、pp28-luc細胞から調製されたタンパク質溶解物を使用したウェスタン分析の結果を示すオートラジオグラムである。このブロットを、矢印で示されるように、ルシフェラーゼおよびpp 28タンパク質に対する抗体でプローブした。図１０、パネルＡは、ＨＣＭＶ感染なし（カラム１）、ＨＣＶＭ感染後（カラム２）、およびＨＳＶ−１感染後（カラム３）のMIRP-luc細胞において検出されたルシフェラーゼ活性を示すグラフである。パネルＢは、ＨＣＭＶ感染なし（カラム１）、ＨＣＶＭ感染後（カラム２）、およびＨＳＶ−１感染後（カラム３）のpol-luc細胞において検出されたルシフェラーゼ活性を示すグラフである。パネルＣは、ＨＣＭＶ感染なし（カラム１）、ＨＣＶＭ感染後（カラム２）、およびＨＳＶ−１感染後（カラム３）のpp28-luc細胞において検出されたルシフェラーゼ活性を示すグラフである。図１１は、感染なし（カラム１〜３）、ＨＣＭＶ感染時（カラム４〜６）、およびＨＳＶ−１感染時（カラム７〜９）の、MIEP-luc（カラム１、４、および７）、pol-luc（カラム２、５，および８）、およびpp28-luc（カラム３、６、および９）についてのルシフェラーゼ活性の活性化倍数（fold activation）を示すグラフである。発明の詳細な説明上記のように、本発明は、一般に、サンプルにおいてサイトメガロウイルス(C MV)感染を検出するため、およびCMV遺伝子発現のモジュレーターを同定するための方法に関する。サイトメガロウイルスは、好ましくはヒトサイトメガロウイルス(HCMV)であるが、本発明はまた、他の宿主に感染するウイルス(例えば、マウスサイトメガロウイルスまたはMCMV)に適用し得る。そのような方法で使用する細胞株もまた、提供される。本発明の細胞株は、サイトメガロウィルプロモーターの制御下にレポーター遺伝子を含む、組込みプラスミドを保有する。そのような細胞株の調製のため、CM Vによる感染を受けやすい任意の細胞型は、適切なプラスミドでトランスフェクトされ得る。適した細胞型は、U373MG(例えば、Ripaltiら，J．Virol.69:2047-2 057，1995を参照のこと)およびU138MG（例えば、Wolffら、Virol.204:101-113， 1994を参照のこと）のようなヒトグリア細胞、不死化ヒト線維芽細胞、MDR-5細胞（ヒト胚(embryonic)肺線維芽細胞）、ヒト単球／マクロファージ細胞(例えば、Fishら，J．Virol．70:1855-1862，1996を参照のこと)、およびヒト内皮細胞を含むが、これに限定しない。安定な形質転換またはトランスフェクションは、 Sambrookら，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Lab oratories，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989に記載されたような、当業者に公知の日常的な方法によって達成され得る。手短に言えば、CMVプロモーター／レポーター遺伝子構築物を含むプラスミドを、ネオマイシン耐性遺伝子（例えば、 Wolffら，Gene 130:167-173，1993を参照のこと）のような選択マーカーを有するベクターと共に同時トランスフェクトさせ得る。選択マーカーを有する細胞のコロニーは単離され、そしてウイルス感染の前および後で、レポーター遺伝子の発現についてアッセイされ得る。CMVプロモーター／レポーター遺伝子構築物でトランスフェクトされた細胞は、CMVによる感染後のレポーター遺伝子発現の強力な活性化を示す。トランスフェクションに続いて、細胞は、10％ウシ胎児血清、１％抗真菌剤／抗生物質、およびG148のような、プラスミド選択において適切な化合物を補充したDulbecco改変Eagle培地(DMEM)のような、適切な選択培地で維持され得る。 CMVの存在下でレポーター遺伝子の発現を仲介し得る（非存在下では仲介しない）任意のCMVプロモーターが、本発明の構築物に用いられ得る。本発明の構築物中に用いられるプロモーターは、CMVの非存在下でレポーター遺伝子の構成的発現を引き起こすべきではない。適切なプロモーターは、即時(IEまたはα)プロモーターUL122-123(MIEP)、UL36-38、UL3、US3およびTRS1(US22ファミリー）；初期(Eまたはβ)プロモーターUL54(pol)、UL44(ICP36、p52)、UL122、UL84およびUL98；および後期（Lまたはγ）プロモーターUL99(pp28)、gH(UL75)およびIE4 0を含むが、それらに限定しない。これらのプロモーターは、例えば、Throwerら，J．Virol．70:91-100，1996;Pariら，Antimicrobial Agents and Chemotherap y 39:1157-1161，1995;Geballeら，J．Virol 57:864-874，1986;LeachおよびMoc arski，J．Virol．63:1783-1791，1989;Pariら，J．Virol．67:2575-2582，1993 ;ErtlおよびPowell，J．Virol．66:4126-4133，1992;StasiakおよびMocarski，J ．Virol．66:1050-1058，1992;Meyerら，J．Virol．62:2243-2250，1988;Stenbe rgら，J．Virol．63:2699-2708，1989;Rugerら，J．Virol．61:446-453，1987;K lucherら，Mol．Cell．Biol．13:1238-1250，1993;Arltら，J．Virol．68:4117- 4125，1994;Langら，J．Virol．69:6030-6037，1995;SpectorおよびTevethia，J ．Virol．68:7549-7553，1994;Heら，J．Virol．66:1098-1108，1992;DeptoおよびStenberg，J．Virol．63:1232-1238，1989;Adamら，J．Virol．69:5304-5310 ，1995に記載される。好ましいプロモーターは、HSV-1のような、他のヘルペスウイルスの存在下で有意なレポーター遺伝子発現を可能にしないプロモーターである。そのようなプロモーターは、主要即時プロモーター(MIEP)(例えば、Kohler ら，J．Virol．68:6589-6597，1994に記載される)、polプロモーター(例えば、K erryら，J．Virol．68:4167-4176，1994に記載される)およびpp28プロモーター( 例えば、DeptoおよびStenberg，J．Virol．66:3241-3246，1992に記載される)を含む。HCMVゲノム内のこれらのプロモーターの位置は、図１に提供される。レポーター遺伝子は、その産物が遺伝子発現の検出におけるマーカーとして供され得る任意の遺伝子であり得る。多くのそのようなレポーター遺伝子は、当業者に公知である。いくつかのレポーター遺伝子は、広範に使用される：細菌性クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、ホタルルシフェラーゼ( LUC)、ヒト成長ホルモン(hGH)、アルカリホスファターゼおよび細菌性β-ガラクトシダーゼ。cat遺伝子およびluc遺伝子は共に、真核細胞において最も一般的に使用され、そしてlucは特に好ましいレポーター遺伝子である。ルシフェラーゼアッセイは、CATアッセイより10〜1000倍の感度があり、バックグラウンドが無視でき、すばやく定量化し、そして半減期が短い（哺乳動物細胞において、CAT の50時間と比較して、lucは３時間）という利点を提供する。ルシフェラーゼレポーター遺伝子のこれらの特性は、安定な細胞株中でCATのようなより安定なレポーターより、転写における変化のより高感度なモニターを提供する(例えば、M orieraら，Methods in Mol．and Cell．Biol．3:23-29，1992を参照)。次に、プロモーター／レポーター遺伝子構築物は、当業者に周知の技術を用いて、適切な発現ベクターに挿入し得る。適切な発現ベクターは、pGL2-Basicプラスミド(Promega，Madison，WI)を含む。上記細胞株は、任意の液体サンプル中、および好ましくは温血動物から得られた生物学的サンプル中のCMV感染の検出に使用され得る。より好ましくは、サンプルは、尿、咽喉分泌物、生殖器分泌物、母乳および血液を含むがそれらに限定されないヒトの生物学的サンプルである。液体サンプルはまた、当該分野で一般的な抽出または他の手順によって固体材料から調製され得る。遠心分離のような１つ以上の予備的工程が、試験に至適な条件にサンプルを置くために、望ましいことであり得ることは当業者に明らかである。他のウイルスもまた液体サンプル中に存在し得、これらには、単純ヘルペスウイルス１型および２型(HSV-1およびHSV-2)、ヒトヘルペスウイルス６型(HHV6)、水痘−帯状ヘルペスウイルス(VZV )、エプスタイン-バーウイルス(EBV)、アデノウイルス、ならびにインフルエンザ、ライノウイルス、およびRSウイルス(RSV)のようなRNAウイルスが含まれる。サンプルがCMVを含むかどうかを決定するために、サンプルは、上記のように、サイトメガロウイルスプロモーターに作動可能に連結したレポーター遺伝子を含む組込みプラスミドを保有する細胞と接触させる。サンプルおよび細胞は、代表的には、組み合わされ、所定の期間および細胞のウイルス感染を達成するに十分な条件下でインキュベートさせる。例えば、ウェルあたり30×10³細胞が、適切な選択培地中で96ウェルプレートに播種され、そして約10〜50μｌのサンプルと組み合わされ得る。次に、サンプルおよび細胞は、代表的には約２〜５日間、好ましくは約48時間インキュベートされる。インキュベーションに続いて、レポーター遺伝子の発現レベルは、特定のレポータータンパク質に適切な技法を用いて決定される。多くの場合で、レポータータンパク質は、日常的な比色定量、蛍光定量または発光定量の技法により検出され得る酵素である。例えば、ルシフェラーゼ活性は、酵素基質としてルシフェリンを用いて、標準的な発光定量法を用いて検出され得る(de-Wetら，Mol．Cell． Biol．7:725-737，1987)。他のレポーター遺伝子の発現レベルを検出するための適切な方法は、当業者に明らかであり、そして例えば、Sambrookら，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，Cold Sprin g Harbor，N.Y.，1989および製造者のプロトコールに見出され得る。サンプル中のCMVの存在または非存在を決定するために、レポータータンパク質アッセイにおいて検出されたシグナルは、一般的に、予め決定されたカットオフ値に対応するシグナルと比較される。このカットオフ値は、好ましくは、CMV 感染サンプルの非存在下でインキュベートした細胞から得られた平均シグナルの平均値である。一般に、平均の約２倍以上のシグナルを生じたサンプルは、CMV 感染についてポジティブだと考えられる。上記アッセイはまた、サンプル中のCM Vの量の決定に使用され得る。CMVの絶対的なレベルは、サンプルによって生じたシグナルと既知量のウイルスを有するスタンダードによって生じたシグナルとを、当業者に周知の技法を用いて比較することによって得られ得る。以下により詳細に考察するように、CMVの相対的レベルの決定もまた、例えばCMV感染についての治療のモニタリング、または所定の薬剤に対するCMV単離物の応答の評価（例えば、薬物耐性の同定）に有用であり得る。上記の検出法の顕著な利点は、CMVを特異的に検出する能力である。本発明によれば、特定のプロモーター（MIEP，pol，およびpp28のような）の使用により、上記方法は、HSV-1を検出することなくCMVの検出について感受性にされることが見出される。この予期しない特異性は、CMVの正確な同定を可能にし、そのことは次には特定のウイルスに正確に合わせた処置の使用を可能にする。上記の方法によるCMVの検出はまた、薬物耐性CMVの同定および治療のモニタリングに有用であり得る。これらの局面において、薬物または他の治療への曝露に応じたCMVレベルの変化が評価される。CMVが所定の薬物に抵抗性かどうかを評価するために、このウイルスを含むサンプルは、当業者に明らかなサンプル型に適切な方法を用いて、適切量の薬物に曝露される。次に、曝露に続いて、サンプルは、上記のようにCMVについて試験される。処置したサンプル中のCMVが、特定の薬物に対して抵抗性である場合、CMVは検出される。サンプル中に検出された薬物耐性CMVのレベルは、処置に応じて一時的に減少し得ることが気づかれるべきである。それにもかかわらず、処置の２〜３週間後に読み出し(readout)値が変化しないか、または、読み出し値が最初、処置の２〜４週間後には減少し、そしてその後の追跡評価では増加する場合、CMVは薬物耐性と考えられる。 CMV感染について治療の有効性を評価するために、１人以上の感染患者から得られた適切なサンプルは、最初に、上記のように、CMVについて評価される。次に、候補治療が、患者に適用され、そして処置後のCMVレベルが決定される。例えば、感染患者から採取された血液は、処置に先立って、CMVの存在について試験され得る。処置の２〜４週間後、第２の血液サンプルが採取され、そしてCMV について試験され得る。治療が、CMVレベルを少なくとも２倍低下させる場合、その治療は有効であると考えられる。一旦、治療が有効であることが見出されたならば、患者の更なる治療は、CMVがもはや検出されなくなるまで、約２〜４週間の間隔で、同様のCMVアッセイを行うことによってモニターされ得る。本発明の関連する局面では、CMVの存在を検出するための診断キットが提供される。そのようなキットは、一般に、上記のような、トランスフェクトされた細胞、および別の容器にレポーター遺伝子発現の検出を可能にするのに十分な所定量の試薬を含む。例えば、キットは、図２に示すように、MIEP、pol、またはpp2 8プロモーターに作動可能に連結されたルシフェラーゼ遺伝子を有する発現ベクターを含む細胞を含み得る。そのようなキットでは、付随の所定量の試薬は、ルシフェラーゼ活性の検出を可能にするのに十分である。適切なキットは、 Promega(Madison，WI)およびAnalytical Luminescence Laboratories(San Diego ，CA)から入手可能である。他のレポータータンパク質の検出に使用される他の構築物および試薬を含むキットは、同様に調製され得る。本発明において、トランスフェクトされた細胞中のレポーター遺伝子は、内因性ウイルス遺伝子と同様に調節されることが見出された。従って、さらに別の局面では、本発明は、上記のように安定にトランスフェクトした細胞を用いて、CM V遺伝子発現のモジュレーターを同定する方法を提供する。本発明において、「モジュレーター」は、CMV遺伝子発現を誘導または阻害し得る任意の化合物である。モジュレーターは、ウイルス遺伝子の転写または翻訳を誘導または阻害するために直接作用し得る。あるいは、モジュレーターは、ウイルスDNAの複製に影響し得る。モジュレーターは、種々のアッセイ形式を用いて同定され得る。一つの好ましい形式は、多数の候補モジュレーターを同時に試験することを可能にする高処理能力(throughput)スクリーニングである。例えば、luc遺伝子を含む細胞は、96 ウェルプレートに播種され(3×10⁴細胞／ウェル)、37℃の加湿された環境中で約 18時間インキュベートされ得る。次に、候補モジュレーターは、10μg/mLの最終濃度で添加され得、そしてプレートは37℃で30分間インキュベートされ得る。次に、HCMVは、２〜５pfu/細胞で添加され得る。感染の48時間後、細胞は、洗浄および溶解される。次に、溶解物のアリコートは、黒色96ウェルプレートに移され、そしてルシフェラーゼアッセイ試薬が添加される。次に、それぞれのウエルのルシフェラーゼ活性（発光）は、測定される。他のレポーター遺伝子が使用される場合、本プロトコルのいくつかの改変が適切であり得ることは、当業者に明らかである。さらに、細胞特異的染色がレポーター遺伝子発現の検出に使用され得る。アッセイ形式にかかわらず、候補モジュレーターおよびウイルスとインキュベートされた細胞から得られたシグナルは、一般的に、予め決定されたカットオフ値に対応するシグナルと比較される。このカットオフ値は、好ましくは、ウイルスの存在下であるが、モジュレーターの非存在下でインキュベートされた細胞から得られる平均シグナルの平均値である。一般的に、平均値の１倍以上のシグナルを生じる候補モジュレーターは、CMV遺伝子発現のインデューサーと考えられ、そして平均値を約25%、好ましくは50%を越えて下回るシグナルを生じる候補モジュレーターは、CMV遺伝子発現のインヒビターと考えられる。 CMV遺伝子発現を阻害するモジュレーターは、抗ウイルス薬剤としての治療的可能性を有する。特に、そのようなモジュレーターは、肺炎、胃腸炎、および脈絡網膜炎のようなHCMV関連疾患の処置における使用を見出し得る。モジュレーターのさらなる特徴づけは、上記のアッセイを用いて、モジュレーターによる処置前から得られた患者のサンプル中のCMVレベルと、処置後の種々の時間に得られたサンプル中のレベルを比較することによって達成され得る。以下の実施例は、限定の目的ではなく、例示の目的で提供される。実施例実施例１トランスフェクト細胞の調製本実施例は、サイトメガロウイルスプロモーターの制御下にレポーター遺伝子を含む、組込まれたプラスミドを有する細胞株の調製を例示する。Ａ．プラスミド構築１．MIEP-luc −1145位〜＋l22位のMIEPプロモーター配列を、プラスミドPSE(Peter Ghazal ，The Scripps research Institute)をテンプレートとして用いて、PCRにより増幅した。プライマーは以下の通りである：5'-CGGGGTACCGCTGCAGTGAATAATAAAATG- 3'（センスプライマー）、および 5'CGGGGTACCGTCACTCTTGGCACGGGGAATC-3'（アンチセンスプライマー）。これらのオリゴプライマーは、MIEPプロモーターフラグメントの5'末端および3'末端にKp nI制限部位を導入した。KpnI消化PCRフラグメントを、KpnI消化pGL-2ベースのルシフェラーゼレポータープラスミド(Promega，Madison，WI)に挿入した。プロモーター方向を決定し、そしてプロモーター配列のPCR忠実度を配列決定により確認した。２．Pol-luc −425位〜＋15位のPolプロモーター配列を、コスミドpCM1058(Peter Ghazal) をテンプレートとして用いて、PCRにより増幅した。プライマーは以下の通りである：5'-CCCAAGCTTGGGGAATTCAACTCGTACAAGCAG-3'（センスプライマー）、および5'-CCCAAGCTTGGGTCAGACGACGGTGGTCCC-3'（アンチセンスプライマー）。これらのオリゴプライマーは、Polプロモーターフラグメントの5'末端および3'末端にH indIII制限部位を導入した。HinIII消化PCRフラグメントを、HindIII消化pGL-2 ベースのルシフェラーゼレポータープラスミド(Promega，Madison，WI)に挿入した。プロモーター方向を決定し、そしてプロモーター配列のPCR忠実度を配列決定により確認した。３．pp28-luc −609位〜＋106位のpp28プロモーター配列を、コスミドpCM1(PeterGhazal，Sc ripps Research Institute)をテンプレートとして用いて、PCRにより増幅した。オリゴヌクレオチドプライマーは以下の通りである： 5'-AAAGGTACCGCCGGCGTCTCGCCGGGCATC-3'（センスプライマー）、および 5'-AAAAAGCTTGCCGGCCCAGCAGCTCGGGCG-3'（アンチセンスプライマー）。これらのオリゴヌクレオチドプライマーは、pp28プロモーターフラグメントの5'末端にKp nI制限部位を、そして3'末端にHindIII制限部位を導入した。独特な部位であるK pnIおよびHindIIIは、pGL-2ベースのルシフェラーゼレポータープラスミド(Prom ega，Madison，WI)への指向性クローニングを可能にし、図２に示すpp28-lucプロモーター構築物を生じた。pp28プロモーター配列のPCR忠実度を配列決定により確認した。Ｂ．安定細胞株の樹立 HCMV受容ヒトグリア芽細胞種細胞株U373 MGを、上記の構築物でトランスフェクトした。細胞増殖の条件は、Baracchiniら、Virol．188:518-529，1992に記載された通りであった。pp28-ルシフェラーゼレポーターおよびpSV2Neo選択プラスミドを、リン酸カルシウム法により、U373MG細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクタントを、トランスフェクションの３日後に、0.6mg/mlG4l8を含む培地中で選択した。G4l8耐性クローンを拡大し、そして３×10⁴個の細胞を三連で96ウェルプレートに播種した。細胞に、５〜l0pfu/細胞で、HCMV(Towne株、アメリカンタイプカルチャーコレクション、Rockville，MDから入手した）を感染させた。感染の48時間後に、細胞を採取し、そして以下のようにルシフェラーゼ活性についてアッセイした。培養培地を除去し、そして細胞をCa⁺⁺Mg⁺⁺を含まないPBS緩衝液(137mM NaCl、2.7m M KCl，4.3mM Na₂HPO₄、および1.4mM KH₂PO₄)で１回リンスした。60マイクロリットルの１×溶解緩衝液（25mM Trisリン酸、pH7.8、２mM DTT、２mM1,2-ジアミノシクロヘキサン-N,N,N',N'-四酢酸、10％グリセロール、および１％Triton X- 100を含む(Promega Cell Culture Lysis Buffer，Madison,WI)）を添加した。室温にて15分間のインキュベーションの後、40μLの細胞溶解物を黒い96ウェルプレートに移し、そして各ウェルに50μLのルシフェラーゼ基質(Promega，Madison ，WI)を添加した。プレートを、すぐにPackard TopCount^TM(Packard，Hartford ，CT)で読んだ。高ルシフェラーゼ誘導性を示すクローンを、PCRでさらに分析し、ゲノムDNAに組込まれたレポーター転写ユニットの完全性を確認した。実施例２ウイルス感染に際するレポーター遺伝子発現の分析本実施例は、実施例１において調製された細胞株を用いる、HCMV感染に際するレポーター遺伝子発現の速度論的分析を例示する。上記のように調製された細胞株に、HCMVのTowne株(ATCC受託番号VR-977)を、５〜10pfu/細胞の感染多重度で感染させ、そしてルシフェラーゼ活性を５日にわたって種々の時間で測定した。結果を図３〜５に示す。各細胞株について、ルシフェラーゼ活性を24時間で検出した。MIEP-luc細胞株は、24時間〜４日で最大活性を示し、この活性は感染後５日で減少した（図３）。pol-luc（図４）およびp p28（図５）細胞株は、48時間で徐々に増加し、感染後４〜５日でピークに達した。各場合において、遺伝子発現の速度論は、内因性ウイルス遺伝子について予測されるものに類似した。これらのデータは、試験したHCMVプロモーターを介して調節されるルシフェラーゼ発現は、受容細胞では非常に低いが、ウイルス感染に際して強力に活性化されることを示す。しかし、トランスフェクト細胞にUV処置ウイルスを感染させた場合、ルシフェラーゼ活性は検出されなかった（データ示さず）。ルシフェラーゼの短い半減期により、本発明者らは、ルシフェラーゼ活性の増大は転写の活性化を反映しており、単なるレポータータンパク質の蓄積ではないと結論付けた。これらの結果は、これらのプロモーターの活性化が、ウイルス遺伝子発現に必要であり、そしてこれらのプロモーターが、ウイルスゲノム中の状況におけるプロモーターに類似してウイルス感染に応答することを示す。プローブとしてルシフェラーゼおよびpp28遺伝子フラグメントを用いるノーザンブロット分析を用いて、pp28-luc遺伝子および内因性pp28遺伝子の発現パターンもまた比較した（図６）。トランスフェクトおよび感染させたU373 MG細胞を、メッセンジャーRNAについて製造者(Stratagene，La Jolla，CA)の指示通りに加工し、そしてmRNAの等量のアリコートをノーザンブロット分析に供した。プローブを、Prime-It RmTランダムプライマー標識キット(Stratagene，La Jolla，C A)を用いて、α-³²P-dCTP(300Ci/mmol、Amersham，Arlington Heights，IL)で標識した。ブロットを、製造者(Stratagene，La Jolla，CA)のプロトコルに従って QuikHybハイブリダイゼーション溶液を用い、各遺伝子についての放射標識プローブにハイブリダイズさせた。この分析は、pp28 mRNAが24時間で検出可能であり、そして48時間および72時間で次第に増加したことを示した（図６、パネルＡ、それぞれレーン４、５、および６）。対照的に、偽処置コントロール細胞（図６、パネルＡおよびＢ、レーン１）と同様に、感染のみさせた細胞（図６、パネルＢ、レーン２）でもトランスフェクトのみした細胞（図６、パネルＢ、レーン３）でも、ルシフェラーゼ mRNAは検出されなかった。これらの結果は、ウイルスゲノムの状況外のpp28プロモーターが、その内因性相当物に類似して挙動することを示唆する。 HCMV感染に対する組込まれたレポータープラスミドの応答をまた、十分に特徴付けられたウイルスDNAインヒビターであるホスホノ酢酸(PAA，Sigma，St．Loui s，MO，純度99.7）の存在下および非存在下で試験した。結果を図７（MIEP-luc) 、図８(pol-luc)、および図９(pp28-luc)に示す。細胞を、96ウェルプレート中のG418選択培地に播種した。次の日、細胞を、200μg/mL（レーン２および５、パネルＢおよびＣ）および４００μg/mL（レーン３および６、パネルＢおよびＣ）のPAAの存在下、または非存在下（レーン１および４、パネルＢおよびＣ）で処置した。次いで、細胞にHCMVをl0pfu/細胞で超感染させた。感染の48時間後、細胞を採取し、mRNA調製、タンパク質溶解物またはルシフェラーゼアッセイのいずれかのために単離した。上記のように測定したルシフェラーゼ活性を、図７〜９のパネルＡに示す。ルシフェラーゼ、MIEP特異的、pol特異的、またはpp28特異的mRNA、および各レーンのmRNAの量を定量するためのβアクチンmRNAのプローブを用いて、mRNAについてノーザン分析を行った（パネルＢ）。タンパク質溶解物を、ルシフェラーゼに対して特異的な抗体を用いるウエスタンブロット分析のために使用した（パネルＣ）。PAAの阻害濃度（200〜400μg/ml）は、MTS細胞傷害性アッセイに基づいて、U373 MG細胞には傷害性ではなかった（データ示さず）。異なる３つの安定クローンにおけるドットブロット分析により決定されたように、PAAの存在下で、ウイルスDNA複製はほぼ90％阻害された（データ示さず）。これらの結果は、ウイルスDNA複製の阻害が、内因性ウイルス遺伝子発現に対して有する同じ効果を、ルシフェラーゼ発現に対して有することを示す。従って、この細胞株は、天然のウイルス感染の間に生じる遺伝子発現のカスケードのインヒビターを同定するために使用され得る。実施例３レポーター遺伝子発現の誘導の特異性本実施例は、実施例１に記載された細胞株が、異なるヘルペスウイルス間を識別する能力を例示する。異なるヘルペスウイルスによる遺伝子発現のパターンは類似し、そして即時ウイルスタンパク質は関連した機能を有するようである。従って、本発明者らは、上記のレポーター系がHCMVに特異的であるかどうかを見出すことに興味があった。本発明者らは、相同なサイトメガロウイルスと、単純ヘルペスウイルス１型(H SV-1)とを比較することを選択した。MIEP-luc、pol-luc、およびpp28-lucレポーター細胞株に、HCMV(Towne株)またはHSV-1（両方ともATCCから購入した）を３pf u/細胞で感染させ、そして感染後48時間でルシフェラーゼ活性を定量した。図10 および11に示すように、HCMV感染はルシフェラーゼの有意な発現を生じたが、一方、HSV感染はこれらの細胞株の各々におけるレポーター遺伝子の発現に対して、わずかな効果のみを有した。ウェスタンブロット分析は、後期ウイルス遺伝子産物のHSV-1 gCタンパク質が、HSV-1感染U373MG細胞において効率的に発現したことを明らかにした（データ示さず）。従って、HSV-1はU373MG細胞に感染し、そして後期遺伝子の発現を導くが、HCMV MIEP，polまたはpp28プロモーターを効率的に誘導しない。このことは、これらのプロモーターの活性化が、ウイルス特異的であることを示唆する。これらの結果は、これらの細胞株が所定のサンプルにおけるHCMV感染を特異的に診断するために使用され得ることを示す。実施例４ウイルス遺伝子発現のモジュレーターについての高スループットスクリーニング本実施例は、ウイルス遺伝子発現のインデューサーおよびインヒビターを同定するための、実施例１の細胞株の使用を例示する。細胞を、10％ウシ胎児血清(Gemini Bioproducts，Inc.，Calabasas，CA)、１％抗糸状菌／抗生物質(GIBCO，Baltimore，MD)、および0.6μg/mLG148(GIBCO，B altimore，MD)を補充したDMEM(Mediatech，Herndon，VA)中で維持する。細胞を、平底の組織培養処置96ウェルプレート(Corning，Corning，New York)に３×10⁴ 細胞／ウェルで播種し、37℃の加湿環境で約18時間インキュベートする。次いで、適切に希釈した候補モジュレーターを、10μg/mLの最終濃度で直接細胞上の培地に添加し、プレートを37℃で30分間インキュベートする。次いで、HCMV(Towne株、ATCC)を３pfu/細胞で添加する。感染の48時間後、細胞をPBS（Ca⁺⁺およびMg⁺⁺を含まない）で１回洗浄し、そして96ウェルプレート中で溶解する。次いで、細胞溶解物のアリコートを、黒い96ウェルプレート(P ackard，Hartford，CT)に移し、そしてルシフェラーゼアッセイ試薬(Promega，M adison，WI)をプレートに添加する。次いで、各ウェルにおけるルシフェラーゼ活性（発光）を、Packard Top Count^TMを用いて測定する。ウイルスの存在下およびモジュレーターの非存在下でインキュベートされた細胞から得られた平均シグナルの平均を約１倍上回るルシフェラーゼ活性を生じる候補モジュレーターを、CMV遺伝子発現のインデューサーとしてのさらなる研究のために選択する。モジュレーターの非存在下の平均を約25％、好ましくは50％を越えて下回るシグナルを生じる候補モジュレーターは、CMV遺伝子発現のインヒビターであり、そして抗ウイルス剤として治療能力を有する。以上から、本発明の特定の実施態様が例示のために本明細書に記載されたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の改変がなされ得ることが理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/66 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者バーボサ，ミゲルエス. アメリカ合衆国カリフォルニア 92129, サンディエゴ，カミノデルスエロ 13763 (72)発明者スト，カーラエム. アメリカ合衆国カリフォルニア 92129, サンディエゴ，ピクルスストリート 12465

Claims

【特許請求の範囲】１．サンプル中のサイトメガロウイルスを検出するための方法であって、（ａ）サンプルを細胞と接触させる工程、ここで、該細胞は、サイトメガロウイルスプロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子で安定に形質転換されており、該プロモーターは、ＨＳＶ−１存在下で、顕著なレポーター遺伝子発現を可能にしない、および（ｂ）サンプルの非存在下で予め決定したレベルに対して、該レポーター遺伝子の発現レベルを決定し、それによって該サンプル中のサイトメガロウイルスを検出する工程を包含する、方法。２．前記サイトメガロウイルスプロモーターが、主要即時プロモーター、polプロモーター、およびpp28プロモーターからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。３．前記レポーター遺伝子が、呈色アッセイ、蛍光アッセイ、および/または発光アッセイにより検出され得る酵素をコードする、請求項１に記載の方法。４．前記レポーター遺伝子が、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびヒト成長因子からなる群より選択されるレポータータンパク質をコードする、請求項１に記載の方法。５．前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼをコードする、請求項１に記載の方法。６．前記細胞が、ヒトグリア細胞、不死化ヒト線維芽細胞、ヒト胚性肺線維芽細胞、ヒト単球/マクロファージ細胞、およびヒト内皮細胞からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。７．前記サンプルが、患者から単離された生物学的サンプルである、請求項１に記載の方法。８．サイトメガロウイルス遺伝子発現のモジュレーターについてスクリーニングする方法であって、（ａ）候補モジュレーターを細胞と接触させる工程、ここで、該細胞は、サイトメガロウイルスプロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子で安定形質転換されており、該プロモーターは、ＨＳＶ−１存在下で、顕著なレポーター遺伝子発現を可能にしない、および（ｂ）モジュレーターの非存在下で予め決定した発現レベルに対して、該レポーター遺伝子の発現レベルを決定し、このことからサイトメガロウイルス遺伝子発現を阻害もしくは誘導する該候補モジュレーターの能力を評価する工程を包含する、方法。９．前記サイトメガロウイルスプロモーターが、主要即時プロモーター、polプロモーター、およびpp28プロモーターからなる群より選択される、請求項８に記載の方法。１０．前記レポーター遺伝子が、呈色アッセイ、蛍光アッセイ、および/または発光アッセイにより検出され得る酵素をコードする、請求項８に記載の方法。１１．前記レポーター遺伝子が、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびヒト成長因子からなる群より選択されるレポータータンパク質をコードする、請求項８に記載の方法。１２．前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼをコードする、請求項８に記載の方法。１３．前記細胞が、ヒトグリア細胞、不死化ヒト線維芽細胞、ヒト胚性肺線維芽細胞、ヒト単球/マクロファージ細胞、およびヒト内皮細胞からなる群より選択される、請求項８に記載の方法。１４．サンプル中のサイトメガロウイルスを検出するためのキットであって、（ａ）細胞株、ここで、該細胞株は、サイトメガロウイルスプロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子で安定に形質転換されており、該プロモーターは、ＨＳＶ−１存在下で、顕著なレポーター遺伝子発現を可能にしない、および（ｂ）該レポーター遺伝子の発現を検出するための一定量の試薬を含む、キット。１５．前記サイトメガロウイルスプロモーターが、主要即時プロモーター、pol プロモーター、およびpp28プロモーターからなる群より選択される、請求項１４に記載のキット。１６．前記レポーター遺伝子が、呈色アッセイ、蛍光アッセイ、および/または発光アッセイにより検出され得る酵素をコードする、請求項１４に記載のキット。１７．前記レポーター遺伝子が、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびヒト成長因子からなる群より選択されるレポータータンパク質をコードする、請求項１４に記載のキット。１８．前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼをコードする、請求項１４に記載のキット。１９．前記細胞株が、ヒトグリア細胞、不死化ヒト線維芽細胞、ヒト胚性肺線維芽細胞、ヒト単球/マクロファージ細胞、およびヒト内皮細胞からなる群より選択される、請求項１４に記載のキット。２０．ＣＭＶ感染について治療の有効性をモニターするための方法であって、（ａ）ＣＭＶに感染し、候補治療に曝された患者から得られたサンプルを、細胞に接触させる工程、ここで、該細胞は、サイトメガロウイルスプロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子で安定に形質転換されており、該プロモーターは、ＨＳＶ−１存在下で、顕著なレポーター遺伝子発現を可能にしない；および（ｂ）該患者から得られた第２のサンプルと接触させた細胞について予め決定した発現レベルに対して、該レポーター遺伝子の発現レベルを決定し、このことから該候補治療の有効性をモニターする工程、ここで、該第２のサンプルは該候補治療の前に得られるを包含する、方法。２１．薬剤耐性ＣＭＶを検出するための方法であって、（ａ）ＣＭＶに感染した患者から得られたサンプルを薬剤に曝す工程；（ｂ）該サンプルを細胞に接触させる工程、ここで、該細胞は、サイトメガロウイルスプロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子で安定に形質転換されており、該プロモーターは、ＨＳＶ−１存在下で、顕著なレポーター遺伝子発現を可能にしない；および（ｃ）該患者から得られた第２のサンプルと接触させた細胞について予め決定した発現レベルに対して、該レポーター遺伝子の発現レベルを決定し、このことから薬剤耐性ＣＭＶを同定する工程、ここで、該第２のサンプルは該薬剤に曝されないを包含する、方法。