CA2182724A1 - Modele animal de la maladie d'alzheimer, preparation et utilisations - Google Patents
Modele animal de la maladie d'alzheimer, preparation et utilisationsInfo
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Abstract
La présente invention concerne un modèle animal de la maladie d'Alzheimer, sa préparation au moyen de virus recombinants, et son utilisation, notamment pour la mise en évidence de composés actifs.
Description
~ W09~'U22616 ~1 8~ " Cl , MODFI .F, ANIM~L DE LA MALADIE D'AI,ZHEIM~,R.
PREPA~ATION El' UTILISATIONS
La presente invention concerne un modèle animal de la maladie d'Alzheimer, sa ~ liull au moyen de virus ~ , et son utilisation, ~ pour la s mise en évidence de composés sctifs, Plus I iLul;~c~l~c~ elle concerne des adénovirus IP~ LU~ JI lallt une séquence d'ADN codant pour une forrne du précurseur du peptide amyloide, leur préparation et leur utilisation pour la l~ r~
de modeles animaux de la maladie d'Alzheimer. Elle concerne aussi l'utilisation de ces modèles animaux, notamment pour la mise en évidence de composés actifs sur la ] 0 maladie d'Alzheimer, ainsi que les composés identifiés.
La malad~e d'Alzheimer atteint ~ IPrnPn1 10 % des persormes agées de plus de 65 ans, et 20 % au delà de 80 ans. Les estimations prévoient pour l'an 2000, 5 à 8 millions de cas aux Etats-l~nis et 23 milliorls dans le monde. Cette démence sénile est caractérisée par la présence post-mortem de plaques séniles (CU~ ull/ulL un dépôt 15 amyloide central) et de ~ neurofibrillaires. Bien que l'étiologie de la maladie ne soit pas encore ~I-L,èlc-l,~,.,L connue, la formation des dépôts amyloldes semble (;LIIt~5~UOII~LC à un é~énement précoce et ~I.~i,-, ..,:n --,1 Le composant majoritaire de ces dépots est le peptide ~A4 de 39 à 43 acides aminés dont le précurseur, désigné précurseur du peptide amyloide (APP pour "Amyloid Precursor Protein"), a été cloné et séquencé (Kang et al., Nature 325 (1987~
733). Depuis, différentes isoformes du précurseur du peptide amyloide ont été
identifiées, ~u~lc~pu~ld~l~L à un épissage alternatif de l'ARN ~ a~cr ~Ponte et al., Nature 331 ~lg88) 5~5). De plus, I'i 1~ récente dans certaines formes familiales de la maladie d'Alzheimer de mutations dans l'APP a renforcé l'iII~ <,L;U
2s de cette protéine dans l'étiologie de la maladie.
Actuellement, I'étude de la maladie d'Alzheimer et la mise au point de composés actifs sur cette maladie sont ~Ai ~el~c~ t difficiles"~ en raison de l'absence de modeles animaux de cette pathologie. Les seuls modèles dispo~ubles P~i~PI~ n1 reposent sur l'étude in vitro de 1'~ ;5àLiull du peptide ~ amyloide ou de la toxicité de ce peptide sur cellules en culture. Mais ce type de modèle ne peut être prédictif d'une activite in vi~o, en particulier pour une pathologie aussi complexe que la maladie d'Alzheimer. La présente invention apporte une solution à ce proWème. Elle decrit en effet la préparation de modèles animauA de la maladie d'Alzheimer, ainsi que la possibilité d'utiliser ces modèles pour la mise en évidence de composés actifs sur cette pathologie. Les modèles selon l'invention ont été préparés au moyen de ve~teurs wossn26lfi 2 ~272~ rw~
viraux, plus ~,allil,ul.~ Ll de Yecteurs dérivés des adénovirus, contenant une séquence d'ADN codant pour une forme du précurseur du peptide amyloide. La ddlllallJ~G.~:~G a en effet montré qu'il est possible de construire des adénovirus rr-rrlmhinrnr~ contenant une telle séquence codant pour une forme du précurseur du s peptide amyloide, d'administrer ces adénovirus .~ "- à un anirnal, que cette ,..11";";~ permet une expression de cette séquence dans ledit anin~l et en particulier dans le sy.steme nerveux dudit animal, et que rG.~G~;~;UI~ obtenue permet d'induire sur ledit animal certaines ~ t ;~.~;q, .~ ;q.,.; et/ou r l I IG I I ~d les de la m al adie d'Alzheimer.
o Un premier objet de la présente invention réside donc dans un adénovrrus LGco~ lL défectif ~ el~d"l une séquence d'ADN codant pour une forme du précurseur du pep~ide amyloide.
Il a été montre dans la demande cvpdlldr~lte n PCT11~3/0~51g que les adénovirus pou~aient etre utilisés pour le transfert de ~ènes in vivo ddns le système 15 nerveux. Les adénovirus ,~".1,;~, ~ de la présente invention sont }Jal~ L
avantageu~ puisqu'ils sont capables d'induire l'apparition de symptômes de la maladie d'Alzheimer chez l'animal. En particulier, de manière ~ul~lU~tcul~U~ les adénovirus de l'invention sont capables d'induire rapparition de ~,C~ ,Li~ Li4~e.~ lr~gjtl1fr~c et/ou ~:o,,,l,ult.. l~^ de la maladie d'Alzheimer, ce qui permet la réalisation d'un 20 modèle physiopathologique animal ~lJa~ ul;f~ avantageux pour l'étude et la mise au poillt d'un traitemenl de cette maladie.
Les propriétés particulierement avantageuses des modeles de l'invention decoulent ~ rntil~llr-m~nt du virus utilisé (adé,~uvilus défectif, délété de certaines régions virales), du promoteur utilisé pour l'expression de la sequence codant pour 2s l'~PP ~promoteur Yiral de ptéférence), et des méthodes d'~. l . . .;" ;~l . ,.l ;~ ,.. dudit vecteur, permettsnt l'expression ef~icace et dans les tissus appropriés de la séquence APP.
Préfé~entiell~3m~nt, on utilise dans le cadre de la présente invention un adénovirus depourvu des régions de son génome qui sont necessaires à sa réplication dans la cellu~e cible. Les adénovirus défectifs selon rinvention sont donc incapables de 30 se répliquer de facon autûnome dans Is cellule cible.
C.én~rPlr-mr^nt, le genome des adénovirus defectifs utilisés dans le cadre de laprésente invention est dépour~u au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit élirninées ~en tout ou
PREPA~ATION El' UTILISATIONS
La presente invention concerne un modèle animal de la maladie d'Alzheimer, sa ~ liull au moyen de virus ~ , et son utilisation, ~ pour la s mise en évidence de composés sctifs, Plus I iLul;~c~l~c~ elle concerne des adénovirus IP~ LU~ JI lallt une séquence d'ADN codant pour une forrne du précurseur du peptide amyloide, leur préparation et leur utilisation pour la l~ r~
de modeles animaux de la maladie d'Alzheimer. Elle concerne aussi l'utilisation de ces modèles animaux, notamment pour la mise en évidence de composés actifs sur la ] 0 maladie d'Alzheimer, ainsi que les composés identifiés.
La malad~e d'Alzheimer atteint ~ IPrnPn1 10 % des persormes agées de plus de 65 ans, et 20 % au delà de 80 ans. Les estimations prévoient pour l'an 2000, 5 à 8 millions de cas aux Etats-l~nis et 23 milliorls dans le monde. Cette démence sénile est caractérisée par la présence post-mortem de plaques séniles (CU~ ull/ulL un dépôt 15 amyloide central) et de ~ neurofibrillaires. Bien que l'étiologie de la maladie ne soit pas encore ~I-L,èlc-l,~,.,L connue, la formation des dépôts amyloldes semble (;LIIt~5~UOII~LC à un é~énement précoce et ~I.~i,-, ..,:n --,1 Le composant majoritaire de ces dépots est le peptide ~A4 de 39 à 43 acides aminés dont le précurseur, désigné précurseur du peptide amyloide (APP pour "Amyloid Precursor Protein"), a été cloné et séquencé (Kang et al., Nature 325 (1987~
733). Depuis, différentes isoformes du précurseur du peptide amyloide ont été
identifiées, ~u~lc~pu~ld~l~L à un épissage alternatif de l'ARN ~ a~cr ~Ponte et al., Nature 331 ~lg88) 5~5). De plus, I'i 1~ récente dans certaines formes familiales de la maladie d'Alzheimer de mutations dans l'APP a renforcé l'iII~ <,L;U
2s de cette protéine dans l'étiologie de la maladie.
Actuellement, I'étude de la maladie d'Alzheimer et la mise au point de composés actifs sur cette maladie sont ~Ai ~el~c~ t difficiles"~ en raison de l'absence de modeles animaux de cette pathologie. Les seuls modèles dispo~ubles P~i~PI~ n1 reposent sur l'étude in vitro de 1'~ ;5àLiull du peptide ~ amyloide ou de la toxicité de ce peptide sur cellules en culture. Mais ce type de modèle ne peut être prédictif d'une activite in vi~o, en particulier pour une pathologie aussi complexe que la maladie d'Alzheimer. La présente invention apporte une solution à ce proWème. Elle decrit en effet la préparation de modèles animauA de la maladie d'Alzheimer, ainsi que la possibilité d'utiliser ces modèles pour la mise en évidence de composés actifs sur cette pathologie. Les modèles selon l'invention ont été préparés au moyen de ve~teurs wossn26lfi 2 ~272~ rw~
viraux, plus ~,allil,ul.~ Ll de Yecteurs dérivés des adénovirus, contenant une séquence d'ADN codant pour une forme du précurseur du peptide amyloide. La ddlllallJ~G.~:~G a en effet montré qu'il est possible de construire des adénovirus rr-rrlmhinrnr~ contenant une telle séquence codant pour une forme du précurseur du s peptide amyloide, d'administrer ces adénovirus .~ "- à un anirnal, que cette ,..11";";~ permet une expression de cette séquence dans ledit anin~l et en particulier dans le sy.steme nerveux dudit animal, et que rG.~G~;~;UI~ obtenue permet d'induire sur ledit animal certaines ~ t ;~.~;q, .~ ;q.,.; et/ou r l I IG I I ~d les de la m al adie d'Alzheimer.
o Un premier objet de la présente invention réside donc dans un adénovrrus LGco~ lL défectif ~ el~d"l une séquence d'ADN codant pour une forme du précurseur du pep~ide amyloide.
Il a été montre dans la demande cvpdlldr~lte n PCT11~3/0~51g que les adénovirus pou~aient etre utilisés pour le transfert de ~ènes in vivo ddns le système 15 nerveux. Les adénovirus ,~".1,;~, ~ de la présente invention sont }Jal~ L
avantageu~ puisqu'ils sont capables d'induire l'apparition de symptômes de la maladie d'Alzheimer chez l'animal. En particulier, de manière ~ul~lU~tcul~U~ les adénovirus de l'invention sont capables d'induire rapparition de ~,C~ ,Li~ Li4~e.~ lr~gjtl1fr~c et/ou ~:o,,,l,ult.. l~^ de la maladie d'Alzheimer, ce qui permet la réalisation d'un 20 modèle physiopathologique animal ~lJa~ ul;f~ avantageux pour l'étude et la mise au poillt d'un traitemenl de cette maladie.
Les propriétés particulierement avantageuses des modeles de l'invention decoulent ~ rntil~llr-m~nt du virus utilisé (adé,~uvilus défectif, délété de certaines régions virales), du promoteur utilisé pour l'expression de la sequence codant pour 2s l'~PP ~promoteur Yiral de ptéférence), et des méthodes d'~. l . . .;" ;~l . ,.l ;~ ,.. dudit vecteur, permettsnt l'expression ef~icace et dans les tissus appropriés de la séquence APP.
Préfé~entiell~3m~nt, on utilise dans le cadre de la présente invention un adénovirus depourvu des régions de son génome qui sont necessaires à sa réplication dans la cellu~e cible. Les adénovirus défectifs selon rinvention sont donc incapables de 30 se répliquer de facon autûnome dans Is cellule cible.
C.én~rPlr-mr^nt, le genome des adénovirus defectifs utilisés dans le cadre de laprésente invention est dépour~u au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit élirninées ~en tout ou
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en partie~, soit rendues non-fnn-~ti--nnP~ c, soit substituées par d'autres séquences et notamment par la séquence codant pour une forme du précurseur.
Pr.~f~r~.nti~ mPnt~ le virus défectif conserve néantnoins les séquences de son génome qui sont ~ e~Sa;lr~ à 1'~ des particules ~irales.
11 existe différents sérotypes ~i'ad~luvilus, dont la structure et les propriétés va~ient quelque peu. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la presente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale. Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origi~te canine, bovine, murine, (exemple: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne ~exemple: SAV) (voir demande FR 93 05954). De préférence, I'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus plr~r~ lrm~nt un adénovirus obtenu à partir d'une souche CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC
VR-800) par exemple]. Il peut également s'agir d'un adénovirus d'origine mixte ls (contenant des séquences humaines et des séquence animales).
Dans un mode préféré, I'~ lUVil-ls de l'ittvention est un adénovirus humain de type Ad~ ou Ad5.
Dans un autre mode préféré, I'd~é.luvi.us de l'invention est un adénovirus canin de type CAV-2.
Comme indiqué ci-dessus, les adénovirus de l'inventior. portent une séquence d'ADN codant pour une forme du précurseur du peptide amylotde. Le terme précursetlr du peptide amylolde désigne au sens de la présente invention tout peptide capable de maturer en peptide amyloide. De pr~férence, le précuræur du peptide amyloide ælon l'invention est capable de maturer en une forme du peptide amyloide 2s 13A4 ou d'un variant de celle-ci. De maniere ~Ja~ r~ avantitgeuse, il doit pouvoir maturer en une des formes ~U~ all~ 39 à 43 acides aminés du peptide BA4.
De préférence, le précur.seur du peptide amyloide au sens de rinvention est représenté par tout variant naturel ou artificiel de l'APP. Comme indiqué ci-avant, différents ~ariants natureis de l'APP existent, ainsi que certaines formes mutées. Parrni les formes naturelles du précurseur, oll peut citer plus ~lalL;~uli~lr~ les isoforrnes APP6g5, APP751 et APP770. Par ailleurs, de3 variants artificiels de rAPP peuventêtre utilisés, notamment des variants contenant une région N-terminale tronquée. i_n effet, dans les variants naturels de l'APP, et en particulier pour l'isoforrne de l'APP à
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695 acides aminés, le peptide amyloide mature est situé au centre de la molecule, au niveau des résidus 597 à 638 (Kang et al., Nature 325 ~1987) 733). Dans un r~lode de réalisation avantageux de rinvention, on utilise une séquence d'ADN codant pour le précurseur du pep ide amyloide tronqué dans sa région N-terrninale. Plus 5 préfér~nh~ mPnt on utilise une sequence d'ADN codant pour le précurseur du peptide amy~oide tronqué de la région N-terininale précédent le peptide amyloidevariant A4CT ou SpA4CT (précede d'une séquence signal)~.
Preférentiellement, l'~;~,n~,v;lus de l'invention comprend une séquence d'ADN
codant pour tout varir1nt naturel ou ~yll~lléli~lu~ de l'APP
Encore plus: préférPntiPIlPmPnt l'~ vi~us de l'invention comprend u}le séquence d'ADN codant pour l'APP695, l'APP751 ou rAPP770.
Dans un mode particulier, I'id~ .Ius de l'invention comprend une séquence d'ADI~ codant pour le precurseur du peptide amyloide tronque dans sa région N-terminale, tel que notamment les variants A4CT ou SpA4CT.
Par ailleurs, il est entendu que la sequence d'ADN peut être également toute séquence homologue à celles décrites ci-dessus, codant pour une forrne du précurseur du peptide amyloide tel que défr,li ci-aYant. De telles sequences ~"""''~'le - peuvent en particulier être obtenues par des techniques COMues de l'hornme du métier, telles que la mutation, délétion, addition et/ou hybridation avec les séque~tces décrites ci-20 dessus. P;~rmi les formes mutées, on peut citer à titre d'exemple les mutations obser-vees dans les formes familiales de la maladie d'Alzheimer.
Avart~ cPmpnt~ la séquence codant pour le précurseur du peptide amyloide est placee sous le contrôle de signau.~ d'~lv~co~;ull ~étérologues permettant son expression dans les cellules infectées. Au sens de la présente invention, on entend par ~5 signaux d'expression héLcL~ u~,o des signaux différents de ceux naturellennent IL~ r",~ de l'~~ coo;v~ du précurseur du peptide amyloïde. Il peut s'agir en part;culier de séquences l~ de l'expression d'autres protéines, ou de sequences synthétiques. Nu,lal"..l~.~l, il pêut s'agir de séquences ~lVllll~tL;.,Cs de gènes eucar,L~otes ou viraux. Par exemple, il peut s'a~ir de séquences ,L)L~lllULli~,Cs issues du 30 génome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences vLI i~,eS is~ues du génome d'un virus, y compris l'adenovirus utilisé.
2~
~ WO9~122616 ,~I/r~ . lu/
s Préfér.~nfiP~ mrnt la séquence d'ADN est placée sous le contrôle de signaux d'P~tJLca:~iulL permettant son expression dans le système nerveux d'un animal, choisis de préférence parmi les ,LJI V~ I IV~UI a dbrigine virale.
Plus pL.~i.uli.,~ .ll, on peut citer par exemple les IUlV~ Jt~,~JLà ElA, MLP, s CMV, LTR-RSV, etc.
En outre, les séquences Ll'~ aaivll peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation de régulation, ou permettant une expression tissu-spécifique. ~
peut en effet étre pal li~ulicl~lllelll intéressant d'utiliser des signaux Ll'L ,.I~lc~-aiv., actifs aL)ccirir~uè~ OU lll~julilail~lllcllL dans les cellules nerveuses, de manière à ce que la U séquence d'ADN ne soit exprimée et ne produise son effet que lorsque le virus a L,r[r,~ ",~"~ infecté une cellule nerveuse. A cet égard, on peut citer par exemple le promoteur de la GFAP
Dans un mode l~d.Li~uliclclll~ aYantageux, I'~clcllvvi,u, de l'invention comprend une séquence d'ADN codant pour une forme du précurseur du peptide amyloide sous controle du LTR-RSV. ~omme le montrent les exemples, cette construction permet en effet d'exprimer de maruère très eEficace et durable ladite sequence d'ADN dans le système nerveux des animaux, et d'induire rapparition de symptômes facilement detectables de la maladie d'Alzheimer.
Les adéno~irus recrmhinrntc dérectifs selon l'rnvention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier ~Levrero et al., Gene 101 (1991)195, EP 18~ 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par l.~r cll~ homologue entre un adénovirus et un plasrnide portant entre autre la séquence d'ADN. La l~ ;"~ homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La 2s lignée ce~lulaire utilisée doit de préférence Q) être IL~larvLlllable par lesdits élémerLts, et (ii~, comporter les séquences capables de .~.,,,.l,I~.,,P,,IP, la partie du génome de l'~rrJ~rlv~;ius défectif, de preférence sous for~ne intégrée pour éviter les risques de ~cvlllbillaia~lrl~ A titre d'exemple de lignée, on peut lllcllLiulu~ Ia lignée de oein embr~onn~ire humain ~93 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 ~1977) 59) qui contient ~,)lu,l,l,.~.,l intégrée dans son genome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (1~ ~o) Des stratégies de ~:UlLaLLUr~tiVIl de vecteurs derivés des adénovirus ont également été décrites dans les demandes n FR 93 05954 et FR 93 08596.
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Ensuite, lei adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techn3ques classiqaes de bialogie "lole~uldil~;, comme illustré dans les exemples.
Un autre objet de l'invention ooncerne rutilisation d'un adénovirus tel que défini ci-avant pour la préparation d'un modèle animal de la maladie d'Al~heimer.
I,'invention concerne egalement tout modele animal de la maladie d'Alzheimer CUI~I~Jll,.lall~ un mammifère non-humain contenant un adénovirus le~ tel que défini ci-avant.
(:omme indique ci-avant, I'utilisation des vecteurs décrits ci-avant permet de manière tOUI à fait i,Y~ c~u~ de preparer des modèles animaux de ~a maladie d'Alzheimer fiables et particulierement simples à utiliser. Plus particulierement, dans ces modèles, I'~l;..uvilu~ ~r~ est administré par injection et, encore plus préférPnti.~ tn~nt par injection directe dans le système nerveux central. Ce mode d'~.l",;";~ est particulièrement avantageux puisqu'il permet au vecteur d'infecter rapidement et rrr;~ les cellules nerveuses, ~ sans etre disséminé
15 dans le reste de l'organisme.
L'injection directe dans le systeme nerveux central est réalisée de préférence au mo~en d'un a~)parei~ d'injection s~,cu~,,ique. L'emploi de ce type d'appareil permet en effet de cibler a~ec une grande precision le site d'injection, comme le montrent les e~emples.
Avant~ Pmf~nt~ lC.. ~JV;IU~ Irc~ l est administré sous forrne de solutions, et en particulier de solutions stériles, ;Y~ P~ ou de ~
seches, notamment IyLJ~l~ili.,f,~." qui, par addition selon le cas d'eau sterilisée ou de sérurn physiologiqueA permettent la ~ , de solutes injectables.
Les doses d';.d~ Yiius ,~,.""1,;,. ,1 défectif utilisées i~our l'injection et le2s nombre d'injections peuvent être adaptées en fonction de différ~nts paramètres, et notamment en fonction du mode d'R~ nl;~ utilisé, de l'animal utilisé, etc. D'unemanière générale, les adénovirus ,~, ..,.1~;1.~,ll~ selon l'invention sont forrnulés et dL~IllilLis~ SOUS forme de doses comprises entre 10~ et 10l4 pfu/ml, et de préférence 106 à ~010 pfu/ml. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir 30 infectieux d'une solution de virus, et est déterrniné par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 48 heures, du nombre de plages de cellules ~ 1 8~
~N0 95122616 ~ r ~
infectées. Les techn;ques de ~ du titre pfu d'une solution virale sont bien ,1. ~ . .. I.r . .t~ dans la littérature.
Le nombre d'injections peut Ysrier selon les cas, entre I et 5.
De préférence, les adénovirus ~æc~ sont all~ ~..~ à un animal âgé
s de 1 à 25 semaines, de préférence de 4 à 20 semaines. Plus ~ 111 encore, I'injection est réalisée sur des animaux de 8 à 10 semaines.
Le mammifere non-humain utilisé pour la iJ~éiJalalio-l des modèles selon l'invention est av~nt~ crmrnt ci~loisi pnrmi les rongeurs. Plus iJ~rélr..1;rllrmr~nt, il s'agit d'une souris, d'un rat, d'un cobaye ou d'un lapin. Toutefois, d'autres animaux, 10 comme le lémurien, peuvent également être utilisés.
La présente invention décrit égalemellt un procédé de l,lc-ip~Li~ll d'un modèle animal de In maladie d'Alzheimer selon lequel on administre, à un mammifere non-humain, un adénovirus recombinant ~:UllliJ~ lli une séquence d'ADN codant pour une forme du précurseur du peptide amyloide.
La présente invention a éga lement pour objet un procédé de mise en évidence de composes ou ~ )u~ iulla actifs vis-à-vis de la maladie d'Alzheimer selon lequel on administre ledit composé ou ladite ~ a un animal tel que décrit ci-dessus, et on détermine son activité sur les effets induits par l'adénovrius ~æ~ . ,.1 .l ,:..,... I
AvRi~t~ c~mrnt, le composé ou la ~ est administré par voie 20 orale, topique, parentérale, intranasaie, i~ n~a~e~ t~ sous-cutanée, intraoculaire, ll~,.s.i~. ,.,i~Lue, etc.
L'invention comprend aussi tout composé ou r nmrncitinn actif vis-à-vis de la maladie d'Alzheimer, obtenu par le procédé décrit ci-avant.
La plésente invention sera plus ~ décrite à l'aide des exemples 2s qui suivent, qui doivent etre considérés comme illustratifs et non iimitatifs, Lé?en~le ~l~c fu~llres Figure 1: R~iJlésellldLiul~ du vecteur pXL2244 Figure 2: R~iJI~IL~ JII du vecteur pSh-Ad-APP6,5 2 ~ ~7i~T
W095112616 ~ rr~ io/ ~
Techni~lles ~énérales de biolo~ie 1~O~
Les méthodes l`IA~ 1- 11 utilisees en biologie mnl~ , teiies que ies extractions ~ L;~o d'ADN ~ , la ~ LIi~u~ Liul~ d'ADI~ en gradient de chlorure de césium, l'éle~l.upl,v.;3~ sur gels d'agarose ou ~ yl~ulli~, la 5 purification de fragments d'ADN par él~LLu,,luLiul~, les extraction de protéines au phénol ou au phenol-ul,luluru,~, la pl~c;~ LiLul~ d'ADN en rr~iiieu salin par del'éthanol ou de l'jDUiJI~J.~IIC~I~ la L~ ru~ LiOn dans F.~chPrirhil~ cûli, etc ... sont bien connues de l'homn e de métier et sont ~i~o..~LL..I~.~L décrites dans la litterature [Maniatis-T. et al., "Molecular C~oning, a Laboratory Manual", Cold Spring Hrrbor Labcuatory, 0 Cold Spring Marbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protoco~s in Molecular Biology", John Wiiey & Sons, New York, 1987].
Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de ia série Ml3 sont d'origine L,U~ (Bethesda i~esearch T sa~l~r~trlriP~) Pou~ les l;gatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur t~ie 15 par électrophorèse en gels d'agarose ou Li'~ulylal~ ic~ extraits au phénol ou par un mélange phénoi/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN
ligase du phage T4 (Biolabs) selon les ~ du r ,- ll~
Le ,e"~ des extrémités 5' ~LU6.llL~ tu., peut étre effectué par le fragment de Klenow ~ie l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les ~ rj. ..~;~.,.~.
20 du fournisseur. La destruction des extrémités 3' t"~ ..,l.t~ est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilrsée selon les ..~. ~.l.,... - ..l ,l;"".~ du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuee par url traitement ménagé par la nucléase Sl.
La ~l~u~ SC dirigée irl vitro par OI;~;VUWAYIIUC~ ;d~ y~Ll~ ., peut 25 etre effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. l3 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham.
L~a~ ;r;~ l;. ..l enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR
Lolymerase-catal~,ed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 2.~Q (1985~ 1350-1354; Mullis K.B. et Faioûna F.A., Meth. Enzym~ 155 (1~87) 335-350] peut ~tre 30 effectuee en utilisant un UDNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant.
La ~ r~ Liu,l des sé~luences ll~ Ir~ peut etre effectuée par la methode dé~eloppée par Sang~r et a~. IProc. Natl. Acad. Sc;. USA, 74 (1977~ 5463-54671.
~ WO9S/22616 2 ~ 7~ rhs ~Y~mples Exemple 1. C1J~L~ ljOII dll vecteur pSIl-Ad~APP695.
Cet exemple décrit la construction d'un vecteur CUIII,L~I~ une séquence d'ADN codant pour le précurseur du peptide amyloide ~PP695 sous le controle d'un5 promoteur constitué par le LTR du virus du sarcome de rous (LTR-RSV).
1.1. Vecteurs de départ:
- Vecteur pXL2244: Le plasmide p~L2244 contient l'ADNc de rApoAI sous le c~ntrole du promoteur LTR du virus RSV, ainsi que des séquences de l'~d~ u~
AdS (figure 1). Il a été construit par insertion d'un fragment Clal-EcoRV contenant 10 I'ADNc cGdant pour la préproApoAI dans le Yecteur pLTR RSV-Bgal (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90 ~19g2) 626), digéré par les meme enz~Ymes.
- Vecteur pSVK3 APP695: Ce ~ecteul contient une séquence codant pour l'isoforrrle 695 du précurseur du peptide amyloide (fourni par le Dr. J.N. Octave) (~ang et al. précitée).
1.2. Construction du vecteur pSh-Ad-APP695 Cet exemple decrit la construction du ~ecteur pSh~Ad-APP695 contenant la séquence codant pour l'isoforrne 695 du précurseur du peptide amyloide sous controle du LTR du virus RSV, ainsi que des séquences de l'adénoYirus Ad5 permettant la l~rj""l.;"..;~ in vivo.
Le vecteur pSVK3 APK95 a été digéré par les enzymes EcoRV et Sall. Le fragment EcoRV-Sall de 2 k~ contenant la sequence codant pour risoforme 695 du precurseur du peptide amylo;de a ensuite été isolé et purifie par él~lLupllG,~ sur un gel d'agaro.se LMP ('`Lo~v Melting Point"). Par~llPlPrnPnt le vecteur pXL2244 a été
traité par l'enzyme de restriction Clal (site en position 1089 sur la &gure 1). Les 2s extrémites ont ensuite éte rendues franches par traitement en presence du fragment klenow de l'ADN polymérase. Le vecteur a ensuite été digéré par l'enzyme Sall (site en position ]930 sur la figure 1). Le vecteur linéaire de 7 kb résultant a ensuite été isolé
et purifie par éle~lLu~ ;... sur un gel d'agarose LMP. Les fragments de 2 et 7 kb ainsi obtenus ont ensuite eté ligaturés pour générer le vecteur pSh-Ad-APP695 30 (figure 2~.
~i&~:724 W095/2261C T~ rl_ '~ i Exemple 2. ~ ' du Yecteur pSh-Ad-APP695 La capacité du vecteur pS~I-Ad-APP695 a exprimer sur culture cellulaire l'isoforrne 695 de rAPP a éte démontrée par ~ r~ transitoire de cellules COSl.
Pour cela, les cellules (106 cellules par boite de 10 cm de diamètre) ont éte s ~ rn,~S 18 llg de ~ecteur) en presence de Tnin~f~i~rn Apres 72 heures, les protéines totales et sécrétées ont été analysées en westem blot. A cet effet, les protéines sont séparées selon leur masse par éle~ p~lv,~ sur un gel de polyd~lyld~llide pUiS transférées sur une membrane de nitrocellulose. La présence d'APP est ensuite confirrnée par réaction ;~ selon la méthode ECL
lo (Amersham~ en utilisant l'anticorps spécifique 22Cl1 (Boehringer).
Exemple 3. Cu~ Ll U.~iOl~ de l'~d~. -u ~ ;- u~ Ad-APP695 Le vecteur pSh-Ad-APP695 a eté Irnéarisé et ~ avec un vecteur adénoviral déficient, dans les cellules helper (lignee 293) apportant en ~ans les fonctions codées par les régions E1 (El A et E1 B) d'al;.l~vu us.
Plus p.~i~.~ , I'adéno~itus Ad-APP6g5 a été obtenu par ~ 3 ~
homologue in vivo entre l'adénovirus mutant Ad-dll324 ('IllillUlldU~/dyd et al., Cell 31 (1982) 543) et le vecteur pSh-Ad-APP695. selon le protocole suivant: le plasmidepSh-Ad-APP695 et r~l~ v;lus Ad-dll324, linéarisé par l'enzyme ClaI, ont été co-tran.sfectés dans la lignée 293 en presence de phosphate de calciurn, pour permettre la It~,~JllllJil~di~VII hr~n~ P Les adénovirus ,~ rlinsi genérés ont été
~al~c~ nn~c par purification sur plaque. Après isolement, I'Al~N de l'dd~.~oYi-~Ls rP nnl~-inant a été ampliîié dans la lignée cellulaire 293, ce ~ui conduit à un surnageant de culture contenant l'adénovirus défectif l~ non ptnifié ayant un titre d'environ 101 pfulml.
2s I~es particules virales sont ensuite purifiées par ~ - ;r.~ sur gradient de chlorure de césium selon les techniques connues (voir llvta~ Gra~tam et al., Virology 52 (1973) 45b). L'adenovirus Ad-APP695 peut être conservé à -80C dans 20 % de glycerol.
Exemple 4.1~ l.lr de l'adétlovir~w Ad-APP695 La capacité de l'~dc.,vYL"~s Ad-APP695 à exprimer sur culture cellu}aire l'isoforme 695 de l'APP a été démontrée p:~r infection des c,ellules de la lignée 293. La ~ WO9.iQ2616 ~ 1 8~724 .~1111 t JO/
présence d'APP dans les ce~luies a ensuite été déterminée dans les mêmes conditions que dans ~'exemple 2.
Ces études permettent de montrer que ~ VV;IU~I exprime bien le variant 695 de l'APP en culture cellulaire.
s Exemple 5. Co,~L- u..i~"~ d'l~n modèle animal Cet exemple décrit la ~:LJIl~L~uuLi~r~l d'un modèle animal de la maladie d'Alzheimer contenant un adénovirus capable d'exprimer le variant 695 de l'APP.
L`adénovirus prépûré dans l'exemple 3 est utilisé sous forme purifiée (3,5106 pftll~l), dans une solution saline phosphate (PBS).
Les animau~ prP~l~Qhl~msnt snP~th~ , sont préparés par injections directes dans le s~stème ner~.~eux central et, plus LJI~-is~".~.,L, au niveau de l'~ et du cortex entorhinal. Les injections sont réalisees à l`aide d`une canule (diamètre extérieur 280 ,um) connectée à une pompe. La vitesse d`injection est fixée a 0,5 ~/min, après quoi~ la canule reste en place pendant 4 minutes .s~rrl~nv~ntsireS avant d`etre remontée. Le volurne d'injection dans l'~ p~ et le cortex entorhinal est de 1 1ll.
La dose d'adénovirus injectée est de 3,5. 106 pful,u1.
Pour l'injection dans l'hippocampe, les ~ stéréota~iques sont les suivantes: AP=-2,0; ML=1,5; V=-2,5 (les cooldonnées AP et ML sont ~h.llliu~6.CS
par rapport ûu bregma, la coordonnée V par rapport à la surface de l'os cranien au ni~eau du bregma.
Pour l`injection dans le cortex entorhinal, les coordonnées stéréota~iques sont les suivantes: AP=-3,5; ML=3,5; V=-3,7.
Les injectinns suivantes sont réalisées:
- 11 souris C57B116 mâles, agées de 2 mois, sont injectées avec 3,5. 106 2s pfullll d`adénovirus ad-APP et 4 avec 3~5. 106 pfu/lll d`adénovirus ad-APP + 3,5. 105 pfu/~tl L~ d~ vil us ad-13Gal (Le Gal La Salle et al., Science 259 (1993) 988~.
- 5 souris C57BI/6 males~ agées de 2 mois~ sont injectées avec 3,5. 106 pfu/,ul d'adénovirus ad-13Gal.
Analyse hi.~tolo~ique Au cours du temps (7, 15, 30 et 60 jours après l`injection) la su,~ de l'APP695 au niveau du site d`injection illLld~ bLdl est analysée par i"."~
21~24 WO g'.V22616 P._llrn ~ ol Les animaux sont sacrifies, sous anesthésie, par perfus;on intr~rs-~ii,-ll--r- de 4%
paraformaldéhyde. Après ~ "..-~ et post-fixation (2 heures), le ceneau est coupéau cryomat: dec coupes de 40 ~m d'épaisseur sont recueillies dans du tampon. Cescoupes flottantes sont ensuile traitées pour la révélation ;~ p,j-L,r de s l'APP695 par un anticorps spécifique 22C11 ~13';i.h.iUlj~ L) (méthode de skc~L~Lvi~iU~
biotine peroxydase1-En plus de l'analyse hict~ iql~P ~m~nt~nt la bUUG~LGSSi~ll de l'APP695, les animaux de l'inverttion per.mettent de mettre en é~idence l'incidence de cette ~LL~ JL~a~iUII sur le L~GV~ de pathologies céré~rales liees à la maladie d'Alzheimer, comme la présence de protéine ~-amyloide en dépots diffus ou en plaques, la présence de LJ~ G.Ga~G~ neurofibrillaires et de plaques neuritiques, ou encore des pertes neuronales et ~,y~a~)Li~ur,S. Comme pour l'APPt;gS, la présence de beta-A4l P.'~F, 11biquitine et GFAP est déterminée par " ", """~ . ,Irigir Dans ce cas, I'immunohistologie est réalisée sur coupes en paraffirte, le ceneau ayant éte lS prr~l~hll~m~nt deshydraté et inclu en paraffine.
Analyse ~v"~ ,." ~ Glll~dc Les animaux de l'in~ention permettent également de mettre en évidence l'incidence de lâ su,G,~, Gaaion d'APP695 sttr le L,u~ ullGIllG~ll, et en parti~lier, sur les processtls mnésiques. A cet ég~rd, le test de la piscine (R. Morris, J. Neuro.sc. Meth.
ZO 11 (1984~ 47) permet de mesurer l'effet de l'injection de l'adéno-APP, et é-~nt ~ mf~t d'un composé ou d'une ~:LJIll,L~Oai~iv~ à tes~er, sur certains de ces processus.
en partie~, soit rendues non-fnn-~ti--nnP~ c, soit substituées par d'autres séquences et notamment par la séquence codant pour une forme du précurseur.
Pr.~f~r~.nti~ mPnt~ le virus défectif conserve néantnoins les séquences de son génome qui sont ~ e~Sa;lr~ à 1'~ des particules ~irales.
11 existe différents sérotypes ~i'ad~luvilus, dont la structure et les propriétés va~ient quelque peu. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la presente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale. Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origi~te canine, bovine, murine, (exemple: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne ~exemple: SAV) (voir demande FR 93 05954). De préférence, I'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus plr~r~ lrm~nt un adénovirus obtenu à partir d'une souche CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC
VR-800) par exemple]. Il peut également s'agir d'un adénovirus d'origine mixte ls (contenant des séquences humaines et des séquence animales).
Dans un mode préféré, I'~ lUVil-ls de l'ittvention est un adénovirus humain de type Ad~ ou Ad5.
Dans un autre mode préféré, I'd~é.luvi.us de l'invention est un adénovirus canin de type CAV-2.
Comme indiqué ci-dessus, les adénovirus de l'inventior. portent une séquence d'ADN codant pour une forme du précurseur du peptide amylotde. Le terme précursetlr du peptide amylolde désigne au sens de la présente invention tout peptide capable de maturer en peptide amyloide. De pr~férence, le précuræur du peptide amyloide ælon l'invention est capable de maturer en une forme du peptide amyloide 2s 13A4 ou d'un variant de celle-ci. De maniere ~Ja~ r~ avantitgeuse, il doit pouvoir maturer en une des formes ~U~ all~ 39 à 43 acides aminés du peptide BA4.
De préférence, le précur.seur du peptide amyloide au sens de rinvention est représenté par tout variant naturel ou artificiel de l'APP. Comme indiqué ci-avant, différents ~ariants natureis de l'APP existent, ainsi que certaines formes mutées. Parrni les formes naturelles du précurseur, oll peut citer plus ~lalL;~uli~lr~ les isoforrnes APP6g5, APP751 et APP770. Par ailleurs, de3 variants artificiels de rAPP peuventêtre utilisés, notamment des variants contenant une région N-terminale tronquée. i_n effet, dans les variants naturels de l'APP, et en particulier pour l'isoforrne de l'APP à
WO9~22616 21 ~7~ rJ~7~
695 acides aminés, le peptide amyloide mature est situé au centre de la molecule, au niveau des résidus 597 à 638 (Kang et al., Nature 325 ~1987) 733). Dans un r~lode de réalisation avantageux de rinvention, on utilise une séquence d'ADN codant pour le précurseur du pep ide amyloide tronqué dans sa région N-terrninale. Plus 5 préfér~nh~ mPnt on utilise une sequence d'ADN codant pour le précurseur du peptide amy~oide tronqué de la région N-terininale précédent le peptide amyloidevariant A4CT ou SpA4CT (précede d'une séquence signal)~.
Preférentiellement, l'~;~,n~,v;lus de l'invention comprend une séquence d'ADN
codant pour tout varir1nt naturel ou ~yll~lléli~lu~ de l'APP
Encore plus: préférPntiPIlPmPnt l'~ vi~us de l'invention comprend u}le séquence d'ADN codant pour l'APP695, l'APP751 ou rAPP770.
Dans un mode particulier, I'id~ .Ius de l'invention comprend une séquence d'ADI~ codant pour le precurseur du peptide amyloide tronque dans sa région N-terminale, tel que notamment les variants A4CT ou SpA4CT.
Par ailleurs, il est entendu que la sequence d'ADN peut être également toute séquence homologue à celles décrites ci-dessus, codant pour une forrne du précurseur du peptide amyloide tel que défr,li ci-aYant. De telles sequences ~"""''~'le - peuvent en particulier être obtenues par des techniques COMues de l'hornme du métier, telles que la mutation, délétion, addition et/ou hybridation avec les séque~tces décrites ci-20 dessus. P;~rmi les formes mutées, on peut citer à titre d'exemple les mutations obser-vees dans les formes familiales de la maladie d'Alzheimer.
Avart~ cPmpnt~ la séquence codant pour le précurseur du peptide amyloide est placee sous le contrôle de signau.~ d'~lv~co~;ull ~étérologues permettant son expression dans les cellules infectées. Au sens de la présente invention, on entend par ~5 signaux d'expression héLcL~ u~,o des signaux différents de ceux naturellennent IL~ r",~ de l'~~ coo;v~ du précurseur du peptide amyloïde. Il peut s'agir en part;culier de séquences l~ de l'expression d'autres protéines, ou de sequences synthétiques. Nu,lal"..l~.~l, il pêut s'agir de séquences ~lVllll~tL;.,Cs de gènes eucar,L~otes ou viraux. Par exemple, il peut s'a~ir de séquences ,L)L~lllULli~,Cs issues du 30 génome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences vLI i~,eS is~ues du génome d'un virus, y compris l'adenovirus utilisé.
2~
~ WO9~122616 ,~I/r~ . lu/
s Préfér.~nfiP~ mrnt la séquence d'ADN est placée sous le contrôle de signaux d'P~tJLca:~iulL permettant son expression dans le système nerveux d'un animal, choisis de préférence parmi les ,LJI V~ I IV~UI a dbrigine virale.
Plus pL.~i.uli.,~ .ll, on peut citer par exemple les IUlV~ Jt~,~JLà ElA, MLP, s CMV, LTR-RSV, etc.
En outre, les séquences Ll'~ aaivll peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation de régulation, ou permettant une expression tissu-spécifique. ~
peut en effet étre pal li~ulicl~lllelll intéressant d'utiliser des signaux Ll'L ,.I~lc~-aiv., actifs aL)ccirir~uè~ OU lll~julilail~lllcllL dans les cellules nerveuses, de manière à ce que la U séquence d'ADN ne soit exprimée et ne produise son effet que lorsque le virus a L,r[r,~ ",~"~ infecté une cellule nerveuse. A cet égard, on peut citer par exemple le promoteur de la GFAP
Dans un mode l~d.Li~uliclclll~ aYantageux, I'~clcllvvi,u, de l'invention comprend une séquence d'ADN codant pour une forme du précurseur du peptide amyloide sous controle du LTR-RSV. ~omme le montrent les exemples, cette construction permet en effet d'exprimer de maruère très eEficace et durable ladite sequence d'ADN dans le système nerveux des animaux, et d'induire rapparition de symptômes facilement detectables de la maladie d'Alzheimer.
Les adéno~irus recrmhinrntc dérectifs selon l'rnvention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier ~Levrero et al., Gene 101 (1991)195, EP 18~ 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par l.~r cll~ homologue entre un adénovirus et un plasrnide portant entre autre la séquence d'ADN. La l~ ;"~ homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La 2s lignée ce~lulaire utilisée doit de préférence Q) être IL~larvLlllable par lesdits élémerLts, et (ii~, comporter les séquences capables de .~.,,,.l,I~.,,P,,IP, la partie du génome de l'~rrJ~rlv~;ius défectif, de preférence sous for~ne intégrée pour éviter les risques de ~cvlllbillaia~lrl~ A titre d'exemple de lignée, on peut lllcllLiulu~ Ia lignée de oein embr~onn~ire humain ~93 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 ~1977) 59) qui contient ~,)lu,l,l,.~.,l intégrée dans son genome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (1~ ~o) Des stratégies de ~:UlLaLLUr~tiVIl de vecteurs derivés des adénovirus ont également été décrites dans les demandes n FR 93 05954 et FR 93 08596.
W0 95/22616 ~ r~-~,r~
Ensuite, lei adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techn3ques classiqaes de bialogie "lole~uldil~;, comme illustré dans les exemples.
Un autre objet de l'invention ooncerne rutilisation d'un adénovirus tel que défini ci-avant pour la préparation d'un modèle animal de la maladie d'Al~heimer.
I,'invention concerne egalement tout modele animal de la maladie d'Alzheimer CUI~I~Jll,.lall~ un mammifère non-humain contenant un adénovirus le~ tel que défini ci-avant.
(:omme indique ci-avant, I'utilisation des vecteurs décrits ci-avant permet de manière tOUI à fait i,Y~ c~u~ de preparer des modèles animaux de ~a maladie d'Alzheimer fiables et particulierement simples à utiliser. Plus particulierement, dans ces modèles, I'~l;..uvilu~ ~r~ est administré par injection et, encore plus préférPnti.~ tn~nt par injection directe dans le système nerveux central. Ce mode d'~.l",;";~ est particulièrement avantageux puisqu'il permet au vecteur d'infecter rapidement et rrr;~ les cellules nerveuses, ~ sans etre disséminé
15 dans le reste de l'organisme.
L'injection directe dans le systeme nerveux central est réalisée de préférence au mo~en d'un a~)parei~ d'injection s~,cu~,,ique. L'emploi de ce type d'appareil permet en effet de cibler a~ec une grande precision le site d'injection, comme le montrent les e~emples.
Avant~ Pmf~nt~ lC.. ~JV;IU~ Irc~ l est administré sous forrne de solutions, et en particulier de solutions stériles, ;Y~ P~ ou de ~
seches, notamment IyLJ~l~ili.,f,~." qui, par addition selon le cas d'eau sterilisée ou de sérurn physiologiqueA permettent la ~ , de solutes injectables.
Les doses d';.d~ Yiius ,~,.""1,;,. ,1 défectif utilisées i~our l'injection et le2s nombre d'injections peuvent être adaptées en fonction de différ~nts paramètres, et notamment en fonction du mode d'R~ nl;~ utilisé, de l'animal utilisé, etc. D'unemanière générale, les adénovirus ,~, ..,.1~;1.~,ll~ selon l'invention sont forrnulés et dL~IllilLis~ SOUS forme de doses comprises entre 10~ et 10l4 pfu/ml, et de préférence 106 à ~010 pfu/ml. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir 30 infectieux d'une solution de virus, et est déterrniné par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 48 heures, du nombre de plages de cellules ~ 1 8~
~N0 95122616 ~ r ~
infectées. Les techn;ques de ~ du titre pfu d'une solution virale sont bien ,1. ~ . .. I.r . .t~ dans la littérature.
Le nombre d'injections peut Ysrier selon les cas, entre I et 5.
De préférence, les adénovirus ~æc~ sont all~ ~..~ à un animal âgé
s de 1 à 25 semaines, de préférence de 4 à 20 semaines. Plus ~ 111 encore, I'injection est réalisée sur des animaux de 8 à 10 semaines.
Le mammifere non-humain utilisé pour la iJ~éiJalalio-l des modèles selon l'invention est av~nt~ crmrnt ci~loisi pnrmi les rongeurs. Plus iJ~rélr..1;rllrmr~nt, il s'agit d'une souris, d'un rat, d'un cobaye ou d'un lapin. Toutefois, d'autres animaux, 10 comme le lémurien, peuvent également être utilisés.
La présente invention décrit égalemellt un procédé de l,lc-ip~Li~ll d'un modèle animal de In maladie d'Alzheimer selon lequel on administre, à un mammifere non-humain, un adénovirus recombinant ~:UllliJ~ lli une séquence d'ADN codant pour une forme du précurseur du peptide amyloide.
La présente invention a éga lement pour objet un procédé de mise en évidence de composes ou ~ )u~ iulla actifs vis-à-vis de la maladie d'Alzheimer selon lequel on administre ledit composé ou ladite ~ a un animal tel que décrit ci-dessus, et on détermine son activité sur les effets induits par l'adénovrius ~æ~ . ,.1 .l ,:..,... I
AvRi~t~ c~mrnt, le composé ou la ~ est administré par voie 20 orale, topique, parentérale, intranasaie, i~ n~a~e~ t~ sous-cutanée, intraoculaire, ll~,.s.i~. ,.,i~Lue, etc.
L'invention comprend aussi tout composé ou r nmrncitinn actif vis-à-vis de la maladie d'Alzheimer, obtenu par le procédé décrit ci-avant.
La plésente invention sera plus ~ décrite à l'aide des exemples 2s qui suivent, qui doivent etre considérés comme illustratifs et non iimitatifs, Lé?en~le ~l~c fu~llres Figure 1: R~iJlésellldLiul~ du vecteur pXL2244 Figure 2: R~iJI~IL~ JII du vecteur pSh-Ad-APP6,5 2 ~ ~7i~T
W095112616 ~ rr~ io/ ~
Techni~lles ~énérales de biolo~ie 1~O~
Les méthodes l`IA~ 1- 11 utilisees en biologie mnl~ , teiies que ies extractions ~ L;~o d'ADN ~ , la ~ LIi~u~ Liul~ d'ADI~ en gradient de chlorure de césium, l'éle~l.upl,v.;3~ sur gels d'agarose ou ~ yl~ulli~, la 5 purification de fragments d'ADN par él~LLu,,luLiul~, les extraction de protéines au phénol ou au phenol-ul,luluru,~, la pl~c;~ LiLul~ d'ADN en rr~iiieu salin par del'éthanol ou de l'jDUiJI~J.~IIC~I~ la L~ ru~ LiOn dans F.~chPrirhil~ cûli, etc ... sont bien connues de l'homn e de métier et sont ~i~o..~LL..I~.~L décrites dans la litterature [Maniatis-T. et al., "Molecular C~oning, a Laboratory Manual", Cold Spring Hrrbor Labcuatory, 0 Cold Spring Marbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protoco~s in Molecular Biology", John Wiiey & Sons, New York, 1987].
Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de ia série Ml3 sont d'origine L,U~ (Bethesda i~esearch T sa~l~r~trlriP~) Pou~ les l;gatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur t~ie 15 par électrophorèse en gels d'agarose ou Li'~ulylal~ ic~ extraits au phénol ou par un mélange phénoi/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN
ligase du phage T4 (Biolabs) selon les ~ du r ,- ll~
Le ,e"~ des extrémités 5' ~LU6.llL~ tu., peut étre effectué par le fragment de Klenow ~ie l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les ~ rj. ..~;~.,.~.
20 du fournisseur. La destruction des extrémités 3' t"~ ..,l.t~ est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilrsée selon les ..~. ~.l.,... - ..l ,l;"".~ du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuee par url traitement ménagé par la nucléase Sl.
La ~l~u~ SC dirigée irl vitro par OI;~;VUWAYIIUC~ ;d~ y~Ll~ ., peut 25 etre effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. l3 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham.
L~a~ ;r;~ l;. ..l enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR
Lolymerase-catal~,ed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 2.~Q (1985~ 1350-1354; Mullis K.B. et Faioûna F.A., Meth. Enzym~ 155 (1~87) 335-350] peut ~tre 30 effectuee en utilisant un UDNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant.
La ~ r~ Liu,l des sé~luences ll~ Ir~ peut etre effectuée par la methode dé~eloppée par Sang~r et a~. IProc. Natl. Acad. Sc;. USA, 74 (1977~ 5463-54671.
~ WO9S/22616 2 ~ 7~ rhs ~Y~mples Exemple 1. C1J~L~ ljOII dll vecteur pSIl-Ad~APP695.
Cet exemple décrit la construction d'un vecteur CUIII,L~I~ une séquence d'ADN codant pour le précurseur du peptide amyloide ~PP695 sous le controle d'un5 promoteur constitué par le LTR du virus du sarcome de rous (LTR-RSV).
1.1. Vecteurs de départ:
- Vecteur pXL2244: Le plasmide p~L2244 contient l'ADNc de rApoAI sous le c~ntrole du promoteur LTR du virus RSV, ainsi que des séquences de l'~d~ u~
AdS (figure 1). Il a été construit par insertion d'un fragment Clal-EcoRV contenant 10 I'ADNc cGdant pour la préproApoAI dans le Yecteur pLTR RSV-Bgal (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90 ~19g2) 626), digéré par les meme enz~Ymes.
- Vecteur pSVK3 APP695: Ce ~ecteul contient une séquence codant pour l'isoforrrle 695 du précurseur du peptide amyloide (fourni par le Dr. J.N. Octave) (~ang et al. précitée).
1.2. Construction du vecteur pSh-Ad-APP695 Cet exemple decrit la construction du ~ecteur pSh~Ad-APP695 contenant la séquence codant pour l'isoforrne 695 du précurseur du peptide amyloide sous controle du LTR du virus RSV, ainsi que des séquences de l'adénoYirus Ad5 permettant la l~rj""l.;"..;~ in vivo.
Le vecteur pSVK3 APK95 a été digéré par les enzymes EcoRV et Sall. Le fragment EcoRV-Sall de 2 k~ contenant la sequence codant pour risoforme 695 du precurseur du peptide amylo;de a ensuite été isolé et purifie par él~lLupllG,~ sur un gel d'agaro.se LMP ('`Lo~v Melting Point"). Par~llPlPrnPnt le vecteur pXL2244 a été
traité par l'enzyme de restriction Clal (site en position 1089 sur la &gure 1). Les 2s extrémites ont ensuite éte rendues franches par traitement en presence du fragment klenow de l'ADN polymérase. Le vecteur a ensuite été digéré par l'enzyme Sall (site en position ]930 sur la figure 1). Le vecteur linéaire de 7 kb résultant a ensuite été isolé
et purifie par éle~lLu~ ;... sur un gel d'agarose LMP. Les fragments de 2 et 7 kb ainsi obtenus ont ensuite eté ligaturés pour générer le vecteur pSh-Ad-APP695 30 (figure 2~.
~i&~:724 W095/2261C T~ rl_ '~ i Exemple 2. ~ ' du Yecteur pSh-Ad-APP695 La capacité du vecteur pS~I-Ad-APP695 a exprimer sur culture cellulaire l'isoforrne 695 de rAPP a éte démontrée par ~ r~ transitoire de cellules COSl.
Pour cela, les cellules (106 cellules par boite de 10 cm de diamètre) ont éte s ~ rn,~S 18 llg de ~ecteur) en presence de Tnin~f~i~rn Apres 72 heures, les protéines totales et sécrétées ont été analysées en westem blot. A cet effet, les protéines sont séparées selon leur masse par éle~ p~lv,~ sur un gel de polyd~lyld~llide pUiS transférées sur une membrane de nitrocellulose. La présence d'APP est ensuite confirrnée par réaction ;~ selon la méthode ECL
lo (Amersham~ en utilisant l'anticorps spécifique 22Cl1 (Boehringer).
Exemple 3. Cu~ Ll U.~iOl~ de l'~d~. -u ~ ;- u~ Ad-APP695 Le vecteur pSh-Ad-APP695 a eté Irnéarisé et ~ avec un vecteur adénoviral déficient, dans les cellules helper (lignee 293) apportant en ~ans les fonctions codées par les régions E1 (El A et E1 B) d'al;.l~vu us.
Plus p.~i~.~ , I'adéno~itus Ad-APP6g5 a été obtenu par ~ 3 ~
homologue in vivo entre l'adénovirus mutant Ad-dll324 ('IllillUlldU~/dyd et al., Cell 31 (1982) 543) et le vecteur pSh-Ad-APP695. selon le protocole suivant: le plasmidepSh-Ad-APP695 et r~l~ v;lus Ad-dll324, linéarisé par l'enzyme ClaI, ont été co-tran.sfectés dans la lignée 293 en presence de phosphate de calciurn, pour permettre la It~,~JllllJil~di~VII hr~n~ P Les adénovirus ,~ rlinsi genérés ont été
~al~c~ nn~c par purification sur plaque. Après isolement, I'Al~N de l'dd~.~oYi-~Ls rP nnl~-inant a été ampliîié dans la lignée cellulaire 293, ce ~ui conduit à un surnageant de culture contenant l'adénovirus défectif l~ non ptnifié ayant un titre d'environ 101 pfulml.
2s I~es particules virales sont ensuite purifiées par ~ - ;r.~ sur gradient de chlorure de césium selon les techniques connues (voir llvta~ Gra~tam et al., Virology 52 (1973) 45b). L'adenovirus Ad-APP695 peut être conservé à -80C dans 20 % de glycerol.
Exemple 4.1~ l.lr de l'adétlovir~w Ad-APP695 La capacité de l'~dc.,vYL"~s Ad-APP695 à exprimer sur culture cellu}aire l'isoforme 695 de l'APP a été démontrée p:~r infection des c,ellules de la lignée 293. La ~ WO9.iQ2616 ~ 1 8~724 .~1111 t JO/
présence d'APP dans les ce~luies a ensuite été déterminée dans les mêmes conditions que dans ~'exemple 2.
Ces études permettent de montrer que ~ VV;IU~I exprime bien le variant 695 de l'APP en culture cellulaire.
s Exemple 5. Co,~L- u..i~"~ d'l~n modèle animal Cet exemple décrit la ~:LJIl~L~uuLi~r~l d'un modèle animal de la maladie d'Alzheimer contenant un adénovirus capable d'exprimer le variant 695 de l'APP.
L`adénovirus prépûré dans l'exemple 3 est utilisé sous forme purifiée (3,5106 pftll~l), dans une solution saline phosphate (PBS).
Les animau~ prP~l~Qhl~msnt snP~th~ , sont préparés par injections directes dans le s~stème ner~.~eux central et, plus LJI~-is~".~.,L, au niveau de l'~ et du cortex entorhinal. Les injections sont réalisees à l`aide d`une canule (diamètre extérieur 280 ,um) connectée à une pompe. La vitesse d`injection est fixée a 0,5 ~/min, après quoi~ la canule reste en place pendant 4 minutes .s~rrl~nv~ntsireS avant d`etre remontée. Le volurne d'injection dans l'~ p~ et le cortex entorhinal est de 1 1ll.
La dose d'adénovirus injectée est de 3,5. 106 pful,u1.
Pour l'injection dans l'hippocampe, les ~ stéréota~iques sont les suivantes: AP=-2,0; ML=1,5; V=-2,5 (les cooldonnées AP et ML sont ~h.llliu~6.CS
par rapport ûu bregma, la coordonnée V par rapport à la surface de l'os cranien au ni~eau du bregma.
Pour l`injection dans le cortex entorhinal, les coordonnées stéréota~iques sont les suivantes: AP=-3,5; ML=3,5; V=-3,7.
Les injectinns suivantes sont réalisées:
- 11 souris C57B116 mâles, agées de 2 mois, sont injectées avec 3,5. 106 2s pfullll d`adénovirus ad-APP et 4 avec 3~5. 106 pfu/lll d`adénovirus ad-APP + 3,5. 105 pfu/~tl L~ d~ vil us ad-13Gal (Le Gal La Salle et al., Science 259 (1993) 988~.
- 5 souris C57BI/6 males~ agées de 2 mois~ sont injectées avec 3,5. 106 pfu/,ul d'adénovirus ad-13Gal.
Analyse hi.~tolo~ique Au cours du temps (7, 15, 30 et 60 jours après l`injection) la su,~ de l'APP695 au niveau du site d`injection illLld~ bLdl est analysée par i"."~
21~24 WO g'.V22616 P._llrn ~ ol Les animaux sont sacrifies, sous anesthésie, par perfus;on intr~rs-~ii,-ll--r- de 4%
paraformaldéhyde. Après ~ "..-~ et post-fixation (2 heures), le ceneau est coupéau cryomat: dec coupes de 40 ~m d'épaisseur sont recueillies dans du tampon. Cescoupes flottantes sont ensuile traitées pour la révélation ;~ p,j-L,r de s l'APP695 par un anticorps spécifique 22C11 ~13';i.h.iUlj~ L) (méthode de skc~L~Lvi~iU~
biotine peroxydase1-En plus de l'analyse hict~ iql~P ~m~nt~nt la bUUG~LGSSi~ll de l'APP695, les animaux de l'inverttion per.mettent de mettre en é~idence l'incidence de cette ~LL~ JL~a~iUII sur le L~GV~ de pathologies céré~rales liees à la maladie d'Alzheimer, comme la présence de protéine ~-amyloide en dépots diffus ou en plaques, la présence de LJ~ G.Ga~G~ neurofibrillaires et de plaques neuritiques, ou encore des pertes neuronales et ~,y~a~)Li~ur,S. Comme pour l'APPt;gS, la présence de beta-A4l P.'~F, 11biquitine et GFAP est déterminée par " ", """~ . ,Irigir Dans ce cas, I'immunohistologie est réalisée sur coupes en paraffirte, le ceneau ayant éte lS prr~l~hll~m~nt deshydraté et inclu en paraffine.
Analyse ~v"~ ,." ~ Glll~dc Les animaux de l'in~ention permettent également de mettre en évidence l'incidence de lâ su,G,~, Gaaion d'APP695 sttr le L,u~ ullGIllG~ll, et en parti~lier, sur les processtls mnésiques. A cet ég~rd, le test de la piscine (R. Morris, J. Neuro.sc. Meth.
ZO 11 (1984~ 47) permet de mesurer l'effet de l'injection de l'adéno-APP, et é-~nt ~ mf~t d'un composé ou d'une ~:LJIll,L~Oai~iv~ à tes~er, sur certains de ces processus.
Claims (23)
1. Adénovirus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADN codant pour une forme du précurseur du peptide amyloïde.
2. Adénovirus selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il est dépourvu des régions de son génome qui sont nécessaires à sa réplication dans la cellule cible.
3. Adénovirus selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un adenovirus humain de type Ad2 ou Ad5 ou canin de type CAV-2.
4. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la séquence d'ADN hétérologue code pour tout variant naturel ou synthétique de l'APP.
5. Adénovirus selon la revendication 4 caractérisé en ce que la séquence d'ADN hétérologue code pour l'APP695, l'APP751 ou l'APP770.
6. Adenovirus selon la revendication 4 caractérisé en ce que la séquence d'ADN hétérologue code pour le précurseur du peptide amyloïde tronqué dans sa région N-terminale.
7. Adénovirus selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que la séquence d'ADN est placée sous le contrôle de signaux d'expression permettant son expression dans le système nerveux d'un animal, choisis de préférence parmi les promoteurs d'origine virale.
8. Adénovirus selon la revendication 7 caractérisé en ce que les signaux d'expression sont choisis parmi les promoteurs E1A, MLP, CMV et LTR-RSV.
9. Adénovirus recombinant défectif caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'ADN codant pour une forme du précurseur du peptide amyloïde sous contrôle du LTR-RSV.
10. Utilisation d'un adénovirus selon l'une des revendications 1 à 9 pour la préparation d'un modèle animal de la maladie d'Alzheimer.
11. Modèle animal de la maladie d'Alzheimer caractérisé en ce qu'il s'agit d'un mammifère non-humain contenant un adénovirus recombinant selon l'une des revendications 1 à 9.
12. Modèle animal selon la revendication 11 caractérisé en ce que l'adénovirus recombinant est administré par injection.
13. Modèle animal selon la revendication 12 caractérisé en ce que l'adénovirus recombinant est administré par injection dans le système nerveux central.
14. Modèle animal selon la revendication 13 caractérisé en ce que l'adénovirus recombinant est administré par injection dans le système nerveux central au moyen d'un appareil d'injection stéréotaxique.
15. Modèle animal selon l'une des revendications 11 à 14 caractérise en ce que l'adénovirus recombinant est administré à un animal agé de 1 à 25 semaines, et de préférence, de 4 à 20 semaines.
16. Modèle animal selon l'une des revendications 11 à 15 caractérisé en ce que l'adénovirus recombinant est administré sous forme d'une solution stérile partiellement purifiée.
17. Modèle animal selon l'une des revendications 11 à 16 caractérisé en ce que le mammifère non-humain est choisi parmi les rongeurs.
18. Modèle animal selon la revendication 17 caractérisé en ce qu'il s'agit d'unesouris, d'un rat, d'un cobaye, d'un lémurien ou d'un lapin.
19. Procédé de préparation d'un modèle animal de la maladie d'Alzheimer caractérisé en ce que l'on administre, à un mammifère non-humain, un adénovirus recombinant comprenant une séquence d'ADN codant pour une forme du précurseur du peptide amyloïde.
20. Procédé de mise en évidence de composés ou compositions actifs vis-à-vis de la maladie d'Alzheimer caractérisé en ce que l'on administre ledit composé ou ladite composition à un animal selon l'une des revendications 11 à 18, et on détermine son activité sur l'effet induit par l'adénovirus recombinant.
21. Procédé selon la revendication 20 caractérisé en ce que le composé ou la composition sont administrés par voie orale, topique, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire ou transdermique.
22. Composé actif vis-à-vis de la maladie d'Alzheimer, obtenu par le procédé
selon les revendications 20 à 21.
selon les revendications 20 à 21.
23. Composition active vis-à-vis de la maladie d'Alzheimer, obtenue par le procédé selon les revendications 20 à 21.
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