FR2793142A1 - Utilisation d'oligonucleotides antisens de no-synthase inductible dans la prevention et le traitement de l'ischemie cerebrale - Google Patents

Abstract

Utilisation d'oligonucléotides antisens d'une isoforme inductible de la synthase du monoxyde d'azote dans la prévention et le traitement de l'ischémie cérébrale. Vecteurs contenant un acide nucléique codant pour les séquences desdits oligonucléotides antisens et compositions les contenant.

Description

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UTILISATION D'OLIGONUCLEOTIDES ANTISENS DE NO-SYNTHASE
INDUCTIBLE DANS LA PREVENTION ET LE TRAITEMENT DE
L'ISCHEMIE CEREBRALE.

La présente invention concerne le domaine thérapeutique du système nerveux central et plus particulièrement l'utilisation d'oligonucléotides antisens d'une isoforme inductible de la synthase du monoxyde d'azote (NO-synthase, NOS, EC 1.14.13.39) dans la prevention et le traitement de l'ischémie cérébrale. L'invention se rapporte également à des vecteurs contenant un acide nucléique codant pour lesdits oligonucléotides antisens et compositions les contenant.

L'ischémie cérébrale se caractérise par une baisse du débit sanguin cérébral ayant pour conséquence un déficit en substrats énergétiques indispensables pour le cerveau (oxygène et glucose).

Les conséquences de l'ischémie dépendent de sa sevérité (intensité de la chute du débit sanguin) et de sa durée. La diminution du débit sanguin entraine d'important dysfonctionnements cellulaires dont l'augmentation du calcium cytosolique, l'activation de nombreuses enzymes à l'origine d'une perte de l'intégrité cellulaire et la libération d'acides aminées excitateurs tels que le glutamate et l'aspartate, conduisant à la mort neuronale.

A l'heure actuelle, les atteintes ischémiques cérébrales constituent toujours l'une des principales causes de mortalité et de morbidité, en raison de l'absence de thérapeutiques efficaces. Les modèles expérimentaux d'ischémie par occlusion de l'artère cérébrale moyenne (ACM) mis au point chez différentes espèces animales ont permis de révéler l'effet neuroprotecteur des stratégies consistant, soit à bloquer les différents types de récepteurs glutamatergiques, soit à inhiber la libération de glutamate.

Cependant, il a été décrit par Margaill et al. (1996) que les stratégies "anti-glutamate", efficaces dans les modèles d'ischémie focale permanente, ne présentent qu'une fenêtre d'opportunité thérapeutique étroite dans certains modèles d'ischémie focale transitoire. Ceci pouvant être à l'origine des difficultés actuelles à mettre en évidence une activité de ces traitements "antiglutamate" au cours d'essais cliniques.

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Par ailleurs, Margaill et al. (1997) ont démontré qu'une stratégie visant à inhiber la production de monoxyde d'azote (NO) conserve une activité protectrice même lorsque le traitement est instauré 9 heures après l'ischémie. Cette fenêtre d'opportunité thérapeutique, considérablement supérieure à celle observée à la suite de l'administration d'agents agissant sur le glutamate, a incité à poursuivre l'exploration des mécanismes tardifs survenant à la suite d'une ischémie. En effet, on peut faire l'hypothèse qu'une stratégie thérapeutique visant à s'opposer à un phénomène délétère tardif pourrait avoir un intérêt clinique supérieur à celui des stratégies "anti-glutamate".

Le rôle délétère de la NO-synthase et en particulier d'une isoforme inductible de cette enzyme a été établi dans des modèles d'ischémie focale permanente et transitoire grâce à l'utilisation d'animaux transgéniques chez lesquels un gène codant pour une NOS inductible à été invalidé (Iadecola et al., 1997) ou de substrances pharmacologiques inhibitrices de NOS inductible (Parmentier et al., 1999).

L'effet d'oligonucléotides antisens de NOS inductible a déjà été étudié dans le cas de l'ischémie rénale (Noiri et al., 1996). Les résultats de ces études démontrent une atténuation des dysfonctionnements des reins chez des rats sujets à des ischémie expérimentales de ces organes et une amélioration de la viabilité des cellules épithéliales rénales (Peresleni et al., 1996).

L'effet d'oligonucléotides antisens de NOS inductible a été également étudié dans le cas d'une affection du système nerveux à caractère immunitaire telle que la sclérose en plaque (Ding et al., 1998). Les résultats de cette étude démontrent l'inhibition de l'induction d'encéphalomyélite autoimmune expérimentale chez la souris.

Bien que des études aient été menées avec des antisens, il n'en demeure pas moins qu'aucune étude n'a utilisé cette stratégie pour bloquer spécifiquement la synthèse de NO-synthase inductible et démontrer le rôle bénéfique de cette inhibition dans l'ischémie cérébrale.

La demanderesse a maintenant démontré un effet thérapeutique surprenant de protection de cellules bien particulières, les cellules nerveuses, dans une affection du système nerveux à caractère métabolique comme l'ischémie cérébrale par l'administration d'oligonucléotides antisens .

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La présente invention se rapporte donc à l'utilisation d'oligonucléotides antisens d'une isoforme inductible de la NO-synthase pour la protection des cellules nerveuses envers les effets délétères de la surproduction de monoxyde d'azote lors d'une ischémie cérébrale. En particulier, l'invention concerne l'utilisation d'oligonucléotides antisens d'une isoforme inductible de NO-synthase pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention et la traitement de ischémie cérébrale .

On distingue classiquement deux groupes de NO synthase. Les NO synthases dites "constitutives" (cNOs) sont présentes à l'état physiologique et calmoduline dépendantes. Ces enzymes produisent le monoxyde d'azote (NO) pendant de courtes périodes (Bredt et Snyder, 1990 ; Fôrsterman et al., 1991). Ce NO intervient comme médiateur dans de nombreux processus physiologiques tels que la vasodilation et la neurotransmission. Par des techniques de purification puis de clonage, il a ainsi été identifié une isoforme constitutive neuronale de NO-synthase (Bredt et al., 1991) et une isoforme constitutive endothéliale de NO-synthase (Lamas et al., 1992).

Les NO synthases inductibles (iNOs) ne sont généralement pas présentes à l'état physiologique mais sont induites à la suite d'une stimulation par des messagers biologiques telles que des cytokines comme l'interféron-gamma ou l'interleukine-1, ou des produits bactériens comme des lipopolysaccharides. Ces enzymes produisent le NO en grande quantité et sur de longues périodes et leur activation est calmodulineindépendante. Le NO produit joue un rôle délétère dans divers processus physiopathologiques. Une NO-synthase inductible à été clonée à partir de macrophages de souris (Xie et al., 1992). Il a ensuite été démontré qu'une activité NO-synthase pouvait aussi être induite dans un grand nombre de type cellulaires tels que les cellules musculaires lisses, les hépatocytes, les cardiomyocytes, les neutrophiles, la microglie, les astrocytes, les chondrocytes (Nathan, 1992) et également les neurones (Minc-Golomb et al., 1992).

Ainsi, dans le cadre de l'invention, la NO-synthase à l'encontre de l'expression de laquelle les oligonucléotides de l'invention sont utilisés est de manière préférée une NO synthase inductible (iNOs) ou également appelée de type 2.

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Les oligonucléotides antisens selon l'invention constituent des séquences antisens des ARN messagers de tout ou partie de l'enzyme NO synthase. Comme cela a été décrit précédemment, les oligonucléotides antisens de l'invention sont de manière préférée dirigés contre tout ou partie d'une NO-synthase inductible.

Selon un premier mode de réalisation de l'invention, la séquence des oligonucléotides antisens selon l'invention correspond à la séquence SEQ ID N 1 ou l'une des séquences dérivées.

Selon une variante de l'invention, la séquence des l'oligonucléotides antisens correspond à la séquence SEQ ID N 2 ou l'une des séquences dérivées.

Par séquence dérivée, on entend toute séquence obtenue par modification et codant pour un produit conservant la propriété d'inhiber la synthèse d'une isoforme inductible de la NO-synthase. Cette séquence dérivée partage en outre 90 % et préférentiellement 80 % d'homologie avec la séquence native.

Par modification, on entend toute mutation, délétion, substitution addition ou modification de nature génétique et/ou chimique. Ces modifications peuvent être réalisées par des techniques connues de l'homme du métier.

Ces dérivés peuvent notamment être des molécules ayant une grande affinité pour leurs sites de fixation, des séquences permettant une expression améliorée in vivo, des molécules présentant une plus grande résistance aux protéases, des molécules ayant une efficacité thérapeutique plus grande.

Parmi les dérivés préférés, on peut citer plus particulièrement les variants naturels, les molécules dans laquelles un ou plusieurs résidus ont été substitués, les dérivés comportant par rapport à la séquence native des résidus suplémentaires tels que par exemple des signaux de sécrétions et/ ou de jonction.

La séquence de l'oligonucléotide antisens telle que décrite précédemment comprend entre 10 et 30 mers et préférentiellement entre 15 et 25 mers.

Un autre objet de l'invention est relatif à un vecteur comprenant dans son génome un acide nucléique codant pour l'oligonucléotide antisens selon l'invention.

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Le vecteur de l'invention peut être par exemple un plasmide, un cosmide ou tout ADN encapsulé par un virus, un phage, un chromosome artificiel, un virus recombinant....Il s'agit de préférence d'un plasmide ou d'un virus recombinant.

A titre de vecteurs viraux conformes à l'invention, on peut tout particulièrement citer les vecteurs de type adenovirus, les rétrovirus, les virus adénoassociés, le virus de l'herpès ou le virus de la vaccine ainsi que les baculovirus.

Selon un mode préféré de l'invention le vecteur viral est défectif c'est-a-dire dépourvu des séquences nécessaires à sa réplication autonome dans les cellules cibles.

L'obtention de vecteurs viraux défectifs tels que ceux mentionés précédemment est maintenant bien connue de l'homme du métier.

Généralement, la séquence d'acide nucléique comprend un région promotrice de la transcription fonctionelle. Il peut s'agir d'une région promotrice de gènes eucaryotes ou viraux.

Par ailleurs, le vecteur peut comporter dans son génome, en particulier en amont de la séquence d'acide nucléique codant pour l'oligonucléotide selon l'invention, une séquence signal dirigeant le produit synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être une séquence signal naturelle ou une séquence signal artificielle.

Le vecteur selon l'invention peut être utilisé aussi bien dans une approche ex vivo ou in vivo. Dans le cadre d'une thérapie génique applicable à l'homme, on peut envisager une approche ex vivo par greffe de cellules modifiées génétiquement par un vecteur décrit ci-dessus. Ces cellules peuvent être d'origines diverses : exemple nerveuses (humaines ou non humaines). L'association de certains médicaments peut être envisagée en vue notamment de d'améliorer le maintien de la greffe ou l'expression du transgène (immunosuppresseurs, anti-complément...). On peut aussi envisager l'implantation de cellules génétiquement modifiées par un vecteur de l'invention après encapsidation dans un système inerte.

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Pour leur utilisation selon la présente invention, les oligonucléotides antisens ou le vecteur les contenant sont préférentiellement associés à un ou des véhicules pharmaceutiquement acceptables pour être formulé en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, stéréotaxique, etc. De préférence, les oligonucléotides antisens ou le vecteur les contenant sont utilisés sous une forme injectable. Il peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc, ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Les doses de virus utilisées pour l'administration peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du site d'administration considéré, du nombre d'injections, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu, et de préférence 106 à 1010 pfu. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 15 jours, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature.

C'est pourquoi un autre objet de l'invention réside dans une composition pharmaceutique comprenant au moins un vecteur viral ou plasmidique comprenant dans son génome un acide nucléique codant pour l'oligonucléotide antisens défini précédemment.

Par ailleurs, un autre objet de l'invention réside dans une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un oligonucléotide antisens d'une isoforme inductible de la NO-synthase pour la protection contre l'ischémie cérébrale.

Un autre objet de l'invention est un médicament comprenant au moins un oligonucléotide antisens d'une isoforme inductible de la synthase du monoxyde d'azote pour la prévention et le traitement de l'ischémie cérébrale.

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Un autre objet encore de l'invention se rapporte à l'utilisation d'un vecteur décrit précédemment pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention et le traitement de l'ischémie cérébrale.

Ainsi, l'invention consiste également en un médicament comprenant au moins un vecteur tel que décrit précédemment et de manière préférée comprenant au moins un vecteur viral ou plasmidique.

LEGENDE DES FIGURES Figure 1 : Réalisation du modèle d'ischémie focale transitoire. Mise en place du dispositif d'occlusion temporaire de l'artère carotide commune (A) et manoeuvre de celui-ci (B).

Figure 2 : Réalisation du modèle d'ischémie focale transitoire. Mise en place du dispositif d'occlusion temporaire (microclip) de l'artère cérébrale moyenne.

Figure 3 : Quantification des atteintes histologiques par coloration au triphényletétrazolium.

Figure 4 : Mise en place du guide pour l'injection intracérébroventriculaire
MATERIEL ET METHODES
Toutes les expériences sont réalisées sur des rats mâles Sprague-Dawley (Iffa Credo, France) d'un poids compris entre 300 et 330 grammes.

1. ISCHÉMIE CÉRÉBRALE FOCALE TRANSITOIRE
Le modèle d'ischémie focale transitoire pratiqué nécessite une craniectomie afin de dégager l'artére cérébrale moyenne (ACM). L'approche subtemporale que nous utilisons est celle initialement décrite par Tamura et al. (1981).

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1.1. Procédure chirurgicale 1. 1.1. Abord chirurgical de l'artère cérébrale moyenne
Les rats sont anesthésiés par injection intrapéritonéale (i. p.) d'hydrate de chloral (400 mglkg sous un volume de 10 ml/kg). L'animal est ensuite placé sur le flanc droit sous une loupe binoculaire (Zeiss). Le scalp est incisé selon un axe partant de l'oreille gauche à l'aide d'un bistouri électrique (ME 80#, Martin). Suivant ce même axe, le muscle temporal est incisé et l'arcade zygomatique retirée. On effectue alors autour du foramen ovale une craniectomie de 3 à 4 mm de diamètre à l'aide d'une fraise dentaire (Minigyr, Anthogyr, France). La dure-mère est incisée afin de dégager l'ACM gauche.

Durant toute la durée de l'opération, la température rectale des animaux est contrôlée à l'aide de sondes thermiques (Digi-Sense, Cole-Palmer, Chicago, USA) et maintenue à 37,5 0,5 C grâce à une couverture chauffante.

1. 1.2. Ischémie focale transitoire
Le modèle d'ischémie focale transitoire utilisé consiste à occlure de façon réversible l'ACM gauche à l'aide d'un microclip. A cette occlusion, est associé le clampage de l'artère carotide commune ipsilatérale (ACCi). Pour cela, les rats, anesthésiés par injection intrapéritonéale d'hydrate de chloral (400 mg/kg sous un volume de 10 ml/kg), sont placés en décubitus dorsal. Une incision longitudinale est effectuée dans la région trachéenne, l'ACC est dégagée et isolée du nerf vague à l'aide d'un tube de silicone (Silastic, réf. 602-7, Sigma), sur lequel est enfilé une pastille d'environ 5 mm de diamètre également en silicone (Silastic, réf. 500-135, Sigma) préalablement percée de deux trous. Les bouts libres du tube de silicone sont noués comme indiqué dans la figure 1A. L'ACC est ainsi prête pour le clampage qui sera effectué immédiatement après la mise en place du microclip sur l'ACM.

L'approche chirurgicale de l'ACM est celle décrite au paragraphe 1.1.1.

Celle-ci est ensuite occluse au niveau de sa partie proximale, en amont de l'artère lenticulo-striée, par un microclip (zen type temporary clip, 15mm x 0,4 Ohwa Tsusho Co., Ltd Tokyo, Japon) enfoncé perpendiculairement à la surface du cerveau, à l'aide

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d'une pince spéciale (zen type clip applier, 15 cm, Ohwa Tsusho Co., Ltd Tokyo, Japon) (Figure 2). L'incision des plans cutanés superficiels est ensuite refermée par une agrafe chirurgicale.

On effectue enfin le clampage de l'ACC en enfilant sur le tube de silicone un embout bleu de pipette Gilson@ (Polylabo) préalablement coupé à ses deux extrémités et fendu dans sa partie supérieure ; tirant sur le fil et en le coinçant dans cette fente, on interrompt la circulation carotidienne (Figure 1B).

Au terme de la durée d'occlusion souhaitée, les animaux sont à nouveau anesthésiés par l'hydrate de chloral. L'incision est ré-ouverte et le microclip ainsi que le clampage carotidien sont retirés. Les incisions temporale et trachéenne sont alors définitivement refermées à l'aide d'agrafes. Les animaux sont placés dans des enceintes thermostatées à 29 C jusqu'à leur réveil puis remis à l'animalerie jusqu'à leur euthanasie. Les animaux, ayant de la difficulté pour mâcher, sont nourris avec des granulés préalablement ramollis dans de l'eau.

1. 2. Mesure des variables physiologiques
Pour la mesure de la pression artérielle moyenne (PA moyenne), la pression partielle en O2 (P02), la pression partielle en C02 (pC02) et le pH, un cathéter en polyéthylène (Biotrol, ref. E03403) est introduit dès l'anesthésie des animaux dans l'artère de la queue. Le cathéter est relié à un robinet à trois voies ; sert au prélèvement de sang pour l'analyse de la pO2, de la pCO2 et du pH par un analyseur des gaz du sang (ABL 330, Radiometer, Copenhagen); l'autre est branchée sur un capteur (EMKA Technologies, Paris), relié à un enregistreur (SEFRAM, Paris), pour la mesure de la PA moyenne.

Ce dispositif nécessite l'héparinisation des animaux. Une solution d'héparine (solution injectable d'héparine Choay) à 50 UI/ml de soluté physiologique est préparée. Deux cent microlitres de cette solution sont injectés par le robinet dès la pose du cathéter, puis à chaque prélèvement de sang. Les animaux sont maintenus en normothermie pendant toute la durée des mesures à l'aide d'une couverture chauffante.

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Trois mesures des variables physiologiques sont effectuées, l'une immédiatement avant le clampage des artères, la seconde 30 minutes après le clampage des artères, enfin la troisième est réalisée 30 minutes après le déclampage des artères. Simultanément, la température rectale des animaux est relevée, afin de vérifier leur normothermie. A la fin de l'expérience, le cathéter est retiré et l'artére de la queue occluse à l'aide d'un fil.

Il faut noter que les animaux sont maintenus anesthésiés durant la mesure des variables physiologiques.

1. 3. Mesure du débit sanguin cérébral
La mesure du débit sanguin cérébral est réalisée à l'aide d'un laser-Doppler (Laseflow BPM2(E Vasamedics). Les animaux anesthésiés par une solution d'hydrate de chloral (400 mg/kg sous un volume de 10 ml/kg) sont placés en contention stéréotaxique. La surface du crâne est rasée et une incision est effectuée de manière à dégager le calvarium. Un orifice est percé pour permettre l'introduction de la sonde à laser-Doppler dans la région choisie. Le débit sanguin cérébral (DSC) est mesuré dans une zone correspondant à la pénombre de l'infarctus. Les coordonnées de la mesure ont été déterminées à l'aide de l'Atlas Paxinos et Watson (1986): - Antéro-postériorité : mm par rapport à la ligne inter-aurale.

- Latéralité : mm par rapport au bregma.

La sonde est placée à la surface du cortex en contact de la dure-mère. La sonde est maintenue au niveau de son site de mesure grâce à un support en polyéthylène collé à l'os du crâne avec une colle de type cyanolit. L'animal est alors retiré de l'appareil stéréotaxique et on peut commencer la procédure chirurgicale d'ischémie.

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1. 4. Quantification des atteintes fonctionnelles 1. 4.1. Perte de poids
La perte de poids des animaux est évaluée par la différence entre le poids avant la réalisation de l'ischémie et le poids le jour de l'euthanasie.

1. 4.2. Déficit neurologique
L'examen neurologique consiste en une évaluation de la présence de différents réflexes et de réactions comportementales.

Les perturbations neurologiques sont évaluées à l'aide des tests suivants: - Le réflexe d'agrippement au niveau de chacune des pattes antérieures.

Score = 1: capable de s'agripper / 0 : ne s'agrippe pas.

Total = 1 pour chaque côté.

- Les réactions de placement visuel au niveau de chacune des pattes antérieures.

Score = 1: capable de se placer / 0 : ne se place pas.

Total = 1 pour chaque côté.

- Les réactions de perte d'appui au niveau de chacune des pattes antérieures et postérieures.

Score = 1: prend son appui / 0 : ne prend pas son appui.

Total = 2 pour chaque côté.

- Le réflexe de redressement avec le test de rotation.

Score = 1: rotation dans le sens opposé / 0 : pas de rotation.

Total = 1 pour chaque côté.

Le score neurologique global est donc pour chaque côté égal à 5.

1. 5. Quantification des atteintes histologiques
L'euthanasie des rats est réalisée par l'injection d'une dose massive de pentobarbital sodique (120 mg/kg, i. p.) (Sanofi). Leurs cerveaux sont prélevés et coupés en 7 sections coronales de 2 mm d'épaisseurs à l'aide d'une matrice pour

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cerveaux de rats. Elles sont prélevées àpartir du niveau d'antériorité 13,7 par rapport à la ligne inter-aurale et ceci tous les 2 mm jusqu'au niveau d'antériorité 1,7.

1) Coloration
Les coupes fraîchement prélevées sont immergées dans une solution à 2% de chlorhydrate de triphényl-tétrazolium (TTC) (Sigma) pendant 20 minutes à température ambiante. Cette solution entraîne la coloration des zones saines en rose alors que les zones nécrosées ne se colorent pas. Les coupes sont ensuite fixées dans une solution à 4% de paraformaldéhyde (PFA, Sigma) dans un tampon phosphate sodique à 50 mM (pH 7) et placées à l'obscurité. Les surfaces d'infarctus peuvent alors être mesurées 24 heures après la coloration (Figure 3).

2) Quantification des atteintes histologiques
Les coupes sont examinées à l'aide d'un système d'analyse d'image (IMSTAR, Paris, France). Les zones d'infarctus corticales et striatales sont délimitées à l'aide d'un curseur et leur surface mesurée par l'ordinateur. Nous déterminons également la surface de l'hémisphère droit et de l'hémisphère gauche afin d'évaluer l'oedème cérébral pour chacune des coupes frontales digitalisées. Les surfaces de nécrose mesurées sont alors corrigées en fonction de cet oedème (c'est-à-dire multipliées par le rapport de la surface de l'hémisphère droit sur la surface de l'hémisphère gauche). Le volume de l'infarctus pourra alors être calculé en fonction des valeurs de surfaces de nécrose corrigées et de la distance séparant chacun des niveaux de coupe.

L'oedème est calculé de la façon suivante : de l'hémisphère gauche - surface de l'hémisphère droit/ surface de l'hémisphère droit) 2. INJECTION INTRACEREBROVENTRICULAIRE CHEZ LE RAT
La voie d'administration choisie pour l'étude de l'effet des oligonucléotidiques antisens anti-NOS inductible a nécessité la mise en place d'un guide, 5 jours avant le premier traitement (Figure 4).

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2. 1. Mise en place du guide
Un guide d'une longueur de 8 mm, réalisé à partir d'une aiguille de calibre 25G (Terumo), est fixé sur le micromanipulateur d'un appareil stéréotaxique (David Kopf, établissement Roucaire).

Les rats sont anesthésiés par l'hydrate de chloral (400 mg/kg, i. p.) puis placés en contention stéréotaxique. La surface du crâne est rasée et une incision est effectuée de manière à découvrir la boîte crânienne ; lecalvarium est dégagé. Un orifice est percé à la verticale du ventricule gauche selon les coordonnées déterminées à l'aide de l'Atlas Paxinos et Watson (1986): - Antéro-postériorité : mm par rapport au bregma -Latéralité : 1,5 mm par rapport au bregma.

Le guide est ensuite amené à l'aide du micromanipulateur à la surface de la dure-mère de manière à induire le moins possible de lésion.

On fixe ensuite le guide à la boite crânienne par du ciment dentaire (AP9, AtlanticCodental) et deux vis d'ancrage. On peut alors détacher le guide du micromanipulateur. L'animal est retiré de l'appareil stéréotaxique et remis dans des conditions normales de stabulation à l'animalerie.

2. 2. Protocole d'injection des oligonucléotides antisens anti-NOS inductible Les antisens anti-NOS inductible ont été synthétisés à l'aide d'un synthétiseur automatique. Les traitements débutent 5 jours après la mise en place du guide.

L'aiguille d'injection est constituée d'une aiguille dentaire de calibre 30G (Sofijet#), sur laquelle un butoir, constitué d'un tronçon d'aiguille de calibre 23G (Terumo) a été préalablement collé à l'aide de colle de type cyanolit, à 11mm de l'extrémité du biseau de l'aiguille dentaire. De cette manière, lorsque l'aiguille est enfoncée dans son guide jusqu'au butoir, le milieu de son biseau se trouve à 3,5 mm de la surface du crâne, ce qui d'après l'Atlas de Paxinos et Watson (1986) correspond au centre du ventricule.

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EXEMPLES EXEMPLE A : Administration des oligonucléotides antisens de l'invention
Les oligonucléotides sont administrés en solution dans du liquide céphalorachidien artificiel (Dulbecco, Sigma, réf. D8662) à une concentration de 1 nmole/l. Trois nanomoles des différentes séquences (SEQ ID n 1et n 2) sont injectés sous un volume de 3 l en 2 minutes à l'aide d'une pompe à perfusion (débit de 1,5 l/min), 12 heures avant l'ischémie, juste avant l'ischémie, puis toutes les 12 heures jusqu'à l'euthanasie des animaux, 3 jours après l'ischémie. Les animaux servant de témoins pour le solvant reçoivent, selon le même protocole, une injection de liquide céphalorachidien artificiel.

La séquence antisens (AS) ou oligonucléotide antisens, sa séquence contrôle ou le solvant sont administrés selon le protocole décrit précédemment. Trois jours après l'ischémie, les animaux sont euthanasiés et leur cerveau est prélevé et coupé en 7 sections coronales de 2 mm d'épaisseur à l'aide d'une matrice. La quatrième coupe est isolée et disséquée sur de la glace. Au niveau de cette coupe, un échantillon contenant à la fois l'infarctus cortical (excepté la zone du clip) et l'infarctus striatal est prélevé et congelé à -40 C pour le dosage des activités NOS et de la production de nitrotyrosine. Ces dosages sont aussi réalisés chez des animaux témoins-opérés, mais non-traités, et chez des rats témoins non-opérés. Les 6 autres coupes sont immergées dans une solution de TTC à 2% pour la mesure des surfaces d'infarctus. Malgré l'absence de la quatrième coupe, le volume total de l'infarctus peut être déterminé, puisque la surface de l'infarctus correspondant à la quatrième coupe, est identique à celle mesurée au dos de la troisième coupe.

EXEMPLE B : de l'oligonucléotide antisens AS et de sa séquence contrôle sur les atteintes histologiques et fonctionnelles
Le but de cet exemple est de démontrer une amélioration histologique et fonctionelle par rapport à la séquence contrôle, par l'action de l'oligonucléotide de l'invention, mesurées au travers des paramètres indicateurs des atteintes fonctionnelles et histologiques. Les traitements sont injectés par voie intracérébroventriculaire comme décrit dans l'exemple A (dose de 3 nmoles (1nmole/ l) 12 heures avant

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l'ischémie, juste avant l'ischémie, puis toutes les 12 heures jusqu'à l'euthanasie des animaux, 3 jours après l'ischémie).

1) Volumes des infarctus
Trois jours après l'ischémie, les animaux témoins ayant reçu le solvant ont des volumes d'infarctus corticaux et striataux respectivement de 112 7 et 42 2 mm3. Ces volumes ne sont pas significativement modifiés par la séquence contrôle. Par contre, les rats traités par la séquence AS présentent des volumes d'infarctus corticaux réduits de 25 à 50 % par rapport à ceux des animaux traités par le solvant, et ceux des rats traités par la séquence contrôle. Les volumes des infarctus striataux ne sont pas significativement affectés ni par la séquence AS, ni par sa séquence contrôle. La réduction de l'infarctus s'exerce aux niveaux des sections comprises entre 11,7 et 9,7 mm par rapport à la ligne inter-aurale, ce qui correspond à la partie antérieure de l'infarctus.

2) Score neurologique
Les animaux témoins-opérés ont un score neurologique égal à 5 pour les côtés gauche et droit. L'ischémie induit un déficit neurologique marqué du côté droit. Le traitement par la séquence contrôle ne modifie pas ce déficit neurologique. En revanche, le traitement par la séquence AS réduit significativement le déficit du côté droit par rapport à celui des animaux traités par le solvant, et par rapport à celui des rats traités par la séquence contrôle.

3) Perte de poids
L'évolution de la perte de poids au cours des jours qui suivent l'ischémie des animaux traités, soit par la séquence AS, soit par sa séquence contrôle, soit par le solvant a été mesurée ainsi que chez des animaux témoins-opérés .

Les animaux témoins-opérés perdent en moyenne 7 grammes pendant les deux jours après l'intervention, puis ils retrouvent leur poids initial. Après l'ischémie, les animaux perdent en moyenne 36 3 g le premier jour suivant l'intervention , 52 2 g à 2 jours et 66 3 g à 3 jours. Le traitement par la séquence contrôle n'affecte pas

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cette chute progressive de poids. Par contre, les rats traités par la séquence AS présentent, 2 jours après l'ischémie, une perte de poids réduite comprise entre 10 et 30% par rapport à celles induites chez les animaux traités par le solvant ou chez les rats traités par la séquence contrôle. Trois jours après l'ischémie, la perte de poids n'est plus modifiée par le traitement par la séquence AS.

Par la mesure des différentes paramètres ci-desus, cet exemple démontre que les animaux traités par les oligonucléotides antisens présentent, 3 jours après l'ischémie, une réduction comprise entre 25 et 50 % des volumes de l'infarctus cortical et une amélioration marquée des performances sensorimotrices. Cet exemple a également permis de mettre en évidence que le traitement par la séquence contrôle de l'antisens n'exerce aucun effet, ni sur la taille des lésions ni sur les atteintes fonctionnelles. Cette absence d'effet de la séquence contrôle démontre bien que l'effet de l'oligonucléotide antisens n'est pas lié à une activité non spécifique, mais résulte de l'inhibition de la synthèse d'une NO-synthase inductible.

EXEMPLE C : de l'oligonucléotide antisens AS et de sa séquence contrôle sur le dosage des activités NO-synthases Le but de cet exemple est de démontrer que l'administration d'oligonucléotides antisens selon l'invention permet une réduction de l'activité NOS calcium-indépendante induite par l'ischémie.

Les activités NOS calcium-dépendante et calcium-indépendante des animaux traités, soit par la séquence AS, soit par sa séquence contrôle, soit par le solvant ont été évaluées ainsi que chez des rats témoins-opérés et chez des rats contrôles non-opérés.

1) Activité NO-synthase calcium-dépendante
L'ischémie induit une diminution de l'activité NOS calcium-dépendante par rapport aux animaux témoins-opérés et témoins non-opérés. Les traitements par la séquence AS et sa séquence contrôle sont sans effet sur cette activité.

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2) Activité NO-synthase calcium-indépendante
L'ischémie induit une augmentation de l'activité NOS calcium-indépendante d'un facteur 6 à 10 par rapport aux animaux témoins-opérés et témoins non-opérés. Le traitement par la séquence contrôle ne modifie pas significativement cette activité. Par contre, le traitement par la séquence AS entraîne une réduction de 25 à 50 % de l'activité NOS calcium-indépendante induite par l'ischémie.

Les résultats de cet exemple démontrent que l'administration d'oligonucléotides antisens selon l'invention permet avantageusement de réduire l'activité NOS calcium-indépendante induite par l'ischémie dans les cellules nerveuses.

Ces résultats montrent en outre, que le traitement par l'antisens réduit entre 25 et 50 % l'activité NOS inductible trois jours après l'ischémie, alors que sa séquence contrôle est dépourvue d'effet significatif sur cette activité enzymatique. En revanche, l'antisens comme son contrôle ne modifie pas l'activité NOS constitutive. Ces données révèlent l'inactivité de la séquence contrôle et l'effet inhibiteur spécifique de l'antisens de l'invention sur la synthèse de la NOS 2. De plus, la réduction de l'activité NOS 2 associée à l'effet neuroprotecteur, observée chez les animaux traités par l'antisens, suggère que l'antisens exerce son effet bénéfique via l'inhibition de la synthèse de la NOS 2.

EXEMPLE D : de l'oligonucléotide antisens AS et de sa séquence contrôle sur la production de nitrotyrosine
La production de nitrotyrosine des animaux traités, soit par la séquence AS, soit par sa séquence contrôle, soit par le solvant a été évaluée ainsi chez des rats témoins-opérés et chez des rats témoins non-opérés .

Trois jours après l'ischémie, la production de nitrotyrosine est augmentée d'un facteur 2 par rapport à celles des animaux témoins-opérés et témoins non-opérés. La séquence contrôle ne modifie pas cette production. En revanche, le traitement par la séquence AS réduit d'environ un tiers l'augmentation des quantités de nitrotyrosine induite par l'ischémie.

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Cet exemple démontre l'effet de l'antisens de l'invention sur la production des peroxynitrites, les principaux métabolites toxiques du NO. Cette production a été évaluée par le dosage de la nitrotyrosine. Les résultats montrent que le traitement par l'antisens réduit d'environ 1/3 l'augmentation de la production de nitrotyrosine induite par l'ischémie, alors que la séquence contrôle n'exerce aucun effet significatif sur cette production.

De plus, il faut remarquer que l'importance de la réduction de la formation de peroxynitrites sous l'effet de l'antisens est du même ordre que l'inhibition de l'activité NOS inductible. Cette donnée semble indiquer que les peroxynitrites sont issus du NO produit par l'activation d'une NOS inductible. Ainsi, l'antisens en inhibant la synthèse d'une NOS inductible réduit la formation des peroxynitrites. Cet effet associé à la neuroprotection suggère en outre que les peroxynitrites sont responsables des effets délétères de l'activation d'une NOS inductible.

EXEMPLE E : de l'oligonucléotide antisens AS et de sa séquence contrôle sur les variables physiologiques
Les variables physiologiques des animaux traités, soit par la séquence AS, soit par sa séquence contrôle, soit par le solvant ont été mesurées.

Les animaux témoins présentent des valeurs physiologiques de pression artérielle moyenne, p02, pC02, pH et température rectale qui ne sont pas modifiées ni par l'ischémie, ni par la reperfusion. Les traitements par la séquence AS et sa séquence contrôle sont sans effet sur ces variables physiologiques.

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Paxinos, G. et Watson, C., The rat brain in stereotaxic coordinates, 1986, Académie press, London.

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LISTE DE SEQUENCES <110> RHONE-POULENC RORER SA <120> UTILISATION D'OLIGONUCLEOTIDES ANTISENS DE NO-SYNTHASE
INDUCTIBLE DANS LA PREVENTION ET LE TRAITEMENT DE
L'ISCHEMIE CEREBRALE.

<130> séquences 1 et 2 <140> <141> <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 24 <212> ADN <213> Séquence artificielle <220> <223> Description de la séquence artificielle: oligonucléotide antisens de iNOS <400> 1 acaggccatc tctatggatt taca 24 <210> 2 <211> 21 <212> ADN <213> Séquence artificielle <220> <223> Description de la séquence artificielle:oligonucléotide antisens de iNOS <400> 2 cttcagagtc tgcccattgc t 21

Claims (16)

1. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'oligonucléotides antisens d'une isoforme inductible de la synthase du monoxyde d'azote (iNOS) pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention et le traitement de l'ischémie cérébrale.
2. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que les oligonucléotides antisens sont antisens pour tout ou partie de la NO-synthase inductible.
3. 3. Oligonucléotides antisens tel que décrit selon la revendication 2, caractérisé en ce que la séquence des oligonucléotides correspond à la séquence présentée en SEQ ID N 1 ou l'une des séquences dérivées.
4. 4. Oligonucléotides antisens tel que décrit selon la revendication 2, caractérisée en ce que la séquence des oligonucléotides correspond à la séquence présentée en SEQ ID N 2 ou l'une des séquences dérivées.
5. 5. Oligonucléotides antisens tel que décrit selon la revendication 2, caractérisés en ce que la séquence des oligonucléotides comprend entre 10 et 30 mers.
6. 6. Oligonucléotides antisens tel que décrit selon la revendication 2, caractérisée en ce que la séquence des oligonucléotides comprend entre 15 et 25 mers.
7. 7. Composition caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un oligonucléotide antisens d'une isoforme inductible de la synthase du monoxyde d'azote pour la prévention et le traitement de l'ischémie cérébrale.
8. 8. Vecteur comprenant dans son génome un acide nucléique codant pour les oligonucléotides antisens tel que décrit selon la revendication 1.
9. 9. Vecteur selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur plasmidique.
10. 10. Vecteur selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un virus recombinant.

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11. 11. Virus tel que décrit selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il est défectif.
12. 12. Virus selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'il s'agit d'un adénovirus, un rétrovirus, un virus adéno-associé, un herpès virus, le virus de la vaccine .
13. 13. Utilisation d'un vecteur tel que décrit selon l'une des revendications 8 à 12 pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention et le traitement de l'ischémie cérébrale.
14. 14. Composition comprenant au moins un vecteur tel que décrit selon les revendications 8 à 12.
15. 15. Médicament comprenant au moins un vecteur tel que décrit selon les revendications 8 à 12.
16. 16. Médicament comprenant au moins un oligonucléotide antisens d'une isoforme inductible de la synthase du monoxyde d'azote pour la prévention et le traitement de l'ischémie cérébrale.