CA2184408A1 - Adenovirus recombinants pour le facteur de maturation des cellules gliales de type beta (gmf-.beta.) - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne des adénovirus recombinants comportant une séquence d'ADN hétérologue codant pour le facteur de maturation des cellules gliales type béta (GMF-.beta.), leur préparation, et leur utilisation, en particulier pour le traitment et/ou la prévention des maladies neurodégératives ou des tumeurs du système nerveux central.

Description

wo 9512s802 pcTlFR9sloo248 ADENOVIRUS RECOMBINANTS POUR LE FACTEUR DE MATURATION DES CELLULES GLIALES
DE TYPE BETA (GMF-~) La présente invention conç.orne des vecteurs recombin~ntc d'origine virale et leur utilisation pour le traitement et/ou la prevelllion des m~ liec neuro~é~nératives.
5 Plus particulièrement, elle concerne des adénovirus recombinants comportant une séquence d'ADN codant pour le facteur de maturation des cellules gliales type béta (GMF-~, "glial maturation factor"). L'invention concerne ég~l~ment la préparation de ces vecteurs, les compositions pharmaceutiques les contenant et leur utilic~tionthérapeutique, notamment en thérapie génique.
o Les m~ ies neurodégénératives représçntçnt une large part des dépenses de santé dans les pays ocrirlent~llx~ part qui ne cesse de s'accroitre suite au viçini.~
de la population. Au titre de ces affections, on peut citer notamment la maladied'~l7heim~r, le maladie de Parkinson, la chorée de Hllntington, la sclérose latérale an-yol~vphique, etc. Les signes pathologiques et l'étiologie de ces m~ içs sont fort variés, mais toutes résultent d'une perte progles~ive de cellules neuronales dans le système nerveux central, parfois au sein de structure très loc~ c comme la subst~n-~e noire dans la maladie de p~rkincon Bien que certains tr~it~om~nt.c ph~rm~cologiques p~ tifc soient déjà disponibles, leurs effets sont relalive,llelimités. La p,ése"Le invention décrit une approche thé,apeulique nouvelle, particulièrement avantageuse pour le tr~itement de ces m~ liçs. Plus particulie~,ne,lt, la présente invention décrit des vecteurs permettant de promouvoir directçmçnt la survie des cellules neuronales impliquées dans ces pathologies, par e~ ssion efficace et localisée de certains facteurs trophiques.
Les facteurs trophiques sont une classe de molécules ayant des propriétés de stim~ tion de la croissance neuritique ou de la survie des cellules nerveuses. Le premier facteur possédant des propriétés ne~u~,uphiques, le NGF ("Nerve Growth Factor"), a été caractérisé il y a une qual~ aille d'années (pour revue, voir Levi-Mont~l~ ini et Angelleti, Physiol. Rev. 48 (1968) 534). Ce n'est que réc~mm~nt que d'autres facteurs neurotrophiques ont été i~l~ntifi.os, tel que notamment le facteur neuro~luphique dérivé du cerveau (BDNF) (Thoenen, Trends in NeuroSci. 14 (1991) 165), le CNTF, etc. La dem~n~çresse s'est intéressée plus particulièrement à un facteur trophique désigné facteur de maturation des cellules gliales, possél~nt certaines propriétés avantageuses. Le GMF-13 est un facteur trophique isolé en premier lieu à

40~
wo 95/25802 PCr/FR95100248 partir du cerveau bovin (Lim et al., PNAS 86 (1989) 3901). Le GMF-~ possède un poids moléculaire de 17 kD, et est synthétisé essenti~llçmPnt dans les astrocytes, bien qu'une présence au niveau des neurones ait été détectée récemm~nt (Zaheer et al., J.
Neurochem. 60 (1993) 914). Conllai~e-llent à la plupart des facteurs trophiques, le 5 GMF-13 est présent essentiellement dans le cytosol des cçll~ s, et seul un faible po~,rcenlage est sécrété et exposé à l'extérieur des c~ le~ sur la membrane plasmique. Le GMF-~ stimule la croissance de neurites dans le test classique desganglions de la racine dorsale (DRG). Par ailleurs, il est capable de promouvoir la dirr~l~nciation de certaines lignées cellulaires telles que des gliomes (C6) ou des lo neuroblastomes (N18) (Kaplan et al., J. Neurochem. 57 (1991) 483). Cette activité se traduit par un effet antiprolifératif sur lesdites lignées tumorales, activité qui n'existe pas v;s-à-vis des cellules normales (Lim et al., Cell Regulat. 1 (1990) 741).
Le GMF-~ possèdent donc in vitro certaines propriétés particulièrement intér~os.~nt~s Toutefois, l'application thérapeutique du GMF-J3 se heurte à différents obst~ es En particulier, l'absence de biodisponibilité du GMF-13 limite toute utili~tion thérapeutique. Par ailleurs, il n'existe pas de moyens effi~ces permettant de délivrer le GMF-13 de manière durable et localisée à certaines régions désirées de l'organisme.
Enfin, il est essentiel que le GMF-~ délivré soit actif et puisse exercer une activité
thérapeutique in vivo.
La présente invention apporte une solution particulièrement avantageuse à ces problèmes. La présente invention réside en effet dans la mise au point de vecteurs particulièrement effi~c~s pour délivrer in vivo et de manière localisée, des quantités thérapeutiquement actives de GMF-~. Dans la dem~nde co~-nd~nte n PCT/EP93/02519, il a été montré que les adénovirus pouvaient être utilisés pour le ll~nsre,l de gènes in vivo dans le système nerveux. La présente invention concerne des constructions nouvelles, particulièrement adaptées et ~ffit~c~ pour le transfert d'un gène spécifique dans le système nerveux. Plus particulièrement, la présente invention concerne un adénovirus recombinant comprenant une séquence d'ADN codant pour le facteur de maturation des cellules gliales (GMF-13), sa pr~paralion, et son utilisation pour le traitement et/ou la prévention des maladies neurodégénératives ou de certaines tumeurs, notamment des tumeurs centrales.
La dem~n~leresse a m~inten~nt montré qu'il est possible de construire des adénovirus recombinants contenant une séquence codant pour le GMF-~, d'arlmini~trer

2 1 ~4408 wo gs/25802 Pcr/FRs5/00248 ces adénovirus recomhin~nts in vivo, et que cette ~lmini~ration permet une expression stable et localisée de quantités thérapeutiquement actives de GMF-~ in vivo, et en particulier dans le système nerveux, et sans effet cy~opaLllologique. Les propriétés particulièrement avantageuses des vecteurs de l'invention découlent 5 nol~n~.. ont de la construction utilisée (adénovirus défectif, délété de certaines régions virales), du promoteur utilisé pour l'e~cs~ion de la séquence codant pour le GMF-~
(promoteur viral ou tissu-spécifique de préférence), et des méthodes d'~mini~ation dudit vecteur, permettant l'e,~p~e~ion efficace et dans les tissus app-.)p.iés du GMF-~.
La présente invention fournit ainsi des vecteurs viraux utili.~hles directement en o thérapie génique, particulièrement adaptés et ~fficaces pour diriger l'expression du GMF-J3 in vivo. La présente invention offre ainsi une nouvelle approche particulièr~mc"t avantageuse pour le traitement et/ou la p eve-lLion des m~ c neurodégénératives ou des tumeurs centrales.
Un p.c~llier objet de l'invention réside donc dans un adénovirus recombinant 5 défectif co,llp.ellant une séquence d'ADN codant pour le facteur de maturation des cellules gliales type 13(GMF-B)ou un dérivé de celui-ci.
L'invention a égAlem~nt pour objet l'utilisation d'un tel adénovirus recombin~nt défectif pour la p-~pal~lion d'une col"~silion pharm~ceutique destinée au traitement ou à la plcvention des maladies neurodégéné-dlives.
Le facteur de maturation des cellules gliales type ~ (GMF-~ produit dans le cadre de la présente invention peut être le GMF-13 humain ou un GMF-~ animal. Enparticulier, la séquence d'ADN codant pour le GMF-~ humain a été clonée et séquencée (Kaplan et al., J. Neurochem. 57 (1991) 483). Préalablement à leur inco~o.~lion dans un vecteur adénovirus selon l'invention, ces séquences sont 25 avantaget~s~ment modifiées, par exemple par mllt~èse dirigée, en particulier pour l'insertion de sites de restriction appr~ iés. Les séquences décrites dans l'art antérieur ne sont en effet pas construites pour une utilisation selon l'invention, et des adaptations préalables peuvent s'avérer n~ces.s~ires, pour obtenir des e~ressions illlpOI ~antes (voir exemple 1.2.). Dans le cadre de la présente invention, on préfère utiliser une séquence 30 d'ADN codant pour le facteur de maturation des cellules gliales type ~ humain(hGMF-~). Par aill~ll~, comme indiqué ci-avant, il est également possible d'utiliser une construction codant pour un dérivé du GMF-~, en particulier un dérivé du GMF-13 hl1m~in. Un tel dérivé comprend par exemple toute séquence obtenue par mutation,délétion et/ou addition par rapport à la séquence native, et codant pour un produit wo 95t25802 Pcr~Rs5loo248 conservant l'une au moins des propriétés biologiques du GMF-J3 (effet trophique et/ou dirrérl~nl;~tellr et/ou antiprolifératif des cellules tumorales). Ces modifications peuvent être réalisées par les techniques connues de l'homme du métier (voir techniques générales de biologie moléculaire ci-après et exemple 2). L'activité biologique des 5 dérivés ainsi obtenus peut ensuite être ~i~ém~nt ~lét~rmin~e, comme indiqué
nol~.n...~nt dans l'exemple 3. Les dérivés au sens de l'invention peuvent également être obtenus par hy~ri~tiQn à partir de banques d'acides nucléiques, en utilisant comme sonde la séquence native ou un fra~ment de celle-ci.
Ces dérivés sont notamment des molécules ayant une plus grande affinité
pour leurs sites de fixation, des séquences permettant une e~ ion améliorée in vivo, des molécules pr~sent~nt une plus grande rési~t~n~e aux protéases, des molé,cules ayant une efficacité thérapeutique plus grande ou des effets secon~l~ires moindres, ou éventt~ellement de nouvelles propriétés biologiques.
Parmi les dérivés préférés, on peut citer plus particulièrement les variants naturels, les molécules dans lesquelles un ou plusieurs résidus ont été substitués, les dérivés obtenus par délétion de régions n'inle, venanl pas ou peu dans l'interaction avec les sites de liaison c-)n~i(lerés ou exprimant une activité indésirable, et les dérivés comportant par rapport à la séquence native des résidus supplémentaires, tels que par exemple un signal de sécrétion et/ou un peptide de jonction.
De ,lla~ particulièrement avantageuse, la séquence de la présente invention co..l;e~.l un signal de sécrétion permettant de diriger le GMF-~ synthétisé
dans les voies de sécrétion des cellules infectées, de manière à ce que le GMF-J3 synthétisé soit libéré dans les colllpa~ lents extracell~ ires et puisse activer ses réce~leuls. Le signal de sécrétion utilisé peut être tout signal de sécrétion hétérologue 25 ou même artificiel. Avantageusement, il s'agit d'un signal de sécrétion actif dans les cellules hllm~in~s, notamment nerveuses. De manière préférée, on utilise le signal de sécrétion d'une cytokine, et notamment de l'i.lle,rer~n de fibroblastes hllm~in, qui permet des niveaux de sécrétion élevés de GMFJ3.

La séquence d'ADN codant pour le facteur de maturation des cellules gliales utilisée dans le cadre de la présente invention peut être un ADNc, un ADN génomique (ADNg), ou une construction hybride consistant par exemple en un ADNc dans lequel seraient insérés un ou plusieurs introns. Il peut également s'agir de séquences synthétiques ou s~lni~yl,Lhétiques. De manière particulièrement avantageuse, on utilise 21 ~4~08 wo 95/25802 PCTtFR95tOo248 un ADNc ou un ADNg. En particulier, I'utilisation d'un ADNg peut permettre une meilleure expression dans les cellules hllm~ines.
Dans un premier mode de réalisation de l'invention, l'adénovirus co"lprend donc une séquence d'ADNc codant pour le facteur de maturation des cellules gliales 5 (GMF-~). Dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention, l'adénovirus comprend une séquence d'ADNg codant pour le facteur de maturation des cellules gliales (GMF-~). Avantageusement, la séquence d'ADN code pour le GMF-13 précédé
d'un signal de sécrétion et, de préférence, du signal de sécrétion efficace dans les cellules humaines nerveuses.

Avantageusement, la séquence codant pour le GMF-J3 est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans les cellules nerveuses.
P'lerén:n~iPllp~rnpnt~ il s'agit de signaux d'expression hétérologues, c'est-à-dire de signaux différents de ceux naturellement responsables de l'expression du GMF-~. Il 15 peut s'agir en particulier de séquences responsables de l'expression d'autres protéines, ou de séquences synthétiques. Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotricesissues du génome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, y compris l'adénovirus utilisé. A
20 cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs ElA, MLP, CMV, LTR-RSV, etc.
En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une eA~ ion tissu-spécifique. Il peut en effet être particulièrement il,lé~ssallt d'utiliser des signaux d'~Ap,~ion actifs spécifiquement ou majoritairement dans les cellules nerveuses, de manière à ce que la 25 séquence d'ADN ne soit exprimée et ne produise son effet que lorsque le virus a effectivement infecté une cellule nerveuse. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs de l'énolase neurone-spécifique, de la GFAP, etc.
Dans un premier mode de réalisation particulier, l'invention concerne un adénovirus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADNc codant pour le 30 facteur de maturation des cellules gliales type ~ humain (hGMF-~) sous le contrôle du promoteur LTR-RSV.
Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention conceme un adénovirus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADNg codant pour le facteur de maturation des cellules gliales type ~ humain (hGMF-~) sous le contrôle du 35 promoteur LTR-RSV.

wo gs/25802 PCT/~k951~248 La d~-m~n~l~oresse a en effet montré que le promoteur LTR du virus du sarcome de rous (RSV) permettait une e~l,ression durable et importante du GMF-~
dans les cellules du système nerveux, not~mment central.
Toujours dans un mode préféré, l'invention ccincern~ un adénovirus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADN codant pour le facteur de maturation des cellules gliales type ~ humain (hGMF-13) sous le contrôle d'un promoteur permettant une e~p1e~sion majoritaire dans le système nerveux.
Un mode particulièrement préféré de mise en oeuvre de la présente ~llv~lllion réside dans un adénovirus recornbin~nt défectif comprenant les séquences ITR, une séquence permettant l'~n~p~ tiQn, une séquence d'ADN codant pour le facteur de maturation des cellules gliales type 13 humain (hGMF-~) ou un dérivé de celui-ci sous le contrôle d'un promoteur permettant une expression majoritaire dans le systèmenerveux, et dans lequel le gène E1 et au moins un des gènes E2, E4, L1-L5 est non fonctionnel.
Les adénovirus défectifs selon l'invention sont des adénovirus inc~r~hles de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Généralement, le génome des adénovirus défectifs utilisés dans le cadre de la pr~sen~e invention est donc dépourvu au moins des séquences necç~ires à la réplic~ti-~n dudit virus dans la cellule infectée.
Ces régions peuvent être soit eliminPes (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et not~mm~nt par la séquence d'ADN codant pour le GMF-J3.
Préférenti~ m~nt, le virus défectif de l'invention conserve les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'~n-~psifl~tion des particules virales. Encore plus p1~ré,e1,liellement, comme indiqué ci-avant, le génome du virus recomhin~nt défectif selon l'invention co,~,~re,ld les séquences ITR, une séquence permettant l'encapsidation, le gène E1 non fonctionnel et au moins un des gènes E2, E4, L1-L5 non fonctionnel.
Il existe dirré1~nts sérotypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétésvarient quelque peu. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus lli1"~ de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir clem~n(le FR 93 05954). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple: SAV). De préférence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus WO 95/25802 2 1 8 4 4 0 ~3 PCT~5100248 plerél~ iellement un adénovirus CAV2 [souche m~nh~ n ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte.

5 Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être plepales par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gene 101 (1991)195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être pr~pales par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre la séquence d'ADN codant pour le GMF-13. La recombinaison homologue 10 se produit après co-transfection desdits adénovirus et pl~mi~le dans une lignée cellulaire appropliée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) êtresro~n~able par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut 15 m~ntionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol.
36 (1977) 59) qui contiçnt notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 '3~o). Des stratégies de construction de vecteursdérivés des adénovirus ont également été décrites dans les clem~n~es n FR 93 05954 et FR 93 08596 qui sont incorporées à la présente par référence.
F.n~l-ite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés ælonles techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples.
Comme indiqué ci-avant, la présente invention concerne égalem~nt toute utili~tion d'un adénovirus tel que décrit ci-dessus pour la préparation d'une composition pharm~eutique destinée au traitement et/ou à la prévention des maladies 25 neurodégénératives. Plus particulièrement, elle concerne toute utilisation de ces adénovirus pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la plevelllion de la maladie de Parkinson, de la maladie d'Alzheimer, de la sclérose latérale amyc)l,~phique (ALS), de la maladie d'Huntington, de l'épilepsie et de la démence vasculaire. Elle concerne également l'utilisation de ces adénovirus 30 pour le traitement des tumeurs du système nerveux, not~mm~ns central. En particulier, on peut citer les médulloblastomes, les neuroblastomes, les gliomes, etc.
La présente invention concerne également une composition pharm~celltique comprenant un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs tels que décrits précédemm~nt Ces compositions pharmaceutiques peuvent être formulees en vue wo 95125802 PCT/FR95/00248 d'~lmini.~trations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, i~lldveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De ~neré~ ce, les co,nposilions pharmareuti(lues de l'invention conti~nn~nt un véhicule ph~rm~ceu tiquement acceptable pour une formulation injectable, n~ nt pour une injection 5 directe dans le système nerveux du patient. Il peut s'agir en particulier de solution.c stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, not~mm~nt lyophili~s, qui, paraddition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, p~rmett~nt la con~titution de solutés injectables. L'injection directe dans le système ne.v~:~ du patient est avantageuse car elle permet de concentrer l'effet thérapeutique au niveau 10 des tissus affectés. L'injection directe dans le système nerveux central du patient est av~nt~ em~nt réalisée au moyen d'un appareil d'injection stéréotaxique. L'emploid'un tel appareil permet en effet de cibler avec une grande précision le site d'injection.
A cet égard, l'invention concerne ég~lement une méthode de tr~item~nt des m~ s neurodégénératives comprenant l'administration à un patient d'un adénovirus15 recombin~nt tel que défini ci-avant. Plus particulièrement, l'invention conc~ e une méthode de traitement des maladies neurodégénératives comprenant l'a~ .;n;~.dlion stéréotaxique d'un adénovirus recombinant tel que défini ci-avant.
Les doses d'adénovirus recombinant défectif utili~é~os pour l'injection pellvenlêtre adaptées en fonction de di~réle,-~ paramètres, et notamment en fonction du mode 20 d'atimini~tration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du tr~it~m~nt recherchée. D'une manière générale, les adénovirus recombin~nt~ selon l'invention sont formulés et a~ ;n;~LIes sous forme de doses comprises entre 104 et 10l4 pfu/ml, et de pler~rence 106 à 101 pfu/ml. Le terme pfu ("plaque forming unit") co-lespond aupouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture 25 cellulaire apl,lupriée, puis mesure, généralement après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature.
Un autre objet de l'invention concerne toute cellule de m~.n.-~;rèle infectée par un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs tels que décrits ci-dessus. Plus 30 particulièrement, l'invention concerne toute population de cellules ht1m~in~s infectée par ces adénovirus. Il peut s'agir en particulier de fibroblastes, myoblastes, hépatocytes, kératinocytes, cellules endothéliales, cellules gliales, etc.
Les cellules selon l'invention peuvent être issues de cultures pli",ai~es. Celles-ci peuvent être prélevées par toute technique connue de l'homme du métier, puis mises wo ss/2s802 Pcr/FRs5/00248 en culture dans des conditions permettant leur prolifération. S'agj~s~nS plus particulièr~me"l de fibroblastes, ceux-ci peuvent être aisément obtenus à partir de biopsies, par exemple selon la technique décrite par Ham [Methods Cell.Biol. 21a (1980) 255]. Ces cellules peuvent être utili.cé~,~ directement-pour l'infection par les 5 adénovirus, ou conselvees, par exemple par congélation, pour l'ét~bli~cem~nt de banques autologues, en vue d'une utilisation ultérieure. Les cellules selon l'invention peuv~l-l également être des cultures secondaires, obtenues par exemple à partir de banques préétablies.
Les cellules en culture sont ensuite infectées par des adénovirus lO recombinants, pour leur conférer la c~p~it de produire du GMF-~. L'infection est réalisée in vitro selon des techniques connues de l'homme du métier. En particulier, selon le type de cellules utilisé et le nombre de copies de virus par cellule désiré, l'homme du métier peut adapter la multiplicité d'infection et événtuellement le nombre de cycles d'infection réalisé. Il est bien entendu que ces étapes doivent être effectuées 15 dans des conditions de stérilité appr.~p~iées lorsque les cellules sont ~lestin~s à une ~imini~tration in vivo. Les doses d'adénovirus recombinant~lltili~é~s pour l'infection des cellules peuvent être adaptées par l'homme du métier selon le but recherché. Les conditions décrites ci-avant pour l'~-in~;n;~ lion in vivo peuvent être appliquées à
l'infection in vitro.
Un autre objet de l'invention concerne un implant co,l,p~ellant des cellules n~.. ;~ infectées par un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs telles que décrites ci-dessus, et une matrice extracellulaire. ~lerére,lliellement, les impl~nt.~ selon l'invention co",p-~mlent 105 à 101 cellules. Plus ple~él~nliellement, ils en co,l.~u~ennellt 106 à 108.
Plus particulièrement, dans les impl~nts de l'invention, la matrice ex~-ell~ ire comprend un composé ~lifi~nt et éventuellement un support permettant l'ancrage des cellules.
Pour la préparation des implants selon l'invention, dirréle,.L~ types de gélifiants peuvent être employés. Les gélifiants sont utilisés pour l'inclusion des cellules dans une matrice ayant la constitution d'un gel, et pour favoriser l'ancrage des cellules sur le support, le cas échéant. Différents agents d'adhésion cellulaire peuvent donc être utilisés comme gélifiants, tels que notamment le collagène, la ~l~tine, les glycos~minoglycans, la fibronectine, les lectines, etc. De préférence, on utilise dans le wo 9s/25802 PCT/~h95~248 cadre de la présente invention du collagène. Il peut s'agir de collagène d'origine humaine, bovine ou murine. Plus p,~fé~nciellement, on utilise du collagène de type I.
Comme indiqué ci-avant, les compositions selon l'invention colllp,eimenL
avantag~ucement un support permettant l'ancrage des c'~ PS. Le terme ancrage 5 désigne toute forrne d'interaction biologique et/ou chimique et/ou physique e,ll,dî~
l'adhésion et/ou la fixation des cellules sur le support. Par ailleurs, les cellules peuvent soit recouvrir le support utilisé, soit pénétrer à l'intérieur de ce support, soit les deux.
On préfère utiliser dans le cadre de l'invention un support solide, non toxique et/ou bio-compatible. En particulier, on peut utiliser des fibres de polytétrafluoroéthylène 0 (PTFE) ou un support d'origine biologique.
Les impla~t~ selon l'invention peuvent hre impl~nt~o~ en dirfé,e,lls sites de l'organisme. En particulier, I'implantation peut être effectuée au niveau de la cavité
péritonéale, dans le tissu sous-cutané (région sus-pubienne, fosses iliaques ou inguinales, etc), dans un organe, un muscle, une tumeur, le système ne,v~:~x central, 15 ou encore sous une muqueuse. Les impl~nts selon l'invention sont particulièrement avantageux en ce sens qu'ils permettent de contrôler la libération du produit ~e,~peutique dans l'organisme: Celle-ci est tout d'abord déterminée par la ml-hirlicité
d'infection et par le nombre de cellules ;...pl~ es Ensuite, la libération peut être contrôlée soit par le retrait de l'implant, ce qui arrête d~rinilivement le traitement, soit 20 par l'utilisation de systèmes d'expression régulable, permettant d'induire ou de ,~li,ner l'e~pression des gènes thérapeutiques.

La présente invention offre ainsi un moyen très efficace pour le traitement ou la p~venlion des maladies neurodégénératives et des tumeurs du système nerveux, 25 notamment central. Elle est tout particulièrement adaptée au traitement des mal~ s d'~ h~im~r, de Parkinson, de Huntington, de l'ALS et des m~dlllloblastomes, neurobl~ctomes ou gliomes. Les vecteurs adénoviraux selon l'invention présentent en outre des avantages importants, liés notamment à leur très haute efficacité d'infection des cellules nerveuses, perrnettant de réaliser des infections à partir de faibles volumes 30 de suspension virale. De plus, I'infection par les adénovirus de l'invention est très localisée au site d'injection, ce qui évite les risques de diffusion aux structures cérébrales voisines.
En outre, ce traitement peut concerner aussi bien l'homme que tout animal tel que les ovins, les bovins, les animaux domestiques (chiens, chats, etc), les chevaux, les 35 poissons, etc.

wo 95/2~802 PcrlFRs5/00248 La présente invention sera plus complètemçnt décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non l;n.;l~l;
I,~ende d~ f~ur~
Figure 1: Repræs~nl~tiQn du vecteur pXL2244 5 Figure 2: Replese.l~a~ion du vecteur pSh-Ad-GMF-~
Techni~ues ~énérales de biolo~ie moléculaire Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que lesextractions præpaldlives d'ADN pl~miflique, la centrifugation d'ADN pl~cmillique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la 10 purification de fr~gm~nt.~ d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chlc,l.,~-,.,e, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la tran~orn alion dans Escherichia coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la li~el~ e [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 5 Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Les pl~cmirhs de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont d'origine cQrnm~rciale (Reth~sda Research Laboratories).
Pour les ligatures, les fr~gmçntc d'ADN peuvent être séparés selon leur taille 20 par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénoVchlon~ol..,e, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN
ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recomm~nd~tions du fo1lrni~ellr.
Le r~mpli~ge des extrémités 5' proémin~nt~s peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications 2s du fol-rni~ellr. La destruction des extræ,.,ilés 3' pro~min~nt-?~ est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recomm~nd~tions du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S1.
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut 30 être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 - (1985) 8749-8764] en utili~nt le kit distribué par Amersham.
L'~mplifi~ation enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR
[~olymérase-catalyzed Chain Beaction, Saiki R.K. et al., Science ~ (1985) 1350-WO gs/25802 PCr/1~95,'~248 1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant.
La vérification des séquences nucléotidiques peut être cffectuée par la metho~ledéveloppée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en utili.c~nt le kit distribué par Arnçr~h~m E
xemp ~x;
Exemple 1: Construction du vecteur pSh-Ad-GMF-13.
Cet exemple décrit la construction d'un vecteur co.llplenant une séquence 10 d'ADI~' codant pour le GMF-B sous le contrôle d'un promoteur con.~ é par le LTR
du virus du sarcome de rous (LTR-RSV).
1.1. Vecteur de départ (pXL2244): Le plasmide pXL2244 contient l'ADNc de l'ApoAI sous le contrôle du promoteur LTR du virus RSV, ainsi que des séq.lences de l'adénovirus Ad5 (figure 1). Il a été construit par insertion d'un fragment ClaI-EcoRV
15 cont~n~nt l'ADNc codant pour la préproApoAI dans le vecteur pLTR RSV-Bgal (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626), digéré par les même enzymes.
1.2. Construction d'une séquence d'ADN codant pour le GMF-B humain Pour permettre la construction de vecteurs selon l'invention, la séquence 20 d'ADNc codant pour le GMF-B humain présente dans le pl~mide pET-3a-hGMF-~(Kaplan et al., J. Neurochem. 57 (1991) 483) a été modifiée de différentes manières.
Dans une première construction, cette séquence a été modifiée par la technique de PCR, en ut~ nt comme amorce les oligonucléotides suivants:
Oligonucléotide 5': 5'-GCGATCGATAAAATGAGTGAGTCTTTG-3' (SEQ ID n 1) 2s Oligonucléotide 3':5'-GCGGTACCTTCACATTAGTGAAAAAATCC-3' (SEQ ID n2) Les étapes d'amplification permettent d'introduire de part et d'autre de la séquence codante des sites de restriction app~.~priés. Plus précisément, ces étapes permettent l'incorporation d'un site ClaI à l~exlle.l~ilé 5' (séquence soulignée en simple dans l'oligonucléotide 5', qui indique sa position par rapport au codon start souligné en 30 double) et d'un site KpnI à l'extrémité 3' (souligné en simple dans l'oligonucléotide 3').
Le fragment de PCR ainsi obtenu a été sous cloné dans le vecteur pCRII (Invitrogen).
Le vecteur résultant a été désigné pCR-hGMF-13. Les sites créés permettent l'insertion de la séquences dans des conditions d'expression dans les vecteurs de l'invention. Ils 21 8~4~
wo ss/2s802 pcT~ 9s~n248 permettent également d'insérer en phase de lecture, d'autres séquences particulières, et notamment une région promotrice et/ou une séquence de sécrétion (Cf exemple 2).
1.3. Construction du vecteur pSh-Ad-GMF-13 Cet exemple décrit la construction du vecteur pSh-Ad-GMF-~3 con~
5 sous contrôle du LTR du virus RSV, la séquence codant pour le GMF-J3 humain ainsi que des séquences de l'adénovirus Ad5 permettant la recomhin~i~on in vivo.
Le vecteur pCR-hGMF-J3 a été digéré par les enzymes ClaI et KpnI, et le fragment de 0,5 kb résultant, contenant la séquence codant pour le GMF-~ a ensuite été isolé et purifié par électrophorèse sur un gel d'agarose LMP ("Low Melting lo Point"). Par~ lem~nt, le vecteur pXL2244 a été digéré par les mêmes enzymes de restriction ClaI et KpnI, puis précipité après inactivation de ces dernières. Le vecteur linéaire r~ lt~nt, préalablement isolé et purifié par électrophorèse sur un gel d'agarose, et le fragment de 0,5 kb ont ensuite été ligaturés pour générer le vecteur pSh-Ad-GMF-~ (figure 2). L'ensemble de la séquence nucléotidique de l'insert GMF-~ a été
5 vérifiée par séquençage didéoxynucléotides.
Exemple 2: Construction du vecteur pSh-Ad-lNF/GMF-~.
Cet exemple décrit la construction d'un second vecteur comprellant, sous le contrôle d'un promoteur constitué par le LTR du virus du sarcome de rous (LTR-RSV), une séquence d'ADNc codant pour le GMF-13 précédée d'une séquence de 20 sécrhion.

2.1. Insertion d'une séquence de sécrétion: La séquence d'ADNc présente dans le pl~mitle pET-3a-hGMF-~ a été mo-lifiée par insertion, à l'eAI,é,nilé 5' et en phase de la séquence codante du GMF-J3, de la séquence de sécrétion de l'i.~e.~r~il de25 fibroblastes h1-m~in.~ L'introduction de cette séquence est particulièrement avantageuse puisqu'elle permet la libération extracçl~ ire du GMF-13 synthétisé par les cellules infectées par les vecteurs de l'invention. La séquence de sécrétion utilisée à
été synthétisée artificiellement sur la base de la séquence publiée par Taniguchi et al.
(Gene 10 (1980) 11). Plus précisément, la séquence de sécrétion synthéti~ée comprend 30 l'enchaînement des 63 pb suivantes (SEQ ID n 3):

ATG ACC AAC AAG TGT CTC CTC CAA ATT GCT CTC CTG TTG TGC
Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys W095/25802 PCTlrh9S;ua248 TTC TCC ACT ACA GCT CTT TCC
Phe Ser Thr Thr Ala Leu Ser Cette séquence a été insérée en amont de la séquence codante du GMFJ3 par amplification génique par la technique de PCR sur le plasmide pET-3a-hGMF-~, en ili~nt les deux oligonucléotides suivants:

Oligonucléotide 5': 5'-GCGATCGATGAGATGACCAACAAGTGTCTCCTC
CAAATTGCTCTCCTGTTGTGCTTCTCCACTACAGCTCTTTCCATGAGTGAGT
CTTTGGTT-3' (SEQ ID n 4) 0 Oligonllcléotide 3':5'-GCGGTACCTTCACATTAGTGAAAAAATCC-3' (SEQ ID n5) 2.2. Construction du vecteur pSh-Ad-INF/GMF-~
Cet exemple décrit la construction du vecteur pSh-Ad-INF/GMF-~3 cont~n~nt la séquence codant pour le GMF-~ précédée de la séquence de sécrétion de l'interféron de fibroblaste hum~in, sous contrôle du LTR du virus RSV, ainsi que des séquences de I'adénovirus Ad5 pe~ e~ l la recombinaison in vivo.
La séquence construite en 2.1. a été digéré par les enzymes ClaI et KpnI, et le fragment de 0,6 kb résl~lt~nt, contenant la séquence codant pour le GMF-~ précédée de la séquence de sécrétion de l'il,te,r~ de fibroblaste humain a ensuite été isolé et purifié par électrophorèse sur un gel d'agarose LMP ("Low Melting Point").
Parallèlement, le vecteur pXL2244 (exemple 1.1.) a été digéré par les mêmes enzymes de restriction ClaI et KpnI, puis précipité après inactivation de ces dernières. Le vecteur linéaire r~sult~nt préalablement isolé et purifié par électrophorèse sur un gel d'agarose, et le fragment de 0,6 kb ont ensuite été ligaturés pour générer le vecteur pSh-Ad-INF/GMF-13.
Exemple 3. Fonctionalité des vecteurs pSh-Ad-GMF-13 et pSh-Ad-lNF/GMF-~
La capacité des vecteurs pSh-Ad-GMF-J3 et pSh-Ad-INF/GMF-13 à exprimer sur culture cellulaire une forme biologiquement active du GMF-~ a été démontrée par transfection transitoire de cellules COS1. Pour cela, les cellules (2.106 cellules par boite de 10 cm de diamètrê) ont été transfectées (8 llg de vecteur) en présence de Transfectam. Après 48 heures, la présence de GMF-13 a été démontrée par wo 9sl25802 2 1 & 4 4 0 ~ PCT~R95/00248 immtlno~lçtçction à l'aide de l'anticorps monoclonal G2-09 dans le sllrn~nt de culture des cellules transfectées ainsi qu'intracellulai~ ,enl.
F.YemP1C 4. Construction des adénovirus recombinants contenant une séquence codant pour le GMF~
s 4.1. Construction de l'adénovirus Ad-GMF-~
Le vecteur pSh-Ad-GMF-~ a été linéarisé et cotransfecté avec un vecteur adénoviral déficient, dans les cellules helper (lignée 293) appo,lan~ en t7ans les f~nctiQn~ codées par les régions E1 (ElA et ElB) d'adénovirus.
Plus preci~çmçnt, l'adénovirus Ad-GMF-J3 a hé obtenu par recomhin~i~n homologue in vivo entre l'adénovirus mutant Ad-dll324 (Thimm~ppaya et al., Cell 31 (1982) ~43) et le vecteur pSh-Ad-GMF-13, selon le protocole suivant: le pl~cmidepSh-Ad-GMF-J3 et l'adénovirus Ad-dll324, linéarisé par l'enzyme ClaI, ont été co-transfectés dans la lignée 293 en présence de phosphate de c~lcillm, pour permettre la recombinaison homologue. Les adénovirus recombin~nt~ ainsi générés ont été
sélectionnés par purification sur plaque. Après isolement, l'ADN de l'adénovirusrecombinant a été amplifié dans la lignée cellulaire 293, ce qui conduit à un surnageant de culture contçn~nt l'adénovirus défectif recombinant non purifié ayant un titre d'environ 10l pfu/ml.
Les particules virales sont ensuite purifiées par centrifugation sur gradient dechlorure de césium selon les techniques connues (voir not~mmçnt Graham et al., Virology 52 (1973) 456). L'adénovirus Ad-GMF-~ peut être conservé à -80C dans 20 % de glycérol.

4.2. Construction de l'adénovirus Ad-INF/GMF-~
2s L'adénovirus Ad-INF/GMF-~ a été construit selon le même protocole que l'adénovirus Ad-GMF-13, mais en utilisant comme vecteur de départ le vecteur pSh-Ad-INF/GMF-~.
Exemple 5. Fonctionalité de l'adénovirus Ad-GMF-13 La c~paçitç de l'adénovirus Ad-GMF-13 à infecter des cellules en culture et à
exprimer dans le milieu de culture une forme biologiquement active du GMF-13 a été
démontrée par infection des lignées 293 h~ ine et PC12 de rat. La présence de W O 95/25802 2 1 8 4 4 0 8 P~li~h9S~'~D248 GMF-13 actif dans le surnageant de culture a ensuite été déterminée dans les mêmes conditions que dans l'exemple 3.
Ces études permettent de montrer que l'adénovirus exprime bien une forme biologiquement active du GMF-J3 en culture cellulaire.
5 Exemple 6: Transfert in vivo du gène GMF-i3 par un adénovirus recombinant à
des rats ~ .,~nt une lésion du fimbria-fornix Cet exemple décrit le tlansfe" du gène GMF-~ in vivo au moyen d'un vecteur adénoviral selon l'invention. Il montre sur un modèle animal de la lésion du fimbria-fornix, que les vecteurs de l'invention permettent d'induire l'expression in vivo de l O quantités thé~a~u~iques de GMF-~.
Sur des rats préalablement anesthésiés, la voie septo-hippocampique (fimbria-fornix) a été sectionnée au niveau de l'he---;cl,here gauche. Cette lésion mec~ni~lue a été réalisée à l'aide d'un couteau chirurgical rétractable. Les coordonnées stéréotaxiques utilisées à cet effet sont, par rapport au bregma: AP: -1,7; ML: +1,5;
5 V: -5,5 à -0,5.
L'adénovirus recombinant GMF-13 a été injecté immé~ia~e...en~ après la lésion, dans le noyau médian du septum et dans la partie dorsale de l'hippocampe déafférenté
(hippocampe du coté de la lésion). Plus particulièrement, l'adénovirus injecté est l'adéno~/irus Ad-GMF-~ préparé dans l'exemple 4.1., utilisé sous forme purifiée (3,5 106 pfu/~l), dans une solution saline phosphate (PBS).

Les injections sont réalisées à l'aide d'une canule (diamètre extérieur 280 ~m) connectée à une pompe. La vitesse d'injection est fixée à 0,5 ~l/min, après quoi, la canule reste en place pendant 4 minutes supplément~ires avant d'être remontée Les 25 volumes d'injection dans l'hippocampe et le septum sont respectivement 3 ~l et 2 ~l.
La concentration d'adénovirus injectée est de 3,5. 106 pfu/~l.
Pour l'injection dans l'hippocampe, les coordonnées stéréotaxiques sont les suivantes: AP=-4; ML=3,5; V=-3,1 (les coordonnées AP et ML sont déterminées par rapport au bregma, la coordonnée V par rapport à la surface de l'os crânien au niveau 30 du bregma.

21 ~4~0~
wo 95/2s802 PCrlFR95/00248 Pour l'injection dans le septum, les coordonnées stéréotaxiques sont les suivantes: AP=1; ML=1; V=-6 (les coordonnées AP et ML sont déterminées par rapport au bregma, la coordonnée V par rapport à la surface de l'os crânien au niveau du bregma. Dans cette condition, la canule plesellle un angle de 9 degrés par rapport à
5 la verticale (dans le sens médio-latéral) afin d'éviter le sinus veineux me~i~n Les effets thérapeutiques de l'a~ ;ni~ tion de l'adénovirus selon l'illv~nLioll ont été mis en évidence par trois types d'analyse: une analyse histologique et immunc hi~tochimique, une analyse quanlilalive et une analyse co,~ol le.n~ e Analyse histolo~ique et immunohistochimique lo La lésion méc~nique du fimbria-fornix induit une perte de neurones cholinergiques (révélée en immunohistologie par un anticorps anti-choline acétyltransférase, ChAT) dans le septum médian, ainsi que la dénervation ~holinergique dans l'hippocampe (detectee en hi~tochimie par l'activité de l'acétyl choline estérase, AChE).
L'analyse histologique des cerveaux injectés est réalisée 3 st.~ s après 15 I'injection intracérébrale de l'adénovirus Ad-GMF-~. Pour cela, les anillla~,c sont sacrifiés, sous anesthésie, par perfusion intracardiaque de 4% paraformaldéhyde. Après prélèvement, post-fixation et c~yoproleclion, le cerveau est coupé au cryomat selon le plan coronal: des coupes sériées coronales de 30 ~m d'épaisseur sont réalisées sur toute la longueur du septum médian et aux niveaux antérieur, médian et postérieur de I'hippocampe. Pour le septum médian, des coupes espacées de 180 ~m (1 coupe sur 6) sont colorées au crésyl violet (pour évaluer la densité neuronale) et ;~llmLInoll~a~l~ées par un anticorps anti ChAT (Biochem) (pour identifier les neurones cholinergiques).
La métnode immllnohicto~himillue est celle de la ~e~avidine-biotine pelo~yiase révélée par la DAB. Pour l'hippocampe, des coupes espacées de 180 ,um sont colorées 2s selon la méthode histochimique pour l'AChE (acétyl choline estérase) afin de détecter détecter l'innervation cholinergique. Les coupes sont montées sur lames de verre.
Analyse qua"lil~liv~
Le nombre de neurones cholinergiques (ChAT positifs), dans le septum médian est le paramètre d'évaluation des effets de l'adénovirus Ad-GMF-B. Le ~enombrement est réalisé sur un échantillon (1 coupe sur 6 sur toute la longueur du septum médian). Pour chaque coupe, les neurones ChAT positifs sont dénombrés sépali:,llent des 2 cotés du septum. Les résultats cumulés pour toutes les coupes sont wo 95/25802 Pcr/FR95/00248 exprimés par le rapport du nombre de neurones ChAT positifs du coté lésé sur le nombre de neurones ChAT positifs du coté non lésé.
Analyse co"~orle~"entale Il est connu qu'une lésion bilatérale de la voie septo-hippocampique conduit à
5 des déficits mnésiques. Les effets fonctionnels protecteurs de l'injection d'adénovirus Ad-GMF-~3 sur ce type de lésion ont été mis en évidence par analyse des perfol,nances mnésiques des anim~ au cours de 2 tests co",po,le~ ntal~x: le test de la piscine de Morris (mémoire de référence visuo-spatiale) et le test TMTT ("two-trials memorytask"; "mémoire à court-terme d'un envin),ulement nouveau").

10 Exempie 7: Transfert in vivo du gène GMF-I~ par un adénovirus r ecombinant à
des rats p. ~e..l~nt une lésion de la voie nigro-striée 2 1 ~4408 Cet exemple décrit le transfert du gène GMF-B in vivo au moyen d'un vecteur adénoviral selon l'invention. Il montre sur un modèle animal de la lésion de la voie nigro-striée, que les vecteurs de l'invention permettent d'induire l'eApr~ioll in vivo de quantités thélape~.liques de GMF-13.
Sur des rats préalablement anesthésiés, la voie nigro-striée a été lésée au niveau du faisceau mPsPncéphalique médian (MFB) par injection de la toxine 6-hydluAy dopamine (60H-DA). Cette lésion chimique par injçction a été unilatçrale, suivant les coordc-nnPes stéréotaxiques suiv~n~s: AP: 0 et -1; ML: +1,6; V: -8,6 et -9 (les coordonnçPs AP et ML sont déterrninées par rapport au bregma, la coordonnée 0 V par rapport à la dure-mère). La barre d'incisive est fixée au niveau +5 mm.
L'adénovirus recombinant GMF-B a été injecté immPf~ après la lésion, dans la substance noire et le striatum, du coté de la lésion. Plus particulièrement, I'adénovirus injecté est l'adénovirus Ad-GMF-B préparé dans l'PxPmple 4.1., utilisé
sous forme purifiée (3,5 106 pfu/~l), dans une solution saline phosph~te (PBS).
Les injections ont été réalisées à l'aide d'une canule (rli~mptre extérieur 280 ,um) connçctée à une pompe. La vitesse d'injection est fixée à 0,5 ~Il/min, après quoi, la canule reste en place pendant 4 minutes supplémPnt~ires avant d'être remontée Les volumes d'injection dans le striatum et la subst~nce noire sont respeclivel,.enL 2x3 ,ul et 20 2 IlL La concentration d'adénovirus injectée est de 3,5. 106 pfu/,ul.
Pour l'injection dans la substance noire, les coordonnées stéréotaxiques sont les suivantes: AP=-5,8; ML=+2; V=-7,5 (les coordonnées AP et ML sont ~Pt.orrninçes par rapport au bregma, la coordonnée V par rapport à la dure-mère).
Pour les injections dans le stri~tl~m, les coordonnées stéréotaxiques sont les 25 suiv~les: AP=+0,5 et -0,5; ML=3; V=-5,5 (les coor~o~nPes AP et ML sont déterminées par rapport au bregma, la coordonnée V par rapport à la dure-mère).
Les effets thérapeutiques de l'a-lminictration de l'adénovirus selon l'inventionont été mis en évidence par trois types d'analyse: une analyse histologique et immunohistochimique, une analyse quantitative et une analyse cu"lporle-..~ .lP

WO 95/2s802 P~ l/rn9~ 248 Analyse histolo~ique et immunoh;stochimique La lésion chimique de la voie nigro-striée induit une perte neuronale dans la substance noire ainsi que la dénervation dopaminergique dans le striatum (révélées en immunohistologie par un anticorps anti-tyrosine hydroxylase, TH).
L'analyse histologique des cerveaux injectés est réalisée 3 s~m~in~s après l'injection intracérébrale de l'adénovirus Ad-GMF-J3 dans les conditions décrites dans l'exemple 6. Les coupes sériées coronales de 30 ~lm d'ép~i~sellr sont réalisées dans la substance noire et le striatum. Des coupes espacées de 180 ,um (1 coupe sur 6) sont colorées au crésyl violet (pour évaluer la densité neuronale) et immunomarquées par 10 un anticorps anti tyrosine llydloxylase (TH) (pour détecter les neurones dop~min~rgiques dans la sl)bst~nce noire et leur innervation dans le striatum).
Analyse qual,lilalive Le nombre de neurones dopa~ e~giques (TH positifs), dans la subst~nce noire est le paramètre d'évaluation des effets de l'adénovirus Ad-GMF-~. Le 15 dénombrement est réalisé sur un éch~ntillon (1 coupe sur 6 sur toute la longueur de la substance noire). Pour chaque coupe, les neurones TH positifs sont dénombrés sépale,nent des 2 cotés de la subst~n~e noire. Les résultats cumulés pour toutes les coupes sont exprimés en proportion: nombre de neurones TH positifs du coté lésé par rapport au nombre de neurones TH positifs du coté non lésé.
20 Analyse colnpol lell~entale Les effets fonctionnels protecteurs de l'injection d'adénovirus Ad-GMF-J3 sur la lésion de la voie nigro-striée ont été mis en évidence par analyse des performances sensori-motrices des animaux au cours de 2 tests comportementaux: le test de la rotation induite par des agonistes dopaminergiques (apomorphine, ~mph~t~mine et 25 lévodopa), et le test de préhension ("paw-reaching").
Exemple 8: Transfert in vivo du gène GMF-~ par un adénovirus recombinant à
des rats présentant une lésion de la voie perforante Cet exemple décrit le transfert du gène GMF-13 in vivo au moyen d'un vecteur adénoviral selon l'invention. Il montre sur un modèle animal de la lésion de la voie 30 perforante, que les vecteurs de l'invention permettent d'induire l'expres~ion in vivo de quantités thérapeutiques de GMF-13.

wo ssl2s802 2 1 8 4 4 0 8 PCT/FRgS/00248 Sur des rats préalablement anesthésiés, la voie e-l~o.}uno-hippocampique (voie pelro-allle) a été sectionnée unilatéralement à l'aide d'un couteau chirurgical. Les coor~onnçes stéréotaxiques lltili.~é~s à cet effet sont, par rapport au lambda: AP:
+0,75; ML: +4,1 à 6,6; V: -7,7 (coordonnée V déterminée~par rapport à la dure-s mère).
L'adénovirus recombinant GMF-~ est injecté immé~i~tem~nt après la lésion, soit au niveau de la lésion, soit au niveau de l'hippocampe et du cortex enlo hillal. Plus particulièrement, l'adénovirus injecté est l'adénovirus Ad-GMF-~ préparé dans l'exemple 4.1., utilisé sous forme purifiée (3,5106 pfu/,ul), dans une solution saline lo phosph~te (PBS).

Les injections ont été réalisées à l'aide d'une canule (diamètre extérieur 280 ~m) conn~ctee à une pompe. La vitesse d'injection est fixée à 0,5 IIUmin, après quoi, la canule reste en place pendant 4 minutes supplé...e..l~ s avant d'être remontée. Les 5 volumes d'injection dans l'hippocampe, le cortex entorhinal et le site de lésion de la voie pe-rc,-~-"e sont respectivement 3 ,ul, 2 ~l et 2 ,ul. La concentration d'adénovirus injectée est de 3,5. 106 pfu/~
Les effets thérapeutiques de l'~-I...;ni~ lion de l'adénovirus selon l'inventionpeuve.-l être mis en évidence par une analyse co,~,po-le,nentale dans les conditions de 20 l'exemple 6.

W O95/25802 PCT/rn55/~-248 T.TSTE DE SEOUEN~E~

(1) INFORMATION GENERALE:

~i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE-POULENC RORER S.A.
(B) RUE: 20, avenue Raymond ARON
(C) VILLE: ANTONY
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165 (ii) TITRE DE L' INVENTION: Virus recomhln~nts, préparation et utilisation en thérapie génique (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 5 ~iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape - 20 (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
~D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 ~OEB) ~2l INFORMATION POUR T.~ SF~O Tn NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) nY~Orn~llQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
~ xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:

~2) INFORMATION POUR T.~ SEO In NO: 2:
~i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 29 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:

(2) INFORMATION POUR T ~ SEO ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 63 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double WO95l25802 2 1 8 4 4 0 ~ PCT~R95/00248 (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: _ Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser Thr Thr Ala Leu Ser (2) INFORMATION POUR T.~ S~O I~ NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 93 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: 1i néA i-e (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc ~iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:

~2) TNFORMATION POUR T-~ S~ In NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 29 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: li n~ ire ~ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:

Claims (27)

REVENDICATIONS

1. Adénovirus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADN codant pour le facteur de maturation des cellules gliales type .beta. (GMF-.beta.) ou un dérivé de celui-ci.

2. Adénovirus selon la revendication 1 caractérisé en ce que la séquence d'ADN contient, en 5' et en phase de lecture de la séquence codant pour le GMF-.beta., une séquence de sécrétion.

3. Adénovirus selon la revendication 2 caractérisé en ce que la séquence de sécrétion est choisie parmi les séquences de sécrétion fonctionnelles dans les cellules nerveuses, de préférence provenant d'une cytokine.

4. Adénovirus selon les revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la séquence d'ADN est une séquence d'ADNc.

5. Adénovirus selon les revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la séquence d'ADN est une séquence d'ADNg.

6. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que la séquence d'ADN code pour le GMF-.beta. humain.

7. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que la séquence d'ADN est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans les cellules nerveuses.

8. Adénovirus selon la revendication 7 caractérisé en ce que les signaux d'expression sont choisis parmi les promoteurs viraux, de préférence parmi les promoteurs E1A, MLP, CMV et LTR-RSV.

9. Adénovirus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADNc codant pour le GMF-.beta. humain précédée d'une séquence de sécrétion, sous le contrôle du promoteur LTR-RSV.

10. Adénovirus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADNg codant pour le GMF-.beta. humain précédée d'une séquence de sécrétion, sous le contrôle du promoteur LTR-RSV.

11. Adénovirus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADN
codant pour le GMF-.beta. humain ou un dérivé de celui-ci sous le contrôle d'un promoteur permettant une expression majoritaire dans les cellules nerveuses.

12. Adénovirus recombinant défectif selon la revendication 11 caractérisé en ce que le promoteur est choisi parmi le promoteur de l'énolase neurone spécifique et le promoteur de la GFAP.

13. Adénovirus selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisé en ce qu'il estdépourvu des régions de son génome qui sont nécessaires à sa réplication dans lacellule cible.

14. Adénovirus selon la revendication 13 caractérisé en ce qu'il comprend les ITR et une séquence permettant l'encapsidation, et dans lequel le gène E1 et au moins un des gènes E2, E4, L1-L5 sont non fonctionnels.

15. Adénovirus selon la revendication 13 ou 14 caractérisé en ce qu'il sagit d'un adénovirus humain de type Ad 2 ou Ad 5 ou canin de type CAV-2.

16. Utilisation d'un adénovirus selon l'une des revendications 1 à 15 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention des maladies neurodégénératives.

17. Utilisation selon la revendication 16 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention de la maladie de Parkinson, d'Alzheimer, de Huntington ou de l'ALS.

18. Utilisation d'un adénovirus selon l'une des revendications 1 à 15 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention des tumeurs du système nerveux de préférence central.

19. Composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs selon l'une des revendications 1 à 15.

20. Composition pharmaceutique selon la revendication 19 caractérisée en ce qu'elle est sous forme injectable.

21. Composition pharmaceutique selon la revendication 19 ou 20 caractérisée en ce qu'elle comprend entre 104 et 1014 pfu/ml, et de préférence 106 à 1010 pfu/ml adénovirus recombinants défectifs.

22. Cellule de mammifère infectée par un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs selon l'une des revendications 1 à 15.

23. Cellule selon la revendication 22 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule humaine, choisie de préférence parmi les fibroblaste, myoblaste, hépatocyte, cellule endothéliale, cellule gliale et kératynocyte.

24. Implant comprenant des cellules infectées selon les revendications 22 à 23 et une matrice extracellulaire.

25. Implant selon la revendication 24 caractérisé en ce que la matrice extracellulaire comprend un composé gélifiant choisi de préférence parmi le collagène, la gélatine, les glucosaminoglycans, la fibronectine et les lectines.

26. Implant selon les revendications 24 ou 25 caractérisé en ce que la matrice extracellulaire comprend également un support permettant l'ancrage des cellules infectées.

27. Implant selon la revendication 26 caractérisé en ce que le support est constitué préférentiellement par des fibres de polytétrafluoroéthylène.