ES2240980T3 - Adenovirus mejorado y metodos de utilizacion del mismo. - Google Patents

Abstract

SE PROPORCIONAN UN ADENOVIRUS RECOMBINANTE Y UN METODO PARA PRODUCIR EL VIRUS QUE UTILIZAN UN VECTOR DE ENLACE RECOMBINANTE QUE COMPRENDE SECUENCIA DE ADN DE ADENOVIRUS PARA LOS CISELEMENTOS 5'' Y 3'' NECESARIOS PARA REPLICACION Y ENCAPSIDACION DE VIRION EN LA AUSENCIA DE SECUENCIA QUE CODIFIQUE GENES VIRALES Y UN MINIGEN SELECCIONADO ENLAZADO AL MISMO, Y UN ADENOVIRUS AUXILIAR QUE COMPRENDE SUFICIENTES SECUENCIAS DE GEN DE ADENOVIRUS NECESARIAS PARA UNA INFECCION VIRAL PRODUCTIVA. PREFERIBLEMENTE EL GEN AUXILIAR ES DEBILITADO MEDIANTE MODIFICACIONES A SUS SECUENCIAS DE EMPAQUETAMIENTO 5'', LO CUAL FACILITA LA PURIFICACION DE LA PARTICULA VIRAL DEL VIRUS AUXILIAR.

Description

Adenovirus mejorado y métodos de utilización del mismo.

Esta invención fue apoyada por el National Institute of Health Grant No. P30 DK 47757. El Gobierno de los Estados Unidos tiene derechos sobre esta invención.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con el campo de los vectores útiles en terapia génica somática y la producción de los mismos.

Antecedentes de la invención

La terapia génica humana es una aproximación al tratamiento de enfermedades humanas que se basa en la modificación de la expresión de un gen en las células del paciente. Se ha hecho evidente durante la última década que la única barrera más sobresaliente para el éxito de la terapia génica como una estrategia para el tratamiento de enfermedades heredadas tales como el cáncer y otras disfunciones genéticas, es el desarrollo de vehículos útiles para la transferencia de genes. Los virus eucariotas han sido empleados como vehículos para terapia génica somática. Entre los vectores virales que han sido citados frecuentemente en la investigación en terapia génica se encuentran los adenovirus.

Los adenovirus son virus eucariota de ADN que pueden modificarse para liberar en forma eficiente un transgén terapéutico o indicador a una variedad de tipos de células. Los adenovirus recombinantes de los tipos 2 y 5 (Ad2 y Ad5, respectivamente), que causan enfermedad respiratoria en humanos, actualmente están siendo desarrollados para terapia génica. Tanto Ad2 como Ad5 pertenecen a una subclase de adenovirus que no está asociada con malignidad en humanos. Los adenovirus recombinantes son capaces de proveer niveles extremadamente altos de suministro de transgenes, virtualmente para todos los tipos de células, haciendo caso omiso del estado mitótico. Se pueden generar títulos altos (10^{13} unidades formadoras de placa/ml) de virus recombinante en células 293 (el equivalente del adenovirus a las líneas celulares de empaquetamiento de retrovirus) y ser críoalmacenados por largos períodos de tiempo sin pérdidas apreciables. Se ha demostrado la eficacia de este sistema para liberar un transgén terapéutico in vivo que complemente un desequilibrio genético en modelos animales con diversas enfermedades [Y. Watanabe. Artherosclerosis, 36: 261-268 (1986); K. Tanzawa y colaboradores, FEBS Letters, 118(1): 81-84 (1980); J.L. Golasten y colaboradores, New Engl. J. Med., 309(11983): 288-296 (1983); S. Ishibashi y colaboradores, J. Clin. Invest., 92: 883-893 (1993); y S. Ishibashi y colaboradores, J. Clin. Invest., 93: 1885-1893 (1994)]. En realidad, se ha aprobado el uso de un adenovirus defectuoso de replicación recombinante que codifica un cADN para el regulador transmembrana de fibrosis cística (CFTR) para ser usado en al menos dos ensayos clínicos de CF en humanos [ver, por ejemplo, J. Wilson, Nature, 365: 691-692 (21 de octubre, 1993)]. Un soporte adicional de la seguridad de los adenovirus recombinantes para terapia génica es la gran experiencia con las vacunas de adenovirus vivo en poblaciones humanas.

Los adenovirus humanos constan de un genoma bicatenario de ADN aproximadamente de 36 kb, que está dividido en 100 unidades cartográficas (m.u.), cada una de las cuales tiene una longitud de 360 bp. El ADN contiene repeticiones terminales invertidas cortas (ITR) en cada extremo del genoma que se requieren para la replicación del ADN viral. Los productos génicos se organizan en regiones tempranas (E1 hasta E4) y regiones tardías (L1 hasta L5), con base en la expresión ante y después de la iniciación de la síntesis del ADN viral [ver, por ejemplo, Horwitz, Virology, 2da edición, ed. B. N. Fields, Raven Press, Ltd. New York (1990)].

La primera generación recombinante de adenovirus de replicación deficiente que se desarrolló para terapia génica, contiene supresiones de toda la región E1a y parte de la E1b. Este virus de replicación defectuosa crece sobre un complemento de línea celular de riñón embrionario humano de adenovirus transformado que contiene un gen de adenovirus funcional E1a que provee una proteína de desempeño E1a, la célula 293 [ATCC CRL 1573]. Los virus suprimidos E1 son capaces de replicarse y de producir virus infecciosos en las células 293, que proveen productos del gen en las regiones E1a y E1b in trans. El virus resultante es capaz de infectar muchos tipos de células y puede expresar al gen introducido (dado que porta su propio promotor), pero no puede replicarse en una célula que no porte al ADN de la región E1, a menos que la célula sea infectada en un sin número muy alto de infecciones.

Sin embargo, los estudios in vivo revelaron que la expresión trasgénica en estos vectores suprimidos E1 fue transciente y estaba invariablemente asociada con el desarrollo de inflamación severa en el sitio del vector objetivo [S. Ishibashi y colaboradores, J. Clin. Invest., 93: 1885-1893 (1994); J. M. Wilson y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 85: 4421-4424 (1988); J. M. Wilson y colabordores, Clin. Bio., 3: 21-26 (1991); M. Grossman y colaboradores, Som. Cell. And Mol. Gen., 17: 601-607 (1991)]. Una explicación que ha sido propuesta para explicar este hallazgo es que los adenovirus recombinantes de primera generación, a pesar de la supresión de los genes E1, expresan bajos niveles de otras proteínas virales. Esto puede deberse a la expresión basal de los promotores virales no estimulados o a la transactivación por factores celulares. La expresión de proteínas virales conduce a respuestas celulares inmunes de las células modificadas genéticamente, resultando en su destrucción y en el reemplazo con células con contenido no transgénico.

Subsiste aún la necesidad en el estado de la técnica por el desarrollo de vectores adicionales de adenovirus construidos para terapia génica.

Resumen de la invención

En un aspecto, la invención provee los componentes de un nuevo sistema de producción de adenovirus recombinante. Un componente es un plásmido trasbordador. pAd\Delta, que comprende los elementos cis del adenovirus, necesarios para la replicación y encapsulación del virión y que se suprimen de todos los genes virales. Este vector porta un transgén seleccionado bajo el control de un promotor seleccionado y de otros componentes reguladores del plásmido/vector convencional. El otro componente es un adenovirus auxiliar que, ya sea solo o con una línea celular de empaque, suministra suficientes secuencias de genes necesarias para una infección viral productiva. En una modalidad preferida, el virus auxiliar ha sido alterado para contener modificaciones de las secuencias del gen nativo, que dirigen el empacado eficiente, con el fin de imposibilitar sustancialmente, o de "inutilizar" la función de empaquetamiento del virus auxiliar, o su habilidad para replicar.

En otro aspecto, la presente invención provee un adenovirus recombinante único, un virus Ad\Delta, producido por medio del uso de los anteriores componentes. Este virus recombinante comprende una cápside adenovírica, los elementos cis de adenovirus, necesarios para la replicación y la encapsulación del virión, pero se suprime de todos los genes virales (esto es, de todas las estructuras virales de lectura abierta). Esta partícula de virus porta un transgén seleccionado bajo el control de un promotor seleccionado, y otros componentes reguladores del vector convencional. Este virus recombinante Ad\Delta se caracteriza por un suministro del transgén de título alto a una célula huésped y la capacidad para integrar en forma estable al transgén dentro del cromosoma de la célula huésped. En una modalidad, el virus porta como su transgén a un gen indicador. Otra modalidad del virus recombinante contiene un transgén terapéutico.

En otro aspecto, la invención provee un método para producir el virus recombinante Ad\Delta anteriormente descrito por cotransfección de una línea celular (ya sea una línea celular de empaque o una línea celular no empacadora) con un vector o un plásmido trasbordador y un adenovirus auxiliar como se describió antes, en donde la célula trasfectada genera el virus Ad\Delta. El virus Ad\Delta es posteriormente aislado y purificado a partir de allí.

En aún otro aspecto adicional, la invención provee un método para el suministro de un gen seleccionado a una célula huésped para expresarse en esa célula por medio de la administración, a un paciente, de una cantidad efectiva de un virus recombinante Ad\Delta que contiene un transgén terapéutico, para tratar o corregir un desorden o enfermedad asociados genéticamente.

Otros aspectos y ventajas de la presente invención se describen además en la siguiente descripción detallada de las modalidades preferidas de la misma.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1A es una representación esquemática de la organización de los elementos funcionales principales que definen a la terminal 5' de Ad5 incluida una repetición terminal invertida (ITR) y un dominio de empaque/reforzador. También se muestran la caja TATA del promotor E1 (caja negra) y el sitio (flecha) de arranque transcripcional E1A.

La Figura 1B es un esquema expandido de la región de empaque/reforzadora de la Figura 1A, indicando los cinco dominios de empaque (PAC) (repeticiones A), I hasta V. Las flechas indican la ubicación de los iniciadores PCR referenciados en las Figuras 9A y 9B más abajo.

La Figura 2A es un esquema del vector trasbordador pAdA.CMVLacZ que contiene una 5' ITR de Ad5, seguido por un promotor/reforzador CMV, un gen LacZ, una 3' ITR de Ad5, una secuencia sobrante de plásmido de la columna vertebral del plásmido pSP72. Las enzimas de restricción endonucleasa se representan por designaciones convencionales en las construcciones del plásmido.

La Figura 2B es un esquema del vector trasbordador digerido con EcoRI para liberar al genoma modificado Ad\Delta de la columna vertebral del plásmido pSP72.

La Figura 2C es una descripción esquemática de la función del sistema del vector. En presencia de un virus auxiliar EI suprimido Ad.CbhpAP que codifica a un minigén indicador para la fosfatasa alcalina de placenta humana (hpAP), el genoma Ad\Delta.CMVLacZ se empaca dentro de las cápsides preformadas del virión, en forma distinguible de los viriones auxiliares por la presencia del gen LacZ.

Las Figuras 3A a 3F [SEQ. ID. No. 1] reportan la cadena superior de ADN del plásmido bicatenario pAd\Delta.
CMVLacZ. La secuencia complementaria puede ser fácilmente obtenida por una persona entrenada en la técnica. La secuencia incluye los siguientes componentes: 3' Ad ITR (nucleótidos 607-28 de la SEQ. ID. No. 1); el 5' Ad ITR (nucleótidos 5496-5144 de la SEQ. ID. No. 1); promotor/reforzador CMV (nucleótidos 5117-4524 de la SEQ. ID. No. 1); secuencia SD/SA (nucleótidos 4507-4376 de la SEQ. ID. No. 1); gen LacZ (nucleótidos 4320-845 de la SEQ. ID No. 1); y una secuencia poli A (nucleótidos 837-639 de la SEQ. ID. No. 1).

La Figura 4A es un esquema del vector trasbordador pAd\Deltac.CMVLacZ que contiene un Ad5' ITR y 3'ITR posicionados cabeza con cola, con un minigén LacZ-promotor/reforzador CMV inmediatamente después del 5' ITR, seguido por una columna vertebral del plásmido pSP72 (Promega). Las enzimas de restricción endonucleasa se representan por designaciones convencionales en las construcciones del plásmido.

La Figura 4B es una descripción esquemática de la función del sistema del vector de la Figura 4A. En presencia del virus auxiliar Ad.CbhpAP, la secuencia del vector circular trasbordador pAd\Deltac.CMVLacZ se empaca dentro las cabezas de los viriones, en forma distinguible de los viriones auxiliares por medio de la presencia del gen LacZ.

Las Figuras 5A a 5F (SEQ. ID. No. 2) reportan la cadena superior de ADN del vector bicatenario pAd\Deltac.CMVLacZ. La secuencia complementaria puede ser obtenida fácilmente por una persona entrenada en la técnica. La secuencia incluye los siguientes componentes: 5' Ad ITR (nucleótidos 600-958 de la SEQ. ID. No. 2); promotor/reforzador CMV (nucleótidos 969-1563 de la SEQ. ID. No. 2); secuencia SD/SA (nucleótidos 1579-1711); gen LacZ (nucleótidos 1762-5236 de la SEQ. ID. No. 2); secuencia poli A (nucleótidos 5245-5443 de la SEQ. ID. No. 2); y 3' Ad ITR (nucleótidos 16-596 de la SEQ. ID. No. 2).

La Figura 6 es un esquema del vector trasbordador pAd\Delta.CBCFTR que contiene 5' ITR de Ad5, seguido por un reforzador quimérico CMV/reforzador promotor de actina \beta, un gen CFTR, una secuencia poli A, un 3' ITR de Ad5 y una secuencia sobrante de plásmido de la columna vertebral del plásmido pSL1180 (Pharmacia). Las enzimas de restricción endonucleasa se representan por designaciones convencionales en las construcciones del plásmido.

Las Figuras 7A hasta 7H [SEQ. ID. No. 3] reportan la cadena superior de ADN del plásmido bicatenario pAd\Delta.
CBCFTR. La secuencia complementaria puede ser obtenida fácilmente por una persona entrenada en la técnica. La secuencia incluye los siguientes componentes: 5' Ad ITR (nucleótidos 9611-9254 de la SEQ. ID. No. 3); el promotor quimérico reforzador CMV/actina \beta (nucleótidos 9241-8684 de la SEQ. ID. No. 3); el gen CFTR (nucleótidos 8622-4065 de la SEQ. ID. No. 3); secuencia poli A (nucleótidos 3887-3684 de la SEQ. ID. No. 3); y 3' Ad ITR (nucleótidos 3652-3073 de la SEQ. ID. No.3). La columna vertebral del plásmido restante se obtiene de pSL1180 (Pharmacia).

La Figura 8A ilustra la generación de la secuencia terminal 5' del adenovirus que contenía los dominios PAC I y II por PCR. Ver, las flechas indicando las sondas PCR derecha e izquierda (PAC II) en la Figura 1B.

La Figura 8B ilustra la generación de la secuencia terminal 5' que contenía los dominios PAC I, II, III y IV por PCR. Ver, las flechas indicando las sondas PCR derecha e izquierda (PAC IV) en la Figura 1B.

La Figura 8C describe los productos subclonados de amplificación dentro del sitio de clonación múltiple de pAd.Link 1 (núcleo del vector IHGT) que generan pAd.PACII (dominios I y II) y pAd.PACIV (dominios I, II, III, y IV) que resultan en los virus auxiliares inutilizados Ad.PACII y Ad.PACIV con señales (PAC) modificadas de empaquetamiento.

La Figura 9A es una representación esquemática de la subclonación de un minigén indicador de fosfatasa alcalina de placenta humana que contiene al promotor/reforzador CMV cercano inmediato (CMV), cADN fosfatasa alcalina de placenta humana (hpAP), y señal de poliadenilación (pA) SV40 dentro de pAd.PACII que resulta en un vector del virus auxiliar inutilizado pAdA.PACII.CMVhpAP. Las enzimas de restricción endonucleasa se representan por designaciones convencionales en las construcciones del plásmido.

La Figura 9B es una representación esquemática de la subclonación del mismo minigén de la Figura 9A dentro de pAd.PACIV que resulta en un vector del virus auxiliar inutilizado pAdA.PACIV.CMV.hpAP.

La Figura 10 es un diagrama de flujo que resume la síntesis de un adenovirus con base en el conjugado policatión del virus auxiliar y su combinación con un vector trasbordador pAd\Delta que resulta en un nuevo complejo de partícula viral. La banda purificada de CsCl del adenovirus auxiliar reaccionó con el entrecruzador heterobifuncional sulfo-SMCC y la fibra de proteína de la cápside se marcó con la fracción maleimida nucleofílica. Los sulfhidrilos libres se introdujeron en poli-L-lisina usando clorhidrato de 2-iminotiolano y se mezclaron con el adenovirus marcado, resultando en el conjugado Ad-pLys del virus auxiliar. Se genera una única partícula con base en el adenovirus por purificación del conjugado Ad-pLys sobre un gradiente de CsCl para remover la poli-L-lisina no incorporada, seguido por una diálisis extensiva, la adición de los ADN del plásmido trasbordador a Ad-pLys y permitiendo al complejo formado por el plásmido trasbordador envuelto alrededor de Ad-pLys, que se desarrolle.

La Figura 11 es un diagrama esquemático de pCCL-DMD, que se describe en detalle en el Ejemplo 9 más abajo.

Las Figuras 12A - 12P proveen la secuencia continua de ADN de pAd\Delta.CMVmDys [SEQ. ID. No. 10].

Descripción detallada de la invención

La presente invención provee un único adenovirus recombinante capaz de liberar transgenes a células blanco, así como los componentes para la producción del único virus y los métodos para el uso del virus para tratar una variedad de desórdenes genéticos.

El virus Ad\Delta de esta invención es una partícula viral que contiene solamente los elementos cis del adenovirus, necesarios para la replicación y la encapsidación del virión (esto es, ITRs y secuencias de empacado), de lo contrario suprimidos de todos los genes adenovirus (esto es, todas las estructuras virales de lectura abierta). Este virus porta un transgén seleccionado bajo el control de un promotor seleccionado y de otros componentes reguladores convencionales, tales como una señal poli A. El virus Ad\Delta se caracteriza por la persistencia mejorada del ADN del vector en las células huésped, antigenicidad/inmunogenicidad reducidas, y en consecuencia, un rendimiento mejorado como vehículo de suministro. Una ventaja adicional de esta invención es que el virus Ad\Delta permite el empaquetamiento de transgenes muy grandes, tal como un cADN de distrofina de longitud completa para el tratamiento del agotamiento progresivo del tejido muscular característico de la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD).

Este virus recombinante nuevo se produce por el uso de un sistema de producción de un vector basado en el adenovirus, que contiene dos componentes: 1) un vector trasbordador que comprende los elementos cis del adenovirus necesarios para la replicación y la encapsidación del virión y que se suprime de todos los genes virales, dicho vector porta un minigén indicador o terapéutico y 2) un adenovirus auxiliar el cual, solo o con una línea celular de empaquetamiento, es capaz de proveer todos los productos del gen viral necesarios para una infección viral productiva cuando se co-transfecta con el vector trasbordador. Preferiblemente, el virus auxiliar se modifica de forma que no se empaca a sí mismo en forma eficiente. En esta composición, es usado deseablemente en combinación con una línea celular de empaquetamiento que expresa en forma estable los genes del adenovirus. Los métodos para producir este vector viral a partir de estos componentes incluyen tanto un medio nuevo de empaquetamiento de un vector adenoviral como del vector que contiene un transgén dentro de un virus, y un método novedoso para la separación subsiguiente del virus auxiliar a partir del virus recombinante recientemente formado.

I. El Vector Trasbordador

El vector trasbordador, referido como pAd\Delta, se compone de secuencias de adenovirus y de secuencias transgénicas, incluidas las secuencias de control reguladoras del vector.

A. Las Secuencias del Adenovirus

Las secuencias de ácido nucleico del adenovirus del vector trasbordador proporcionan las secuencias mínimas de adenovirus que permiten a una partícula viral ser producida con la ayuda de un virus auxiliar. Esas secuencias ayudan al suministro de un genoma de transgén recombinante hacia una célula blanco por medio del virus recombinante resultante.

Las secuencias de ADN de una cantidad de tipos de adenovirus se encuentran disponibles en el Banco de Genes, incluido el tipo Ad5 [Número de Acceso en el Banco de Genes No. M73260]. Las secuencias de adenovirus pueden obtenerse a partir de cualquier serotipo de adenovirus conocido, tal como los serotipos 2, 3, 4, 7, 12 y 40, que incluyen además a cualquiera de los 41 tipos humanos ya identificados [ver, por ejemplo, a Horwitz, citado arriba]. Adenovirus similares que se conoce que infectan a otros animales, pueden emplearse también en las construcciones del vector de esta invención. La selección del tipo de adenovirus no se anticipa para limitar la siguiente invención. Una variedad de cepas de adenovirus se encuentran disponibles en la American Type Culture Collection, en Rockville, Maryland, o por solicitud a varias fuentes comerciales o institucionales. En la siguiente modalidad como ejemplo, se usa un adenovirus tipo 5 (Ad5) por conveniencia.

Si embargo, es deseable obtener una variedad de vectores trasbordador pAd\Delta con base en diferentes serotipos de adenovirus humano. Se anticipa que una biblioteca de tales plásmidos y los vectores virales Ad\Delta resultantes serían útiles en un régimen terapéutico pare evadir la inmunidad celular y posiblemente la humoral, y prolongar la duración de la expresión del transgén, así como mejorar el éxito de tratamientos terapéuticos repetidos. Adicionalmente, el uso de varios serotipos se cree que produce virus recombinantes con diferentes especificidades de tejido objetivo. La ausencia de genes adenovirales en el vector viral Ad\Delta se anticipa que reduce o elimina la respuesta adversa CTL que normalmente causa destrucción de los adenovirus recombinantes suprimidos únicamente del gen E1.

Específicamente, las secuencias de ácido nucleico del adenovirus empleadas en el vector trasbordador pAd\Delta de esta invención son secuencias genómicas de adenovirus a partir de las cuales todos los genes virales se suprimen. Más específicamente, las secuencias de adenovirus empleadas son las secuencias cis-activas 5' y 3' de repetición terminal invertida (ITR) de un adenovirus (que funcionan como orígenes de la reproducción) y el dominio de empaquetamiento/reforzador 5' nativo, que contiene las secuencias necesarias para el empaquetamiento de los genomas lineares Ad y de los elementos reforzadores para el promotor E1. Estas secuencias son las secuencias necesarias para la replicación y encapsidación del virión. Ver, por ejemplo, P. Hearing y colaboradores, J. Virol., 61 (8): 2555-2558 (1987); M. Grable y P. Hearing, J. Virol., 64(5): 2047-2056 (1990); y M. Grable y P. Hearing, J. Virol., 66(2): 723-731 (1992).

De acuerdo con esta invención, la secuencia completa 5'del adenovirus que contiene la ITR 5' y la región de empaquetamiento/reforzadora pueden ser empleadas como la secuencia 5' del adenovirus en el vector trasbordador pAd\Delta. Esta secuencia (5') terminal izquierda del genoma Ad5 útil en esta invención abarca desde bp 1 hasta alrededor de 360 del genoma convencional del adenovirus, también mencionado como unidades cartográficas 0-1 del genoma viral. Esta secuencia se proporciona aquí como los nucleótidos 5496-5144 de la SEQ. ID. No 1, los nucleótidos 600-958 de la SEQ. ID. No. 2; y los nucleótidos 9611-9254 de la SEQ. ID. No. 3, y tiene desde alrededor de 353 hasta alrededor de 360 nucleótidos de longitud. Esta secuencia incluye la ITR 5' (bp 1-103 del genoma del adenovirus), y al dominio de empaquetamiento/reforzador (bp 194-358 del genoma del adenovirus). Ver, Figuras 1A, 3, 5 y 7.

Preferiblemente, esta región 5' del adenovirus nativo se emplea en el vector trasbordador en forma no modificada. Sin embargo, algunas modificaciones que incluyen supresiones, sustituciones y adiciones a esta secuencia que no efectúan en forma adversa su función biológica, pueden ser aceptables. Ver, por ejemplo, WO 93/24641, publicada el 9 de diciembre de 1993. La capacidad para modificar estas secuencias ITR está dentro de las posibilidades de una persona entrenada en la técnica. Ver, por ejemplo, textos tales como el de Sambrook y colaboradores, "Molecular Cloning. A Laboratory Manual.", 2da edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989).

Las secuencias 3' del adenovirus del vector trasbordador incluyen la secuencia ITR (3') del terminal derecho del genoma adenoviral que abarca alrededor de bp 35.353 al extremo del genoma del adenovirus, o 98,4-100 unidades cartográficas. Esta secuencia se provee aquí como los nucleótidos 607-28 de la SEQ. ID. No. 1, los nucleótidos 16-596 de la SEQ. ID No. 2; y los nucleótidos 3652-3073 de la SEQ. ID. No. 3, y generalmente es de alrededor de 580 nucleótidos de longitud. Esta secuencia completa se la emplea deseablemente como la secuencia 3' de un vector trasbordador pAd\Delta. Preferiblemente, se emplea la región 3' del adenovirus nativo en el vector trasbordador, en forma no modificada. Sin embargo, pueden ser aceptables algunas modificaciones a esta secuencia que no efectúan en forma adversa su función biológica.

Un ejemplo de un vector trasbordador pAd\Delta de esta invención, descrito más abajo y en la Figura 2A, contiene solamente aquellas secuencias del adenovirus requeridas para el empaquetamiento del ADN genómico adenoviral dentro de la cabeza cápside preformada. El vector pAd\Delta contiene secuencias Ad5 que codifican las secuencias terminales 5' y 3' (identificadas en la descripción de la Figura 3), así como las secuencias transgénicas descritas más abajo.

A partir de la información precedente, se espera que alguien entrenado en la técnica pueda emplear otras secuencias equivalentes de adenovirus para ser usadas en los vectores Ad\Delta de esta invención. Estas secuencias pueden incluir otras cepas de adenovirus, o las secuencias cis-activas anteriormente mencionadas, con modificaciones menores.

B. El Transgén

La secuencia transgénica del vector y del virus recombinante es una secuencia de ácido nucleico o una transcripción inversa de la misma, heteróloga de la secuencia del adenovirus, que codifica a un polipéptido o proteína de interés. El transgén está operativamente enlazado a los componentes reguladores en una forma que permite la trascripción del transgén.

La composición de la secuencia transgénica dependerá del uso que se le dará al virus resultante. Por ejemplo, un tipo de secuencia transgénica incluye una secuencia indicadora, que por expresión produce una señal detectable. Tales secuencias indicadoras incluyen sin limitación un cADN (LacZ) beta-galactosidasa de E. coli, un gen de fosfatasa alcalina de placenta humana y un gen de proteína fluorescente verde. Estas secuencias, cuando están asociadas con elementos reguladores que dirigen su expresión, proveen señales detectables por medios convencionales, por ejemplo, absorbancia de longitud de onda ultravioleta, cambio de color visible, etc.

Otro tipo de secuencia transgénica incluye un gen terapéutico que expresa un producto deseado del gen en una célula huésped. Estas secuencias de ácido nucleico terapéutico típicamente codifican productos para administración y expresión en un paciente in vivo o ex vivo para reemplazar o corregir un defecto genético heredado o no heredado o tratar un desorden o enfermedad epigenética. Tales genes terapéuticos que son deseables para la realización de terapia génica incluyen, sin limitación, un gen regulador normal transmembrana de la fibrosis cística (CFTR) (ver Figura 7), un gen de lipoproteína de baja densidad (LDL) [T. Yamamoto y colaboradores, Cell, 39: 27-28 (noviembre, 1984)], una secuencia cADN DMD [secuencias parciales disponibles del Banco de Genes, Accesos Nos. M36673, M36671, [A. P. Mónaco y colaboradores, Nature, 323: 646-650 (1986)] y L06900, [Roberts y colaboradores, Hum. Mutat., 2: 293-299 (1993)]] (Banco de Genes), y un número de genes que pueden ser seleccionados fácilmente por alguien entrenado en la técnica. La selección del transgén no se considera como una limitación de esta invención, y como tal selección se encuentra dentro del conocimiento de aquel entrenado en la técnica.

C. Elementos reguladores

Además de los elementos principales identificados antes para el vector trasbordador pAd\Delta, esto es, las secuencias del adenovirus y del transgén, el vector también incluye elementos reguladores convencionales necesarios para conducir la expresión del transgén en una célula transfectada con el vector pAd\Delta. Por lo tanto, el vector contiene un promotor seleccionado que se enlaza al transgén y se localiza, con el transgén, entre las secuencias del adenovirus del vector.

La selección del promotor es una materia rutinaria y no es una limitación por sí misma del vector pAd\Delta. Los promotores útiles pueden ser promotores constitutivos o promotores regulados (inducibles), que permitirán el control de la cantidad de transgén a ser expresado. Por ejemplo, un promotor deseable es aquel del citomegalovirus cercanamente inmediato al promotor/reforzador [ver, por ejemplo, Boshart y colaboradores, Cell, 41: 521-530 (1985)]. Este promotor se encuentra en los nucleótidos 5117-4524 de las SEQ. ID. No. 1, y los nucleótidos 969-1563 de la SEQ. ID. No. 2. Otro promotor es el promotor CMV reforzador/\beta-actina de pollo (nucleótidos 9241-8684 de la SEQ. ID. No. 3). Otro promotor deseable incluye, sin limitación, al virus del sarcoma de Rous, promotor/reforzador de LTR. Aún otras secuencias promotor/reforzadoras pueden ser seleccionadas por alguien entrenado en la técnica.

Los vectores trasbordadores también contendrán en forma deseable, secuencias de ácido nucleico heterólogas a las secuencias del adenovirus incluidas las secuencias que proveen las señales requeridas para una poliadenilación eficiente del transcrito y de los intrones con el donante de empalme funcional y los sitios aceptores (SD/SA). Una secuencia poli A común que se emplea en los vectores de los ejemplos de esta invención es aquella derivada del papovavirus SV-40 [ver, por ejemplo, los nucleótidos 837-639 de la SEQ. ID. No. 1; 5245-5443 de la SEQ. ID. No. 2; y 3887-3684 de la SEQ. ID. No. 3]. La secuencia poli A generalmente se inserta en el vector después de las secuencias transgénicas y antes de las secuencias del adenovirus 3'. Una secuencia común de intrón también se deriva de SV-40, y se hace referencia a ella como a la secuencia T del intrón SV-40 [ver, por ejemplo, los nucleótidos 4507-4376 de la SEQ. ID. No. 1, y 1579-1711 de la SEQ. ID. No.2]. Un vector trasbordador pAd\Delta de la presente invención puede también contener tal intrón, deseablemente localizado entre la secuencia del promotor/reforzador y el transgén. La selección de estos y otros elementos comunes del vector es convencional y muchas de tales secuencias están disponibles [ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, y las referencias citadas allí]. Ejemplos de tales secuencias reguladoras para los anteriores se proporcionan en las secuencias del plásmido de las Figuras 3, 5 y 7.

La combinación del transgén, del promotor/reforzador, y de los otros elementos del vector regulador, se la menciona aquí como un "minigén" para fácil referencia. El minigén está preferiblemente flanqueado por las secuencias cis-activas 5' y 3' del adenovirus descrito antes. Tal minigén puede tener un tamaño en el rango de varios cientos de pares de bases hasta alrededor de 30 kb debido a la ausencia de las secuencias temprana y tardía del gen del adenovirus en el vector. Por lo tanto, este sistema del vector Ad\Delta permite bastante libertad en la selección de los diferentes componentes del minigén, particularmente del transgén seleccionado, con relación al tamaño. Provistos con las enseñanzas de esta invención, el diseño de un minigén tal puede hacerse por concurrencia de las técnicas convencionales.

II. El Virus Auxiliar

Debido a la limitada cantidad de secuencia de adenovirus presente en el vector trasbordador Ad\Delta, un adenovirus auxiliar de esta invención debe, solo o en convenio con una línea celular de empaquetamiento, proveer suficientes secuencias del gen del adenovirus, necesarias para una infección viral productiva. Los virus auxiliares útiles en esta invención contienen así, secuencias seleccionadas del gen del adenovirus, y opcionalmente un segundo minigén indicador.

Normalmente, la producción de un adenovirus recombinante que utiliza un adenovirus auxiliar que contiene un complemento completo de genes adenovirales, resulta en virus recombinantes contaminados por exceso de producción del virus auxiliar. Por lo tanto, se requiere la purificación extensiva del vector viral del virus auxiliar contaminante. Sin embargo, la presente invención provee una forma para facilitar la purificación y reducir la contaminación mutilando al virus auxiliar.

Una modalidad preferida de un virus auxiliar de esta invención contiene por lo tanto tres componentes (A) modificaciones o supresiones de las secuencias del gen adenoviral nativo que dirigen el empaquetamiento eficiente, a fin de inhabilitar en forma sustancial o "inutilizar" la función de empacado del virus auxiliar o su capacidad para replicarse, (B) genes seleccionados de adenovirus y (C) un minigén indicador opcional. Esos virus auxiliares "inutilizados" pueden formarse también dentro de los conjugados policatión como se describe más abajo.

Las secuencias del adenovirus que forman el virus auxiliar pueden obtenerse de las fuentes identificadas arriba en la discusión del vector trasbordador. El uso de diferentes serotipos Ad como virus auxiliares permite la producción de virus recombinantes que contienen las secuencias del vector trasbordador \DeltaAd (serotipo 5) en una cápside formada por el otro serotipo de adenovirus. Esos virus recombinantes son deseables en el reconocimiento de diferentes tejidos, o evadiendo una respuesta inmune a las secuencias \DeltaAd que tienen una cápside serotipo 5. El uso de esos virus auxiliares diferentes serotipo Ad puede también demostrar ventajas en la producción de virus recombinante, estable y mejor empacado.

A. Las Modificaciones Mutilantes

Un virus auxiliar deseable, usado en la producción del vector adenovirus de esta invención se modifica (o se inutiliza) en su dominio de empaquetamiento/reforzador ITR 5', identificado arriba. Como se estableció antes, la región de empaquetamiento/reforzadora contiene las secuencias necesarias para el empaquetamiento de los genomas lineares de adenovirus (secuencias "PAC"). Más específicamente, esta secuencia contiene al menos siete distintos dominios aún funcionalmente redundantes que se requieren para la encapsidación eficiente del ADN viral replicado.

Dentro de un intervalo de la secuencia de nucleótidos de bp 194-358 del genoma Ad5, cinco de estas así llamadas repeticiones A o secuencias PAC están localizadas (ver Figura 1B). PAC I se localiza en bp 241-248 del genoma del adenovirus (sobre la hebra complementaria a los nucleótidos 5259-5246 de la SEQ. ID. No. 1). PAC II se localiza en bp 262-269 del genoma del adenovirus (sobre la hebra complementaria a los nucleótidos 5238-5225 de la SEQ. ID. No. 1). PAC III se localiza en bp 304-311 del genoma del adenovirus (sobre la hebra complementaria a los nucleótidos 5196-5183 de la SEQ. ID. No. 1). PAC IV se localiza en bp 314-321 del adenovirus (sobre la hebra complementaria a los nucleótidos 5186-5172 de la SEQ. ID. No. 1). PAC V se localiza en bp 339-346 del adenovirus (sobre la hebra complementaria a los nucleótidos 5171-5147 de la SEQ. ID. No. 1).

Las secuencias correspondientes pueden obtenerse de las SEQ. ID. No. 2 y 3. PAC I se localiza en los nucleótidos 837-851 de la SEQ. ID. No. 2; y sobre la hebra complementaria a los nucleótidos 9374-9360 de la SEQ. ID. No. 3. PAC II se localiza en los nucleótidos 859-863 de la SEQ. ID. No. 2; y sobre la hebra complementaria a los nucleótidos 9353-9340 de la SEQ. ID. No. 3. PAC III se localiza en los nucleótidos 901-916 de la SEQ. ID. No. 2; y sobre la hebra complementaria a los nucleótidos 9311-9298 de la SEQ. ID. No. 3. PAC IV se localiza en los nucleótidos 911-924 de la SEQ. ID. No. 2; y sobre la hebra complementaria a los nucleótidos 9301-9288 de la SEQ. ID. No. 3. PAC V se localiza en los nucleótidos 936-949 de la SEQ. ID. No. 2; y sobre la hebra complementaria a los nucleótidos 9276-9263 de la SEQ. ID. No. 3.

La Tabla 1 abajo en lista esas cinco secuencias nativas Ad5 y una secuencia PAC de consenso basada en las similitudes entre un intervalo de ocho ácidos nucleicos dentro de las cinco secuencias. La secuencia de consenso contiene dos posiciones en las cuales el ácido nucleico puede ser A o T (A/T). Las designaciones convencionales de una sola letra se usan para los ácidos nucleicos, como se conoce en el estado de la técnica.

TABLA 1 Genoma de Adenovirus

1

De acuerdo con esta invención, las mutaciones o supresiones pueden hacerse a una o más de estas secuencias PAC para generar los deseables virus auxiliares inutilizados. Un análisis de la supresión del dominio de empaquetamiento reveló una posible correlación entre la eficiencia de la encapsidación y el número de empaquetamiento de las repeticiones de A que estaban presentes en el extremo 5' del genoma. Las modificaciones de este dominio pueden incluir las secuencias 5' del adenovirus que contiene menos que todas las cinco de las secuencias PAC de la Tabla 1. Por ejemplo, solamente dos secuencias PAC pueden estar presentes en el virus inutilizado, por ejemplo, PAC I y PAC II, PAC III y PAC IV, y así sucesivamente. Las supresiones de las secuencias PAC seleccionadas pueden involucrar la supresión de secuencias contiguas y no contiguas. Por ejemplo, PAC II y PAC IV pueden ser suprimidas, saliendo PAC I, III y IV en la secuencia 5'. Aún una modificación alternativa puede ser el reemplazo de una o más de las secuencias nativas PAC con una o más repeticiones de la secuencia consenso de la Tabla 1. Alternativamente, esta región del adenovirus puede modificarse por la inserción deliberada de mutaciones que rompen una o más de las secuencias nativas PAC. Alguien entrenado en la técnica puede manipular además las secuencias PAC para lograr en forma similar el efecto de reducir la eficiencia de empaquetamiento del virus auxiliar hasta un nivel deseado.

Los virus auxiliares de los ejemplos que involucran la manipulación de las secuencias PAC descritas antes se describen en el Ejemplo 7 más abajo. En resumen, como se describe en ese ejemplo, un virus auxiliar contiene en el lugar de la región 5' ITR nativa (bp 1-360 del genoma del adenovirus), una secuencia 5' de adenovirus que se extiende entre bp 1-269 del genoma del adenovirus, que contiene solamente las secuencias 5' ITR y PAC I y PAC II, y suprime la región bp 270-360 del adenovirus.

Otra secuencia PAC modificada del virus auxiliar contiene solamente la secuencia 5' Ad5 de la ITR y PAC I hasta PAC IV (bp 1-321 de Ad), suprimiendo PAC V y otras secuencias en la región bp 322-360 de Ad.

Estos virus auxiliares modificados se caracterizan por una eficiencia reducida de la encapsidación del virus auxiliar. Estos virus auxiliares con las modificaciones específicas de las secuencias relacionadas con la eficiencia del empaquetamiento, proveen una eficiencia de empaquetamiento lo suficientemente alta para generar la producción de muchos de los virus auxiliares, pero aún lo suficientemente baja para que permitan lograr rendimientos altos de las partículas virales de transducción Ad\Delta de acuerdo con esta invención.

B. Los Genes Seleccionados de Adenovirus

Los virus auxiliares útiles en esta invención, sea que contengan o no las modificaciones "inutilizadoras" descritas antes, contienen secuencias seleccionadas del gen de adenovirus que dependen de la línea celular que se transfecta por el virus auxiliar y por el vector trasbordador. Un virus auxiliar preferido contiene una variedad de genes adenovirus además de las secuencias descritas antes.

Como ejemplo, si la línea celular empleada para producir al virus recombinante no es una línea celular de empaquetamiento, el virus auxiliar puede ser un virus Ad del tipo silvestre. Por lo tanto, el virus auxiliar suministra los genes tempranos necesarios E1, E2, E4 del adenovirus, y todos los restantes genes tardíos, intermedios, estructurales y no estructurales del genoma del adenovirus. Este virus auxiliar puede ser un virus auxiliar inutilizado por la incorporación de modificaciones en su dominio de empaquetamiento/reforzador 5' nativo.

Un virus auxiliar deseable es una replicación defectuosa y carece de toda o de una porción del gen temprano E1a, inmediatamente temprano adenoviral (que abarca desde mu 1,3 hasta 4,5) y el gen temprano E1b retrasado (que abarca desde mu 4,6 hasta 11,2) a fin de eliminar sus funciones biológicas normales. Tales virus de replicación deficiente pueden tener también modificaciones mutilantes en el dominio de empaquetamiento/reforzador. Debido a la dificultad que rodea a la remoción absoluta del adenovirus de las preparaciones de Ad\Delta que han sido enriquecidas por centrifugación en gradiente de densidad por flotación con CsCl, el uso de un auxiliar de adenovirus de replicación deficiente previene la introducción de adenovirus infeccioso para el estudio de animales in vivo. Este virus auxiliar se emplea con una línea celular de empaquetamiento que suministra las proteínas E1 deficientes, tal como la línea celular 293.

Adicionalmente, todo o una porción del gen temprano E3 postergado del adenovirus (que abarca desde mu 76,6 hasta 86,2) puede eliminarse de la secuencia del adenovirus que forma parte de los virus auxiliares útiles en esta invención, sin afectar en forma adversa la función del virus auxiliar debido a que este producto del gen no es necesario para la formación de un virus en funcionamiento.

En presencia de otras líneas celulares de empaquetamiento que sean capaces de proveer las proteínas adenovirales además del E1, el virus auxiliar puede por lo tanto ser suprimido de los genes que codifican esas proteínas adenovirales.

Tales virus auxiliares adicionalmente suprimidos también contienen en forma deseable, modificaciones mutilantes como se describió antes.

C. Un Minigén Indicador

También es deseable para el virus auxiliar que contenga un minigén indicador, en el cual el gen indicador es deseablemente diferente del transgén indicador contenido en el vector trasbordador. Se conocen varios de tales genes informadores, como se mencionó antes. La presencia de un gen indicador sobre el virus auxiliar que es diferente del gen informador sobre el pAd\Delta, permite hacer un seguimiento independiente tanto al virus recombinante Ad\Delta como al virus auxiliar. Por ejemplo, la expresión de la fosfatasa alcalina recombinante permite el seguimiento de las cantidades residuales del adenovirus contaminante, en forma independiente del LacZ recombinante expresado por un vector trasbordador pAd\Delta o un virus Ad\Delta.

D. Conjugados Policatión del Virus Auxiliar

Aún otro método para reducir la contaminación del virus auxiliar implica la formación de conjugados policatión de virus auxiliar, que pueden asociarse con un plásmido que contiene otros genes adenovirales, que no están presentes en el virus auxiliar. Los virus auxiliares descritos arriba pueden modificarse además por la concurrencia de la tecnología del conjugado polilisina-adenovirus. Ver, por ejemplo, Wu y colaboradores, J. Biol. Chem., 264: 16985-16987 (1989); y K. J. Fisher y J. M. Wilson, Biochem. J., 299: 49 (1 de abril de 1994), incorporada aquí como referencia.

Usando esta tecnología, un virus auxiliar que contiene preferiblemente los genes adenovirales tardíos, se modifica por la adición de una secuencia policatión distribuir alrededor de la cápside del virus auxiliar. Preferiblemente, el policatión es polilisina, que se pega alrededor del vector cargado negativamente para formar una carga externa positiva. Se designa entonces a un plásmido para expresar a aquellos genes adenovirales que no están presentes en el virus auxiliar, por ejemplo, los genes E1, E2 y/o E4. El plásmido asociado al conjugado del virus auxiliar a través de las cargas sobre la secuencia de polilisina. Esta modificación deseablemente también se la hace al virus auxiliar inutilizado de esta invención. Este conjugado (también llamado partícula de trans-infección) permite que los genes adicionales de adenovirus sean removidos del virus auxiliar y que estén presentes sobre un plásmido que no llega a incorporarse dentro del virus durante la producción del vector viral recombinante. Por lo tanto, se disminuye considerablemente el impacto de la contaminación.

III. Montaje del Vector Trasbordador, del Virus Auxiliar y Producción del Virus Recombinante

El material a partir del cual se derivan las secuencias usadas en el vector trasbordador pAd\Delta y los virus auxiliares, así como los diferentes componentes del vector y las secuencias empleadas en la construcción de los vectores trasbordadores, virus auxiliares, y los virus Ad\Delta de esta invención, se obtienen de fuentes comerciales o académicas con base en los materiales previamente descritos y publicados. Estos materiales pueden obtenerse también a partir de un paciente individual, o ser generados y seleccionados usando técnicas estándar de clonación molecular recombinante, conocidas y practicadas por aquellos entrenados en la técnica. Cualquier modificación de las secuencias existentes de ácido nucleico que forman los vectores y los virus, incluidas las supresiones de secuencias, las inserciones, y otras mutaciones, también se generan usando técnicas estándar.

El montaje de las secuencias seleccionadas de ADN de los adenovirus, y de los genes indicadores o de los genes terapéuticos y de otros elementos del vector dentro del vector trasbordador pAd\Delta usando técnicas convencionales, se describe en el Ejemplo 1 abajo. Tales técnicas incluyen técnicas de clonación convencionales de cADN tales como aquellas descritas en textos [Sambrook y colaboradores, citado antes], usan el traslapo de las secuencias de oligonucleótidos de los genomas de adenovirus, la reacción en cadena de la polimerasa, y cualquier método adecuado que provea la secuencia nucleótida deseada. Las técnicas empleadas de transfección estándar y de co-transfección, por ejemplo, las técnicas de transfección con CaPO_{4} usando la línea celular HEK 293. Otros métodos convencionales empleados en esta invención incluyen recombinación homóloga de los genomas virales, siembra de los virus en superficie de agar, métodos para medir la generación de señal, y similares. El montaje de cualquier vector AdA deseado o virus auxiliar de esta invención, está dentro de las destrezas de la técnica, que se basan en las enseñanzas de esta invención.

A. Vector Trasbordador

Como se describe abajo en detalle en el Ejemplo 1, y haciendo uso de la Figura 2A y de la secuencia de ADN del plásmido reportado en la Figura 3, se genera un único vector trasbordador pAd\Delta de esta invención, pAd\Delta.CMVLacZ. pAd\Delta.CMVLacZ contiene secuencias Ad5 que codifican al terminal 5' seguido por un promotor/reforzador CM, una secuencia donora de empalme/aceptora de empalme, un gen bacterial beta-galactosidasa (LacZ), una secuencia SV-40 poli A (pA), un 3' ITR de Ad5 y una secuencia del plásmido remanente de la columna vertebral del plásmido pSP72 (Promega).

Para generar el genoma Ad\Delta que se incorpora en el vector, el plásmido pAd\Delta.CMVLacZ debe digerirse con EcoRI para liberar el genoma Ad\Delta.CMVLacZ, liberando el adenovirus ITRs y haciéndolos objetivos disponibles para replicación. Por lo tanto, la producción del vector es "dependiente de restricción", esto es, requiere el rescate de la endonucleasa de restricción de la plantilla de replicación. Ver, Figura 2B.

Se diseñó un segundo tipo de plásmido pAd\Delta que ubica la secuencia terminal 3' Ad en una disposición cabeza con cola con relación a la secuencia terminal 5'. Como se describió en el Ejemplo 1 y en las Figuras 4A, y haciendo uso de la secuencia de ADN del plásmido reportado en la Figura 5, se genera una segunda secuencia única del vector Ad\Delta de esta invención, Ad\Deltac.CMVLacZ, a partir del plásmido trasbordador pAd\Deltac.CMVLacZ, que contiene una secuencia Ad5 5' ITR y una secuencia 3' ITR posicionada cabeza con cola, seguido por un reforzador/promotor CMV, una secuencia SD/SA, un gen LacZ y una secuencia pA en una columna vertebral del plásmido pSP72 (Promega). Como se describió en el Ejemplo 1B, este plásmido "independiente de restricción" permite que el genoma Ad\Delta sea replicado y rescatado de la columna vertebral del plásmido sin incluir un tratamiento con endonucleasa (ver, Figura 4B).

B. Virus Auxiliar

Como se describió en detalle en el Ejemplo 2, un E1 como ejemplo convencional suprimido el virus auxiliar adenovirus, es el virus Ad.CbhpAP, que contiene una secuencia 5' de adenovirus de mu 0-1, un minigén indicador que contiene fosfatasa alcalina de placenta humana (hpAP) bajo el control transcripcional del promotor B-actina de pollo, seguido por una secuencia poli A de SV40, seguido por secuencias de adenovirus desde 9,2 hasta 78,4 y desde 86 hasta 100. Este auxiliar que contenía supresiones desde mu 1,0 hasta 9,2 y 78,4 hasta 86, que elimina sustancialmente la región E1 y la región E3 del virus. Este virus puede ser deseablemente inutilizado de acuerdo con esta invención por modificaciones a su dominio reforzador de empaquetamiento.

Los virus auxiliares inutilizados de los ejemplos de esta invención se describe utilizando las técnicas descritas en el Ejemplo 7 y contienen las secuencias modificadas PAC 5', esto es, genoma de adenovirus bp 1-269; mu 0-0,75 o genoma de adenovirus bp 1-321; mu 0-0,89. En resumen, las secuencias 5' se modifican por PCR y se clonan por técnicas convencionales dentro de un plásmido basado en un adenovirus convencional. Se incorpora un minigén hpAP dentro del plásmido, que luego se altera por recombinación homóloga con un adenovirus dl7001 suprimido de E3 para resultar en los vectores modificados de forma que el minigén indicador es seguido sobre su extremo 3' con las secuencias de adenovirus mu 9,6 hasta 78,3 y 87 hasta 100.

La generación de un virus auxiliar de conjugado de poli-L-lisina se demostró esencialmente como se describe en detalle en el Ejemplo 5 más abajo y en la Figura 10 por acoplamiento de poli-L-lisina a la cápside del virión Ad.CbhpAP. Alternativamente, puede emplearse el mismo procedimiento con la secuencia PAC de los virus auxiliares modificados de esta invención.

C. Virus Recombinante Ad\Delta

Como se estableció antes, un vector trasbordador pAd\Delta en presencia de un virus auxiliar y/o de una línea celular de empaquetamiento, permite a las secuencias transgénicas de adenovirus en el vector trasbordador, ser replicadas y empacadas dentro de las cápsides del virión, dando como resultado el virus recombinante Ad\Delta. El método actual para producir tales virus Ad\Delta es el basado en la transfección, y se describe en detalle en el Ejemplo 3. En resumen, se usa el virus auxiliar para infectar células, tales como la línea celular humana de empaquetamiento HEK 293, que luego es transfectada con un vector trasbordador pAd\Delta que contiene un transgén seleccionado por métodos convencionales. Alrededor de 30 horas o más después de la transfección, las células se cosechan, y se prepara un extracto. El genoma viral Ad\Delta se empaca dentro de los viriones que sedimentan a una densidad más baja que el virus auxiliar en los gradientes de cesio. Por lo tanto, el virus recombinante Ad\Delta que contiene un transgén seleccionado, se separa del grueso del virus auxiliar por medio de purificación a través de ultracentrifugación por densidad de flotación en gradiente de CsCl.

El rendimiento de virus de transducción Ad\Delta depende grandemente del número de células que se transfectan con el plásmido trasbordador pAd\Delta, haciendo deseable usar un protocolo de transfección de alta eficiencia. Un método tal involucra el uso de un adenovirus auxiliar poli-L-lisinilado como se describió antes. Un plásmido trasbordador pAd\Delta que contiene al transgén deseado bajo el control de un promotor adecuado, como se describe arriba, se compleja luego directamente con la cápside del virus auxiliar cargada positivamente, lo que resulta en la formación de una partícula única de transfección que contiene al vector trasbordador pAdA y las funciones auxiliares del virus auxiliar.

El principio fundamental es que el adenovirus auxiliar recubierto con el ADN del plásmido pAd\Delta, co-transportará al ácido nucleico unido a través de la membrana celular y dentro del citoplasma, de acuerdo a su mecanismo normal de entrada a la célula. Por lo tanto, la poli-L-lisina del adenovirus auxiliar modificado asume múltiples papeles en el contexto de un complejo basado en el Ad\Delta. Primero, la fundación estructural sobre la cual el ADN del plásmido puede unirse incrementando la concentración efectiva. Segundo, la endocitosis del virus mediada por el receptor, proporciona el vehículo para la incorporación del ADN del plásmido a la célula. Tercero, La actividad endosomalítica asociada con la infección adenoviral facilita el suministro del plásmido internalizado dentro del citoplasma. Y el adenovirus contribuye a las funciones auxiliares trans sobre las cuales el adenovirus recombinante Ad\Delta depende de la replicación y el empaquetamiento de partículas virales de transducción. El procedimiento de transfección basado en Ad que utiliza un vector trasbordador pAd\Delta y un conjugado auxiliar de policatión se detalla en el Ejemplo 6. Adicionalmente, como se describió previamente, el conjugado del plásmido virus auxiliar puede ser otra forma de virus auxiliar liberado de los genes del adenovirus omitidos no presentes en el vector pAd\Delta. Tal estructura permite que el resto de los genes requeridos del adenovirus se dividan entre el plásmido y el virus auxiliar, reduciendo así la eficiencia en la auto replicación del virus auxiliar.

Un método preferido actualmente para producir el virus recombinante Ad\Delta de esta invención, implica llevar a cabo la transfección descrita anteriormente con el virus auxiliar inutilizado, o el conjugado del virus auxiliar inutilizado, como se describió antes. Un virus auxiliar "inutilizado" de esta invención, es incapaz de empacarse a sí mismo en forma eficiente, y por lo tanto permite la separación fácil del virus auxiliar del vector Ad\Delta recientemente empacado de esta invención, por medio del uso de ultracentrifugación por densidad de flotación en gradiente de CsCl, como se describe más abajo en los ejemplos.

IV. Función del Virus Recombinante Ad\Delta

Una vez que el virus Ad\Delta de esta invención se produce por cooperación del vector trasbordador y del virus auxiliar, el virus Ad\Delta puede ser destinada a, y adoptada para, una célula blanco seleccionada. La selección de una célula blanco también depende del uso del virus recombinante, esto es de si el transgén va a ser replicado o no in vitro o ex vivo para la producción en un tipo de célula deseado para el nuevo suministro dentro de un paciente, o in vivo para el suministro a un tipo de célula o tejido particulares. Las células diana pueden ser cualquier célula de mamífero (preferiblemente una célula humana). Por ejemplo, para uso in vivo, el virus recombinante puede dirigirse a cualquier tipo de célula normalmente infectada por adenovirus, dependiendo de la vía de administración, esto es, puede dirigirse, sin limitaciones a neuronas, hepatocitos, células epiteliales y similares. Las secuencias de adenovirus auxiliares suministran las secuencias necesarias para permitir la entrada del virus por el Ad\Delta.

Una vez que el virus recombinante es adoptado por una célula el transgén flanqueado del adenovirus se rescata de la columna vertebral del adenovirus por medio de la maquinaria de la célula infectada como con otros adenovirus recombinantes. Una vez desacoplado (rescatado) del genoma del virus Ad\Delta, el minigén recombinante busca un sitio de integración en la cromatina huésped y llega a integrarse allí dentro, ya sea en forma transciente o estable, proveyendo la expresión del transgén acompañante en la célula huésped.

V. Uso de los Virus Ad\Delta en Terapia Génica

Los nuevos virus recombinantes y conjugados virales de esta invención, proveen eficientes vehículos de transferencia de genes para terapia génica somática. Estos virus se preparan para contener un gen terapéutico en lugar del transgén indicador LacZ ilustrado en los virus y vectores de los ejemplos. Por medio del uso de los virus Ad\Delta que contienen transgenes terapéuticos, estos transgenes pueden ser liberados en un paciente in vivo o ex vivo para permitir la integración del gen deseado dentro de una célula blanco. Por lo tanto, estos virus pueden emplearse para corregir deficiencias genéticas o defectos. Un ejemplo de la generación de un vehículo para la transferencia del gen Ad\Delta para el tratamiento de la fibrosis cística, se describe en el Ejemplo 4 más abajo. Alguien entrenado en la técnica puede generar cualquier cantidad de otros vehículos para la transferencia de genes, incluido un transgén seleccionado para el tratamiento de otros desórdenes.

Los virus recombinantes de la presente invención pueden administrarse a un paciente, preferiblemente suspendidos en una solución biológicamente compatible o en un vehículo de suministro farmacéuticamente aceptable. Un vehículo aceptable incluye solución salina estéril. Otras soluciones isotónicas estériles acuosas y no acuosas para inyección, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas conocidas por ser portadores farmacéuticamente aceptable, y bien conocidas por aquellos entrenados en la técnica, pueden ser empleadas para este propósito.

Los virus recombinantes de esta invención pueden administrarse en cantidades suficientes para transfectar las células deseadas y proveer niveles suficientes de integración y de expresión del transgén seleccionado y permitir un beneficio terapéutico sin efectos adversos indebidos o con efectos fisiológicos médicamente aceptables que pueden ser determinados por aquellos entrenados en las artes médicas. Las vías de administración parenteral convencionales y farmacéuticamente aceptables incluyen el suministro directo al órgano objetivo, tejido o sitio de administración intranasal, intravenoso, intramuscular, subcutáneo, intradérmico y oral. Las vías de administración pueden combinarse, si se desea.

Las dosis del virus recombinante dependerán primeramente de factores tales como la condición que está siendo tratada, el gen seleccionado, la edad, el peso y la salud del paciente, pudiendo variar así entre diferentes pacientes. Una dosis terapéuticamente efectiva para humanos de los virus de la presente invención, se cree que está en el rango de alrededor de 20 hasta alrededor de 50 ml de solución salina que contiene concentraciones desde alrededor de 1 x 10^{7} hasta 1 x 10^{10} pfu/ml del virus de la presente invención. Una dosis preferida para humanos está alrededor de 20 ml de solución salina de las anteriores concentraciones. La dosis se ajustará para balancear el beneficio terapéutico contra cualquier efecto secundario. Puede hacerse seguimiento a los niveles de expresión del gen escogido para determinar la selección, ajuste o frecuencia de la administración de la dosis. Los siguientes ejemplos ilustran la construcción de los vectores trasbordadores Ad\Delta, de los virus auxiliares y de los virus recombinantes Ad\Delta de la presente invención, y el uso de los mismos en terapia génica. Estos ejemplos son solamente ilustrativos, y no limitan el alcance de la presente invención.

Ejemplo 1 Producción de los vectores trasbordadores pAd\Delta.CMVLacZ y pAd\Deltac.CMVLacZ A. pAd\Delta.CMVLacZ

Se modificó una secuencia Ad5 de adenovirus humano para contener una supresión en la región E1a [1 a 9.2 unidades cartográficas], que seguía inmediatamente a la región Ad 5' (bp 1-360) (ilustrada en las Figuras 1A). Por lo tanto, el plásmido contiene la secuencia 5' ITR (bp 1-103), las secuencias nativas de empaquetamiento/del reforzador y la caja TATA para la región E1a (bp 104-360). Se introdujo un minigén que contiene al reforzador/promotor inmediato temprano del CMV, una secuencia SD/SA, un gen citoplasmático lacZ, y un poli A SV40 (pA), en el sitio de la supresión E1a. Esta construcción fue modificada además de forma tal que el minigén es seguido por las secuencias 3' ITR (bp 35.353 hasta el final). Las secuencias de ADN para estos componentes se proporcionan en la Figura 3 y en la SEQ. ID No. 1 (ver también la breve descripción de esta figura).

Esta construcción fue clonada entonces por técnicas convencionales dentro de la columna vertebral de un vector pSP72 (Promega) para hacer al vector trasbordador circular pAd\DeltaCMVLacZ. Ver el esquema de la Figura 2A. Esta construcción fue modificada genéticamente con los sitios EcoRI flanqueando las secuencias 5' y 3' Ad5 ITR. pAd\Delta.CMVLacZ fue sometida entonces a digestión enzimática con EcoRI, liberando un fragmento linear del vector abarcando el extremo terminal de la secuencia Ad 5' ITR a través del extremo terminal de la secuencia 3' ITR de la columna vertebral del plásmido. Ver Figura 2B.

B. pAd\Deltac.CMVLacZ

El vector trasbordador pAd\Deltac.CMVLacZ (Figuras 4ª y 5) se construyó usando una columna vertebral de pSP72 (Promega) de tal manera que los Ad5 5' ITR y 3' ITR estuvieran posicionados cabeza con cola. La organización de los Ad5 ITR se basó en los reportes que sugieren que los genomas Ad circulares que tienen los extremos terminales fusionados juntos cabeza con cola son infecciosos hasta niveles comparables con los genomas Ad lineares. Un minigén que codifica al reforzador CMV, una secuencia SD/SA, el gen LacZ, y la secuencia poli A se insertaron inmediatamente enseguida de 5' ITR. La secuencia de ADN del plásmido resultante y las secuencias para los componentes individuales se reportan en la Figura 5 y la SEQ. ID. No. 2 (ver también, la breve descripción de la Figura 5). Este plásmido no requiere digestión enzimática previa a su uso para producir la partícula viral (ver el Ejemplo 3). Este vector fue diseñado para permitir la producción independiente de restricción de los vectores Ad\Delta LacZ.

Ejemplo 2 Construcción de un Virus Auxiliar

El virus auxiliar Ad.CbhpAP [K. Kozarsky y colaboradores, Som. Cell Mol. Genet, 19(5): 449-458 (1993)] es una replicación deficiente de adenovirus que contiene un minigén de fosfatasa alcalina. Su construcción involucró técnicas de clonación convencional y recombinación homóloga. El sustrato ADN del adenovirus se extrajo a partir de los viriones d17001 purificados de CsCl, una variante Ad5 (serotipo del subgrupo C) que porta una supresión de 3 kb entre mu 78,4 hasta 86 en la región E3 no esencial (proporcionada por el Dr. William Wold, Washington University St. Louis, Missouri). El ADN viral se preparó por cotransfección por medio de digestión con CLAI (bp posición 917 del adenovirus genómico) que remueve el brazo izquierdo del genoma que abarca a las unidades cartográficas del adenovirus 0-2,5. Ver el diagrama inferior de la Figura 1B.

Se diseñó un vector de clonación parental, pAd.BgIII. Éste contiene dos segmentos del genoma Ad5 de tipo silvestre (esto es, unidades cartográficas 0-1 y 9-16,1) separados por un único sitio de clonación BgIII por inserción de las secuencias heterólogas. Las secuencias Ad5 pérdidas entre los dos dominios (bp 361-3327 del genoma del adenovirus) resultan en la supresión de E1a y la mayoría de E1b después de la recombinación con el ADN viral.

Se diseñó un minigén recombinante hpAp y se insertó dentro del sitio BgIII de pAd.BgIII para generar el plásmido complementario, pAdCBhpAP. La disposición lineal de este minigén incluye:

(a)

al promotor de \beta-actina citoplasmática de pollo [nucleótidos +1 hasta + 275 como se describe en T.A. Kost y colaboradores, Nucl. Acids Res., 11 (23): 8287 (1983); nucleótidos 9241-8684 de la Figura 7];

(b)

un intrón SV40 (por ejemplo, nucleótidos 1579-1711 de la SEQ. ID No. 2),

(c)

la secuencia para la fosfatasa alcalina placentaria humana (disponible en el Banco de Genes) y

(d)

una señal de poliadenilación SV40 (un fragmento de restricción Bam HI-BclI 237 que contiene señales de escisión/poli A tanto de las unidades de trascripción temprana como tardía; por ejemplo, los nucleótidos 837-639 de la SEQ. ID. No. 1).

El plásmido complementario resultante, pAdCBhpAP, contenía una copia única del minigén recombinante hpAP flanqueado por las coordenadas 0-1 del adenovirus por un lado, y 9,2-16,1 por el otro.

El ADN del plásmido fue linearizado usando un sitio único NheI enseguida 5' a la unidad cartográfica cero (0) del adenovirus y el sustrato del adenovirus anteriormente identificado, y los ADN del plásmido complementario fueron transfectados a células 293 [ATCC CRL 1573] usando un procedimiento estándar de transfección de fosfato de calcio [ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, citado antes]. El resultado final de la recombinación homóloga que involucra secuencias que cartografían al adenovirus, unidades cartográficas 9-16.1 es un virus auxiliar Ad.CbhpAP híbrido que contiene unidades cartográficas del adenovirus 0-1, y en lugar de las regiones de codificación E1a y E1b del sustrato de adenovirus d17001, está el minigén hpAP del plásmido, seguido por las secuencias AD 9 a 100, con una supresión en las regiones E3 (78,4-86 mu).

Ejemplo 3 Producción del Virus Recombinante Ad\Delta

Los virus recombinantes Ad\Delta de esta invención se generan por cotransfección de un vector trasbordador con el virus auxiliar en una línea celular seleccionada de empaquetamiento o no empaquetamiento.

Como se describe más abajo en detalle, el fragmento linear proveído en el Ejemplo 1A, o el genoma circular Ad\Delta portando al LacZ del Ejemplo 1B, es empacado dentro del virus auxiliar Ad.CbhpAP (Ejemplo 2) usando técnicas convencionales, que proporcionan una cabeza de cápside vacía, como se ilustra en la Figura 2C. Aquellas partículas de virus que han sido exitosamente adoptadas por el genoma trasbordador pAd dentro de la cabeza del cápside, puede distinguirse de aquellas que contienen al gen hpAP en virtud de la expresión diferencial de LacZ y hpAP.

Más detalladamente, las células 293 (4 x 10^{7} pfu células 293/150 mm de plato) fueron sembradas e infectadas con el virus auxiliar Ad.CbhpAP (producidas como se describió en el Ejemplo 2) en un MOI de 5 en 20 ml DMEM/suero fetal bovino al 2% (FBS).Este marcador auxiliar especifico es crítico para hacer seguimiento al nivel de contaminación del virus auxiliar en preparaciones Ad\Delta antes y después de la purificación. El virus auxiliar proporciona en trans, las funciones auxiliares necesarias para la síntesis y empaquetamiento del genoma Ad\DeltaCMVLacZ.

Dos horas después de la infección, usando ya sea el vector trasbordador dependiente de restricción, o el vector trasbordador independiente de restricción, se añadió a las células el plásmido pAd\Delta.CMVLacZ (digerido con EcoRI) o ADN pAd\Deltac.CMVLacZ, cada uno portando un minigén LacZ, por medio de un precipitado de fosfato de calcio (2,5 ml de un coctel de transfección de fosfato de calcio que contiene 50 \mug del ADN del plásmido).

Treinta a cuarenta horas después de la transfección las células fueron cosechadas suspendidas en Tris-Cl 10 mM (pH 8,0) (0,5 ml/placa de 150 mm) y congeladas a -80ºC. Las suspensiones de células congeladas fueron sometidas a tres rondas de ciclos de congelación (etanol-hielo seco) -descongelación (37ºC) para liberar las cápsides del virión. Los restos de las células se removieron por centrifugación (5.000 x g durante 10 minutos) y el sobrenadante clarificado fue aplicado a un gradiente de CsCl para separar el virus recombinante del virus auxiliar como sigue.

Los sobrenadantes (10 ml) aplicados al gradiente discontinuo de CsCl (compuesto de volúmenes iguales de CsCl de 1,2 g/ml, 1,36 g/ml, y 1,45 g/ml de Tris-Cl 10 mM (pH 8,0)) fueron centrifugados durante ocho horas a 72.128 x g, dando como resultado la separación del virus auxiliar infeccioso de los viriones formados en forma incompleta. Las fracciones fueron recogidas de la zona de interfase entre el auxiliar y los componentes de la superficie y analizados por hibridación de transferencia Southern, o por la presencia de partículas de transducción LacZ. Para el análisis funcional fueron añadidas alícuotas (2,0 ml de cada muestra) de las mismas fracciones a mono capas de células 293 (en pozos de 35 mm) y se determinó la expresión de \beta-galactosidasa recombinante 24 horas después. Más específicamente, las monocapas fueron cosechadas, suspendidas en 0,3 ml de solución amortiguadora de Tris-Cl 10 mM (pH 8,0), y un extracto preparado por tres rondas de ciclos de congelación-descongelación. Los residuos celulares fueron removidos por centrifugación y el sobrenadante fue analizado para la actividad (LacZ) de \beta-galactosidasa de acuerdo al procedimiento descrito en J. Price y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84: 156-160 (1987). La actividad especifica (miliunidades de \beta-galactosidasa/mg de proteína o enzimas indicadoras) fue medida a partir de las células indicadoras. Para los virus recombinantes, la actividad específica fue 116.

Las fracciones con actividad de \beta-galactosidasa de gradiente discontinuo fueron sedimentadas a través de un gradiente de cesio en equilibrio para enriquecer además la preparación para el virus Ad\Delta. Se generó un gradiente linear en el área del virus recombinante abarcando densidades desde 1,29 hasta 1,34 gm/ml. Un pico agudo del virus recombinante, detectado con la apariencia de actividad \beta-gal en células 293 infectadas, eluyó entre 1,31 y 1,33 gm/dl. Este pico de virus recombinante fue localizado entre dos picos de absorción principales A_{260} nm y, en un área del gradiente donde el virus auxiliar fue disminuyendo precipitadamente. El equilibrio del gradiente de sedimentación logró otra purificación 102 a 103 veces del virus recombinante a partir del virus auxiliar. El rendimiento de virus recombinante Ad\Delta.CMVLacZ recuperado de una preparación de 50 placas después de 2 sedimentaciones, se encontró en el rango de 107 a 108 partículas transductoras.

El análisis de los lisados de células transfectadas con el vector recombinante e infectadas con auxiliar reveló viriones capaces de transducir al minigén recombinante contenido dentro del vector. Sometiendo las alícuotas de las fracciones al análisis Southern usando sondas específicas del virus recombinante o del virus auxiliar, reveló el empaquetamiento de múltiples formas moleculares de secuencias derivadas del vector. La forma predominante del genoma viral suprimido era del tamaño (\sim5,5 kb) del correspondiente monómero de ADN bicatenario (Ad\Delta.CMVLacZ) con especies discretas menos abundantes pero de peso molecular mayor (\sim10 kb y \sim15 kb) presentes también. La longitud completa del virus auxiliar es 35 kb. De forma muy importante, el pico de actividad de transducción del vector corresponde con la forma del peso molecular más alto del virus suprimido. Estos resultados confirman la hipótesis de que los ITR y las secuencias de empaquetamiento contiguas son los únicos elementos necesarios para incorporación dentro de los viriones. Un reordenamiento aparentemente ordenado o preferido del genoma del monómero Ad recombinante conduce a una molécula biológicamente más activa. El hecho de que especies moleculares mayores del genoma suprimido son 2x y 3x veces mayores que el genoma monómero del virus suprimido, sugiere que el reordenamiento puede involucrar duplicación secuencial del genoma original.

Estos mismos procedimientos pueden adaptarse para la producción de un virus recombinante Ad\Delta, usando un virus auxiliar inutilizado, o un conjugado del virus auxiliar como se describió anteriormente.

Ejemplo 4 Virus Recombinante Ad\Delta que Contiene un Minigén Terapéutico

Para analizar la versatilidad del sistema del virus recombinante Ad\Delta, el minigén indicador LacZ obtenido a partir de pAd\Delta.CMVLacZ fue el casete reemplazado con un minigén terapéutico que codifica a CFTR.

El minigén contenía cADN CFTR humano [Riordan y colaboradores, Science, 245: 1066-1073 (1989); nucleótidos 8622-4065 de la SEQ. ID. No. 3] bajo el control transcripcional de un elemento promotor quimérico CMV reforzador/\beta-actina de pollo (nucleótidos +1 hasta +275 como se describió en T.A. Kost y colaboradores, Nucl. Acids Res., 11(23):8287 (1983); nucleótidos 9241-8684 de la SEQ.ID. No. 3, Figura 7); y seguido por una secuencia poli A SV-40 (nucleótidos 3887-3684 de la SEQ. ID. No. 3, Figura 7).

El minigén CFTR fue insertado dentro del sitio de supresión E1 de un virus Ad5 (llamado pAd.E1\Delta) que contiene una supresión en E1a de mu 1-9,2 y una supresión en E3 de mu 78,4-86.

El vector trasbordador resultante llamado pAd\Delta.CBCFTR (ver las Figuras 6 y las secuencia de ADN de la Figura 7 [SEQ. ID. No. 3]) usó los mismos Ad ITR de pAd\Delta.CMVLacZ, pero las secuencias Ad5 terminadas con los sitios Nhel en vez de EcoRI. Por lo tanto, la liberación del minigén del plásmido fue consumada por digestión con Nhel.

Se empleó el sistema de producción del vector descrito en el Ejemplo 3, usando el virus auxiliar Ad.CBhpAP (Ejemplo 2). Las monocapas de células 293 que crecieron hasta una confluencia del 80-90% en placas de cultivo de 150 mm, fueron infectadas con el virus auxiliar en un MOI de 5. Las infecciones se hicieron en DMEM suplementado con FBS al 2% en placas de 150 mm con 20 ml de medio. Dos horas después de la infección, se añadieron 50 \mug de ADN de plásmido en 2,5 ml de un cóctel de transfección a cada placa y distribuidos igualmente.

El suministro del plásmido pAd\Delta.CBCFTR las células 293 fue mediado por la formación de un precipitado de fosfato de calcio, y el virus Ad\Delta.CBCFTR resuelto del virus auxiliar Ad.CBhpAP por ultracentrifugación a través de densidad de flotación en gradiente de CsCl como sigue:

Las células fueron dejadas en esta condición durante 10-14 horas, después de las cuales el medio de infección/transfección fue reemplazado con 20 ml de DMEM/FBS al 2% fresco. Aproximadamente 30 horas después de la transfección, las células fueron cosechadas, suspendidas en solución amortiguadora Tris-Cl 10 mM (pH 8,0) (0,5 ml/placa 150 mm), y almacenadas a -80ºC.

Las suspensiones de células congeladas fueron lisadas en tres rondas secuenciales de congelación(etanol-hielo seco)-descongelación (37ºC). Los restos de las células se removieron por centrifugación (5.000 x g durante 10 minutos) y 10 ml de extracto clarificado quedaron sobre una capa del gradiente con CsCl compuestos de tres hileras de 9,0 ml con densidades de 1,45 g/ml, 1,36 g/ml y 1,20 g/ml de CsCl en solución amortiguadora Tris-Cl 10 mM (pH 8,0). La centrifugación se realizó a 20,000 rpm en un rotor Beckman SW-28 durante 8 horas a 4ºC. Las fracciones (1,0 ml) se recolectaron del fondo del tubo de la centrífuga y se analizaron los vectores de transducción r\DeltaAd. Las fracciones de los picos se combinaron y se asociaron hasta el equilibrio. Las fracciones que contenían viriones de transducción fueron dializadas contra HEPES 20 mM (pH 7,8)/NaCl 150 mM (HBS) y se almacenaron congeladas a -80ºC en presencia de glicerol al 10% o como un patrón liquido a -20ºC (HBS + glicerol al 40%).

A las fracciones que se recolectaron después de ultracentrifugación se les analizó su expresión transgénica y el ADN del vector. Para los vectores lacZ\DeltarAd, se añadieron alícuotas de 2 \mul a monocapas de células 293 sembradas en pozos de cultivo de 35 mm. Veinticuatro horas después las células fueron cosechadas, suspendidas en 0,3 ml de solución amortiguadora Tris-Cl 10 mM (pH 8,0), y lisadas en tres rondas de congelación-descongelación. Los restos de las células se removieron por centrifugación (15.000 x g durante 10 minutos) y analizada su proteína total [Bradford, (1976)] y la actividad de \beta-galactosidasa [Sambrook y colaboradores, (1989)] usando ONPG (o-Nitrofenil \beta-D-galactopiranosido) como sustrato.

La expresión de la proteína CFTR del vector Ad\Delta.CBCFTR se determinó por localización con inmunofluorescencia. Las alícuotas de Ad\Delta.CBCFTR, enriquecidas por 2 rondas de ultracentrifugación e intercambiadas a solución amortiguadora de almacenamiento HBS, fueron añadidas a cultivos primarios d células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas de los pulmones de receptores de trasplantes CF. Veinticuatro horas después de la adición del vector, las células fueron cosechadas y fijadas a portaobjetos de vidrio usando fuerza centrífuga (Cytospin 3, Shandon Scientific Limited). Las células fueron fijadas con paraformaldehído al 3% preparado en forma fresca en PBS (KH_{2}PO_{4} 1,4 mM, Na_{2}HPO_{4} 4,3 mM, KCl 2,7 mM, y NaCl 137 mM) durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT), lavadas dos veces en PBS, y permeabilizadas con NP-40 al 0,05% durante 10 minutos a RT. El procedimiento de inmunofluorescencia comenzó con una etapa de bloqueo en suero de cabra al 10% (PBS/GS) durante 1 hora a RT, seguido por enlazamiento al anticuerpo monoclonal primario CFTR (dominio específico R) antihumano de ratón (Genzyme) diluida 1:500 en PBS/GS durante 2 horas a RT. Las células fueron lavadas extensivamente en PBS/GS e incubadas durante 1 hora a RT con anticuerpo conjugado con FITC IgG (H+L) antirratón de asno (Jackson ImmunoResearch Laboratories) diluido 1:100 en PBS/GS.

Para el análisis Southern del ADN del vector, se tomaron alícuotas de 5 \mul directamente de las fracciones CsCl e incubadas con 20 \mul de solución amortiguadora para digestión del cápside (Tris-Cl 50 mM, pH 8,0; EDTA 1,0 mM, pH 8,0; SDS al 0,5%, y Proteinasa K 1,0 mg/ml) a 50ºC durante 1 hora. A las reacciones se les permitió enfriarse hasta RT, se les añadió una carga de colorante, y se hizo una electroforesis a través de gel de agarosa al 1,2%. Los ADN que se resolvieron se procesaron por electroforesis sobre una membrana de nylon (Hybond-N) y se hibridaron con un fragmento de restricción marcado como 32-P. Las manchas se analizaron por autoradiografia o se escaneó sobre un Phosphorimager 445 SI (Molecular Dynamics).

Los resultados que se obtuvieron del análisis de transferencia Southern de las fracciones del gradiente revelaron una banda viral clara que migró más rápidamente que el ADN del Ad.CBhpAP auxiliar. Los títulos virales más altos se cartografiaron hasta las fracciones 3 y 4. La cuantificación de las bandas en la fracción 4 indicó que el título de Ad.CBhpAP era aproximadamente 1,5 veces mayor que el de Ad\Delta.CBCFTR. Sin embargo, si la diferencia en tamaño entre los 2 virus se pondera (Ad.CBhpAP=35 kb; Ad\Delta.CBCFTR=6,2 kb), el título viral (donde 1 partícula=1 molécula de ADN) de Ad\DeltaCB.CFTR es al menos 4 veces más grande que el título viral de Ad.CBhpAP.

Mientras que el análisis de transferencia Southern de las fracciones del gradiente fueron útiles para mostrar la producción de las partículas virales Ad\Delta, también demostró la utilidad de la ultracentrifugación para la purificación de los virus Ad\Delta. Considerando lo reciente de éstas, tanto los virus de transducción LacZ como CFTR ubicados en bandas en el CsCl con una densidad intermedia entre los viriones auxiliares de adenovirus infeccioso (1,34 g/ml)y las cápsides incompletamente formadas (1,31 g/ml). La menor densidad relativa del virus auxiliar probablemente es debida al genoma más pequeño transportado por los virus Ad\Delta. Esto sugiere además cambios en el tamaño del virus que influyen en la densidad y en la purificación de los virus Ad\Delta. Con todo, la capacidad para separa los virus Ad\Delta de los virus auxiliares es una observación importante y sugiere que puede lograrse un purificación adicional por rondas sucesivas de bandeado a través del CsCl.

Este virus recombinante es útil en terapia génica solo, o preferiblemente, en la forma de un conjugado preparado como se describe aquí.

Ejemplo 5 Corrección del Defecto Genético en Células Epiteliales CF de las Vías Aéreas con Ad\DeltaCB.CFTR

El tratamiento de la fibrosis cística, utilizando el virus recombinante proporcionado antes, es particularmente adecuado para terapia génica in vivo dirigida al pulmón. Las células epiteliales de las vías aéreas son los objetivos más deseables para transferencia génica, debido a que las complicaciones pulmonares del CF son usualmente su limitación más mórbidas y de vida.

El virus recombinante Ad\DeltaCB.CFTR fue fraccionado sobre los gradientes secuenciales en CsCl, y las fracciones que contienen las secuencias CFTR, y que migran entre el adenovirus y las fracciones de los componentes superiores descritas antes, fueron usadas par infectar cultivos primarios de células epiteliales humanas de las vías aéreas derivadas de los pulmones de un paciente CF. Los cultivos fueron posteriormente analizados por la expresión de la proteína CFTR, por medio de inmunocitoquímica. La detección por inmunofluorescencia con anticuerpo CFTR (dominio específico R) antihumano de ratón, se realizó 24 horas después de la adición del virus recombinante. El análisis de células CF infectadas en forma simulada falló en revelar un enlazamiento significativo con el anticuerpo CFTR de dominio específico R. Los cultivos primarios de epitelio de las vías aéreas expuestos al virus recombinante, demostraron altos niveles de proteína CFTR en 10-20% de las células.

Por lo tanto, el virus recombinante de la invención que contiene al gen CFTR, puede ser suministrado directamente dentro de las vías aéreas, por ejemplo, por formulación del virus anterior dentro de una preparación que puede ser inhalada. Por ejemplo, el virus recombinante o el conjugado de la invención que contienen al gen CFTR, se suspenden en cloruro de sodio 0,25 molar. El virus o el conjugado son adoptados por las células de las vías respiratorias y el gen se expresa.

Alternativamente, el virus o los conjugados de la invención pueden suministrase por otros medios adecuados, incluida una inyección dirigida al sitio, del virus de apoyo del gen CFTR. En el caso del suministro del gen CFTR, las soluciones preferidas para la instilación bronquial son las soluciones salinas estériles que se encuentran dentro del rango de alrededor de 1 x 10^{7} hasta 1 x 10^{10} pfu/ml, más particularmente, en el rango de alrededor de 1 x 10^{8} hasta 1 x 10^{9} pfu/ml del virus de la presente invención.

Otros métodos adecuados para el tratamiento de la fibrosis cística por medio del uso de virus recombinantes para terapia génica de esta invención, pueden obtenerse a partir de la presentación en el estado de la técnica de otros tipos de vectores para terapia génica por CF. Ver, por ejemplo, la patente US No. 5.240.846, incorporada aquí para referencia.

Ejemplo 6 Síntesis del Conjugado del Virus Auxiliar Policatión

Otra versión del virus auxiliar de esta invención es un conjugado de polilisina que permite al plásmido trasbordador pAd\Delta acomplejarse directamente con la cápside del virus auxiliar. Este conjugado permite un suministro eficiente del vector trasbordador pAd\Delta del plásmido trasbordador en tándem con el virus auxiliar, eliminando así la necesidad de una etapa de transfección separada. Ver, la Figura 10 para una reseña diagramática de esta construcción. Alternativamente, tal conjugado con un plásmido que suministra algunos genes Ad y el auxiliar que suministra los genes necesarios restantes para la producción del vector viral Ad\Delta provee una nueva forma para reducir la contaminación del virus auxiliar, como se discutió antes.

Los patrones purificados de expansión a gran escala de Ad.CBhpAP fueron modificados por acoplamiento de poli-L-lisina con la cápside del virión, esencialmente como lo describieron K. J. Fisher y J. M. Wilson, Biochem. J., 299: 49-58 (1994), resultando en un conjugado de Ad.CBhpAP-(Lys)_{n}. El procedimiento involucra tres etapas.

Primero, el virus auxiliar Ad.CBhpAP purificado de la banda de CsCl, reaccionó con el entrecruzador heterobifuncional sulfo-SMCC [sulfo-(N-succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato] (Pierce). La reacción de conjugación, que contenía 0,5 mg (375 nmol) de sulfo-SMCC y 6 x 10^{12} A_{260} de partículas de virus auxiliar en 3,0 ml de HBS, se incubó a 30ºC durante 45 minutos con agitación suave constante. Esta etapa involucró la formación de un enlace de péptido entre el éster activo N-hidroxisuccinimida (NHS) de sulfo-SMCC y una amina libre (por ejemplo, lisina) aportada por una secuencia de proteína de adenovirus (proteína de cápside) en el vector, produciendo una partícula viral activada de maleimida. El adenovirus activado que se muestra en la Figura 10, tiene la fibra de la proteína de la cápside marcada con la fracción nucleofílica de maleimida. En la práctica, otros polipéptidos de la cápside incluyendo también al hexon y a la base pentón como objetivos.

EL entrecruzador no incorporado que no reaccionó se removió por filtración a través de gel sobre una columna Bio-Gel P-6DG de 1 cm x 15 cm (BioRad Laboratories) equilibrada con solución amortiguadora Tris/HCl 50 mM, pH 7,0, y NaCl 150 mM. Las fracciones del pico A_{260} que contenían virus auxiliar activado con maleimina se combinaron y se colocaron sobre hielo.

Segundo, la poli-L-lisina de una masa molecular de 58 kDa con 10 mg/ml en solución amortiguadora de trietanolamina 50 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM y EDTA 1 mM se tioló con 2-iminotiolano/HCl (Reactivo de Traut; Pierce) en una relación molar de 2 moles-SH/mol de polilisina bajo atmósfera de N_{2}; el tioimidato cíclico reacciona con las aminas primarias de poli(L-lisina) dando como resultado un policatión tiolado. Después de 45 minutos de incubación a temperatura ambiente la reacción se aplicó a una columna Bio-Gel P6DG de 1 cm x 15 cm equilibrada con solución amortiguadora Tris/HCl 50 mM (pH 7,0), NaCl 150 mM y EDTA 2 mM para remover el Reactivo de Traut no incorporado.

La cuantificación de los grupos tiol libres fue acompañada con el reactivo de Ellman [5,5'-ditio-bis-(2-ácido nitrobenzóico)] revelando aproximadamente 3-4 moles de -SH/mol de poli(L-lisina). La reacción de acoplamiento se inició por la adición de 1 x 10^{12} A_{260} partículas de virus auxiliar activado por maleimida de poli(L-lisina) tiolada e incubación de la mezcla sobre hielo a 4ºC durante 15 horas bajo atmósfera de argón. Se añadió 2-mercaptoetilamina al completarse la reacción y se realizó la incubación a temperatura ambiente durante 20 minutos para bloquear los sitios de maleimida que no reaccionaron.

Los conjugados de polilisina-virus, Ad.CPAP-p(Lys)_{n}, se purificaron a partir de la poli(L-lisina) no conjugada por ultracentrifugación a través de un gradiente por etapas de CsCl con una composición inicial de volúmenes iguales de 1,45 g/ml (etapa del fondo) y 1,2 g/ml (etapa superior) de CsCl en solución amortiguadora Tris/HCl 10 mM (pH 8,0). La centrifugación se realizó a 90.000 g durante 2 horas a 5ºC. El producto final se dializó contra solución amortiguadora Hepes 20 mM (pH 7,8) que contenía NaCl 150 mM (HBS).

Ejemplo 7 Formación de Ad\Delta/auxiliar-Partícula Viral pLys

La formación de la partícula Ad.CBhpAP-pLys/pAd\Delta.CMVLacZ se inicia por la adición de 20 \mug los ADN del plásmido pAd\Delta.CMVLacZ a 1,2 x 10^{12} A_{260} partículas de Ad.CBhpAP-pLys en un volumen final de 0,2 ml de DMEM y permitiendo al complejo desarrollarse a temperatura ambiente entre 10-15 minutos. Esta relación representa típicamente la capacidad de enlazamiento del ADN del plásmido de un lote estándar de conjugado de adenovirus-pLys y da los niveles más altos de expresión transgénica del plásmido.

La partícula resultante de la trans-infección se transfecta sobre células 293 (4 x 10^{7} células sembradas sobre una placa de 150 mm). Treinta horas después de la transfección, las partículas se recuperan y se someten a una técnica de congelación/descongelación para obtener un extracto. El extracto se purifica sobre un gradiente en etapas de CsCl con gradientes de 1,20 g/ml, 1,36 g/ml y 1,45 g/ml. Después de centrifugación a 90.000 x g durante 8 horas, los vectores Ad\Delta se obtuvieron a partir de una fracción bajo los componentes superiores que se identificaron por la presencia de LacZ, y el virus auxiliar se obtuvo a partir de una fracción más pequeña y más densa, que se identificó por la presencia de hpAP.

Ejemplo 8 Construcción de Virus Auxiliares Modificados con Secuencias de Empaquetamiento Inutilizadas (PAC)

Este ejemplo se refiere a las Figuras 9A hasta 9C, 10A y 10B en el diseño de virus auxiliares modificados de esta invención.

Las secuencias del terminal 5' Ad5 que contenían dominios PAC I y II (Figura 8A) o dominios PAC I, II, III y IV (Figura 8B) se generaron por PCR a partir del genoma 5' Ad5 del tipo silvestre descrito en la Figura 1B usando los clones PCR indicados por las flechas en la Figura 1B. Las secuencias de los productos resultantes de la amplificación (Figuras 8A y 8B) difirieron del genoma Ad5 de tipo silvestre en el número de repeticiones A transportadas por el extremo izquierdo (5').

Como se describió en la Figura 8C, estos productos de amplificación fueron subclonados dentro del sitio de clonación múltiple de pAd.Link.1 (IHGT Centro del Vector). pAd.Link.1 es un adenovirus basado en el plásmido que contiene al adenovirus m.u. 9,6 hasta 16,1. La inserción de las regiones PAC modificadas dentro de pAd.Link.1 generó dos vectores pAd.PACII (que contienen dominios PAC I y II) y pAd.PACIV (que contienen dominios PAC I, II, III y IV).

Después de eso, como se describe en las Figuras 10A y 10B, para cada uno de esos plásmidos, un minigén indicador de fosfatasa alcalina de placenta humana que contiene al promotor/reforzador CMV temprano inmediato (CMV), cADN de fosfatasa alcalina de placenta humana (hpAP), y una señal de poliadenilación SV40 8pA), se subclonaron dentro de cada vector PAC, generando pAd.PACII.CMVhpAP y pAd.PACIV.CMVhpAP, respectivamente.

Esos plásmidos fueron usados entonces como sustratos para recombinación homóloga con virus dI7001, descritos arriba, por cotransfección dentro de células 293. la recombinación homóloga ocurrida entre las unidades cartográficas 9-16 del adenovirus del plásmido y del virus Ad5 inutilizado. Los resultados de la recombinación homóloga fueron los virus auxiliares que contenían las secuencias del terminal 5' Ad5 que contenían los dominios PAC I y II o los dominios I, II, III y IV, seguidos por el minigén, y por las secuencias 3' Ad5 9,6-78,3 y 87-100. Por lo tanto, esos virus inutilizados se suprimen del gen E1 y del gen E3.

Las características de la formación de la placa de los virus auxiliares PAC dieron una indicación inmediata de que las modificaciones PAC disminuyeron la velocidad y el grado de crecimiento. Específicamente, las placas del virus auxiliar no se desarrollaron hasta el día 14-21 después de la transfección, y en la madures permanecieron pequeñas. A partir de la experiencia previa, una primera generación estándar del virus auxiliar Ad.CBhpAP con una secuencia terminal izquierda completa comenzaría a desarrollarse hacia el día 7 y a madurar hacia el día 10.

Las placas virales fueron escogidas y suspendidas en 0,5 ml de medio DMEM. Se usó una pequeña alícuota del patrón de virus para infectar a una monocapa fresca de células 293 teñidas histoquímicamente para medir la actividad de la fosfatasa alcalina recombinante 24 horas después de la infección. Seis de los ocho clones Ad.PACIV.CMVhpAP (que codifican las repeticiones A I-IV) que fueron protegidos de la expresión transgénica fueron positivos, mientras que los tres clones Ad.PACII.CMVhpAP que fueron seleccionados marcaron positivo. Los clones habían sido tomados a través de dos rondas de purificación de placa y actualmente están siendo expanden para generar un patrón de trabajo.

Estos virus auxiliares inutilizados fueron útiles en la producción de las partículas virales Ad\Delta de acuerdo a los procedimientos descritos en el Ejemplo 3. Ellos se caracterizan por contener suficiente genes de adenovirus para permitir el empaquetamiento del genoma del vector trasbordador, pero sus secuencias PAC inutilizadas reducen su eficiencia para su propia encapsidación. Por lo tanto, se producen menos virus auxiliares a favor de más virus recombinantes Ad\Delta. La purificación de las partículas virales Ad\Delta a partir de los virus auxiliares se facilita en el gradiente de CsCl, que se basa en el peso de las partículas virales respectivas. Esta facilidad en la purificación es una ventaja decisiva de los vectores Ad\Delta de esta invención en contraste con los vectores adenovirus que tienen solamente E1 o supresiones más pequeñas. Los vectores Ad\Delta aún con minigenes de hasta aproximadamente 15 kb son significativamente diferentes en peso con respecto a los de tipo silvestre o a otros auxiliares de adenovirus que contienen muchos genes de adenovirus.

Ejemplo 9 Vector Ad\Delta que Contiene un Transgén de Distrofina de Longitud Completa

La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad genética común x-enlazada causada por la ausencia de distrofina, una proteína de 427K codificada por una trascripción de 14 Kbases. La carencia de esta importante proteína del sarcolema conduce a un desgaste progresivo del músculo, debilidad y a la muerte. Una aproximación corriente para el tratamiento de esta enfermedad letal es transferir una copia funcional del gen de distrofina dentro de los músculos afectados. Para el músculo esqueletal, un adenovirus de replicación defectuosa representa un sistema de suministro eficiente.

De acuerdo con la presente invención, se creo un plásmido recombinante pAd\Delta.CMVmdys que contiene solamente los elementos cis de Ad5 (esto es, los ITR y las secuencias de empaquetamiento contiguas) y puertos del gen de distrofina murina de longitud completa conducidos por el promotor CMV. Este plásmido se generó como sigue.

pSL1180 [Pharmacia Biotech] fue cortado con Not I, insertado por Klenow, y ligado nuevamente por ablación del sitio Not I en el plásmido. El plásmido resultante es llamado pSL1180NN y porta un gen de resistencia bacterial ori y Amp.

pAd\Delta.CMVLacZ del Ejemplo 1 fue cortado con EcoRI, klenowado, y ligado con el ApaI-cut pSL1180NN para formar pAd\Delta.CMVLacZ (Apal).

El cADN de distrofina de ratón de 14 kb [secuencias suministradas en C.C. Lee y colaboradores, Nature, 349:334-336 (1991)] fue clonado en dos grandes fragmentos usando un vector de clonación lambda ZAP (Stratagene) y clonado seguidamente dentro del vector blue-script pSK dando origen al plásmido pCCL-DMD. Un diagrama esquemático de este vector es proporcionado en la Figura 11, que ilustra los sitios de restricción de la enzima.

pAd\Delta.CMVLacZ (Apal) fue cortado con NotI y el fragmento grande aislado con gel del cADN lacZ. pC-CL-DMD fue cortado también con NotI, aislado con gel y seguidamente ligado al fragmento grande NotI del NotI digerido con pAd\Delta.CMVLacZ (Apal). Las secuencias del vector resultante, pAd\Delta.CMVmdys, se suministran en las Figuras 12A- 12P [SEQ. ID.No. 10].

Este plásmido contiene secuencias del extremo izquierdo del Ad5 que abarcan bp 1-360 (5' ITR), un minigén de distrofina de ratón bajo el control del promotor CMV, y una secuencia del extremo derecho de Ad5 que abarca BP35353 del extremo del genoma (3' ITR). El minigén es seguido por una secuencia poli A SV-40 similar a aquella descrita para los plásmidos descritos arriba.

Se emplea el sistema de producción del vector descrito aquí. Diez placas 293 de 150 mm fueron infectadas con una confluencia de alrededor de 90% con un virus suprimido de EI recombinante indicador Ad.CBhpAP en un MOI de 5 durante 60 minutos a 37ºC. Estas células se transfectaron con pAd\Delta.CMVmDys por coprecipitación con fosfato de calcio usando 50 \mug de ADN linearizado/placa durante aproximadamente 12-16 horas a 37ºC. El medio se reemplazó con DMEM + suero bovino fetal al 10%.

Se observa un efecto citopático completo y se elaboró un lisado de células sometiendo a la pelotilla de células a un procedimiento de congelación-descongelación por tres veces. Las células se sometieron a un gradiente de CsCl en tres hileras de SW41 durante 2 horas y se detectó una migración de banda entre el adenovirus auxiliar y el virus incompleto. Las fracciones fueron analizadas sobre una placa de seis pozos conteniendo células 293 infectadas con 5\lambda de fracción durante 16-20 horas en DMEM + FBS al 2%. Las células se recolectan, se lavan con solución salina amortiguada de fosfato, y se resuspenden en 2 ml de PBS. 200\lambda de las fracciones de células en los 2 ml son hilados de células sobre un portaobjetos.

Las células fueron sometidas a inmunofluorescencia para distrofina como sigue. Las células fueron fijadas en MeOH 10N a -20ºC. Las células se expusieron a un anticuerpo monoclonal específico para el terminal carboxi de distrofina humana [NCL-DYS2; Novocastra Laboratories Ltd., Reino Unido]. Las células fueron lavadas entonces tres veces y expuestas a un anticuerpo secundario, esto es 1:200 IgG de cabra anti-ratón en FITC.

El título/fracción para siete fracciones reveladas en la coloración por inmunofluorescencia fueron calculados fue calculado por la siguiente fórmula y reportado en la Tabla 2 más abajo. DFU/campo = (DFU/células 200\lambda) x 10 = DFU/10^{6} células = (DFU/fracción viral 5\lambda) x 20 = DFU/fracción 100\lambda.

TABLA 2

Fracción	DFU/100\lambda
1	-
2	-
3	6 x 10^{3}
4	1,8 x 10^{4}
5	9.6 x 10^{3}
6	200
7	200

Un virus capaz de transducir al minigén de distrofina es detectado como una célula "positiva" (esto es, fluorescencia verde). Los resultados de la IF ilustran que las fracciones tratadas con calor no muestran inmunofluorescencia positiva. Los datos por transferencia Southern sugieren una especie del mismo tamaño que el ADN ingresado, con contaminación del virus auxiliar.

El virus recombinante puede ser separado a continuación de la mayoría del virus auxiliar por sedimentación a través de gradientes de cesio. Los estudios iniciales demuestran que se producen los viriones funcionales AdCMV\DeltamDys, pero están contaminados con el virus auxiliar. La purificación exitosa produciría viriones Ad\Delta que son incapaces de codificar proteínas virales, pero capaces de transducir músculo esqueletal de murina.

Ejemplo 10 Pseudotipismo

El siguiente experimento proporciona un método para preparar un Ad\Delta recombinante de acuerdo a la invención utilizando virus auxiliares de serotipos que difieren de aquellos del pAd\Delta en el protocolo de transfección/infección. No se esperó que los ITR y las secuencias de empaquetamiento de Ad5 pudieran ser incorporadas dentro de un virión de otro serotipo.

A. Protocolo

La aproximación básica es transfectar al virus recombinante Ad\Delta.CMVlacZ (Ad5) dentro de células 293 y posteriormente infectar a la célula con el virus auxiliar derivado de una variedad de serotipos Ad (2, 3, 4, 5, 7, 8, 12 y 40). Cuando CPE se activa, el lisado se cosecha y se pasa por bandas a través de dos gradientes de cesio.

Más particularmente, el plásmido pAd\Delta.CMVlacZ con base en Ad5 del Ejemplo 1 se linearizó con EcoRI. Los plásmidos linearizados fueron entonces transfectados dentro de diez placas de 150 mm de células 293, usando coprecipitación con fosfato de calcio. 10-15 horas después de la transfección, fueron usados los adenovirus tipo silvestre (de un de los siguientes serotipos: 2, 3, 4, 5, 7, 12, 40) para infectar células en un MOI de 5. las células fueron entonces cosechadas a CPE completo y lisadas por medio de tres rondas de congelación-descongelación. La pelotilla se resuspende en 4 mL de Tris-HCl. Los residuos de las células se removieron por centrifugación y la purificación parcial de Ad5\Delta.CMVlacZ a partir del virus auxiliar se logró con dos rondas de centrifugación por gradiente de CsCl (columna SW41, 35.000 rpm, 2 horas). Las fracciones se recolectaron del fondo del tubo (fracción #1) y se analizaron para virus de transducción lacZ sobre células blanco 293 por coloración histoquímica (a 20h PI). Los virus auxiliares contaminantes fueron cuantificados por ensayo de placa.

Excepto por el adenovirus tipo 3, la infección con serotipos Ad 2, 4, 5, 7, 12, y 40 fueron capaces de producir virus de transducción lacZ. El pico de actividad de \beta-galactosidasa se detectó entre los dos picos de absorción mayores A_{260}, donde la mayoría de los virus auxiliares se pasan por bandas (no se muestran datos). La cantidad de virus lacZ recuperados de las 10 placas están en el rango entre 10^{4} a 10^{8} partículas de transducción, dependiendo del serotipo del auxiliar. Como se esperaba Ad2 y Ad5 produjeron el título más alto de virus de transducción lacZ (Tabla 3). La contaminación de tipo silvestre fue en general 10^{2}-10^{3} log más alto que el correspondiente título lacZ, excepto en el caso de Ad40.

B. Resultados

La Tabla 3 resume las características de crecimiento de los adenovirus tipo silvestre como se evaluaron en su propagación sobre células 293. Esto demostró la posibilidad de utilizar estos virus auxiliares para infectar la línea celular que ha sido transfectada con el virus suprimido Ad5.

TABLA 3

2

\vskip1.000000\baselineskip

La Tabla 4 resume los resultados de las fracciones purificadas finales. La columna del medio, marcada como LFU/\mul cuantifica la producción de las unidades que forman lacZ, que es una medida directa del empaquetamiento y de la propagación de los virus recombinantes Ad\Delta pseudotipados. El título pfu/\mul es un estimado del virus contaminante de tipo silvestre. Se generó un virus Ad\Delta pseudotipado con todas las cepas adenovirales, excepto para Ad3. El rango de títulos está entre 10^{7}-10^{4}.

TABLA 4

3

\vskip1.000000\baselineskip

Las Tablas 5A-5D representan un análisis más detallado de las fracciones de la segunda purificación para cada uno de los experimentos resumidos en la Tabla 4. Nuevamente, LFU/\mul es la recuperación de los virus Ad\Delta, mientras que pfu/\mul representa la recuperación del virus auxiliar.

TABLA 5A

4

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 5B

5

TABLA 5C

6

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 5D

7

C. Caracterización de la Estructura de Virus Empaquetados

Las alícuotas de las fracciones consecutivas fueron analizadas por transferencia Southern usando una sonda lacZ. En el caso de Ad2 y 5, no solamente el monómero linearizado fue empaquetado sino que se encontraron formas múltiples de virus recombinantes con tamaños distintos. Esas formas se correlacionaron bien con los tamaños de los dímeros, trímeros y otros concatámeros de mayor peso molecular. Los monómeros linearizados fueron más puntiagudos cerca de la superficie del tubo (la banda defectiva de adenovirus) que otras formas. Cuando esas formas fueron correlacionadas con la actividad de lacZ, se encontró una mejor correlación entre las formas de peso molecular más alto que los monómeros. Con la pseudotipación de Ad4 y Ad7, los monómeros no linearizados fueron empaquetados y solamente se encontraron las formas de peso molecular más alto.

Estos datos demuestran definitivamente la producción y caracterización del virus \Delta y de los pseudotipos diferentes. Este ejemplo ilustra una forma muy simple de generar virus pseudotipo.

Ejemplo 11 Vector Ad\Delta que Contiene un Gen FH

La hipercolesterolemia familiar (FH) es un desorden autosómico dominante causado por anormalidades (deficiencias) en la función o expresión de los receptores LDL [M.S. Brown y J. L. Goldstein, Science, 232 (4746): 34-37 (1986); J. L. Goldstein y M. S. Brown, "Familial hipercolesterolemia" en Metabolic Basis of Inherited Disease., ed. C. R. Scriver y colaboradores, McGraw Hill, New York, pgs. 1215-1250 (1989)]. Los pacientes que heredan un alelo anormal tienen elevaciones moderadas en el LDL del plasma y sufren de enfermedad prematura de la arteria coronaria con peligro para la vida (CAD). Los pacientes homocigóticos tienen hipercolesterolemia aguda y CAD con peligro para la vida en la niñez. Un vector de la invención que contiene FH se construye por reemplazo del minigén lacZ en el vector pAd\Deltac.CMVlacZ con un minigén que contiene al gen receptor de LDL [T. Yamamoto y colaboradores, Cell, 39:27-38 (1984)] usando técnicas conocidas y como se describió análogamente para el gen de la distrofina y CFTR en los ejemplos precedentes. Los vectores de apoyo del gen receptor de LDL pueden construirse fácilmente de acuerdo con esta invención. El plásmido resultante se llama pAd\Deltac.CMV-LDL.

Este plásmido es útil en terapia génica de FH solo, o preferiblemente, en la forma de un conjugado preparado como se describe aquí para sustituir un gen normal de LDL por el alelo anormal responsable del gen.

A. Terapia Génica Ex Vivo

La terapia génica ex vivo puede realizarse cosechando y estableciendo un cultivo primario de hepatocitos de un paciente. Pueden utilizarse técnicas conocidas para aislar y transducir los hepatocitos con el(los) vector(es) anterior(es) con el apoyo del(los) gen(es) receptor(es) de LDL. Por ejemplo, las técnicas de perfusión de colagenasa desarrolladas para el hígado de conejo, pueden adaptarse al tejido humano y usarse en transducción. Después de la transducción, los hepatocitos se remueven de las placas de cultivo del tejido y se introducen nuevamente dentro del paciente usando técnicas conocidas, por ejemplo, por medio de un catéter colocado dentro de la vena mesentérica inferior.

B. Terapia Génica In Vivo

En forma deseable, la aproximación in vivo a la terapia génica, por ejemplo, dirigida al hígado, implica el uso de los vectores y de los conjugados de los vectores descritos arriba. Un tratamiento preferido implica la infusión de un conjugado LDL del vector de esta invención dentro de la circulación periférica del paciente. El paciente es evaluado entonces por el cambio de los lípidos en el suero y en los tejidos del hígado.

El virus o el conjugado pueden usarse para infectar hepatocitos in vivo por inyección directa dentro de una vena periférica o la vena porta (10^{7}-10^{8} pfu/kg) o de un retrógrado dentro del tracto biliar (misma dosis). Esto efectúa la transferencia génica dentro de la mayoría de los hepatocitos.

Los tratamientos se repiten en la medida en que sean necesarios, por ejemplo, en forma semanal. La administración de una dosis de virus equivalente a un MOI de aproximadamente 20 (esto es, 20 pfu/hepatocito) se anticipa que conduce a un alto nivel de expresión génica en la mayoría de los hepatocitos.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: Depositarios de la Universidad de Pensilvania

\hskip3.9cm

Wilson, James M.

\hskip3.9cm

Fisher, Krishna J.

\hskip3.9cm

Chen, Shu-Jen

\hskip3.9cm

Weitzman, Matthew

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Adenovirus Mejorado y Métodos de Utilización del Mismo

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 10

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Howson y Howson

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Spring House Corporate Cntr, PO Box 457

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Spring House

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Pensilvania

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Estados Unidos

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 19477

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA QUE PUEDE LEERSE EN EL COMPUTADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

COMPUTADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICTUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD DE PRIORIDAD

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE LA SOLICTUD: US 08/331.381

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 28 de octubre de 1994

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Bak, Mary E.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 31.215

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/MINUTA: GNVPN.008PCT

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 215-540-9200

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 215-540-5818

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7897 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

8

9

10

11

12

13

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7852 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

15

16

17

18

19

20

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD:9972 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

22

23

24

25

26

27

28

29

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 14 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAGTAAATTT GGGC

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 14 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGTAAGATTT GGCC

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 14 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGTGAAATCT GAAT

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 14 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAATAATTTT GTGT

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 14 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGTAATATTT GTCT

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 14 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

WANWTTTG

\hfill

8

\newpage

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19307 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

Claims (15)

1. Un método para producir un pseudotipo de adenovirus que comprende las etapas de:

(a)

introducir en una célula huésped seleccionada:

(i)

un vector trasbordador recombinante que comprende secuencias de ácido nucleico de adenovirus y un minigén, en donde dichas secuencias de adenovirus son de un primer serotipo y consisten de los elementos cis 5' y 3' del adenovirus, necesarios para la replicación y encapsidación del virión; y en donde dicho minigén comprende un gen seleccionado enlazado operativamente a las secuencias reguladoras que dirigen la expresión de dicho gen seleccionado en una célula blanco, dichos elementos cis del adenovirus flanqueando a dicho minigén, y

(ii)

un virus auxiliar que comprende las secuencias génicas de adenovirus necesarias para infección adenoviral y codificación de una cápside adenoviral de un segundo serotipo que difiere del serotipo del adenovirus de (i)

(b)

cultivar dicha célula huésped que contiene al vector trasbordador y al virus auxiliar para permitir la formación de pseudotipo de adenovirus que comprende las secuencias de ácido nucleico del adenovirus y un minigén del vector trasbordador (i) en una cápside adenoviral de un segundo serotipo que difiere de dicho primer serotipo.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el virus auxiliar carece de todo o de una porción suficiente del adenovirus E1 y/o de los genes E3 para eliminar su función biológica.

3. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, en donde el primero y el segundo serotipos se seleccionan independientemente de un serotipo de adenovirus del grupo que consiste de 2, 4, 5, 7, 12 y 40.

4. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además las etapas de aislar el pseudotipo de adenovirus de dicha célula huésped o del cultivo celular que lo contiene.

5. Un método para producir un pseudotipo de adenovirus que comprende las etapas de:

(a)

introducir en una célula huésped seleccionada:

(i)

un vector trasbordador recombinante que comprende secuencias de ácido nucleico de adenovirus y un minigén, en donde dichas secuencias de adenovirus son de un primer serotipo y consisten de los elementos cis 5' y 3' del adenovirus, necesarios para la replicación y encapsidación del virión; y en donde dicho minigén comprende un gen seleccionado operativamente enlazado a las secuencias reguladoras que dirigen la expresión de dicho gen seleccionado en una célula blanco, dichos elementos cis del adenovirus flanqueando a dicho minigén, y

(ii)

un virus auxiliar que comprende secuencias génicas de adenovirus de un segundo serotipo que difiere del serotipo de las secuencias del adenovirus de (i); y

(b)

cultivar dicha célula huésped que contiene al vector trasbordador y al virus auxiliar, en donde el virus auxiliar y la célula huésped contienen los genes del adenovirus que son necesarios para la infección adenoviral y que permiten la formación de un pseudotipo de adenovirus que comprende las secuencias de ácido nucleico del adenovirus y un minigén del vector trasbordador (i) en una cápside adenoviral de un segundo serotipo que difiere de dicho primer serotipo.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el primero y el segundo serotipos se seleccionan independientemente de un serotipo de adenovirus del grupo que consiste de 2, 4, 5, 7, 12 y 40.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 5 o la 6, que comprende además las etapas de aislar el pseudotipo de adenovirus de dicha célula huésped o del cultivo celular que lo contiene.

8. Un pseudotipo de adenovirus que comprende:

(a)

secuencias de ácido nucleico de adenovirus y un minigén, en donde dichas secuencias de ácido nucleico de adenovirus comprenden los elementos cis 5' y 3' del adenovirus para replicación y encapsidación del virión; en donde dicho minigén comprende un gen seleccionado operativamente enlazado a las secuencias reguladoras que dirigen la expresión de dicho gen seleccionado en una célula blanco, dichos elementos cis del adenovirus son de un primer serotipo y flanquean a dicho minigén; y

(b)

una cápside de un segundo serotipo de adenovirus que difiere de dicho primer serotipo y que encapsida a dichas secuencias de ácido nucleico de adenovirus y al minigén de (a).

9. Un pseudotipo de adenovirus de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el primero y el segundo serotipos se seleccionan independientemente de un serotipo de adenovirus del grupo que consiste de 2, 4, 5, 7, 12 y 40.

10. Un pseudotipo de adenovirus de acuerdo con la reivindicación 8 o la 9, en donde dichos elementos cis 5' del adenovirus comprenden las repeticiones terminales invertidas (ITRs) 5' del adenovirus nativo, y secuencias de empaquetamiento.

11. Un pseudotipo de adenovirus de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde dichos elementos cis 3' comprenden las repeticiones terminales invertidas (ITRs) 3' del adenovirus nativo.

12. Un pseudotipo de adenovirus de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en donde dicho gen seleccionado es un gen indicador seleccionado del grupo que consiste de los genes que codifican \beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina y proteína fluorescente verde.

13. Un pseudotipo de adenovirus de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en donde dicho gen seleccionado es un gen terapéutico seleccionado del grupo que consiste de un gen CFTR normal, un alelo DMD de Becker y un gen receptor normal de LDL.

14. Una composición farmacéutica que comprende un pseudotipo de adenovirus de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

15. El uso de un pseudotipo de adenovirus de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 en la preparación de un medicamento.