CN116836975A

CN116836975A - 一种耳蜗和/或前庭细胞特异性启动子及其应用

Info

Publication number: CN116836975A
Application number: CN202210321731.0A
Authority: CN
Inventors: 钟桂生; 储岑凤
Original assignee: Shanghai Weimei Gene Technology Co ltd
Current assignee: Shanghai Weimei Gene Technology Co ltd
Priority date: 2022-03-25
Filing date: 2022-03-25
Publication date: 2023-10-03
Also published as: WO2023179419A1

Abstract

本发明公开了耳蜗和/或前庭细胞特异性启动子及其应用，具体涉及特异性启动子STRC、Slc26a5、otof、Sox10、Ngfr 1、Ngfr 2、Dnah5及其在耳蜗和/或前庭细胞中的应用，属于生物医药领域。所述特异性启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1、6、11、16、21、26、31所示。本发明还提供了一种含所述特异性启动子的重组载体。基于所述启动子具有在耳蜗和/或前庭中特异性表达的特点，本发明提供了组织特异性启动子、扩增引物、重组载体或药物组合物在用于听觉相关疾病的基因治疗、构建相关动物模型、发病机制相关研究等方面中的应用。

Description

一种耳蜗和/或前庭细胞特异性启动子及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及耳蜗和/或前庭细胞特异性启动子及其应用，具体涉及特异性启动子STRC、Slc26a5、otof、Sox10、Ngfr 1、Ngfr 2、Dnah5及其在耳蜗和/或前庭细胞中的应用。

背景技术

听力损伤(hearing loss)是世界上最常见的神经感受性疾病之一。根据世界卫生组织统计数据显示，截止到2020年3月，全世界约有4.66亿人有听力障碍，占全球人口的5％，其中3400万是儿童。每1000个新生儿中，就有3个先天性听力障碍患者。遗传因素被认为是导致50-60％感音神经性听力损伤的易感因素或直接原因。耳蜗中主要的功能细胞分为毛细胞，支持细胞和螺旋神经元等。耳聋基因分布在其中，因此特异性调控基因表达对于听力基因治疗有重大意义。

目前，科研工作者对特定类型细胞功能分析主要依赖于转基因动物。然而，转基因动物，如小鼠、大鼠、狗、猪和猴子等，繁殖周期长、饲养成本高以及不能灵活地携带目的基因进行细胞的操控与疾病的治疗；因此，继续发展能够用于标记和操控特异类型细胞的方法具有十分重要的意义。随着生物信息学与分子生物学的发展，利用特异性启动子介导外源基因表达已成为特定组织靶向与操控以及基因治疗的高效途径。

耳聋基因大多分布在毛细胞中。因此特异性调控毛细胞中基因表达对于听力基因治疗有重大意义。目前在听力系统的毛细胞中还没有发现可以特异表达外源基因的启动子。用于基因治疗的启动子为广泛性表达的启动子CAG或CMV，因此，外源基因会在除了毛细胞以外的细胞中表达，造成基因治疗的副作用。此外，通过注射病毒的方式导入外源基因时，如对幼年鼠从圆窗注射病毒时，病毒会通过脑脊液进入脑组织，从而感染脑组织中的细胞。因此，亟需开发能够降低外源基因在毛细胞以外的细胞如脑组织细胞中的表达，提高基因治疗安全性的方法。

毛细胞又被分为外毛细胞和内毛细胞，内毛细胞负责分析声音信息，外毛细胞负责声音的放大。外毛细胞中有很多特异表达的蛋白，对外毛细胞的功能有着重要的意义。一些耳聋基因特异分布在内毛细胞或者外毛细胞中，因此，更加特异的调控对于精准治疗有着很大的意义。Prestin是一种高度特化的阴离子载体，属于溶质转运体超家族SLC26(solute carrier protein)，并特异地分布于内耳柯蒂氏器外毛细胞(outer hair cells,OHCs)的侧壁，它是外毛细胞电致运动和听觉放大效应的分子基础，有马达蛋白的别称。同样，prestin也是一种耳聋基因。因此特异性调控基因表达在外毛细胞中对于外毛细胞的功能研究和听力基因治疗有重大意义。

目前在听力系统的外毛细胞中还没有发现可以特异表达外源基因的启动子。用于基因治疗的启动子为广泛性表达的启动子CAG或CMV，因此，外源基因会在除了外毛细胞以外的细胞中表达，造成基因治疗的副作用。一些耳聋基因特异分布在内毛细胞或者外毛细胞中，因此，更加特异的调控对于精准治疗有着很大的意义。此外，幼年鼠从圆窗注射病毒时，病毒会通过脑脊液进入脑组织，从而感染脑组织中的细胞。因此，亟需开发能够降低外源基因在外毛细胞以外的细胞如脑组织细胞中的表达，提高基因治疗安全性的方法。

毛细胞又分为内毛细胞和外毛细胞，外毛细胞负责声音的放大，而内毛细胞则是负责分析声音的信息。部分耳聋基因如otof，vglut3等主要分布在内毛细胞中，因此特异性调控基因表达在内毛细胞中对于内毛细胞的功能研究和听力基因治疗有重大意义。目前在听力系统的内毛细胞中还没有发现可以特异表达外源基因的启动子。用于基因治疗的启动子为广泛性表达的启动子CAG或CMV，因此，外源基因会在除了内毛细胞以外的细胞中表达，造成基因治疗的副作用。一些耳聋基因特异分布在内毛细胞中，因此，更加特异的调控对于精准治疗有着很大的意义。此外，幼年鼠从圆窗注射病毒时，病毒会通过脑脊液进入脑组织，从而感染脑组织中的细胞。因此，亟需开发能够降低外源基因在内毛细胞以外的细胞如脑组织细胞中的表达，提高基因治疗安全性的方法。

耳聋基因大多分布在毛细胞中。然而我国最高频的耳聋基因Gjb2主要是表达在支持细胞中，占先天性耳聋的30％以上。并且，支持细胞转化为毛细胞被认为是毛细胞再生的重要途经。因此特异性调控基因表达在支持细胞中对于支持细胞的功能研究和听力基因治疗与毛细胞再生有重大意义。

目前在听力系统的支持细胞中还没有发现可以特异表达外源基因的启动子。用于基因治疗的启动子为广泛性表达的启动子CAG或CMV，因此，外源基因会在除了支持细胞以外的细胞中表达，造成基因治疗的副作用。一些耳聋基因特异分布在毛细胞或者支持细胞中，因此，更加特异的调控对于精准治疗有着很大的意义。此外，幼年鼠从圆窗注射病毒时，病毒会通过脑脊液进入脑组织，从而感染脑组织中的细胞，亟需开发能够降低外源基因在支持细胞以外的细胞如脑组织细胞中的表达，提高基因治疗安全性的方法。

螺旋神经节细胞(spiral ganglion neuron,SGN)是听觉系统的初级传入神经元，它将由毛细胞传来的声音信息传递到脑干的耳蜗核产生听觉。因此特异性调控基因表达在螺旋神经节细胞中对于螺旋神经节细胞的功能研究和听力基因治疗有重大意义。其中螺旋神经节细胞分为I型螺旋神经节细胞和II型螺旋神经节细胞，其中I型螺旋神经节细胞与内毛细胞相连接，占所有螺旋神经节细胞的95％，参与声音信息分析的传递；其中II型螺旋神经节细胞与外毛细胞相连接，占所有螺旋神经节细胞的5％，与声音的放大有关。然而目前I型或II型螺旋神经节细胞的结构和功能还未研究明确。

目前在听力系统的I型螺旋神经节细胞中还没有发现可以特异表达外源基因的启动子。用于基因治疗的启动子为广泛性表达的启动子CAG或CMV，因此，外源基因会在除了靶细胞以外的细胞中表达，造成基因治疗的副作用。一些耳聋基因特异分布在I型或II型螺旋神经节细胞中，因此，更加特异的调控对于精准治疗有着很大的意义。此外，幼年鼠从圆窗注射病毒时，病毒会通过脑脊液进入脑组织，从而感染脑组织中的细胞。亟需开发能够降低外源基因在螺旋神经节细胞以外的细胞如脑组织细胞中的表达，提高基因治疗安全性的方法。

眩晕性疾病是一类多发病、常见病，人群患病率高达4.9％，病因纷繁复杂，涉及多个学科。前庭系统是人体平衡系统的重要组成部分，感受器是位于内耳的耳石器和半规管，接受适宜的刺激信号后，经前庭神经传入到前庭神经核，在此与其它感觉信号整合，再经多条传导通路执行特异性或非特异性功能。前庭毛细胞是一种机械感觉感受器，能够探测到头部位置的变化，从而使动物保持姿势和协调运动。前庭毛细胞的作用就是把机械运动信号转化为生物电信号。前庭功能障碍主要由位于前庭感觉上皮的毛细胞损伤引起。前庭毛细胞易受耳毒性药物、衰老和遗传因素的影响，可导致永久性的前庭功能障碍。基因突变会导致前庭毛细胞缺失，如纤毛顶端的Myo15a:whirlin:Esp8复合物对于纤毛的生长很重要，而与纤毛功能相关的基因突变可导致前庭毛细胞的损伤。因此特异性调控基因表达在前庭毛细胞中对于前庭毛细胞的功能研究和听力基因治疗与前庭毛细胞再生有重大意义。

目前在前庭毛细胞中还没有发现可以特异表达外源基因的启动子。用于基因治疗的启动子为广泛性表达的启动子CAG或CMV，因此，外源基因会在除了毛细胞以外的细胞中表达，造成基因治疗的副作用。一些前庭相关的疾病基因特异分布在前庭毛细胞或者支持细胞中，因此，更加特异的调控对于精准治疗有着很大的意义。此外，幼年鼠从圆窗注射病毒时，病毒会通过脑脊液进入脑组织，从而感染脑组织中的细胞，而我们的启动子则可以降低外源基因在脑组织中的表达，提高基因治疗的安全性。亟需开发能够降低外源基因在前庭毛细胞以外的细胞如脑组织细胞中的表达，提高基因治疗安全性的方法。

发明内容

I.耳蜗和/或前庭毛细胞特异性启动子STRC

本发明公开了一种耳蜗和/或前庭毛细胞特异性启动子及其应用，该启动子是从C57BL/6J品种小鼠基因组中获得的毛细胞特异性启动子，能够调控基因在毛细胞中特异性表达。本发明将该启动子装载到腺相关病毒载体中并在体感染小鼠耳蜗和前庭，能够介导目的基因特异性地在耳蜗和前庭毛细胞中表达，从而标记或操控毛细胞。该启动子在耳蜗和前庭毛细胞的结构与功能解析、听神经科学、耳聋疾病模型建立和基因治疗等方面具有广泛的应用价值和市场前景。

本发明的目的之一是提供一种耳蜗和/或前庭毛细胞特异性启动子，

a)所述特异性启动子包含如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；或，

b)所述特异性启动子包含与SEQ ID No.1具有80％以上序列同一性且具有a)限定的特异性启动子的功能的核苷酸片段。

本发明中，b)中所述的核苷酸片段具体指：如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)核苷酸而得到的，或者在5’端和/或3’端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)核苷酸而得到的，且具有序列如SEQ ID No.1所示的核苷酸片段的功能的核苷酸片段。所述b)中的核苷酸序列可与SEQ IDNo.1具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上的序列同一性。

本发明所述的启动子，其包含与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列具有至少80％的序列同一性、优选具有至少90％的序列同一性、优选具有至少95％的序列同一性、进一步优选具有至少98％的序列同一性的核酸，更进一步优选包含具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，特别优选所述启动子为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。所述启动子除了包含与SEQID No.1所示的核苷酸序列具有至少80％的序列同一性的核苷酸以外，还可以在其末端包含限制酶位点、Gateway克隆用att序列等用于克隆到载体中的位点等的碱基序列。

在一些优选实施方式中，所述特异性启动子为STRC，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。在一些优选实施方式中，所述特异性启动子为缩短的启动子STRC mini，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明的另一目的是提供用于扩增如上所述的特异性启动子的引物对A，包括正向引物和反向引物，其中，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明的另一目的是提供一种耳蜗和/或前庭毛细胞特异性重组载体，其包含如上所述的特异性启动子。

在一些优选实施方式中，所述特异性启动子STRC的基因插入在基础载体的Kpn1/Mlu1或XbaI/BamHI多克隆位点处。优选地，所述特异性启动子STRC插入在基础载体的Kpn1/Mlu1多克隆位点处。

在一些优选实施方式中，所述重组载体还包括目的基因。在一些优选实施方式中，所述目的基因位于所述特异性启动子基因的3'端。在一些优选实施方式中，所述目的基因表达在耳蜗和/或前庭细胞中。在一些优选实施方式中，所述目的基因选自人耳聋基因，如Prestin、otof、vglut3、Gjb2中的一种或几种。

本发明另一目的是提供一种药物组合物，其包含如上所述的重组载体。

本发明另一目的是提供如上所述的特异性启动子、引物对、重组载体或药物组合物的用途，选自以下至少任一项：

1)在制备用于预防听觉相关疾病的药物中的用途；

2)在制备用于听觉相关疾病的基因治疗的药物中的用途；

3)在制备筛选用于预防和/或治疗听觉相关疾病的药物或载体中的用途；

4)在构建听觉相关疾病动物模型中的用途；

5)在构建与耳聋基因异常相伴随的疾病动物模型中的用途；

6)在体外耳蜗和/或前庭毛细胞再生相关研究中的用途；

7)在体外耳蜗和/或前庭毛细胞损伤保护相关研究中的用途；

8)在体外内耳发育相关研究中的用途；

9)在体外听觉相关疾病发病机制相关研究中的用途；

10)在体外听觉突触重建相关研究中的用途。

本发明另一目的是一种用于治疗听觉相关疾病的方法，其包括：对需要治疗的患者给予有效量的如上所述的重组载体。

在一具体实施方式中，本发明提供如上所述的耳蜗特异性启动子STRC或缩短的启动子STRC mini在耳蜗和/或前庭毛细胞特异性表达中的应用，将该启动子STRC装载到腺相关病毒载体中并在体感染小鼠耳蜗和前庭的毛细胞，结果表明STRC启动子能够特异性地启动mNeonGreen基因(一种荧光蛋白)在耳蜗和前庭的毛细胞中表达。

在一具体实施方式中，本发明提供如上所述的特异性启动子STRC在构建转基因小鼠模型中的应用，将该启动子STRC或缩短的启动子STRC mini装载到腺相关病毒载体，并同时将目的基因构建到腺相关病毒载体上，可以控制目的基因的转录和表达，构建得到转基因小鼠模型。

本发明所述的启动子STRC或缩短的启动子STRC mini为在耳蜗和前庭的毛细胞中特异性地起作用的启动子，由此可使可操作地连接在该启动子的下游的基因在耳蜗和前庭的毛细胞中特异性地表达。本发明所述的启动子可通过基因工程方法来得到。例如，从人基因组取得人启动子STRC的基因，通过使部分碱基缺失、插入或置换而得到具有期望的碱基序列的启动子。另外，也可以通过部分合成或全合成得到具有期望的碱基序列的启动子。

与现有技术相比，本发明特异性启动子STRC或缩短的启动子STRC mini具有以下优点及有益效果：

本发明提供了一种毛细胞特异性启动子STRC或缩短的启动子STRC mini，能够介导目的基因特异性地在小鼠耳蜗和/或前庭的毛细胞中表达，从而标记或操控毛细胞。

本发明所述特异性启动子STRC或缩短的启动子STRC mini可以降低外源基因在其他组织例如脑组织中的表达，提高基因治疗的安全性。

本发明所述特异性启动子STRC或缩短的启动子STRC mini介导目的基因表达比传统的转基因方法更灵活，应用更方便，成本更低。

本发明所述特异性启动子STRC或缩短的启动子STRC mini能装载到需要的载体上，同时可表达治疗基因用于基因治疗，这是不能用转基因动物实现的。

本发明所述特异性启动子STRC或缩短的启动子STRC mini在听神经科学、耳聋疾病模型建立和基因治疗等领域具有广泛的应用价值和市场前景。

II.耳蜗外毛细胞特异性启动子Slc26a5

本发明公开了一种耳蜗外毛细胞特异性启动子及其应用，该启动子是从C57BL/6J品种小鼠基因组中获得的外毛细胞特异性启动子，能够调控基因在外毛细胞中特异性表达。本发明将该启动子装载到腺相关病毒载体中并在体感染小鼠耳蜗，能够介导目的基因特异性地在耳蜗外毛细胞中表达，从而标记或操控外毛细胞。该启动子在耳蜗外毛细胞的结构与功能解析、听神经科学、耳聋疾病模型建立和基因治疗等方面具有广泛的应用价值和市场前景。

本发明的目的之一是提供一种耳蜗外毛细胞特异性启动子，

a)所述特异性启动子包含如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；或，

b)所述特异性启动子包含与SEQ ID No.6具有80％以上序列同一性且具有a)限定的特异性启动子的功能的核苷酸片段。

本发明中，b)中所述的核苷酸片段具体指：如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)核苷酸而得到的，或者在5’端和/或3’端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)核苷酸而得到的，且具有序列如SEQ ID No.6所示的核苷酸片段的功能的核苷酸片段。所述b)中的核苷酸序列可与SEQ IDNo.6具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上的序列同一性。

本发明所述的启动子，其包含与SEQ ID No.6所示的核苷酸序列具有至少80％的序列同一性、优选具有至少90％的序列同一性、优选具有至少95％的序列同一性、进一步优选具有至少98％的序列同一性的核酸，更进一步优选包含具有SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，特别优选为SEQ ID No.6所示的核苷酸序列。所述启动子除了包含与SEQ ID No.6所示的核苷酸序列具有至少80％的序列同一性的核苷酸以外，还可以在其末端包含限制酶位点、Gateway克隆用att序列等用于克隆到载体中的位点等的碱基序列。

在一些优选实施方式中，所述特异性启动子为Slc26a5，其核苷酸序列如SEQ IDNo.6所示。

本发明的另一目的是提供用于扩增如上所述的特异性启动子的引物对B，包括正向引物和反向引物，其中，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。

本发明的另一目的是提供一种耳蜗外毛细胞特异性重组载体，其包含如上所述的特异性启动子。

在一些优选实施方式中，所述特异性启动子Slc26a5的基因插入在基础载体的Kpn1/Mlu1或XbaI/BamHI多克隆位点处。优选地，所述特异性启动子STRC插入在基础载体的XbaI/BamHI多克隆位点处。

在一些优选实施方式中，所述重组载体还包括目的基因。在一些优选实施方式中，所述目的基因位于所述特异性启动子基因的3'端。在一些优选实施方式中，所述目的基因表达在耳蜗外毛细胞中。在一些优选实施方式中，所述目的基因选自人耳聋基因，如Prestin、otof、vglut3、Gjb2中的一种或几种。

1)在制备用于预防听觉相关疾病的药物中的用途；

2)在制备用于听觉相关疾病的基因治疗的药物中的用途；

4)在构建听觉相关疾病动物模型中的用途；

5)在构建与耳聋基因异常相伴随的疾病动物模型中的用途；

6)在体外耳蜗外毛细胞再生相关研究中的用途；

7)在体外耳蜗外毛细胞损伤保护相关研究中的用途；

8)在体外内耳发育相关研究中的用途；

9)在体外听觉相关疾病发病机制相关研究中的用途；

10)在体外听觉突触重建相关研究中的用途。

在一具体实施方式中，本发明提供如上所述的耳蜗特异性启动子Slc26a5在耳蜗外毛细胞特异性表达中的应用，将该启动子Slc26a5装载到腺相关病毒载体中并在体感染小鼠耳蜗，结果表明启动子Slc26a5能够特异性地启动mNeonGreen基因(一种荧光蛋白)在耳蜗外毛细胞中表达。

在一具体实施方式中，本发明提供如上所述的特异性启动子Slc26a5在构建转基因小鼠模型中的应用，将该启动子Slc26a5装载到腺相关病毒载体，并同时将目的基因构建到腺相关病毒载体上，可以控制目的基因的转录和表达，构建得到转基因小鼠模型。

本发明所述的启动子Slc26a5为在耳蜗外毛细胞中特异性地起作用的启动子，由此可使可操作地连接在该启动子的下游的基因在耳蜗外毛细胞中特异性地表达。本发明所述的启动子Slc26a5可通过基因工程方法来得到。例如，从人基因组取得人启动子Slc26a5的基因，通过使部分碱基缺失、插入或置换而得到具有期望的碱基序列的启动子。另外，也可以通过部分合成或全合成得到具有期望的碱基序列的启动子。

与现有技术相比，本发明特异性启动子Slc26a5具有以下优点及有益效果：

本发明提供了一种毛细胞特异性启动子Slc26a5，能够介导目的基因特异性地在小鼠耳蜗外毛细胞中表达，从而标记或操控耳蜗外毛细胞。

本发明所述特异性启动子Slc26a5可以降低外源基因在其他组织例如脑组织中的表达，提高基因治疗的安全性。

本发明所述特异性启动子Slc26a5介导目的基因表达比传统的转基因方法更灵活，应用更方便，成本更低。

本发明所述特异性启动子Slc26a5能装载到需要的载体上，同时可表达治疗基因用于基因治疗，这是不能用转基因动物实现的。

本发明所述特异性启动子Slc26a5在听神经科学、耳聋疾病模型建立和基因治疗等领域具有广泛的应用价值和市场前景。

III耳蜗内毛细胞特异性启动子otof

本发明公开了一种耳蜗内毛细胞特异性启动子及其应用，该启动子是从C57BL/6J品种小鼠基因组中获得的内毛细胞特异性启动子，能够调控基因在内毛细胞中特异性表达。本发明将该启动子装载到腺相关病毒载体中并在体感染小鼠耳蜗，能够介导目的基因特异性地在耳蜗内毛细胞中表达，从而标记或操控内毛细胞。该启动子在耳蜗内毛细胞的结构与功能解析、听神经科学、耳聋疾病模型建立和基因治疗等方面具有广泛的应用价值和市场前景。

本发明的目的之一是提供一种耳蜗内毛细胞特异性启动子，

a)所述特异性启动子包含如SEQ ID No.11所示的核苷酸序列；或，

b)所述特异性启动子包含与SEQ ID No.11具有80％以上序列同一性且具有a)限定的特异性启动子的功能的核苷酸片段。

本发明中，b)中所述的核苷酸片段具体指：如SEQ ID No.11所示的核苷酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)核苷酸而得到的，或者在5’端和/或3’端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)核苷酸而得到的，且具有序列如SEQ ID No.11所示的核苷酸片段的功能的核苷酸片段。所述b)中的核苷酸序列可与SEQ ID No.11具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上的序列同一性。

本发明所述的启动子，其包含与SEQ ID No.11所示的核苷酸序列具有至少80％的序列同一性、优选具有至少90％的序列同一性、优选具有至少95％的序列同一性、进一步优选具有至少98％的序列同一性的核酸，更进一步优选包含具有SEQ ID No.11所示的核苷酸序列，特别优选为SEQ ID No.11所示的核苷酸序列。所述启动子除了包含与SEQ ID No.11所示的核苷酸序列具有至少80％的序列同一性的核苷酸以外，还可以在其末端包含限制酶位点、Gateway克隆用att序列等用于克隆到载体中的位点等的碱基序列。

在一些优选实施方式中，所述特异性启动子为otof，其核苷酸序列如SEQ IDNo.11所示。

本发明的另一目的是提供用于扩增如上所述的特异性启动子的引物对C，包括正向引物和反向引物，其中，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示；反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示。

本发明的另一目的是提供一种耳蜗内毛细胞特异性重组载体，其包含如上所述的特异性启动子。

在一些优选实施方式中，所述特异性启动子otof的基因插入在基础载体的Kpn1/Mlu1或XbaI/BamHI多克隆位点处。优选地，所述特异性启动子STRC插入在基础载体的XbaI/BamHI多克隆位点处。

在一些优选实施方式中，所述重组载体还包括目的基因。在一些优选实施方式中，所述目的基因位于所述特异性启动子基因的3'端。在一些优选实施方式中，所述目的基因表达在耳蜗内毛细胞中。在一些优选实施方式中，所述目的基因选自人耳聋基因，如Prestin、otof、vglut3、Gjb2中的一种或几种。

1)在制备用于预防听觉相关疾病的药物中的用途；

2)在制备用于听觉相关疾病的基因治疗的药物中的用途；

4)在构建听觉相关疾病动物模型中的用途；

5)在构建与耳聋基因异常相伴随的疾病动物模型中的用途；

6)在体外耳蜗内毛细胞再生相关研究中的用途；

7)在体外耳蜗内毛细胞损伤保护相关研究中的用途；

8)在体外内耳发育相关研究中的用途；

9)在体外听觉相关疾病发病机制相关研究中的用途；

10)在体外听觉突触重建相关研究中的用途。

在一具体实施方式中，本发明提供如上所述的耳蜗特异性启动子otof在耳蜗内毛细胞特异性表达中的应用，将该启动子otof装载到腺相关病毒载体中并在体感染小鼠耳蜗，结果表明启动子otof能够特异性地启动mNeonGreen基因(一种荧光蛋白)在耳蜗内毛细胞中表达。

在一具体实施方式中，本发明提供如上所述的特异性启动子otof在构建转基因小鼠模型中的应用，将该启动子otof装载到腺相关病毒载体，并同时将目的基因构建到腺相关病毒载体上，可以控制目的基因的转录和表达，构建得到转基因小鼠模型。

本发明所述的启动子otof为在耳蜗内毛细胞中特异性地起作用的启动子，由此可使可操作地连接在该启动子的下游的基因在耳蜗内毛细胞中特异性地表达。本发明所述的启动子otof可通过基因工程方法来得到。例如，从人基因组取得人启动子otof的基因，通过使部分碱基缺失、插入或置换而得到具有期望的碱基序列的启动子。另外，也可以通过部分合成或全合成得到具有期望的碱基序列的启动子。

与现有技术相比，本发明特异性启动子otof具有以下优点及有益效果：

本发明提供了一种毛细胞特异性启动子otof，能够介导目的基因特异性地在小鼠耳蜗内毛细胞中表达，从而标记或操控内毛细胞。

本发明所述特异性启动子otof可以降低外源基因在其他组织例如脑组织中的表达，提高基因治疗的安全性。

本发明所述特异性启动子otof介导目的基因表达比传统的转基因方法更灵活，应用更方便，成本更低。

本发明所述特异性启动子otof能装载到需要的载体上，同时可表达治疗基因用于基因治疗，这是不能用转基因动物实现的。

本发明所述特异性启动子otof在听神经科学、耳聋疾病模型建立和基因治疗等领域具有广泛的应用价值和市场前景。

IV.耳蜗支持细胞特异性启动子

本发明公开了一种耳蜗支持细胞特异性启动子及其应用，该启动子是从C57BL/6J品种小鼠基因组中获得的支持细胞特异性启动子，能够调控基因在支持细胞中特异性表达。本发明将该启动子装载到腺相关病毒载体中并在体感染小鼠耳蜗，能够介导目的基因特异性地在耳蜗支持细胞中表达，从而标记或操控支持细胞。该启动子在耳蜗支持细胞的结构与功能解析、听神经科学、疾病模型建立和基因治疗等方面具有广泛的应用价值和市场前景。

本发明的目的之一是提供一种耳蜗支持细胞特异性启动子，包括：

a)所述特异性启动子包含如SEQ ID No.16所示的核苷酸序列；或，

b)所述特异性启动子包含与SEQ ID No.16具有80％以上序列同一性且具有a)限定的特异性启动子的功能的核苷酸片段。

本发明中，b)中所述的核苷酸片段具体指：如SEQ ID No.16所示的核苷酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)核苷酸而得到的，或者在5’端和/或3’端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)核苷酸而得到的，且具有序列如SEQ ID No.16所示的核苷酸片段的功能的核苷酸片段。所述b)中的核苷酸序列可与SEQ ID No.16具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上的序列同一性。

本发明所述的启动子，其包含与SEQ ID No.16所示的核苷酸序列具有至少80％的序列同一性、优选具有至少90％的序列同一性、优选具有至少95％的序列同一性、进一步优选具有至少98％的序列同一性的核酸，更进一步优选包含具有SEQ ID No.16所示的核苷酸序列，特别优选为SEQ ID No.16所示的核苷酸序列。所述启动子除了包含与SEQ ID No.16所示的核苷酸序列具有至少80％的序列同一性的核苷酸以外，还可以在其末端包含限制酶位点、Gateway克隆用att序列等用于克隆到载体中的位点等的碱基序列。

在一些优选实施方式中，所述特异性启动子为Sox10，其核苷酸序列如SEQ IDNo.16所示。

本发明的另一目的是提供用于扩增如上所述的特异性启动子的引物对D，包括正向引物和反向引物，其中，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.18所示；反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示。

本发明的另一目的是提供一种耳蜗支持细胞特异性重组载体，其包含如上所述的特异性启动子。

在一些优选实施方式中，所述特异性启动子Sox10的基因插入在基础载体的Kpn1/Mlu1或XbaI/BamHI多克隆位点处。优选地，所述特异性启动子STRC插入在基础载体的XbaI/BamHI多克隆位点处。

在一些优选实施方式中，所述重组载体还包括目的基因。在一些优选实施方式中，所述目的基因位于所述特异性启动子基因的3'端。在一些优选实施方式中，所述目的基因表达在耳蜗支持细胞中。在一些优选实施方式中，所述目的基因选自人耳聋基因，如Prestin、otof、vglut3、Gjb2中的一种或几种。

1)在制备用于预防听觉相关疾病的药物中的用途；

2)在制备用于听觉相关疾病的基因治疗的药物中的用途；

4)在构建听觉相关疾病动物模型中的用途；

5)在构建与耳聋基因异常相伴随的疾病动物模型中的用途；

6)在体外耳蜗支持细胞再生相关研究中的用途；

7)在体外耳蜗支持细胞损伤保护相关研究中的用途；

8)在体外内耳发育相关研究中的用途；

9)在体外听觉相关疾病发病机制相关研究中的用途；

10)在体外听觉突触重建相关研究中的用途。

在一具体实施方式中，本发明提供如上所述的耳蜗特异性启动子Sox10在耳蜗支持细胞特异性表达中的应用，将该启动子Sox10装载到腺相关病毒载体中并在体感染小鼠耳蜗支持细胞，结果表明启动子Sox10能够特异性地启动mNeonGreen基因(一种荧光蛋白)在耳蜗支持细胞中表达。

在一具体实施方式中，本发明提供如上所述的特异性启动子Sox10在构建转基因小鼠模型中的应用，将该启动子Sox10装载到腺相关病毒载体，并同时将目的基因构建到腺相关病毒载体上，可以控制目的基因的转录和表达，构建得到转基因小鼠模型。

本发明所述的启动子Sox10为在耳蜗支持细胞中特异性地起作用的启动子，由此可使可操作地连接在该启动子的下游的基因在耳蜗支持细胞中特异性地表达。本发明所述的启动子可通过基因工程方法来得到。例如，从人基因组取得人启动子Sox10的基因，通过使部分碱基缺失、插入或置换而得到具有期望的碱基序列的启动子。另外，也可以通过部分合成或全合成得到具有期望的碱基序列的启动子。

与现有技术相比，本发明特异性启动子Sox10具有以下优点及有益效果：

本发明提供了一种毛细胞特异性启动子Sox10，能够介导目的基因特异性地在小鼠耳蜗和前庭的毛细胞中表达，从而标记或操控毛细胞。

本发明所述特异性启动子Sox10可以降低外源基因在其他组织例如脑组织中的表达，提高基因治疗的安全性。

本发明所述特异性启动子Sox10介导目的基因表达比传统的转基因方法更灵活，应用更方便，成本更低。

本发明所述特异性启动子Sox10能装载到需要的载体上，同时可表达治疗基因用于基因治疗，这是不能用转基因动物实现的。

本发明所述特异性启动子Sox10在听神经科学、耳聋疾病模型建立和基因治疗等领域具有广泛的应用价值和市场前景。

V.耳蜗I型螺旋神经节细胞特异性启动子Ngfr 1

本发明公开了一种耳蜗I型螺旋神经节细胞特异性启动子及其应用，该启动子是从C57BL/6J品种小鼠基因组中获得的I型螺旋神经节细胞特异性启动子，能够调控基因在I型螺旋神经节细胞中特异性表达。本发明将该启动子装载到腺相关病毒载体中并在体感染小鼠耳蜗，能够介导目的基因特异性地在耳蜗I型螺旋神经节细胞中表达，从而标记或操控I型螺旋神经节细胞。该启动子在耳蜗I型螺旋神经节细胞的结构与功能解析、疾病模型建立和基因治疗等方面具有广泛的应用价值和市场前景。

本发明的目的之一是提供一种耳蜗I型螺旋神经节细胞特异性启动子，

a)所述特异性启动子包含如SEQ ID No.21所示的核苷酸序列；或，

b)所述特异性启动子包含与SEQ ID No.21具有80％以上序列同一性且具有a)限定的特异性启动子的功能的核苷酸片段。

本发明中，b)中所述的核苷酸片段具体指：如SEQ ID No.21所示的核苷酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)核苷酸而得到的，或者在5’端和/或3’端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)核苷酸而得到的，且具有序列如SEQ ID No.21所示的核苷酸片段的功能的核苷酸片段。所述b)中的核苷酸序列可与SEQ ID No.21具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上的序列同一性。

本发明所述的启动子，其包含与SEQ ID No.21所示的核苷酸序列具有至少80％的序列同一性、优选具有至少90％的序列同一性、优选具有至少95％的序列同一性、进一步优选具有至少98％的序列同一性的核酸，更进一步优选包含具有SEQ ID No.21所示的核苷酸序列，特别优选为SEQ ID No.21所示的核苷酸序列。所述启动子除了包含与SEQ ID No.21所示的核苷酸序列具有至少80％的序列同一性的核苷酸以外，还可以在其末端包含限制酶位点、Gateway克隆用att序列等用于克隆到载体中的位点等的碱基序列。

在一些优选实施方式中，所述特异性启动子为Ngfr 1，其核苷酸序列如SEQ IDNo.21所示。

本发明的另一目的是提供用于扩增如上所述的特异性启动子的引物对E，包括正向引物和反向引物，其中，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示；反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.24所示。

本发明的另一目的是提供一种耳蜗I型螺旋神经节细胞特异性重组载体，其包含如上所述的特异性启动子。

在一些优选实施方式中，所述特异性启动子Ngfr 1的基因插入在基础载体的Kpn1/Mlu1或XbaI/BamHI多克隆位点处。优选地，所述特异性启动子Ngfr 1插入在基础载体的Kpn1/Mlu1多克隆位点处。

在一些优选实施方式中，所述重组载体还包括目的基因。在一些优选实施方式中，所述目的基因位于所述特异性启动子基因的3'端。在一些优选实施方式中，所述目的基因表达在耳蜗I型螺旋神经节细胞中。在一些优选实施方式中，所述目的基因选自人耳聋基因，如Prestin、otof、vglut3、Gjb2中的一种或几种。

1)在制备用于预防听觉相关疾病的药物中的用途；

2)在制备用于听觉相关疾病的基因治疗的药物中的用途；

4)在构建听觉相关疾病动物模型中的用途；

5)在构建与耳聋基因异常相伴随的疾病动物模型中的用途；

6)在体外耳蜗I型螺旋神经节细胞再生相关研究中的用途；

7)在体外耳蜗I型螺旋神经节细胞损伤保护相关研究中的用途；

8)在体外内耳发育相关研究中的用途；

9)在体外听觉相关疾病发病机制相关研究中的用途；

10)在体外听觉突触重建相关研究中的用途。

在一具体实施方式中，本发明提供如上所述的耳蜗特异性启动子Ngfr 1在耳蜗I型螺旋神经节细胞特异性表达中的应用，将该启动子Ngfr 1装载到腺相关病毒载体中并在体感染小鼠耳蜗I型螺旋神经节细胞，结果表明启动子Ngfr 1能够特异性地启动mNeonGreen基因(一种荧光蛋白)在耳蜗I型螺旋神经节细胞中表达。

在一具体实施方式中，本发明提供如上所述的特异性启动子Ngfr 1在构建转基因小鼠模型中的应用，将该启动子Ngfr 1装载到腺相关病毒载体，并同时将目的基因构建到腺相关病毒载体上，可以控制目的基因的转录和表达，构建得到转基因小鼠模型。

本发明所述的启动子Ngfr 1为在耳蜗I型螺旋神经节细胞中特异性地起作用的启动子，由此可使可操作地连接在该启动子的下游的基因在耳蜗I型螺旋神经节细胞中特异性地表达。本发明所述的启动子Ngfr 1可通过基因工程方法来得到。例如，从人基因组取得人启动子Ngfr 1的基因，通过使部分碱基缺失、插入或置换而得到具有期望的碱基序列的启动子。另外，也可以通过部分合成或全合成得到具有期望的碱基序列的启动子。

与现有技术相比，本发明特异性启动子Ngfr 1具有以下优点及有益效果：

本发明提供了一种耳蜗I型螺旋神经节细胞特异性启动子Ngfr 1，能够介导目的基因特异性地在小鼠耳蜗和前庭的毛细胞中表达，从而标记或操控毛细胞。

本发明所述特异性启动子Ngfr 1可以降低外源基因在其他组织例如脑组织中的表达，提高基因治疗的安全性。

本发明所述特异性启动子Ngfr 1介导目的基因表达比传统的转基因方法更灵活，应用更方便，成本更低。

本发明所述特异性启动子Ngfr 1能装载到需要的载体上，同时可表达治疗基因用于基因治疗，这是不能用转基因动物实现的。

本发明所述特异性启动子Ngfr 1在听神经科学、耳聋疾病模型建立和基因治疗等领域具有广泛的应用价值和市场前景。

VI.耳蜗II型螺旋神经节细胞特异性启动子Ngfr 2

本发明公开了一种耳蜗II型螺旋神经节细胞特异性启动子及其应用，该启动子是从C57BL/6J品种小鼠基因组中获得的II型螺旋神经节细胞特异性启动子，能够调控基因在II型螺旋神经节细胞中特异性表达。本发明将该启动子装载到腺相关病毒载体中并在体感染小鼠耳蜗，能够介导目的基因特异性地在耳蜗II型螺旋神经节细胞中表达，从而标记或操控II型螺旋神经节细胞。该启动子在耳蜗II型螺旋神经节细胞的结构与功能解析、听神经科学、耳聋疾病模型建立和基因治疗等方面具有广泛的应用价值和市场前景。

本发明的目的之一是提供一种耳蜗II型螺旋神经节细胞特异性启动子，

a)所述特异性启动子包含如SEQ ID No.26所示的核苷酸序列；或，

b)所述特异性启动子包含与SEQ ID No.26具有80％以上序列同一性且具有a)限定的特异性启动子的功能的核苷酸片段。

本发明中，b)中所述的核苷酸片段具体指：如SEQ ID No.26所示的核苷酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)核苷酸而得到的，或者在5’端和/或3’端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)核苷酸而得到的，且具有序列如SEQ ID No.26所示的核苷酸片段的功能的核苷酸片段。所述b)中的核苷酸序列可与SEQ ID No.26具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上的序列同一性。

本发明所述的启动子，其包含与SEQ ID No.26所示的核苷酸序列具有至少80％的序列同一性、优选具有至少90％的序列同一性、优选具有至少95％的序列同一性、进一步优选具有至少98％的序列同一性的核酸，更进一步优选包含具有SEQ ID No.26所示的核苷酸序列，特别优选为SEQ ID No.26所示的核苷酸序列。所述启动子除了包含与SEQ ID No.26所示的核苷酸序列具有至少80％的序列同一性的核苷酸以外，还可以在其末端包含限制酶位点、Gateway克隆用att序列等用于克隆到载体中的位点等的碱基序列。

在一些优选实施方式中，所述特异性启动子为Ngfr 2，其核苷酸序列如SEQ IDNo.26所示。

本发明的另一目的是提供用于扩增如上所述的特异性启动子的引物对F，包括正向引物和反向引物，其中，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.28所示；反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.29所示。

本发明的另一目的是提供一种耳蜗II型螺旋神经节细胞特异性重组载体，其包含如上所述的特异性启动子。

在一些优选实施方式中，所述特异性启动子Ngfr 2的基因插入在基础载体的Kpn1/Mlu1或XbaI/BamHI多克隆位点处。优选地，所述特异性启动子Ngfr 2插入在基础载体的XbaI/BamHI多克隆位点处。

1)在制备用于预防听觉相关疾病的药物中的用途；

2)在制备用于听觉相关疾病的基因治疗的药物中的用途；

4)在构建听觉相关疾病动物模型中的用途；

5)在构建与耳聋基因异常相伴随的疾病动物模型中的用途；

6)在体外耳蜗II型螺旋神经节细胞再生相关研究中的用途；

7)在体外耳蜗II型螺旋神经节细胞损伤保护相关研究中的用途；

8)在体外内耳发育相关研究中的用途；

9)在体外听觉相关疾病发病机制相关研究中的用途；

10)在体外听觉突触重建相关研究中的用途。

在一具体实施方式中，本发明提供如上所述的耳蜗特异性启动子Ngfr 2在耳蜗II型螺旋神经节细胞特异性表达中的应用，将该启动子Ngfr 2装载到腺相关病毒载体中并在体感染小鼠耳蜗II型螺旋神经节细胞，结果表明启动子Ngfr 2能够特异性地启动mNeonGreen基因(一种荧光蛋白)在耳蜗II型螺旋神经节细胞中表达。

在一具体实施方式中，本发明提供如上所述的特异性启动子Ngfr 2在构建转基因小鼠模型中的应用，将该启动子Ngfr 2装载到腺相关病毒载体，并同时将目的基因构建到腺相关病毒载体上，可以控制目的基因的转录和表达，构建得到转基因小鼠模型。

本发明所述的启动子Ngfr 2为在耳蜗II型螺旋神经节细胞中特异性地起作用的启动子，由此可使可操作地连接在该启动子Ngfr 2的下游的基因在耳蜗II型螺旋神经节细胞中特异性地表达。本发明所述的启动子Ngfr 2可通过基因工程方法来得到。例如，从人基因组取得人启动子Ngfr 2的基因，通过使部分碱基缺失、插入或置换而得到具有期望的碱基序列的启动子。另外，也可以通过部分合成或全合成得到具有期望的碱基序列的启动子。

与现有技术相比，本发明特异性启动子Ngfr 2具有以下优点及有益效果：

本发明提供了一种耳蜗II型螺旋神经节细胞特异性启动子Ngfr 2，能够介导目的基因特异性地在小鼠耳蜗和前庭的毛细胞中表达，从而标记或操控毛细胞。

本发明所述特异性启动子Ngfr 2可以降低外源基因在其他组织例如脑组织中的表达，提高基因治疗的安全性。

本发明所述特异性启动子Ngfr 2介导目的基因表达比传统的转基因方法更灵活，应用更方便，成本更低。

本发明所述特异性启动子Ngfr 2能装载到需要的载体上，同时可表达治疗基因用于基因治疗，这是不能用转基因动物实现的。

本发明所述特异性启动子Ngfr 2在听神经科学、耳聋疾病模型建立和基因治疗等领域具有广泛的应用价值和市场前景。

VII.前庭毛细胞特异性启动子

本发明公开了一种前庭毛细胞特异性启动子及其应用，该启动子是从C57BL/6J品种小鼠基因组中获得的前庭毛细胞特异性启动子，能够调控基因在前庭毛细胞中特异性表达。本发明将该启动子装载到腺相关病毒载体中并在体感染小鼠耳蜗，能够介导目的基因特异性地在前庭毛细胞中表达，从而标记或操控前庭毛细胞。该启动子在前庭毛细胞的结构与功能解析、听神经科学、耳聋疾病模型建立和基因治疗等方面具有广泛的应用价值和市场前景。

本发明的目的之一是提供一种前庭毛细胞特异性启动子，

a)所述特异性启动子包含如SEQ ID No.31所示的核苷酸序列；或，

b)所述特异性启动子包含与SEQ ID No.31具有80％以上序列同一性且具有a)限定的特异性启动子的功能的核苷酸片段。

本发明中，b)中所述的核苷酸片段具体指：如SEQ ID No.31所示的核苷酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)核苷酸而得到的，或者在5’端和/或3’端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)核苷酸而得到的，且具有序列如SEQ ID No.31所示的核苷酸片段的功能的核苷酸片段。所述b)中的核苷酸序列可与SEQ ID No.31具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上的序列同一性。

本发明所述的启动子，其包含与SEQ ID No.31所示的核苷酸序列具有至少80％的序列同一性、优选具有至少90％的序列同一性、优选具有至少95％的序列同一性、进一步优选具有至少98％的序列同一性的核酸，更进一步优选包含具有SEQ ID No.31所示的核苷酸序列，特别优选为SEQ ID No.31所示的核苷酸序列。所述启动子除了包含与SEQ ID No.31所示的核苷酸序列具有至少80％的序列同一性的核苷酸以外，还可以在其末端包含限制酶位点、Gateway克隆用att序列等用于克隆到载体中的位点等的碱基序列。

在一些优选实施方式中，所述特异性启动子为Dnah5，其核苷酸序列如SEQ IDNo.31所示。

本发明的另一目的是提供用于扩增如上所述的特异性启动子的引物对G，包括正向引物和反向引物，其中，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.33所示；反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.34所示。

本发明的另一目的是提供一种前庭毛细胞特异性重组载体，其包含如上所述的特异性启动子。

在一些优选实施方式中，所述特异性启动子Dnah5的基因插入在基础载体的Kpn1/Mlu1或XbaI/BamHI多克隆位点处。优选地，所述特异性启动子STRC插入在基础载体的Kpn1/Mlu1多克隆位点处。

1)在制备用于预防听觉相关疾病的药物中的用途；

2)在制备用于听觉相关疾病的基因治疗的药物中的用途；

4)在构建听觉相关疾病动物模型中的用途；

5)在构建与耳聋基因异常相伴随的疾病动物模型中的用途；

6)在体外前庭毛细胞再生相关研究中的用途；

7)在体外前庭毛细胞损伤保护相关研究中的用途；

8)在体外内耳发育相关研究中的用途；

9)在体外听觉相关疾病发病机制相关研究中的用途；

10)在体外听觉突触重建相关研究中的用途。

在一具体实施方式中，本发明提供如上所述的特异性启动子Dnah5在前庭毛细胞特异性表达中的应用，将该启动子Dnah5装载到腺相关病毒载体中并在体感染小鼠耳蜗和前庭的毛细胞，结果表明启动子Dnah5能够特异性地启动mNeonGreen基因(一种荧光蛋白)在前庭毛细胞中表达。

在一具体实施方式中，本发明提供如上所述的特异性启动子Dnah5在构建转基因小鼠模型中的应用，将该启动子Dnah5装载到腺相关病毒载体，并同时将目的基因构建到腺相关病毒载体上，可以控制目的基因的转录和表达，构建得到转基因小鼠模型。

本发明所述的启动子Dnah5为在前庭毛细胞中特异性地起作用的启动子，由此可使可操作地连接在该启动子Dnah5的下游的基因在前庭毛细胞中特异性地表达。本发明所述的启动子Dnah5可通过基因工程方法来得到。例如，从人基因组取得人启动子Dnah5的基因，通过使部分碱基缺失、插入或置换而得到具有期望的碱基序列的启动子。另外，也可以通过部分合成或全合成得到具有期望的碱基序列的启动子。

与现有技术相比，本发明特异性启动子Dnah5具有以下优点及有益效果：

本发明提供了一种前庭毛细胞特异性启动子Dnah5，能够介导目的基因特异性地在小鼠耳蜗和前庭的毛细胞中表达，从而标记或操控毛细胞。

本发明所述特异性启动子Dnah5可以降低外源基因在其他组织例如脑组织中的表达，提高基因治疗的安全性。

本发明所述特异性启动子Dnah5介导目的基因表达比传统的转基因方法更灵活，应用更方便，成本更低。

本发明所述特异性启动子Dnah5能装载到需要的载体上，同时可表达治疗基因用于基因治疗，这是不能用转基因动物实现的。

本发明所述特异性启动子Dnah5在听神经科学、耳聋疾病模型建立和基因治疗等领域具有广泛的应用价值和市场前景。

附图说明

图1.pAAV-CMVen-STRC promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40表达载体的图谱。

图2.STRC启动子能够特异性地在耳蜗毛细胞中。该图为注射rAAV-CMVen-STRCpromoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40病毒的耳蜗铺片图。图2A中紫色所示为一种毛细胞的标记蛋白Myo7a，绿色为病毒感染的细胞，特异表达荧光蛋白在耳蜗毛细胞中。图2B中红色表示支持细胞的标记物Sox2，绿色为病毒感染的细胞，结果表明STRC promoter可以降低支持细胞中的表达。

图3.STRC启动子能够特异性地在前庭毛细胞中。该图为注射rAAV-CMVen-STRCpromoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40病毒的前庭椭圆囊铺片图，紫色所示为一种毛细胞的标记蛋白Myo7a，红色所示为支持细胞的标记蛋白Sox2，绿色为病毒感染的细胞，结果表明STRC promoter可以特异表达荧光蛋白在前庭毛细胞中，而在毛细胞以外的支持细胞中不表达。

图4为注射rAAV-CMVen-STRC mini promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40病毒的耳蜗铺片图。紫色所示为一种毛细胞的标记蛋白Myo7a，红色表示支持细胞的标记物Sox2，绿色为病毒感染的细胞，结果表明STRC mini promoter可以调控荧光蛋白特异表达在毛细胞中，降低支持细胞中的表达。

图5为rAAV-CMVen-STRC mini promoter-Tprn恢复小鼠听力图。(a)Tprn KO小鼠示意图。通过Crispr Cas9技术，切割外显子1-4区域，约7614nt碱基，通过P1，P2和P3，P4两对引物可以检测Tprn KO小鼠基因型。(b)Tprn KO小鼠鼠尾鉴定PCR胶图。WT：正常小鼠；KO：Tprn KO小鼠；-：ddH2O。(c)听力检测阈值图。黑色：正常小鼠；红色：Tprn KO小鼠；绿色：注射rAAV-CMVen-STRC mini promoter-Tprn-WPRE-SV40治疗小鼠。(d)11.3kHz处听力检测波形图。黑色：正常小鼠，阈值为15dB；红色：Tprn KO小鼠，阈值为75dB；绿色：注射rAAV-CMVen-STRC mini promoter-Tprn-WPRE-SV40治疗小鼠，阈值为35dB。(e)正常小鼠，TprnKO小鼠，注射rAAV-CMVen-STRC mini promoter-Tprn-WPRE-SV40治疗小鼠的共聚焦成像。结果表明rAAV-CMVen-STRC mini promoter-Tprn-WPRE-SV40可以在毛细胞中表达TPRN蛋白，并且恢复小鼠听力。

图6为rAAV-CAG-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40病毒注射的小鼠耳蜗(a)、前庭(b)和螺旋神经元(c)铺片图，d为不同种类耳蜗细胞的感染效率。图a，b中紫色所示为一种毛细胞的标记蛋白Myo7a,红色所示为支持细胞的标记蛋白Sox2，绿色为病毒感染的细胞，图c中紫色所示为一种螺旋神经元的标记蛋白Tuj1，绿色为病毒感染的细胞。

图7为实施例二中Slc26a5保守程度序列比对结果。

图8pAAV-Slc26a5 promoter-SHH mini promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40质粒图谱。

图9为注射rAAV-Slc26a5 promoter-SHH mini promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40病毒的耳蜗铺片图；表明Slc26a5启动子能够特异性地在耳蜗外毛细胞中。

图10为实施例三中pAAV-otof promoter-SHH mini promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40质粒图谱。

图11为实施例三中注射rAAV-otof promoter-SHH mini promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40病毒的耳蜗铺片图；表明otof启动子能够特异性地在耳蜗内毛细胞中。

图12pAAV-Sox10 promoter-SHH mini promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40粒图谱。

图13为注射rAAV-Sox10 promoter-SHH mini promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40病毒的耳蜗铺片图；表明Sox10启动子能够特异性地在耳蜗支持细胞中。图13A为支持细胞显色结果；图13B为毛细胞显色结果。

图14不同物种中Ngfr基因序列保守区域，其中红色圈出的为Ngfr 1启动子序列。

图15pAAV-Ngfr 1promoter-SHH mini promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40质粒图谱

图16为注射rAAV-Ngfr 1promoter-SHH mini promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40病毒的耳蜗切片图；表明Ngfr 1启动子能够特异性地表达在SGN中，但是不在II型螺旋神经节细胞中。

图17为注射rAAV-Ngfr 1promoter-SHH mini promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40病毒的耳蜗切片图；表明Ngfr 1启动子能够特异性地表达在I型螺旋神经节细胞中。

图18不同物种中Ngfr基因序列保守区域，其中红色圈出的为Ngfr 2启动子序列。

图19pAAV-Ngfr 2promoter-SHH mini promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40质粒图谱

图20为注射rAAV-Ngfr 2promoter-SHH mini promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40病毒的耳蜗切片图；表明Ngfr 2启动子能够特异性地表达在SGN中，并且在II型螺旋神经节细胞中。

图21为注射rAAV-Ngfr 2promoter-SHH mini promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40病毒的耳蜗切片图；表明Ngfr 2启动子不能够特异性地表达在I型螺旋神经节细胞中。

图22pAAV-CMVen-Dnah5 promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40质粒图谱

图23为注射rAAV-CMVen-Dnah5 promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40病毒的前庭铺片(a)和耳蜗(b)铺片图；表明Dnah5启动子能够特异性地在耳蜗外毛细胞中。

具体实施方式

本发明公开了耳蜗和/或前庭细胞特异性启动子及其应用，所述启动子能够调控基因在特定耳蜗和/或前庭细胞中的特异性表达。本发明将该启动子装载到腺相关病毒载体中并在体感染小鼠耳蜗和/或前庭，能够介导目的基因特异性地在耳蜗和/或前庭毛细胞中表达，从而标记或操控耳蜗和/或前庭细胞。该启动子在耳蜗和/或前庭细胞的结构与功能解析、听神经科学、耳聋疾病模型建立和基因治疗等方面具有广泛的应用价值和市场前景。

本发明中，对于载体的种类不作限制，可以是病毒载体，包括但不限于是腺相关病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体、单纯疱疹病毒扩增子载体、伪狂犬病毒载体、杆状病毒载体、痘病毒载体中的一种或几种。在一些优选实施方式中，所述载体为腺相关病毒载体。

本发明中，所述疾病为听觉相关疾病；优选地，其中所述感音神经性耳聋选自老年性耳聋、噪声性耳聋、耳毒性药品关联的耳聋、突发性耳聋、缺血性耳聋、自身免疫性耳聋、梅尼埃病、头部损伤关联的耳聋、遗传性耳聋、由其他原因或由不明原因造成的柯蒂氏器官的功能失调、或由病毒或细菌感染引起的对柯蒂氏器官的损害、或其组合。

本发明中，所述药物组合物还可以包括药学上可接受的载体。所述载体可以包括各种赋形剂和稀释剂，这些载体本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体对于本领域技术人员来说应该是熟知的。所述可接受的载体例如无菌水或生理盐水、稳定剂、赋形剂、抗氧化剂(抗坏血酸等)、缓冲剂(磷酸、枸橼酸、其它的有机酸等)、防腐剂、表面活性剂(PEG、Tween等)、螯合剂(EDTA等)、粘合剂等。而且，也可含有其它低分子量的多肽；血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等蛋白质；甘氨酸、谷酰胺、天冬酰胺、精氨酸和赖氨酸等氨基酸；多糖和单糖等糖类或碳水化物；甘露糖醇或山梨糖醇等糖醇。当制备用于注射的水溶液时，例如生理盐水、含有葡萄糖或其它的辅助药物的等渗溶液，如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化钠，可并用适当的增溶剂例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇，PEG等)、非离子表面活性剂(吐温80，HCO-50)等。

实施例一启动子STRC

1.全长启动子STRC的分离与鉴定

a.设计引物

根据NCBI中提供的小鼠C57BL/6J品种全基因组序列，依据小鼠STRC基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，在引物前面添加同源臂，用于重组合成质粒。引物序列如下：上游引物：ctattaccatggtgctcgagacaatatcagttcttgaggccaagtag(SEQ ID NO.3)；下游引物：gcccagtgtgcacctggaaatggtacctcgacggtaagtcc(SEQ IDNO.4)。其上游引物和下游引物均带有同源臂序列，分别用下划线表示。引物由金唯智生物公司(上海)股份有限公司合成。

b.启动子STRC克隆

以小鼠C57BL/6J品种的基因组DNA为模板，利用上、下游引物PCR扩增STRC启动子片段。PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测确认后，切胶回收目的片段，将目的片段送至铂尚(上海)股份有限公司进行测序验证，结果表明：所扩增序列为STRC启动子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。回收后的片段经过Nanodrop2000检测浓度。

SEQ ID NO.1

acaatatcagttcttgaggccaagtagctgctgttggcaaggattaactactgtcatgttttgaccagggtctgcaccaccctagggaacttcaagttccctatgaggctattgtcaagaccaatagccacttgactcaacttgtggaaatagtgttcacaaagtttccatattaggaacttaccaatcatcttgtaaaaacctacaccaaagtgtctgggcagagaacctaggctctggctatggttacaatagagggcatatgtatattttgatttttttttttttgagatggtttcactatgtaaccctggctagcccgaacttgttatatagacaaggctggactcagactcacagagatcatcctgcctctgcctcttaagtgctgggattaaaagcctgtgccaccattcccagcccaacacatttgtttgtttgcttgagaaagggtttctctgtgtagcccaggatgtcctgaaactcactctgtagactaggctggtctcaaactcagtgagccacctgcctttacctcctgagtgctgctgttaaaggcatgtgccaccaccatctagcttgattttttaattaattttttaaaaaacgtgtagtatacatgtaatggtgtgttcctttaatcccagcactcaggctgacagaggcaggcagagctctgtgagtttaaggccagcctaatctacatagagaattccaccgcagccagggctacctggggagaccctatctcaatgatacgatgatgatggatgacttgactgaatggatatctgtgcaccatgtgcatacctggttccctcagagaccagaagaggaggtcagatgccctgaactggaattagagatggttgtgagcagccatatgaatgctgggaatcaaacccaggtcctctgggtttggaagagcagcagtcactgttctaatctgctgagccatccctctagacctgctcataaggtttttttatgcaagaagagatgaccagtctctggacagaccagcttatattgaatgaaatctttctaacccatgaataggattccatgtgtagagagttttaacttgagaaagaaaaagaaactgcaatgtttacatggcctaatcaagtaacagctctctgagtctctctccttacctgttaattgaagggtttacctatgtggtttgtgaagtcctgtctactccttaatattgcaggattccaaggatttatttttatgtgtgtatgtgtgttgtatctgtgtaggcatgggcaggttaagtgcagacgcccacagaggcaagagacatcagattcccctggagctggagttacaggcagttctgaaccacccaattcaggtgcatgtaactcaactcaggtcatctgcaaaggcagcatacactctcagctgctgagccatctcttcagcaccaatactgtgggactctggatagtgtgtctaaggtaacaactctcctcttcctaaatagtctacccttgaaacatctatcttaatatcttctcgctgcccactgctggctgccagaccatttctcaaattcttcaaatctcagttgtctctcaaactccttttgtactttctttgtttgatcacatttttctgtagacccccagattatatttttagtctgccttcttctctctggctcttaactcatgccgtctccttgggtaatactctgagggccccgagatcccctgtcattggtccctctaacagaagtacacccttctcccaaagccagaggatcaggtgttcagtggctccggtgacaggtgtgatgtcaggttacagatactgtttcctgagagaccacacgacagtgtcagaggaaccccagcctgcccacaatgccccgtcttcacctggctatcccttcatggtgagcatagccagaactcacctctaggcccagtgtgcacctggaaatggtacctcgac

2.全长启动子STRC的功能验证

a.重组表达载体构建

首先，合成CMV enhancer序列，并在其序列前后加入与载体相连接的同源臂，同源臂用下划线标出，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5。

SEQ ID NO.5

gttcctgcggccgcacgcgtgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgctcgag

利用多片段同源重组方式，将启动子CMV enhancer片段，STRC片段连入用Kpn1和Mlu1双酶切开的pAAV-CAG-mNeonGreen-WPRE-SV40质粒，使用重组试剂盒(Vazyme，MultiSOne Step Cloning Kit)，通过同源重组的方式，进行连接。重组体系为：线性化pAAV-CAG-mNeonGreen-WPRE-SV40载体，50ng；克隆STRC启动子片段，30ng；合成CMV enhancer片段，30ng；重组连接酶Exnase MultiS，1μL；重组连接buffer 5x CE MultiS Buffer，4μL；ddH₂O，补齐20μL；50℃反应20分钟，产生重组产物。

连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，置于37℃培养箱过夜，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，对阳性菌落进行扩大培养和质粒提取，通过测序验证质粒，测序正确的质粒命名为pAAV-CMVen-STRC promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40。所构建的质粒表达载体的图谱如图1所示。

b.重组表达载体的病毒制备

采用传统的三质粒包装腺相关病毒方法，对重组表达载体进行病毒包装。将带有AAV-ie外壳的rep-cap质粒，pAAV-CMVen-STRC promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40和pHelper质粒3(同AAV-ie专利文献(CN 110437317A的SEQ ID NO.12)以合适的量共转于HEK-293T细胞中，并用碘克沙醇梯度离心法进行浓缩和纯化，最后用SYBR Green qPCR法检测重组腺相关病毒滴度，最终获得rAAV-CMVen-STRC promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40病毒的滴度为1×10¹³vg/mL。

c.全长STRC启动子的活体验证

将rAAV-CMVen-STRC promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40病毒通过圆窗注射到出生2-3天C57BL/6J小鼠的耳蜗中，病毒经10-14天充分表达后，脱颈椎处死小鼠，取出注射的耳蜗，放置4％多聚甲醛中，室温固定2小时。用PBS清洗三次，每次5分钟。再用0.5mM EDTA脱钙处理，室温浸泡2小时，使耳蜗软化。在体式显微镜下用眼科手术刀将基底膜解剖成顶、中、底三个部分，和前庭的椭圆囊组织。通过免疫荧光染色，利用anti-Myo7a抗体标记毛细胞，利用anti-Sox2抗体标记支持细胞，制成耳蜗样品。通过激光共聚焦扫描显微镜对其进行成像，病毒感染的细胞其细胞核中会表达绿色荧光蛋白。激发光波长分别为488nm，561nm，647nm。活体检测结果如图2，图3所示，绿色荧光与紫色所示的毛细胞标记物Myo7a基本完全共标，说明STRC启动子能够特异性地在耳蜗和前庭的椭圆囊毛细胞中表达。

3.缩短的STRC启动子序列的功能验证

缩短的STRC启动子序列也具有特异性,称为STRC mini promoter，序列如下(SEQID NO.2)：

gtgctcgagagcagccatatgaatgctgggaatcaaacccaggtcctctgggtttggaagagcagcagtcactgttctaatctgctgagccatccctctagacctgctcataaggtttttttatgcaagaagagatgaccagtctctggacagaccagcttatattgaatgaaatctttctaacccatgaataggattccatgtgtagagagttttaacttgagaaagaaaaagaaactgcaatgtttacatggcctaatcaagtaacagctctctgagtctctctccttacctgttaattgaagggtttacctatgtggtttgtgaagtcctgtctactccttaatattgcaggattccaaggatttatttttatgtgtgtatgtgtgttgtatctgtgtaggcatgggcaggttaagtgcagacgcccacagaggcaagagacatcagattcccctggagctggagttacaggcagttctgaaccacccaattcaggtgcatgtaactcaactcaggtcatctgcaaaggcagcatacactctcagctgctgagccatctcttcagcaccaatactgtgggactctggatagtgtgtctaaggtaacaactctcctcttcctaaatagtctacccttgaaacatctatcttaatatcttctcgctgcccactgctggctgccagaccatttctcaaattcttcaaatctcagttgtctctcaaactccttttgtactttctttgtttgatcacatttttctgtagacccccagattatatttttagtctgccttcttctctctggctcttaactcatgccgtctccttgggtaatactctgagggccccgagatcccctgtcattggtccctctaacagaagtacacccttctcccaaagccagaggatcaggtgttcagtggctccggtgacaggtgtgatgtcaggttacagatactgtttcctgagagaccacacgacagtgtcagaggaaccccagcctgcccacaatgccccgtcttcacctggctatcccttcatggtgagcatagccagaactcacctctaggcccagtgtgcacctggaaat。

a.含STRC mini promoter病毒构建

按照实施例一第2点a和b的构建方法，仅将STRC promoter替换为STRC minipromoter，获得rAAV-CMVen-STRC mini promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40病毒。

b.小鼠体内验证结果如下：

操作方法同实施例一第2点c。

5.利用STRC mini promoter包装鼠源tprn基因，检测对听力恢复的作用

利用STRC mini promoter包装鼠源tprn基因，构建pAAV-CMVen-STRC minipromoter-tprn-WPRE-SV40质粒。通过上述方法包装成rAAV-CMVen-STRC mini promoter-tprn-WPRE-SV40病毒，注射到P3 tprn^-/-小鼠中。在出生后30天，通过听力脑干反应，检测小鼠听力。结果表明，出生后30天的tprn^-/-小鼠听力损伤严重，而注射rAAV-CMVen-STRC minipromoter-Tprn-WPRE-SV40病毒小鼠的听力有明显恢复。

图5为rAAV-CMVen-STRC mini promoter-Tprn-WPRE-SV40恢复小鼠听力图。(a)Tprn KO小鼠示意图。通过Crispr Cas9技术，切割外显子1-4区域，约7614nt碱基，通过P1，P2和P3，P4两对引物可以检测Tprn KO小鼠基因型，本领域技术人员可以根据实际需要对引物进行设计。(b)Tprn KO小鼠鼠尾鉴定PCR胶图。WT：正常小鼠；KO：Tprn KO小鼠；-：ddH2O。(c)听力检测阈值图。黑色：正常小鼠；红色：Tprn KO小鼠；绿色：注射rAAV-CMVen-STRCmini promoter-Tprn-WPRE-SV40治疗小鼠。(d)11.3kHz处听力检测波形图。黑色：正常小鼠，阈值为15dB；红色：Tprn KO小鼠，阈值为75dB；绿色：注射rAAV-CMVen-STRC minipromoter-Tprn-WPRE-SV40治疗小鼠，阈值为35dB。(e)正常小鼠，Tprn KO小鼠，注射rAAV-CMVen-STRC mini promoter-Tprn-WPRE-SV40治疗小鼠的共聚焦成像。结果表明rAAV-CMVen-STRC mini promoter-Tprn-WPRE-SV40可以在毛细胞中表达TPRN蛋白，并且恢复小鼠听力。

P1:5′-GAGATTATGGCCCTTCAGAGTCAC-3′(SEQ ID NO.35)；

P2:5′-GAGTTGCAGAGCCCAGAGGTTAGG-3′(SEQ ID NO.36)；

P3:5′-GCTGCTTCCTTGATGCCTCCTACA-3′(SEQ ID NO.37)；

P4:5′-TGCTCAATGGCTGCTCCTCACTTC-3′(SEQ ID NO.38)。

6.启动子CAG调控基因的表达

广泛性的启动子CAG可以调控荧光蛋白表达在支持细胞，毛细胞和螺旋神经元以及前庭系统的支持细胞和毛细胞中。

a.含启动子CAG病毒构建

按照实施例一第2点a和b的构建方法，仅将CMV enhancer片段去掉，且STRCpromoter替换为CAG，获得rAAV-CAG-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40病毒。

b.小鼠体内验证结果如下：

操作方法同实施例一第2点c。

图6所示为rAAV-CAG-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40病毒注射的小鼠耳蜗(a)、前庭(b)和螺旋神经元(c)示意图。图a，b中紫色所示为一种毛细胞的标记蛋白Myo7a，红色所示为支持细胞的标记蛋白Sox2，绿色为病毒感染的细胞，图c中紫色所示为一种螺旋神经元的标记蛋白Tuj1，绿色为病毒感染的细胞。d为不同种类耳蜗细胞的感染效率。

实施例二启动子Slc26a5

1.启动子Slc26a5的分离与鉴定

a.启动子Slc26a5序列合成

根据http://www.genome.ucsc.edu/中提供的Mouse GRCm39/mm39基因组中，Slc26a5与大鼠、豚鼠、兔等不同物种的比对，在转录起始区域得到了一些保守程度较高的序列区域，如图7所示，通过合成，将两段序列结合在一起，并且在上下游加上同源臂，上游同源臂为：cacgcgttctcgattctaga(SEQ ID NO.8)，下游同源臂为：ctttctttctctctttcttt(SEQ ID NO.9)，用于构建载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6，同源臂部分用下划线标出。启动子Slc26a5序列由擎科生物公司(上海)股份有限公司合成。

SEQ ID NO.6

cacgcgttctcgattctagaccatagcaaggagaggaaatgaaagtcaaaccagtttgcaacagaaagaaacttaagggtaaagaattcctaggtaaggctgataccgtaagtgtactgctggacagcgctctggtctgttacgtaacaccgggagccccattctgtcgcacagaactgcctttttctctccttaactactctgaaactagacagaattacatggtcctcattaatttatgagtgataccaaaaggatcggctcaatccgggcttcagtgtatccaggcacaggactgtgctgtgcctcctctctactcccacaatgctttgctgcgttctcagcttcccatctcctttgatgggtgaaactctcgcctatctgtgttgatcagctgttctgaaaggccccaggagatgatagcatctcttctctgggtatccatgccagtgtttaatagcctcttgaaactgccgagaagtgctcagcaattgtgtggtggggaaggacggtgtcagcaaggaataaagatgatctctcgcctcgacggtagctgaaatgtgagtttctgtgtccaggctcagataaaaagtgatcctcacacctttctcaagtagccagagacgattgaatttctggaccagggcaggaaaacaagagcatgttgctaaccttgcttagtgctggggacctgatcttcttgccattacattgtcatttctatcattctcattcttgaaaaattatcctttgatttagagataacttatgacaatgtgactctttatcttcctttctttctctctttcttt

b.扩增启动子Slc26a5

以合成产物DNA为模板，利用上、下游引物PCR扩增启动子Slc26a5。PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测确认后，切胶回收目的片段，将目的片段送至铂尚(上海)股份有限公司进行测序验证，结果表明：所扩增序列为Slc26a5启动子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。回收后的片段Nanodrop2000检测浓度。

2.启动子Slc26a5的功能验证

a.重组表达载体构建

首先，合成SHH mini promoter序列，并在其序列下游加入与载体相连接的同源臂，下游同源臂为：gctagcgaattcgccaccat(SEQ ID NO.10)。其核苷酸序列如SEQ ID NO.7。

SEQ ID NO.7

ctttctttctctctttctttcttttttaaactggaagccttcaggtgaaaataaagccacagcagccagaggggggagaaatgtagtctttctcagggttaacatcagaagacaagcttgtgcggcttggccaatcagatgcgcccctgccagctataatatagtgcgaaaggcagcctgtctcacaagctctccagccttgctaccatttaaaatcaggctctttttgtcttttaattgctgtctcgagacccaactccgatgtgttccgttaccagcgaccggcagcctgccatcgcagccccagtctgggtggggatcggagacaagtcccctgcagcagcggcaggcaaggttatataggaagagaaagagccaggcagcgccagagggaacgaacgagccgagcgaggaagggagagccgagcgcaaggaggagcgcacacgcacacacccgcgcgtacccgctcgcgcacagacagcgcggggacagctcacaagtcctcaggttccgcggacgaggc tagcgaattcgccaccat

利用多片段同源重组方式，将SHH mini promoter片段，Slc26a5片段连入用XbaI和NheI双酶切开的pAAV-CAG-mNeonGreen-WPRE-SV40质粒，使用重组试剂盒(Vazyme，MultiS One Step Cloning Kit)，通过同源重组的方式，进行连接。重组体系为：线性化pAAV-CAG-mNeonGreen-WPRE-SV40载体，50ng；克隆Slc26a5启动子片段，30ng；合成SHHmini promoter片段，30ng；重组连接酶Exnase MultiS，1μL；重组连接buffer 5x CEMultiS Buffer，4μL；ddH₂O，补齐20μL；50℃反应20分钟，产生重组产物。

连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，置于37℃培养箱过夜，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，对阳性菌落进行扩大培养和质粒提取，通过测序验证质粒，测序正确的质粒命名为pAAV-Slc26a5 promoter-SHH mini promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40。所构建的质粒重组表达载体的图谱如图8所示。

b.重组表达载体的病毒制备

采用实施例一第2点b中所记载的传统的三质粒包装腺相关病毒方法，仅质粒重组表达载体不同，对重组表达载体进行病毒包装，并用碘克沙醇梯度离心法进行浓缩和纯化，最后用SYBR Green qPCR法检测重组腺相关病毒滴度，最终获得rAAV-Slc26a5 promoter-SHH mini promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40病毒的滴度为1×10¹³vg/mL。

3.Slc26a5启动子的活体验证

将rAAV-Slc26a5 promoter-SHH mini promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40病毒通过圆窗注射到出生2-3天C57BL/6J小鼠的耳蜗中，病毒经10-14天充分表达后，脱颈椎处死小鼠，取出注射的耳蜗，放置4％多聚甲醛中，室温固定2小时。用PBS清洗三次，每次5分钟。再用0.5mM EDTA脱钙处理，室温浸泡2小时，使耳蜗软化。在体式显微镜下用眼科手术刀将基底膜解剖成顶、中、底三个部分，和前庭的椭圆囊组织。通过免疫荧光染色，利用anti-Myo7a抗体标记毛细胞，利用anti-Sox2抗体标记支持细胞，制成耳蜗样品。通过激光共聚焦扫描显微镜对其进行成像，病毒感染的细胞其细胞核中会表达绿色荧光蛋白。激发光波长分别为488nm，561nm，647nm。活体检测结果如图9所示，该图为注射rAAV-Slc26a5promoter-SHH mini promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40病毒的耳蜗铺片图；紫色所示为一种毛细胞的标记蛋白Myo7a，分为上面三排外毛细胞和下面一排内毛细胞，绿色为病毒感染的细胞，说明Slc26a5启动子特异表达荧光蛋白在耳蜗外毛细胞中。

实施例三启动子otof

1.启动子otof的分离与鉴定

a.启动子otof引物设计

根据NCBI中提供的小鼠C57BL/6J品种全基因组序列，依据小鼠otof基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，在引物前面添加同源臂，用于重组合成质粒。引物序列如下：上游引物：cacgcgttctcgattctagagtactacagcccacagaagag(SEQ IDNO.13)，下游引物：cttcccgctgctctggaactgccctttctttctctctttcttt(SEQ ID NO.14)。其上游引物和下游引物均带有同源臂序列，分别用下划线表示。引物由金唯智生物公司(上海)股份有限公司合成。

b.扩增启动子otof

以小鼠C57BL/6J品种的基因组DNA为模板，利用上、下游引物PCR扩增otof启动子片段，PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测确认后，切胶回收目的片段，将目的片段送至铂尚(上海)股份有限公司进行测序验证，结果表明：所扩增序列为otof启动子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，同源臂用下划线表示。回收后的片段经过Nanodrop2000检测浓度。

SEQ ID NO.11

cacgcgttctcgattctagagtactacagcccacagaagagcagtttatccttgtctaccatgtgtgtcccagggatcaaactccagtcgccaggctgagccgtaggagcccttacctgctgagccatcccaccagcccaaagcctgaagactctcttagacaggcccctgagcttccaagccctgtcagtattagttggacatcttgccatgtcttgaacactagatgccctgtgaagatctcgagtgaaaagcatcagtgggggagatccatgtagcaaccccaggccagtgatacctggatcaggagccactgaaagggggtcccaaagtccacctgagtgagggtgcagagtcacccctggggataagccgctgagaccaggaggcagggacaagatgggggacccctaccaagagtgagccgcaaaagcaacggcttagaatccagcccccagcactcctttccctacaagcccttcccgaaagagcagacttctgctgttccttggatatccctctacagatatccctctgctacctctagccactgactagagcagggagcaagatggttgtcctctcactgaaaactactcatcaatagtgtcgcctcctccagttctttgtctccagcctgggatgggtaggttggtgccctgactcttacaagtttcctacctagcacagtagcccctgtgacctctcattagggcttccctagtcacagtctctcatttcaggaccagctgcctgaaattcaaaactatgacccaagaacagagcattagagcctagcatcccaagggcacaaacagtgcaggaccaggcatcaatgcattgtcacttctgatgctcctatataataggggccagtccttggggacctccttcaaactgccttatagaagctgctgctctccagactgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtatgtgtgtgtgtgtgtagtgtgtagatatacagatgtgtttatgtttatgtgtggaagcctagggtcaacttcagttgtcttccttatttatttatctgacttgtttatttaaagacgggtctctttagcaaacctggagcttctccattcagatagctccgctgccattaaactccaggggttctcctgtctccacctttctgccaccgcagagctgggttagaagcccttgcccctgcaccggtctttaccatagactctggaatctaaactcagatcttcatgctcctgtggcagacactttacctactgaggcatctcctttgccctcggctgaggcacagcatgatttatccagagcagtcaggtctgtcccgtccatgatctccaagccttctgagcatccacaaccctggtgattagctagacacatcaagagacatcgtggatactgcccaagagaccagtgccccattcaagctcagacagtgaagttccagatccccatgagaagtggcctgacccctcatctgcccatctgcatgccctctgcaatctgttggctctgagtggcacagcttgctctgccctgccaagtggcaggagcttccattccaggagctggcaggagacacctgaagccggacagggctttatctcggagctggtgctgctgaataatggattcagcatgcgttcctgggctcctgcacacactcactcacacacacacacacacacacacacacacacacacacacacgcgcgctacacacatgctgggctgacaacccagaggggcggggctgccggggctgcacagctctgatgagctgaaggagcagcttgctttggttgccttggtctctgtgggcagcagcaggaggaggcggcagcagccagagaagagggaggcgtgtgagccacactccaccagcgagcttcttcccgctgctctggaactgccctttctttctctctttcttt

2.启动子otof的功能验证

a.重组表达载体构建

首先，合成SHH mini promoter序列，并在其序列下游加入与载体相连接的同源臂，下游同源臂为：gctagcgaattcgccaccat(SEQ ID NO.15)，用下划线表示。其核苷酸序列如(SEQ ID NO.12)。

SEQ ID NO.12

利用多片段同源重组方式，将SHH mini promoter片段，otof片段连入用XbaI和NheI双酶切开的pAAV-CAG-mNeonGreen-WPRE-SV40质粒，使用重组试剂盒(Vazyme，MultiSOne Step Cloning Kit)，通过同源重组的方式，进行连接。重组体系为：线性化pAAV-CAG-mNeonGreen-WPRE-SV40载体，50ng；克隆otof启动子片段，30ng；合成SHH mini promoter片段，30ng；重组连接酶Exnase MultiS，1μL；重组连接buffer 5xCE MultiS Buffer，4μL；ddH₂O，补齐20μL；50℃反应20分钟，产生重组产物。

连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，置于37℃培养箱过夜，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，对阳性菌落进行扩大培养和质粒提取，通过测序验证质粒，测序正确的质粒命名为pAAV-otof promoter-SHH mini promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40。所构建的表达载体的图谱如图10所示。

b.重组表达载体的病毒制备

采用实施例一第2点b中所记载的传统的三质粒包装腺相关病毒方法，仅质粒重组表达载体不同，对重组表达载体进行病毒包装，并用碘克沙醇梯度离心法进行浓缩和纯化，最后用SYBR Green qPCR法检测重组腺相关病毒滴度，最终获得rAAV-otof promoter-SHHmini promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40病毒的滴度为1×10¹³vg/mL。

3.otof启动子的活体验证

将rAAV-otof promoter-SHH mini promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40病毒通过圆窗注射到出生2-3天C57BL/6J小鼠的耳蜗中，病毒经10-14天充分表达后，脱颈椎处死小鼠，取出注射的耳蜗，放置4％多聚甲醛中，室温固定2小时。用PBS清洗三次，每次5分钟。再用0.5mM EDTA脱钙处理，室温浸泡2小时，使耳蜗软化。在体式显微镜下用眼科手术刀将基底膜解剖成顶、中、底三个部分。通过免疫荧光染色，利用anti-Myo7a抗体标记毛细胞，利用anti-Sox2抗体标记支持细胞，制成耳蜗样品。通过激光共聚焦扫描显微镜对其进行成像，病毒感染的细胞其细胞核中会表达绿色荧光蛋白。激发光波长分别为488nm，561nm，647nm。活体检测结果如图11所示。该图为注射rAAV-otof promoter-SHH mini promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40病毒的耳蜗铺片图；紫色所示为一种毛细胞的标记蛋白Myo7a，分为上面三排外毛细胞和下面一排内毛细胞，绿色为病毒感染的细胞，说明otof启动子特异表达荧光蛋白在耳蜗内毛细胞中。

实施例四启动子Sox10

1.启动子Sox10的分离与鉴定

a.启动子Sox10序列合成

启动子Sox10序列来源于Identification of neural crest and glialenhancers at the mouse Sox10 locus through transgenesis in zebrafish.G中MCS7，在序列上下游分别设计同源臂，用于构建载体，上游同源臂为：cacgcgttctcgattctaga(SEQID NO.18)；下游同源臂为：ctttctttctctctttcttt(SEQ ID NO.19)。其核苷酸序列如SEQID NO.16，同源臂部分用下划线标出。序列由擎科生物公司(上海)股份有限公司合成。

SEQ ID NO.16

cacgcgttctcgattctagagtggcctcaggcccctgtgcccgcgcccatggggttaaatctctccctgtctctctctgctccaagttgttttccaagcgaggcagagaatggttctcttgttaccaacatggcttctgggcattgggtaatgcgttccctcttctccctgccctgcgccacaaagggaccttttgttcctctcccggcccctctctctggctcttctctgccccccacccaccccaagtccctcctccccacgcctcctgccctactctgcgcgcacccctgggctgtgaggagtgaccgtggcctggctttctttctctctttcttt

b.扩增启动子Sox10

以合成产物DNA为模板，利用上、下游引物PCR扩增启动子Sox10。PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测确认后，切胶回收目的片段，将目的片段送至铂尚(上海)股份有限公司进行测序验证，结果表明：所扩增序列为Sox10启动子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。回收后的片段经Nanodrop2000检测浓度。

2.启动子Sox10的功能验证

a.重组表达载体构建

首先，合成SHH mini promoter序列，并在其序列下游加入与载体相连接的同源臂，下游同源臂为：gctagcgaattcgccaccat(SEQ ID NO.20)。序列由擎科生物公司(上海)股份有限公司合成。其核苷酸序列如SEQ ID NO.17,同源臂部分用下划线标出。

SEQ ID NO.17

利用多片段同源重组方式，将SHH mini promoter片段，Sox10片段连入用XbaI和NheI双酶切开的pAAV-CAG-mNeonGreen-WPRE-SV40质粒，使用重组试剂盒(Vazyme，MultiSOne Step Cloning Kit)，通过同源重组的方式，进行连接。重组体系为：线性化pAAV-CAG-mNeonGreen-WPRE-SV40载体，50ng；克隆Sox10启动子片段，30ng；合成SHH mini promoter片段，30ng；重组连接酶Exnase MultiS，1μL；重组连接buffer 5x CE MultiS Buffer，4μL；ddH₂O，补齐20μL；50℃反应20分钟，产生重组产物。

连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，置于37℃培养箱过夜，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，对阳性菌落进行扩大培养和质粒提取，通过测序验证质粒，测序正确的质粒命名为pAAV-Sox10 promoter-SHH mini promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40。所构建的质粒重组表达载体的图谱如图12所示。

b.重组表达载体的病毒制备

采用实施例一第2点b中所记载的传统的三质粒包装腺相关病毒方法，仅质粒重组表达载体不同，对重组表达载体进行病毒包装，并用碘克沙醇梯度离心法进行浓缩和纯化，最后用SYBR Green qPCR法检测重组腺相关病毒滴度，最终获得rAAV-Sox10promoter-SHHmini promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40病毒的滴度为1×10¹³vg/mL。

3.Sox10启动子的活体验证

将rAAV-Sox10 promoter-SHH mini promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40病毒通过圆窗注射到出生2-3天C57BL/6J小鼠的耳蜗中，病毒经10-14天充分表达后，脱颈椎处死小鼠，取出注射的耳蜗，放置4％多聚甲醛中，室温固定2小时。用PBS清洗三次，每次5分钟。再用0.5mM EDTA脱钙处理，室温浸泡2小时，使耳蜗软化。在体式显微镜下用眼科手术刀将基底膜解剖成顶、中、底三个部分。通过免疫荧光染色，利用anti-Myo7a抗体标记毛细胞，利用anti-Sox2抗体标记支持细胞，制成耳蜗样品。通过激光共聚焦扫描显微镜对其进行成像，病毒感染的细胞其细胞核中会表达绿色荧光蛋白。激发光波长分别为488nm，561nm，647nm。活体检测结果如图13所示。该图为注射rAAV-Sox10 promoter-SHH mini promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40病毒的耳蜗铺片图，红色所示为一种支持细胞的标记蛋白Sox2，紫色所示为一种毛细胞的标记蛋白Myo7a，绿色为病毒感染的细胞，Sox10启动子特异表达荧光蛋白在耳蜗支持细胞中。

实施例五启动子Ngfr 1

1.启动子Ngfr 1的分离与鉴定

a.启动子Ngfr 1序列合成

根据http://www.genome.ucsc.edu/中提供的Mouse GRCm39/mm39基因组中，Ngfr与大鼠、豚鼠、兔等不同物种的比对，在转录起始区域得到了一些保守程度较高的序列区域，如图14所示，通过合成，将三段序列结合在一起，并且在两端加上同源臂，上游同源臂为：cacgcgttctcgattctaga(SEQ ID NO.23)；下游同源臂为：ctttctttctctctttcttt(SEQID NO.24)，用于构建载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.21，同源臂部分用下划线标出。启动子Ngfr 1序列由擎科生物公司(上海)股份有限公司合成。

SEQ ID NO.21

cacgcgttctcgattctagagatccgaagcatcttatgctcagcataaccggaggtgccctgggtacgtggggcagcccactgagaagccacagcggggcacacgggtgcggctcctctcacgcctcacttgactgctctggactccccaccctaggcagccgggcgggcgcggttccggaggggttgggggggggggggagttgggcgggctgggcggggaggaggcggggctgctgcattgccttcacccagctgctcccgcccgctagcagccagagcgagtggagcctccgccagctccggcgggcagcgggcgctggagcgcagcgcagcgcagctcagctcagcgcgcagcaccatcggtccgcagagcggactgagctagaagctgagcgctgtcgcagactgggagcagtctcgagtggggtggagggaggtttgggaatctcgggcgcctgggttcttttgacgacagcgtgtgaattttgggatcccgaggggagttttctctttagcatcttagtccctggggagttgtagggcagagagaaggaagggaaagagatcggcactaaagatgtgaggggctagagacggaacaatgcgggaggcagctggagggactggaggcagaggggacccagtatggacaatggggaccggccagacaatgggggggaggggcatcgaaaggagcgattcgggatagagccggttctgtgttccgccgcggaccgagcctcttcctgcgccgctgcgagagttctgaaaccagagcgcaaccagagtctgctggccggccgcgccggtaatggaggcactttgtcattcagacgtctgtaaccggagccgcccggctggctaatgctcctaatagggatgcagcagcgtaggcaacaaatgggcagcatgagcgtcctttctttctctctttcttt

b.扩增启动子Ngfr 1

以合成产物DNA为模板，利用上、下游引物PCR扩增启动子Ngfr 1，PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测确认后，切胶回收目的片段，将目的片段送至铂尚(上海)股份有限公司进行测序验证，结果表明：所扩增序列为Ngfr 1启动子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。回收后的片段经Nanodrop2000检测浓度。

2.启动子Ngfr 1的功能验证

a.重组表达载体构建

首先，合成SHH mini promoter序列，并在其序列下游加入与载体相连接的同源臂，下游同源臂为：gctagcgaattcgccaccat(SEQ ID NO.25)。其核苷酸序列如SEQ IDNO.22，同源臂部分用下划线标出。

SEQ ID NO.22

利用多片段同源重组方式，将SHH mini promoter片段，Ngfr 1片段连入用XbaI和NheI双酶切开的pAAV-CAG-mNeonGreen-WPRE-SV40质粒，使用重组试剂盒(Vazyme，MultiSOne Step Cloning Kit)，通过同源重组的方式，进行连接。重组体系为：线性化pAAV-CAG-mNeonGreen-WPRE-SV40载体，50ng；克隆Ngfr 1启动子片段，30ng；合成SHH mini promoter片段，30ng；重组连接酶Exnase MultiS，1μL；重组连接buffer 5x CE MultiS Buffer，4μL；ddH₂O，补齐20μL；50℃反应20分钟，产生重组产物。

连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，置于37℃培养箱过夜，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，对阳性菌落进行扩大培养和质粒提取，通过测序验证质粒，测序正确的质粒命名为pAAV-Ngfr 1promoter-SHH mini promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40。所构建的质粒重组表达载体的图谱如图15所示。

b.重组表达载体的病毒制备

采用实施例一第2点b中所记载的传统的三质粒包装腺相关病毒方法，仅质粒重组表达载体不同，对重组表达载体进行病毒包装，并用碘克沙醇梯度离心法进行浓缩和纯化，最后用SYBR Green qPCR法检测重组腺相关病毒滴度，最终获得rAAV-Ngfr 1promoter-SHHmini promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40病毒的滴度为1×10¹³vg/mL。

3.Ngfr 1启动子的活体验证

将rAAV-Ngfr 1promoter-SHH mini promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40病毒通过圆窗注射到出生2-3天C57BL/6J小鼠的耳蜗中，病毒经10-14天充分表达后，脱颈椎处死小鼠，取出注射的耳蜗，放置4％多聚甲醛中，室温固定2小时。用PBS清洗三次，每次5分钟。再用0.5mM EDTA脱钙处理，室温浸泡2小时，使耳蜗软化。再通过梯度蔗糖脱水过夜后，利用冰冻切片机切成0.2mm的样本。通过免疫荧光染色，利用anti-Tuj1抗体标记螺旋神经节细胞，anti-Calb2抗体I型螺旋神经节细胞，anti-TH抗体II型螺旋神经节细胞，制成耳蜗样品。通过激光共聚焦扫描显微镜对其进行成像，病毒感染的细胞其细胞核中会表达绿色荧光蛋白。激发光波长分别为488nm，561nm，647nm。活体检测结果如图16、17所示。

图16Ngfr 1启动子能够特异性地表达在SGN中，但是不在II型螺旋神经节细胞中。该图为注射rAAV-Ngfr 1promoter-SHH mini promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40病毒的耳蜗切片图。紫色所示为一种螺旋神经节细胞的标记蛋白Tuj1，红色所示为一种II型螺旋神经节细胞的标记蛋白TH，绿色为病毒感染的细胞，Ngfr 1启动子在非II型螺旋神经节细胞中特异表达荧光蛋白。

图17Ngfr 1启动子能够特异性地表达在I型螺旋神经节细胞中。该图为注射rAAV-Ngfr 1promoter-SHH mini promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40病毒的耳蜗切片图。红色所示为一种I型螺旋神经节细胞的标记蛋白Calb2，绿色为病毒感染的细胞，Ngfr 1启动子在I型螺旋神经节细胞中特异表达荧光蛋白。

实施例六启动子Ngfr 2

1.启动子Ngfr 2的分离与鉴定

a.启动子Ngfr 2序列合成

根据http://www.genome.ucsc.edu/中提供的Mouse GRCm39/mm39基因组中，Ngfr与大鼠、豚鼠、兔等不同物种的比对，在转录起始区域得到了一些保守程度较高的序列区域，如图18所示，通过合成，并且在两端加上同源臂，上游同源臂为：cacgcgttctcgattctaga(SEQ ID NO.28)；下游同源臂为：ctttctttctctctttcttt(SEQ ID NO.29)，用于构建载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.26。序列由擎科生物公司(上海)股份有限公司合成。

SEQ ID NO.26

cacgcgttctcgattctagagccgagctctatgtgatgaaaggaaatcagaacagacccttctgaaatctcagctcctgggagaagcctgcctcaagtacctcagggctcctggtctgcagatgttgccattgccagccagcactcccactgccagcacctgggaggagatggtggcagcttccggtgctgcctggactctctctgctgcccttatggagaccactctgcccctagggcatcacccagtgttttctcctgcctctgtttacttttctgtcaaactctggtgaaaccacagtggtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtggtgtgtcttggcaaagatcggtccagcatggaagcaggagaggaatgcccaaacaatcttgtaaagctctctggtctcacgaccaaagcccaaattgctcagcatcaaatggggtgggtggggggtgtgtgcgcaaggtctggagcctgcagagaaggctttggagttttattagacattaagattgttctttaaggaacagaaacaaagtgagcctccaacagcccctccctcgggggaatctggtgctaagtcgttccatccatgagcaaagatgctttagtggcaggaatctgactccccccccccccatccagctctgttcccaggggccacatgggaggagaggggaggggatggagtcaggctaggacggggaagtcaactctggaagaatagagttgctggctggtgaaagccggccactgataacaggcgtccctttctctgtcttggctccagacttgcccatcagtctttgccctggcaccaagctgtccctgtgtttatctgcagaggggtgaaaactcccaaaggaaacccagggcaggccagacacctccagtacagagtcaatatttgaacccaagtcctcactgccttctgttcttggacatagacaactccgttttgatatttaatatgtggaatgagacctggagaagggccctgttctcctttttaggaaagggccctgcctctgggtaactgcagccctgcaggtgtgaagtttagcaaatggagtttgggccaaatttcagttccactggcccccttggctaggagccctgtgcaagctgcaacctgcccagccattctggatatcggtctcaccctcctcctgtggtgtatcctcaggactccaggagaggctgtaaccctaaggtgaactctgcagaaggttagccactgaggctatgacctcacaccccagcagcagtcaagggccccactccccccacgccccccactgccccccagccttccttcctgccagctttgatcctcctaatgcctcccgggtgagctcatcccagcccaggtggttctaatagaaagtattaagagggaggcgtttgatcccttggaagacaccacctttgctcctgccaggctgaccttgtgatctccttccacctaggctttctttctctctttcttt

b.扩增启动子Ngfr 2

以合成产物DNA为模板，利用上、下游引物PCR扩增启动子Ngfr 2。PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测确认后，切胶回收目的片段，将目的片段送至铂尚(上海)股份有限公司进行测序验证，结果表明：所扩增序列为Ngfr 2启动子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示。回收后的片段经Nanodrop2000检测浓度。

2.启动子Ngfr 2的功能验证

a.重组表达载体构建

首先，合成SHH mini promoter序列，并在其序列下游加入与载体相连接的同源臂，下游同源臂为：gctagcgaattcgccaccat(SEQ ID NO.30)。其核苷酸序列如SEQ IDNO.27，同源臂用下划线表示。

SEQ ID NO.27

利用多片段同源重组方式，将SHH mini promoter片段，Ngfr 2片段连入用XbaI和NheI双酶切开的pAAV-CAG-mNeonGreen-WPRE-SV40质粒，使用重组试剂盒(Vazyme，MultiSOne Step Cloning Kit)，通过同源重组的方式，进行连接。重组体系为：线性化pAAV-CAG-mNeonGreen-WPRE-SV40载体，50ng；克隆Ngfr 2启动子片段，30ng；合成SHH mini promoter片段，30ng；重组连接酶Exnase MultiS，1μL；重组连接buffer 5x CE MultiS Buffer，4μL；ddH₂O，补齐20μL；50℃反应20分钟，产生重组产物。

连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，置于37℃培养箱过夜，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，对阳性菌落进行扩大培养和质粒提取，通过测序验证质粒，测序正确的质粒命名为pAAV-Ngfr 2promoter-SHH mini promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40。所构建的质粒重组表达载体的图谱如图19所示。

b.重组表达载体的病毒制备

采用实施例一第2点b中所记载的传统的三质粒包装腺相关病毒方法，仅质粒重组表达载体不同，对重组表达载体进行病毒包装，并用碘克沙醇梯度离心法进行浓缩和纯化，最后用SYBR Green qPCR法检测重组腺相关病毒滴度，最终获得rAAV-Ngfr 2promoter-SHHmini promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40病毒的滴度为1×10¹³vg/mL。

3.Ngfr 2启动子的活体验证

将rAAV-Ngfr 2promoter-SHH mini promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40病毒通过圆窗注射到出生2-3天C57BL/6J小鼠的耳蜗中，病毒经10-14天充分表达后，脱颈椎处死小鼠，取出注射的耳蜗，放置4％多聚甲醛中，室温固定2小时。用PBS清洗三次，每次5分钟。再用0.5mM EDTA脱钙处理，室温浸泡2小时，使耳蜗软化。再通过梯度蔗糖脱水过夜后，利用冰冻切片机切成0.2mm的样本。通过免疫荧光染色，利用anti-Tuj1抗体标记螺旋神经节细胞，anti-Calb2抗体I型螺旋神经节细胞，anti-TH抗体II型螺旋神经节细胞，制成耳蜗样品。通过激光共聚焦扫描显微镜对其进行成像，病毒感染的细胞其细胞核中会表达绿色荧光蛋白。激发光波长分别为488nm，561nm，647nm。活体检测结果如图20、21所示。

图20Ngfr 2启动子能够特异性地表达在SGN中，并且在II型螺旋神经节细胞中。该图为注射rAAV-Ngfr 2promoter-SHH mini promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40病毒的耳蜗切片图。紫色所示为一种螺旋神经节细胞的标记蛋白Tuj1，红色所示为一种II型螺旋神经节细胞的标记蛋白TH，绿色为病毒感染的细胞，Ngfr 1启动子在II型螺旋神经节细胞中特异表达荧光蛋白。

图21Ngfr 2启动子不能够特异性地表达在I型螺旋神经节细胞中。该图为注射rAAV-Ngfr 2promoter-SHH mini promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40病毒的耳蜗切片图。红色所示为一种I型螺旋神经节细胞的标记蛋白Calb2，绿色为病毒感染的细胞，Ngfr 1启动子不在I型螺旋神经节细胞中特异表达荧光蛋白。

实施例七启动子Dnah5

1.启动子Dnah5的分离与鉴定

a.启动子Dnah5引物设计

根据NCBI中提供的小鼠C57BL/6J品种全基因组序列，在小鼠Dnah5基因转录起始位点上游设计引物，并且在两端加上同源臂，上游引物为：ctattaccatggtgctcgaggtcacatgttgacaatgttctcgg(SEQ ID NO.33)；下游引物为：gccatcccagattgctgggggtacctcgacggt aagtcc(SEQ ID NO.34)，用于构建载体，其中下划线表示同源臂。

b.扩增启动子Dnah5

以C57BL/6J小鼠DNA为模板，利用上、下游引物PCR扩增启动子Dnah5，PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测确认后，切胶回收目的片段，将目的片段送至铂尚(上海)股份有限公司进行测序验证，结果表明：所扩增序列为Dnah5启动子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示。回收后的片段经Nanodrop2000检测浓度。

SEQ ID NO.31

gtcacatgttgacaatgttctcgggactaatctgaactgcttagcagggacgatcagactatcttgtcttattctgtgtctctcctgtgacctgtggccaccgttcacaattataacaacaaacagctgcttaccaatacacagaggttgattgaaaattatctttatatctcacgtatagtgtgcgcttcatttgcctgaggctctatgttaagtctgccgtgaccccggatgtattcacacaccatgttggctcagaagatgacactcccaaatgtacagctgtgaagtttagagtgagaacccgtgaagagccgcacattcagggagagttttctttctccttatctatcttcaagtccacatagtccaggagacattatttgctgcaagtgctttcctcagccatcccagcaggaagaggaaacacatgcaaatggcaggcaggagtgatggctaccacaggggcattaccccaaggcattgtctgttctttgagtcaattcatctccgtgaaaaataatctactcttccgataaaattgctcaatacttttttttctctcctcaaagaagaacagatgtaagcttctaaatcttactgaactgctgggcacctgggtgattcccgtgtgtgcaatactctgcatggcttctcccttgtcaatctgtctactgcctttgtcagattcaaacactgaacttccaagggaaaatagagagttcttctgtgcctatacttctgactttaaatatgcttttgttatttgcttgccatcagtattcaacaccaaatatctgtatccatattaacactacaaatggaggccacaccctaactggctgatggctaggtgaattgattgtcctgatatcaaggtagtgccctggttgtcaattctgtttctgatgaggttgaatagcaggggactcctcaatttcctgatgatctttgaataatccgaaaaggatttatttactagattttattttacgttttaatttttttgagatagagtttctctatgtagctgtagccatctggaactcctctgtaaaccaggctagcctggaactcacagatatcggcctctatctcctgagtgctgggattaaaggtgagcaccactgctgcctagctaactgctggatttttaatcccaaggatccaatgaaatggaccttaaattctgccatttgtgtgctttgatgggagggttgtaggtgagaggtctctccccatccgtcggtgcggagaggaagatctagatgtttaggcttatggaatgcaatgctttgctttccatgcttgggcggccgtgtgaacaggagtaatttatggacaccatttgccatttgcatatgaaataggctgcttgttctttatgggagaggaaatggctcctttgggtcacaattagcctatcaagcaattagtcacaattagtcaccatgctggcagttaattgtgcacacaaagttgtttagacaaagtaagactgaatttcctaactcgagtaatatatccagagctgtgacttgtctgccttctgctttgatcaggtttaaggtttcttattgttcagagaaataatttaagctcctttattgactcaaagcttattgttgggcagtgtatggaatggaacattagaacttgtggttgcaaccaagcagttaaattgctttctcttgttgctaaacatgattaagaggcgtgcttaaacggcacagcatggaaacagtattaccctaacaacgaaggaccacagaatcgaggaaaggccccagggcagagactcagggaaggatatatgagcatcgcagatggactgacttctcgcctcagttctgtgaatatcgagagtcacccacatgcatgagaagcaacagcgcgatgctgtgaccctcttagagtctttgcctgtgatattccactggaggatgaacagctctcttggtagttagaagaccattctggaggagctgacttggggccatcccagattgctggg

2.启动子Dnah5的功能验证

a.重组表达载体构建

首先，合成CMV enhancer序列，并在其序列上游加入与载体相连接的同源臂，同源臂用下划线标出，其核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示。

SEQ ID NO.32

利用多片段同源重组方式，将启动子CMV enhancer片段，Dnah5片段连入用Kpn1和Mlu1双酶切开的pAAV-CAG-mNeonGreen-WPRE-SV40质粒，使用重组试剂盒(Vazyme，MultiSOne Step Cloning Kit)，通过同源重组的方式，进行连接。重组体系为：线性化pAAV-CAG-mNeonGreen-WPRE-SV40载体，50ng；克隆Dnah5启动子片段，30ng；合成CMV enhancer片段，30ng；重组连接酶Exnase MultiS，1μL；重组连接buffer 5x CE MultiS Buffer，4μL；ddH₂O，补齐20μL；50℃反应20分钟，产生重组产物。

连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，置于37℃培养箱过夜，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，对阳性菌落进行扩大培养和质粒提取，通过测序验证质粒，测序正确的质粒命名为pAAV-CMVen-Dnah5 promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40。所构建的表达载体的图谱如图22所示。

b.重组表达载体的病毒制备

采用实施例一第2点b中所记载的传统的三质粒包装腺相关病毒方法，仅质粒重组表达载体不同，对重组表达载体进行病毒包装，并用碘克沙醇梯度离心法进行浓缩和纯化，最后用SYBR Green qPCR法检测重组腺相关病毒滴度，最终获得rAAV-CMVen-Dnah5promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40病毒的滴度为1×10¹³vg/mL。

3.Dnah5启动子的活体验证

将rAAV-CMVen-Dnah5 promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40病毒通过圆窗注射到出生2-3天C57BL/6J小鼠的耳蜗中，病毒经10-14天充分表达后，脱颈椎处死小鼠，取出注射的耳蜗，放置4％多聚甲醛中，室温固定2小时。用PBS清洗三次，每次5分钟。再用0.5mMEDTA脱钙处理，室温浸泡2小时，使耳蜗软化。在体式显微镜下用眼科手术刀将基底膜解剖成顶、中、底三个部分，和前庭的椭圆囊组织。通过免疫荧光染色，利用anti-Myo7a抗体标记毛细胞，利用anti-Sox2抗体标记支持细胞，制成样品。通过激光共聚焦扫描显微镜对其进行成像，病毒感染的细胞其细胞核中会表达绿色荧光蛋白。激发光波长分别为488nm，561nm，647nm。活体检测结果如图23所示。该图为注射rAAV-CMVen-Dnah5 promoter-NLS-mNeonGreen-WPRE-SV40病毒的前庭铺片(a)和耳蜗(b)铺片图。紫色所示为一种毛细胞的标记蛋白Myo7a,红色是支持细胞的标记蛋白Sox2，绿色为病毒感染的细胞，Dnah5启动子特异表达荧光蛋白在前庭毛细胞中。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110> 上海玮美基因科技有限责任公司

<120> 一种耳蜗和/或前庭细胞特异性启动子及其应用

<160> 38

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1968

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acaatatcag ttcttgaggc caagtagctg ctgttggcaa ggattaacta ctgtcatgtt 60

ttgaccaggg tctgcaccac cctagggaac ttcaagttcc ctatgaggct attgtcaaga 120

ccaatagcca cttgactcaa cttgtggaaa tagtgttcac aaagtttcca tattaggaac 180

ttaccaatca tcttgtaaaa acctacacca aagtgtctgg gcagagaacc taggctctgg 240

ctatggttac aatagagggc atatgtatat tttgattttt ttttttttga gatggtttca 300

ctatgtaacc ctggctagcc cgaacttgtt atatagacaa ggctggactc agactcacag 360

agatcatcct gcctctgcct cttaagtgct gggattaaaa gcctgtgcca ccattcccag 420

cccaacacat ttgtttgttt gcttgagaaa gggtttctct gtgtagccca ggatgtcctg 480

aaactcactc tgtagactag gctggtctca aactcagtga gccacctgcc tttacctcct 540

gagtgctgct gttaaaggca tgtgccacca ccatctagct tgatttttta attaattttt 600

taaaaaacgt gtagtataca tgtaatggtg tgttccttta atcccagcac tcaggctgac 660

agaggcaggc agagctctgt gagtttaagg ccagcctaat ctacatagag aattccaccg 720

cagccagggc tacctgggga gaccctatct caatgatacg atgatgatgg atgacttgac 780

tgaatggata tctgtgcacc atgtgcatac ctggttccct cagagaccag aagaggaggt 840

cagatgccct gaactggaat tagagatggt tgtgagcagc catatgaatg ctgggaatca 900

aacccaggtc ctctgggttt ggaagagcag cagtcactgt tctaatctgc tgagccatcc 960

ctctagacct gctcataagg tttttttatg caagaagaga tgaccagtct ctggacagac 1020

cagcttatat tgaatgaaat ctttctaacc catgaatagg attccatgtg tagagagttt 1080

taacttgaga aagaaaaaga aactgcaatg tttacatggc ctaatcaagt aacagctctc 1140

tgagtctctc tccttacctg ttaattgaag ggtttaccta tgtggtttgt gaagtcctgt 1200

ctactcctta atattgcagg attccaagga tttattttta tgtgtgtatg tgtgttgtat 1260

ctgtgtaggc atgggcaggt taagtgcaga cgcccacaga ggcaagagac atcagattcc 1320

cctggagctg gagttacagg cagttctgaa ccacccaatt caggtgcatg taactcaact 1380

caggtcatct gcaaaggcag catacactct cagctgctga gccatctctt cagcaccaat 1440

actgtgggac tctggatagt gtgtctaagg taacaactct cctcttccta aatagtctac 1500

ccttgaaaca tctatcttaa tatcttctcg ctgcccactg ctggctgcca gaccatttct 1560

caaattcttc aaatctcagt tgtctctcaa actccttttg tactttcttt gtttgatcac 1620

atttttctgt agacccccag attatatttt tagtctgcct tcttctctct ggctcttaac 1680

tcatgccgtc tccttgggta atactctgag ggccccgaga tcccctgtca ttggtccctc 1740

taacagaagt acacccttct cccaaagcca gaggatcagg tgttcagtgg ctccggtgac 1800

aggtgtgatg tcaggttaca gatactgttt cctgagagac cacacgacag tgtcagagga 1860

accccagcct gcccacaatg ccccgtcttc acctggctat cccttcatgg tgagcatagc 1920

cagaactcac ctctaggccc agtgtgcacc tggaaatggt acctcgac 1968

<210> 2

<211> 1092

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgctcgaga gcagccatat gaatgctggg aatcaaaccc aggtcctctg ggtttggaag 60

agcagcagtc actgttctaa tctgctgagc catccctcta gacctgctca taaggttttt 120

ttatgcaaga agagatgacc agtctctgga cagaccagct tatattgaat gaaatctttc 180

taacccatga ataggattcc atgtgtagag agttttaact tgagaaagaa aaagaaactg 240

caatgtttac atggcctaat caagtaacag ctctctgagt ctctctcctt acctgttaat 300

tgaagggttt acctatgtgg tttgtgaagt cctgtctact ccttaatatt gcaggattcc 360

aaggatttat ttttatgtgt gtatgtgtgt tgtatctgtg taggcatggg caggttaagt 420

gcagacgccc acagaggcaa gagacatcag attcccctgg agctggagtt acaggcagtt 480

ctgaaccacc caattcaggt gcatgtaact caactcaggt catctgcaaa ggcagcatac 540

actctcagct gctgagccat ctcttcagca ccaatactgt gggactctgg atagtgtgtc 600

taaggtaaca actctcctct tcctaaatag tctacccttg aaacatctat cttaatatct 660

tctcgctgcc cactgctggc tgccagacca tttctcaaat tcttcaaatc tcagttgtct 720

ctcaaactcc ttttgtactt tctttgtttg atcacatttt tctgtagacc cccagattat 780

atttttagtc tgccttcttc tctctggctc ttaactcatg ccgtctcctt gggtaatact 840

ctgagggccc cgagatcccc tgtcattggt ccctctaaca gaagtacacc cttctcccaa 900

agccagagga tcaggtgttc agtggctccg gtgacaggtg tgatgtcagg ttacagatac 960

tgtttcctga gagaccacac gacagtgtca gaggaacccc agcctgccca caatgccccg 1020

tcttcacctg gctatccctt catggtgagc atagccagaa ctcacctcta ggcccagtgt 1080

gcacctggaa at 1092

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctattaccat ggtgctcgag acaatatcag ttcttgaggc caagtag 47

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcccagtgtg cacctggaaa tggtacctcg acggtaagtc c 41

<210> 5

<211> 409

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gttcctgcgg ccgcacgcgt gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac 60

ggggtcatta gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg 120

cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc 180

catagtaacg ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggactatt tacggtaaac 240

tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa 300

tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac 360

ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgctcgag 409

<210> 6

<211> 812

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cacgcgttct cgattctaga ccatagcaag gagaggaaat gaaagtcaaa ccagtttgca 60

acagaaagaa acttaagggt aaagaattcc taggtaaggc tgataccgta agtgtactgc 120

tggacagcgc tctggtctgt tacgtaacac cgggagcccc attctgtcgc acagaactgc 180

ctttttctct ccttaactac tctgaaacta gacagaatta catggtcctc attaatttat 240

gagtgatacc aaaaggatcg gctcaatccg ggcttcagtg tatccaggca caggactgtg 300

ctgtgcctcc tctctactcc cacaatgctt tgctgcgttc tcagcttccc atctcctttg 360

atgggtgaaa ctctcgccta tctgtgttga tcagctgttc tgaaaggccc caggagatga 420

tagcatctct tctctgggta tccatgccag tgtttaatag cctcttgaaa ctgccgagaa 480

gtgctcagca attgtgtggt ggggaaggac ggtgtcagca aggaataaag atgatctctc 540

gcctcgacgg tagctgaaat gtgagtttct gtgtccaggc tcagataaaa agtgatcctc 600

acacctttct caagtagcca gagacgattg aatttctgga ccagggcagg aaaacaagag 660

catgttgcta accttgctta gtgctgggga cctgatcttc ttgccattac attgtcattt 720

ctatcattct cattcttgaa aaattatcct ttgatttaga gataacttat gacaatgtga 780

ctctttatct tcctttcttt ctctctttct tt 812

<210> 7

<211> 542

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctttctttct ctctttcttt cttttttaaa ctggaagcct tcaggtgaaa ataaagccac 60

agcagccaga ggggggagaa atgtagtctt tctcagggtt aacatcagaa gacaagcttg 120

tgcggcttgg ccaatcagat gcgcccctgc cagctataat atagtgcgaa aggcagcctg 180

tctcacaagc tctccagcct tgctaccatt taaaatcagg ctctttttgt cttttaattg 240

ctgtctcgag acccaactcc gatgtgttcc gttaccagcg accggcagcc tgccatcgca 300

gccccagtct gggtggggat cggagacaag tcccctgcag cagcggcagg caaggttata 360

taggaagaga aagagccagg cagcgccaga gggaacgaac gagccgagcg aggaagggag 420

agccgagcgc aaggaggagc gcacacgcac acacccgcgc gtacccgctc gcgcacagac 480

agcgcgggga cagctcacaa gtcctcaggt tccgcggacg aggctagcga attcgccacc 540

at 542

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cacgcgttct cgattctaga 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctttctttct ctctttcttt 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gctagcgaat tcgccaccat 20

<210> 11

<211> 1968

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cacgcgttct cgattctaga gtactacagc ccacagaaga gcagtttatc cttgtctacc 60

atgtgtgtcc cagggatcaa actccagtcg ccaggctgag ccgtaggagc ccttacctgc 120

tgagccatcc caccagccca aagcctgaag actctcttag acaggcccct gagcttccaa 180

gccctgtcag tattagttgg acatcttgcc atgtcttgaa cactagatgc cctgtgaaga 240

tctcgagtga aaagcatcag tgggggagat ccatgtagca accccaggcc agtgatacct 300

ggatcaggag ccactgaaag ggggtcccaa agtccacctg agtgagggtg cagagtcacc 360

cctggggata agccgctgag accaggaggc agggacaaga tgggggaccc ctaccaagag 420

tgagccgcaa aagcaacggc ttagaatcca gcccccagca ctcctttccc tacaagccct 480

tcccgaaaga gcagacttct gctgttcctt ggatatccct ctacagatat ccctctgcta 540

cctctagcca ctgactagag cagggagcaa gatggttgtc ctctcactga aaactactca 600

tcaatagtgt cgcctcctcc agttctttgt ctccagcctg ggatgggtag gttggtgccc 660

tgactcttac aagtttccta cctagcacag tagcccctgt gacctctcat tagggcttcc 720

ctagtcacag tctctcattt caggaccagc tgcctgaaat tcaaaactat gacccaagaa 780

cagagcatta gagcctagca tcccaagggc acaaacagtg caggaccagg catcaatgca 840

ttgtcacttc tgatgctcct atataatagg ggccagtcct tggggacctc cttcaaactg 900

ccttatagaa gctgctgctc tccagactgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 960

gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt atgtgtgtgt gtgtgtagtg tgtagatata cagatgtgtt 1020

tatgtttatg tgtggaagcc tagggtcaac ttcagttgtc ttccttattt atttatctga 1080

cttgtttatt taaagacggg tctctttagc aaacctggag cttctccatt cagatagctc 1140

cgctgccatt aaactccagg ggttctcctg tctccacctt tctgccaccg cagagctggg 1200

ttagaagccc ttgcccctgc accggtcttt accatagact ctggaatcta aactcagatc 1260

ttcatgctcc tgtggcagac actttaccta ctgaggcatc tcctttgccc tcggctgagg 1320

cacagcatga tttatccaga gcagtcaggt ctgtcccgtc catgatctcc aagccttctg 1380

agcatccaca accctggtga ttagctagac acatcaagag acatcgtgga tactgcccaa 1440

gagaccagtg ccccattcaa gctcagacag tgaagttcca gatccccatg agaagtggcc 1500

tgacccctca tctgcccatc tgcatgccct ctgcaatctg ttggctctga gtggcacagc 1560

ttgctctgcc ctgccaagtg gcaggagctt ccattccagg agctggcagg agacacctga 1620

agccggacag ggctttatct cggagctggt gctgctgaat aatggattca gcatgcgttc 1680

ctgggctcct gcacacactc actcacacac acacacacac acacacacac acacacacac 1740

acacgcgcgc tacacacatg ctgggctgac aacccagagg ggcggggctg ccggggctgc 1800

acagctctga tgagctgaag gagcagcttg ctttggttgc cttggtctct gtgggcagca 1860

gcaggaggag gcggcagcag ccagagaaga gggaggcgtg tgagccacac tccaccagcg 1920

agcttcttcc cgctgctctg gaactgccct ttctttctct ctttcttt 1968

<210> 12

<211> 542

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ctttctttct ctctttcttt cttttttaaa ctggaagcct tcaggtgaaa ataaagccac 60

agcagccaga ggggggagaa atgtagtctt tctcagggtt aacatcagaa gacaagcttg 120

tgcggcttgg ccaatcagat gcgcccctgc cagctataat atagtgcgaa aggcagcctg 180

tctcacaagc tctccagcct tgctaccatt taaaatcagg ctctttttgt cttttaattg 240

ctgtctcgag acccaactcc gatgtgttcc gttaccagcg accggcagcc tgccatcgca 300

gccccagtct gggtggggat cggagacaag tcccctgcag cagcggcagg caaggttata 360

taggaagaga aagagccagg cagcgccaga gggaacgaac gagccgagcg aggaagggag 420

agccgagcgc aaggaggagc gcacacgcac acacccgcgc gtacccgctc gcgcacagac 480

agcgcgggga cagctcacaa gtcctcaggt tccgcggacg aggctagcga attcgccacc 540

at 542

<210> 13

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cacgcgttct cgattctaga gtactacagc ccacagaaga g 41

<210> 14

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cttcccgctg ctctggaact gccctttctt tctctctttc ttt 43

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gctagcgaat tcgccaccat 20

<210> 16

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cacgcgttct cgattctaga gtggcctcag gcccctgtgc ccgcgcccat ggggttaaat 60

ctctccctgt ctctctctgc tccaagttgt tttccaagcg aggcagagaa tggttctctt 120

gttaccaaca tggcttctgg gcattgggta atgcgttccc tcttctccct gccctgcgcc 180

acaaagggac cttttgttcc tctcccggcc cctctctctg gctcttctct gccccccacc 240

caccccaagt ccctcctccc cacgcctcct gccctactct gcgcgcaccc ctgggctgtg 300

aggagtgacc gtggcctggc tttctttctc tctttcttt 339

<210> 17

<211> 542

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ctttctttct ctctttcttt cttttttaaa ctggaagcct tcaggtgaaa ataaagccac 60

agcagccaga ggggggagaa atgtagtctt tctcagggtt aacatcagaa gacaagcttg 120

tgcggcttgg ccaatcagat gcgcccctgc cagctataat atagtgcgaa aggcagcctg 180

tctcacaagc tctccagcct tgctaccatt taaaatcagg ctctttttgt cttttaattg 240

ctgtctcgag acccaactcc gatgtgttcc gttaccagcg accggcagcc tgccatcgca 300

gccccagtct gggtggggat cggagacaag tcccctgcag cagcggcagg caaggttata 360

taggaagaga aagagccagg cagcgccaga gggaacgaac gagccgagcg aggaagggag 420

agccgagcgc aaggaggagc gcacacgcac acacccgcgc gtacccgctc gcgcacagac 480

agcgcgggga cagctcacaa gtcctcaggt tccgcggacg aggctagcga attcgccacc 540

at 542

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cacgcgttct cgattctaga 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ctttctttct ctctttcttt 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gctagcgaat tcgccaccat 20

<210> 21

<211> 940

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cacgcgttct cgattctaga gatccgaagc atcttatgct cagcataacc ggaggtgccc 60

tgggtacgtg gggcagccca ctgagaagcc acagcggggc acacgggtgc ggctcctctc 120

acgcctcact tgactgctct ggactcccca ccctaggcag ccgggcgggc gcggttccgg 180

aggggttggg gggggggggg agttgggcgg gctgggcggg gaggaggcgg ggctgctgca 240

ttgccttcac ccagctgctc ccgcccgcta gcagccagag cgagtggagc ctccgccagc 300

tccggcgggc agcgggcgct ggagcgcagc gcagcgcagc tcagctcagc gcgcagcacc 360

atcggtccgc agagcggact gagctagaag ctgagcgctg tcgcagactg ggagcagtct 420

cgagtggggt ggagggaggt ttgggaatct cgggcgcctg ggttcttttg acgacagcgt 480

gtgaattttg ggatcccgag gggagttttc tctttagcat cttagtccct ggggagttgt 540

agggcagaga gaaggaaggg aaagagatcg gcactaaaga tgtgaggggc tagagacgga 600

acaatgcggg aggcagctgg agggactgga ggcagagggg acccagtatg gacaatgggg 660

accggccaga caatgggggg gaggggcatc gaaaggagcg attcgggata gagccggttc 720

tgtgttccgc cgcggaccga gcctcttcct gcgccgctgc gagagttctg aaaccagagc 780

gcaaccagag tctgctggcc ggccgcgccg gtaatggagg cactttgtca ttcagacgtc 840

tgtaaccgga gccgcccggc tggctaatgc tcctaatagg gatgcagcag cgtaggcaac 900

aaatgggcag catgagcgtc ctttctttct ctctttcttt 940

<210> 22

<211> 542

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ctttctttct ctctttcttt cttttttaaa ctggaagcct tcaggtgaaa ataaagccac 60

agcagccaga ggggggagaa atgtagtctt tctcagggtt aacatcagaa gacaagcttg 120

tgcggcttgg ccaatcagat gcgcccctgc cagctataat atagtgcgaa aggcagcctg 180

tctcacaagc tctccagcct tgctaccatt taaaatcagg ctctttttgt cttttaattg 240

ctgtctcgag acccaactcc gatgtgttcc gttaccagcg accggcagcc tgccatcgca 300

gccccagtct gggtggggat cggagacaag tcccctgcag cagcggcagg caaggttata 360

taggaagaga aagagccagg cagcgccaga gggaacgaac gagccgagcg aggaagggag 420

agccgagcgc aaggaggagc gcacacgcac acacccgcgc gtacccgctc gcgcacagac 480

agcgcgggga cagctcacaa gtcctcaggt tccgcggacg aggctagcga attcgccacc 540

at 542

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

cacgcgttct cgattctaga 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ctttctttct ctctttcttt 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gctagcgaat tcgccaccat 20

<210> 26

<211> 1499

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

cacgcgttct cgattctaga gccgagctct atgtgatgaa aggaaatcag aacagaccct 60

tctgaaatct cagctcctgg gagaagcctg cctcaagtac ctcagggctc ctggtctgca 120

gatgttgcca ttgccagcca gcactcccac tgccagcacc tgggaggaga tggtggcagc 180

ttccggtgct gcctggactc tctctgctgc ccttatggag accactctgc ccctagggca 240

tcacccagtg ttttctcctg cctctgttta cttttctgtc aaactctggt gaaaccacag 300

tggtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtggtg tgtcttggca aagatcggtc 360

cagcatggaa gcaggagagg aatgcccaaa caatcttgta aagctctctg gtctcacgac 420

caaagcccaa attgctcagc atcaaatggg gtgggtgggg ggtgtgtgcg caaggtctgg 480

agcctgcaga gaaggctttg gagttttatt agacattaag attgttcttt aaggaacaga 540

aacaaagtga gcctccaaca gcccctccct cgggggaatc tggtgctaag tcgttccatc 600

catgagcaaa gatgctttag tggcaggaat ctgactcccc ccccccccat ccagctctgt 660

tcccaggggc cacatgggag gagaggggag gggatggagt caggctagga cggggaagtc 720

aactctggaa gaatagagtt gctggctggt gaaagccggc cactgataac aggcgtccct 780

ttctctgtct tggctccaga cttgcccatc agtctttgcc ctggcaccaa gctgtccctg 840

tgtttatctg cagaggggtg aaaactccca aaggaaaccc agggcaggcc agacacctcc 900

agtacagagt caatatttga acccaagtcc tcactgcctt ctgttcttgg acatagacaa 960

ctccgttttg atatttaata tgtggaatga gacctggaga agggccctgt tctccttttt 1020

aggaaagggc cctgcctctg ggtaactgca gccctgcagg tgtgaagttt agcaaatgga 1080

gtttgggcca aatttcagtt ccactggccc ccttggctag gagccctgtg caagctgcaa 1140

cctgcccagc cattctggat atcggtctca ccctcctcct gtggtgtatc ctcaggactc 1200

caggagaggc tgtaacccta aggtgaactc tgcagaaggt tagccactga ggctatgacc 1260

tcacacccca gcagcagtca agggccccac tccccccacg ccccccactg ccccccagcc 1320

ttccttcctg ccagctttga tcctcctaat gcctcccggg tgagctcatc ccagcccagg 1380

tggttctaat agaaagtatt aagagggagg cgtttgatcc cttggaagac accacctttg 1440

ctcctgccag gctgaccttg tgatctcctt ccacctaggc tttctttctc tctttcttt 1499

<210> 27

<211> 542

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ctttctttct ctctttcttt cttttttaaa ctggaagcct tcaggtgaaa ataaagccac 60

agcagccaga ggggggagaa atgtagtctt tctcagggtt aacatcagaa gacaagcttg 120

tgcggcttgg ccaatcagat gcgcccctgc cagctataat atagtgcgaa aggcagcctg 180

tctcacaagc tctccagcct tgctaccatt taaaatcagg ctctttttgt cttttaattg 240

ctgtctcgag acccaactcc gatgtgttcc gttaccagcg accggcagcc tgccatcgca 300

gccccagtct gggtggggat cggagacaag tcccctgcag cagcggcagg caaggttata 360

taggaagaga aagagccagg cagcgccaga gggaacgaac gagccgagcg aggaagggag 420

agccgagcgc aaggaggagc gcacacgcac acacccgcgc gtacccgctc gcgcacagac 480

agcgcgggga cagctcacaa gtcctcaggt tccgcggacg aggctagcga attcgccacc 540

at 542

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

cacgcgttct cgattctaga 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ctttctttct ctctttcttt 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gctagcgaat tcgccaccat 20

<210> 31

<211> 2014

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

gtcacatgtt gacaatgttc tcgggactaa tctgaactgc ttagcaggga cgatcagact 60

atcttgtctt attctgtgtc tctcctgtga cctgtggcca ccgttcacaa ttataacaac 120

aaacagctgc ttaccaatac acagaggttg attgaaaatt atctttatat ctcacgtata 180

gtgtgcgctt catttgcctg aggctctatg ttaagtctgc cgtgaccccg gatgtattca 240

cacaccatgt tggctcagaa gatgacactc ccaaatgtac agctgtgaag tttagagtga 300

gaacccgtga agagccgcac attcagggag agttttcttt ctccttatct atcttcaagt 360

ccacatagtc caggagacat tatttgctgc aagtgctttc ctcagccatc ccagcaggaa 420

gaggaaacac atgcaaatgg caggcaggag tgatggctac cacaggggca ttaccccaag 480

gcattgtctg ttctttgagt caattcatct ccgtgaaaaa taatctactc ttccgataaa 540

attgctcaat actttttttt ctctcctcaa agaagaacag atgtaagctt ctaaatctta 600

ctgaactgct gggcacctgg gtgattcccg tgtgtgcaat actctgcatg gcttctccct 660

tgtcaatctg tctactgcct ttgtcagatt caaacactga acttccaagg gaaaatagag 720

agttcttctg tgcctatact tctgacttta aatatgcttt tgttatttgc ttgccatcag 780

tattcaacac caaatatctg tatccatatt aacactacaa atggaggcca caccctaact 840

ggctgatggc taggtgaatt gattgtcctg atatcaaggt agtgccctgg ttgtcaattc 900

tgtttctgat gaggttgaat agcaggggac tcctcaattt cctgatgatc tttgaataat 960

ccgaaaagga tttatttact agattttatt ttacgtttta atttttttga gatagagttt 1020

ctctatgtag ctgtagccat ctggaactcc tctgtaaacc aggctagcct ggaactcaca 1080

gatatcggcc tctatctcct gagtgctggg attaaaggtg agcaccactg ctgcctagct 1140

aactgctgga tttttaatcc caaggatcca atgaaatgga ccttaaattc tgccatttgt 1200

gtgctttgat gggagggttg taggtgagag gtctctcccc atccgtcggt gcggagagga 1260

agatctagat gtttaggctt atggaatgca atgctttgct ttccatgctt gggcggccgt 1320

gtgaacagga gtaatttatg gacaccattt gccatttgca tatgaaatag gctgcttgtt 1380

ctttatggga gaggaaatgg ctcctttggg tcacaattag cctatcaagc aattagtcac 1440

aattagtcac catgctggca gttaattgtg cacacaaagt tgtttagaca aagtaagact 1500

gaatttccta actcgagtaa tatatccaga gctgtgactt gtctgccttc tgctttgatc 1560

aggtttaagg tttcttattg ttcagagaaa taatttaagc tcctttattg actcaaagct 1620

tattgttggg cagtgtatgg aatggaacat tagaacttgt ggttgcaacc aagcagttaa 1680

attgctttct cttgttgcta aacatgatta agaggcgtgc ttaaacggca cagcatggaa 1740

acagtattac cctaacaacg aaggaccaca gaatcgagga aaggccccag ggcagagact 1800

cagggaagga tatatgagca tcgcagatgg actgacttct cgcctcagtt ctgtgaatat 1860

cgagagtcac ccacatgcat gagaagcaac agcgcgatgc tgtgaccctc ttagagtctt 1920

tgcctgtgat attccactgg aggatgaaca gctctcttgg tagttagaag accattctgg 1980

aggagctgac ttggggccat cccagattgc tggg 2014

<210> 32

<211> 409

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

gttcctgcgg ccgcacgcgt gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac 60

ggggtcatta gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg 120

cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc 180

catagtaacg ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggactatt tacggtaaac 240

tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa 300

tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac 360

ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgctcgag 409

<210> 33

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

ctattaccat ggtgctcgag gtcacatgtt gacaatgttc tcgg 44

<210> 34

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

gccatcccag attgctgggg gtacctcgac ggtaagtcc 39

<210> 35

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

gagattatgg cccttcagag tcac 24

<210> 36

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

gagttgcaga gcccagaggt tagg 24

<210> 37

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

gctgcttcct tgatgcctcc taca 24

<210> 38

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

tgctcaatgg ctgctcctca cttc 24

Claims

1.一种耳蜗和/或前庭细胞特异性启动子，其特征在于，

a)所述特异性启动子包含如SEQ ID No.1、6、11、16、21、26、31所示的核苷酸序列；或，

b)所述特异性启动子包含与SEQ ID No.1、6、11、16、21、26、31具有80％以上序列同一性且具有a)限定的特异性启动子的功能的核苷酸片段。

2.用于扩增权利要求1所述的特异性启动子的引物对，包括正向引物和反向引物，其特征在于，选自以下引物对A～G之任一：

引物对A：正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；反向引物的核苷酸序列如SEQID No.4所示；

引物对B：正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；反向引物的核苷酸序列如SEQID No.9所示；

引物对C：正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示；反向引物的核苷酸序列如SEQID No.14所示；

引物对D：正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.18所示；反向引物的核苷酸序列如SEQID No.19所示；

引物对E：正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示；反向引物的核苷酸序列如SEQID No.24所示；

引物对F：正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.28所示；反向引物的核苷酸序列如SEQID No.29所示；

引物对G：正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.33所示；反向引物的核苷酸序列如SEQID No.34所示。

3.一种耳蜗和/或前庭细胞特异性重组载体，其特征在于，其包含如权利要求1所述的特异性启动子。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述载体选自腺相关病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体、单纯疱疹病毒扩增子载体、伪狂犬病毒载体、杆状病毒载体、痘病毒载体中的一种或几种；优选地，为腺相关病毒载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述特异性启动子的基因插入在基础载体的Kpn1/Mlu1或XbaI/BamHI多克隆位点处。

6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，选自以下至少任一：

1)包含SEQ ID No.1所示的特异性启动子插入在基础载体的Kpn1/Mlu1多克隆位点处；

2)包含SEQ ID No.6所示的特异性启动子插入在基础载体的XbaI/NheI多克隆位点处；

3)包含SEQ ID No.11所示的特异性启动子插入在基础载体的XbaI/NheI多克隆位点处；

4)包含SEQ ID No.16所示的特异性启动子插入在基础载体的XbaI/NheI多克隆位点处；

5)包含SEQ ID No.21所示的特异性启动子插入在基础载体的XbaI/NheI多克隆位点处；

6)包含SEQ ID No.26所示的特异性启动子插入在基础载体的XbaI/NheI多克隆位点处；

7)包含SEQ ID No.31所示的特异性启动子插入在基础载体的Kpn1/Mlu1多克隆位点处。

7.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体还包括目的基因；和/或，所述目的基因位于所述特异性启动子基因的3'端。

8.根据权利要求7所述的载体，其特征在于，包括以下至少任一项：

1)所述目的基因选自人耳聋基因；

2)所述目的基因表达在耳蜗和/或前庭细胞中；

3)所述目的基因选自Prestin、otof，vglut3、Gjb2。

9.一种药物组合物，其包含权利要求3～8任一项所述的重组载体。

10.如权利要求1所述的特异性启动子或如权利要求2所述的引物对或如权利要求3～8任一项所述的重组载体或如权利要求9所述的药物组合物的用途，选自以下至少任一项：

1)在制备用于预防听觉相关疾病的药物中的用途；

2)在制备用于听觉相关疾病的基因治疗的药物中的用途；

4)在构建听觉相关疾病动物模型中的用途；

5)在构建与耳聋基因异常相伴随的疾病动物模型中的用途；

6)在体外耳蜗外毛细胞、耳蜗内毛细胞、耳蜗支持细胞、前庭毛细胞、耳蜗I型和II型螺旋神经节细胞再生相关研究中的用途；

7)在体外毛细胞损伤保护相关研究中的用途；

8)在体外内耳发育相关研究中的用途；

9)在体外听觉相关疾病发病机制相关研究中的用途；

10)在体外听觉突触重建相关研究中的用途。

11.一种用于治疗听觉相关疾病的方法，其包括：对需要治疗的患者给予有效量的权利要求3～8任一项所述的重组载体。

12.如权利要求10所述的用途或如权利要求11所述的方法，所述疾病为听觉相关疾病；优选地，听觉相关疾病选自感音神经性耳聋或耳鸣；进一步优选地，所述感音神经性耳聋选自老年性耳聋、噪声性耳聋、耳毒性药品关联的耳聋、突发性耳聋、缺血性耳聋、自身免疫性耳聋、梅尼埃病、头部损伤关联的耳聋、遗传性耳聋、由其他原因或由不明原因造成的柯蒂氏器官的功能失调、或由病毒或细菌感染引起的对柯蒂氏器官的损害、或其组合。