CN117165596A - 编码rpgr的核酸及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及编码RPGR的核酸及其应用。本发明提供了编码RPGR的核酸，并提供了含有该核酸的载体、腺相关病毒。该编码核酸经过特殊优化从而使RPGR的表达量显著提高，从而可以用于用于治疗RPGR突变引起X染色体连锁视网膜色素变性。实验表明，AAV‑RPGR药物能够显著改善RPGR突变引起X染色体连锁视网膜色素变性的缺陷小鼠的眼部病变。

Description

编码RPGR的核酸及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及编码RPGR的核酸及其应用。

背景技术

视网膜色素变性(RP)是遗传性视网膜营养不良的一个表型连锁群，该病症会导致病人的视力逐渐下降，RP的发病率为1/4000到1/3000。RP的早期症状包括夜间视力和周边视力下降。随着疾病的进一步发展，中央视觉和彩色视觉也可能受到影响。RP发病年龄症状是可变的，但通常在10岁到30岁之间，恶化的速度也因人而异。

RP是由一种或几种与眼睛的健康和功能相关的基因突变引起的。在所有导致RP的单基因中，由于视网膜色素变性GTPase调节基因(RPGR)的缺陷导致的X染色体连锁病变是最常见的。X染色体连锁视网膜色素变性(XLRP)被认为是最严重的视网膜色素变性。XLRP中有约70％由RPGR突变引起。RPGR定位在感光器细胞的连接纤毛，在蛋白运输中发挥作用。目前已发现超过300种的RPGR突变，RPGR有多种剪接异构体，其中RPGR-ORF15主要表达在视网膜的感光器细胞中，RPGR基因突变导致患者在儿童时期视锥细胞和视杆细胞即开始变性和退化。

RPGR基因具有高度的突变性，这种体内产生的突变增加了致病的可能性。由此，这种突变性质也导致在基因治疗中将编码RPGR蛋白的序列克隆到载体上的难度增大。实际上，以前开发的XLRP基因替代疗法的策略也受到了这类因素的阻碍。

因此，开发一种高效、特异性的药物是满足当下在治疗RPGR突变引起的X染色体连锁视网膜色素变性方面的迫切需求的。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供编码RPGR的核酸及其应用。

本发明提供的编码RPGR的核酸，包括I)～IV)中至少一种：

I)、具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的核酸；

II)、在I)所述的片段中取代、缺失或添加一个或多个核苷酸的核酸；

III)、与I)所述核酸的序列至少具有90％的同源性，且编码RPGR的核酸；

IV)、与I)～III)中任一项部分互补或完全互补的核酸。

一些实施例中，编码RPGR的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供了一种重组载体，其包括骨架载体和本发明所述的核酸。

本发明中，所述的重组载体中的骨架载体为病毒载体。一些实施例中，所述病毒载体选自慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体中至少一种；其中，腺相关病毒载体的血清型为AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV2.7M8或AAV2-TYF突变型。一些具体实施例中，其骨架载体上含有RK1启动子和/或SV40内含子。在本发明实施例中，所述重组载体上包括顺序连接的RK1启动子、SV40内含子、SEQ ID NO:1所示的核酸、SV40poly(A)signal。具体的，所述重组载体上包括顺序连接RK1启动子、SV40内含子、SEQ IDNO:1所示的核酸、SV40 poly(A)signal。其中，RK1启动子的核酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述SV40内含子的核酸序列如SEQ ID NO:5所示。

本发明还提供了一种质粒组合，其包括所述的重组载体、辅助功能质粒和附属功能质粒。所述辅助功能质粒为pAdHelper；所述附属功能质粒为pAAV-r2c5。

本发明还提供了表达RPGR的腺相关病毒的制备方法，其包括：将所述的质粒组合转染宿主细胞，经纯化获得RPGR的腺相关病毒。所述宿主细胞为293细胞或293T细胞。

本发明所述制备方法制备获得的表达RPGR的腺相关病毒。

本发明所述的重组载体、所述的质粒组合或所述的腺相关病毒在制备防治眼部疾病的药物中的应用。本发明中，所述眼部疾病为RPGR突变所致疾病。一些实施例中，所述眼部疾病为视网膜色素变性。一些实施例中，所述防治包括修复视网膜结构，提高视细胞数量和/或改善眼部功能。

本发明还提供了一种药物，其包括本发明所述的重组载体，或质粒组合、或腺相关病毒。

本发明所述的药物中，还包括药学上可以接受的载体和赋形剂。在某些实施方式中，所述赋形剂为纳米载体和/或脂质体、本发明所述药物的剂型为注射液剂，其中所述的腺相关病毒的含量为1×10⁹～1×10¹⁶个病毒/毫升，一些实施例中，所述腺相关病毒的含量为1×10¹²～1×10¹⁴个病毒/毫升。一些具体实施例中，所述的腺相关病毒的滴度为1×10¹³vg/mL。

本发明所述药物的给药方式包括视网膜下注射、玻璃体腔注射、前房注射或者结膜下注射。

本发明所述的药物中，还包括其他具有改善视网膜色素变性活性的药物。

本发明还提供了一种防治视网膜色素变性的方法，其为给予本发明所述的药物。

本发明提供了编码RPGR的核酸，并提供了含有该核酸的载体、腺相关病毒。该编码核酸经过特殊优化从而使RPGR的表达量显著提高，从而可以用于用于治疗RPGR突变引起X染色体连锁视网膜色素变性。实验表明，AAV-RPGR药物能够显著改善RPGR突变引起X染色体连锁视网膜色素变性的缺陷小鼠的眼部病变。

附图说明

图1A～图1D是密码子优化后的RPGRORF15与野生型序列比对，优化后差异性的密码子序列加粗并用下划线标注；

图2是AAV-RPGR载体图谱：其中，A是密码子优化的RPGRORF15质粒载体示意图，载体包含AAV2 5’ITR，RK1启动子，SV40内含子，密码子优化后RPGR ORF15，SV40polyA序列和AAV2 3’ITR；B是野生型的RPGR ORF15质粒载体示意图，载体包含AAV25’ITR，RK1启动子，SV40内含子，野生型RPGR ORF15，SV40 polyA序列和AAV2 3’ITR；

图3显示AAV-RPGR载体的克隆与酶切验证；其中，A为将构建好的优化AAV-RPGRORF15质粒转化Stbl3大肠杆菌菌株；B为将构建好的野生型AAV-RPGR ORF15质粒转化Stbl3大肠杆菌菌株；C为挑取单克隆抽提质粒用HindIII与XhoI双酶切鉴定，对密码子优化后与野生型的载体转化效率与序列的完整性进行验证；1-5：密码子优化质粒酶切结果；M：10kbMarker；6-10：野生型质粒酶切结果；

图4显示优化后的RPGR序列编码蛋白在体外细胞的表达验证；其中，A是在小鼠视锥细胞系661W中转染AAV-RPGR质粒，48小时后裂解细胞检测RPGR蛋白表达水平,检测密码子优化后opt1,opt2和野生型的RPGR蛋白表达差异，B为将AAV5-RPGR-opt1病毒用不同的感染复数(MOI＝1E4,3E4,1E5)对661W细胞进行感染，72小时后裂解细胞利用qPCR检测RPGRmRNA表达水平；

图5显示小鼠体内AAV介导的RPGRopt1蛋白表达水平验证；

图6是小鼠体内RPGR表达效率比较，利用免疫荧光染色观察RPGR蛋白在视网膜的分布，其中A为视网膜铺片后染色RPGR抗体，观察RPGR阳性信号在视网膜的分布和密度，B为RPGR阳性细胞在视网膜的整体占比；

图7显示小鼠体内RPGR组织定位；

图8显示AAV5-RPGRopt基因治疗药物对RPGR突变引起X染色体连锁视网膜色素异常的治疗作用，其中，A为注射后18个月RPGR敲除小鼠的药物注射眼和对照眼视网膜电图分析，光照条件下给予逐渐增强的光刺激，记录不同强度光刺激下各小鼠(n＝20)药物注射眼和对照眼的b波振幅；B为注射后18个月RPGR敲除小鼠的的药物注射眼和对照眼视网膜电图分析，黑暗条件下给予逐渐增强的光刺激，记录不同强度光刺激下各小鼠(n＝20)药物注射眼和对照眼的b波振幅；C示注射后18个月RPGR敲除小鼠的药物注射眼和对照眼视网膜外核层厚度(n＝20)的定量分析。

具体实施方式

本发明提供了编码RPGR的核酸及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明中，RPGR是指视网膜色素变性GTPase调节基因，是X连锁视网膜色素变性(RP)最常见的致病基因，RPGR有多种剪接异构体，其中RPGR-ORF15的野生型编码序列如SEQID NO:2所示，该序列来自人源。本发明对SEQ ID NO:2所示的序列进行优化，使其能够显著改善RPGR突变引起X染色体连锁视网膜色素变性的缺陷小鼠的眼部病变。本发明提供的编码RPGR的核酸如SEQ ID NO:1(opt1)或SEQ ID NO:3(opt2)所示，SEQ ID NO:1所示核苷酸序列为：atgagagaacccgaggaactgatgccagattcaggggctgtctttaccttcggcaagtctaagtttgctgaaaacaatcctggaaagttctggtttaaaaacgacgtccccgtgcacctgtcttgtggcgatgaacattccgccgtggtcacggggaacaacaagttgtatatgtttggttccaataactggggccagttgggcctcggctcaaagagcgctataagcaaacctacatgcgtgaaagccctcaagcctgaaaaagtcaagttggcagcctgcggacggaaccacacccttgtgtcaactgagggcggcaacgtttacgccacgggtggaaataacgagggccagcttgggctcggcgatacagaggagcgaaatactttccatgttatatccttttttacatctgaacacaagattaagcaattgagtgccggaagcaatacatcagcagccctgacagaggatggtagattgtttatgtggggggataattccgagggtcagatcggactgaagaatgtgagcaatgtgtgtgtaccccagcaggtgactatcggcaaaccagtctcttggatctcctgcgggtactatcattctgcctttgtgaccacggacggcgaactgtatgttttcggagagccagaaaatggaaaactgggtctgcccaatcagctgttgggcaatcacagaaccccgcagttggtgagtgaaattccagagaaggtaatacaggtggcgtgcggtggcgagcataccgttgttctgaccgagaatgcagtgtatacgtttgggctcggtcaattcggacaactcggactgggaaccttcctgtttgaaacgagcgagcccaaagtgattgagaacataagagatcagacaatcagctatatctcttgcggcgaaaaccataccgcactgatcacagatatcggtctcatgtacacttttggcgatgggcgccatggaaaattggggctgggcctggaaaatttcactaatcacttcataccgactctgtgcagtaattttcttcgatttattgtaaaacttgtggcatgtggcggctgccacatggtcgttttcgctgcaccacacaggggcgtcgctaaagaaattgaatttgacgagatcaacgacacctgtctttccgtggcgacattccttccctactcaagcctcacatctggaaatgtgctccagaggacactctcagctcgaatgagacgcagggaaagagagcgaagcccagacagcttttctatgagacgcacacttcctcccatcgaggggactttgggacttagtgcttgttttctgcctaattctgtctttccgagatgtagcgagaggaacctccaggaatccgtgttgtccgagcaggatctgatgcagccagaagagcctgattacctgctcgatgagatgactaaggaggctgagatcgataatagttccaccgtggaatccctcggcgagaccactgacattctcaatatgacacatatcatgtccctgaactccaatgaaaagtcactgaagctctctccagtgcaaaaacagaagaagcagcagacaatcggagagctgactcaagacaccgccctgacagaaaatgacgacagcgacgaatacgaagagatgtcagagatgaaggagggcaaggcatgtaaacagcacgtctcccagggcatcttcatgacacagccagccaccactatcgaggctttcagtgatgaagaggtggaaatccctgaggaaaaggagggggctgaggactccaaggggaatgggattgaggagcaggaggttgaggcaaacgaagaaaacgttaaggtccatgggggcagaaaggagaaaactgagattctttcagatgacctgactgataaggctgaggtttccgagggaaaagccaaaagcgtaggggaggctgaggatggccccgaaggaagaggtgatggcacatgtgaagagggcagcagtggtgccgaacactggcaggacgaggagagagagaagggggaaaaggataaggggcgcggagagatggaaagacctggagaaggggagaaggaactcgccgaaaaggaagagtggaaaaagcgggatggagaagagcaggaacaaaaggaaagggagcagggacaccagaaggagcgaaatcaggaaatggaagagggtggtgaagaggagcacggagagggtgaggaagaagaaggcgatagggaagaggaagaggagaaagaaggcgaggggaaagaggagggagaaggggaggaggttgaaggggagagggaaaaggaggagggcgaaagaaagaaagaagagcgggctggcaaagaggaaaaaggcgaagaagaaggagatcagggcgaaggggaggaggaagagactgagggcagaggggaggagaaggaggaagggggtgaagtggaagggggagaggttgaagagggcaagggcgagcgggaagaggaagaagaggagggagaaggagaagaggaagagggggagggagaagaagaagaaggcgaaggggaagaagaagaaggggaaggtaagggtgaagaggaaggcgaggagggggaaggcgaagaggaaggagaagagggtgaaggtgaaggcgaagaagaagaaggtgaaggagagggcgaggaagaaggagagggcgaaggcgaagaagaagagggcgaaggagagggggaggaagagggagagggggaaggagaggaggaggagggagaaggtaagggagaagaggaaggtgaagaaggcgagggagagggggaagaagaagagggggaaggagaaggggaagatggcgagggcgaaggagaggaagaagaaggggaatgggaaggagaagaagaggaaggagaaggtgaaggtgaagaggaaggtgagggggaaggagaagagggcgaaggtgagggcgaagaagaagagggtgagggagaaggagaggaagaggaaggggaagaagaaggcgaagaggaaggtgaaggcgaggaagagggcgaaggggaaggtgaagaagaagaagaaggggaggttgagggagaagttgagggcgaagagggagaaggggaaggagaagaggaagaaggagaagaggaaggagaagaacgggaaaaggaaggcgagggggaggaaaataggcgaaatagggaggaggaagaagaggaggagggtaagtatcaggagactggcgaggaagaaaacgaaaggcaggacggcgaagagtacaaaaaagtgagtaaaattaaaggctccgtgaagtacggtaaacataagacctaccagaaaaagtccgttacaaatacacaaggtaacggcaaggaacagcgatctaagatgcccgtccagtcaaaacgactcctgaagaatgggcctagtgggagcaaaaaattctggaataatgtcctccctcactatctggaactcaag。

通过分析和试验筛选，结果表明，相对于其他优化序列而言，如SEQ ID NO:1所示的核酸，转录水平得到提高，表达量显著提高，从而能够更显著的对视网膜色素变性起到良好的治疗作用。而野生型或其他优化序列的效果不及SEQ ID NO:1所示的核酸。

本发明利用腺相关病毒(AAV)载体进行基因置换治疗，在许多视网膜变性动物模型中，已证明对视网膜功能和结构的挽救是有效的。通过提供一种重组载体，其中RPGRORF15编码区被置于组织特异性的启动子的控制之下，同时其序列进行了密码子优化，为由RPGR突变引起X染色体连锁视网膜色素变性提供具有活性的RPGR蛋白并达到接近野生型水平。首先将构建好的AAV-RPGR质粒转化大肠杆菌，挑取单菌落扩增后提取质粒酶切与测序鉴定，验证RPGR序列克隆的效率以及RPGR序列的完整性与一致性；其次将质粒转染小鼠视锥细胞系661W，检测RPGR蛋白的表达效率高于野生型蛋白；由RK1启动子控制的RPGR蛋白包装病毒后感染661W细胞，其表达随病毒剂量提高而升高。随后对C57小鼠进行视网膜下药物注射，比较RPGR优化前后的体内表达效率，同时检测RPGR蛋白在视网膜组织中正确定位表达；最后对RPGR敲除小鼠药物治疗后的疗效进行评估，视网膜电图分析表明小鼠接受治疗眼功能得到改善；同时OCT结果显示治疗眼视网膜组织外核层厚度明显大于未治疗眼，表明视细胞整体存活数量显著提升。总而言之，体外实验证明了AAV5-RPGRopt1药物的效率，小鼠体内实验证明了AAV介导的基因治疗药物能有效的治疗RPGR突变引起的X染色体连锁视网膜色素变性。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1 AAV-RPGR载体的克隆与酶切验证

将野生型RPGRORF15编码序列进行了密码子优化，两种优化分别记做RPGRopt1和RPGRopt2，其中RPGRopt1与野生型的比对如图1A-图1D，并构建了相应的AAV载体质粒(图2)。将包含有密码子优化的RPGRORF15序列和野生型RPGR ORF15序列的质粒(200ng/μL)分别转化大肠杆菌Stbl3菌株并涂布添加了对应抗生素的LB平板，过夜培养后观察单菌落生长情况。

质粒转化大肠杆菌：

按以下反应体系混合均匀，于冰上放置20min，室温放置10min，加入500μL无抗LB37℃，200rpm摇床培养40min，然后5000rpm离心3min，吸弃500μL上清，将余下液体重悬菌体沉淀并于相应抗性LB固体平板均匀涂布。将平板置于37℃培养箱培养过夜。

sample	volume(μL)
		5X KCM	10μL
质粒	5-20μL
		ddH2O	补充至50μL
感受态细胞	50-100μL

如图3所示，相同浓度的质粒DNA，优化质粒平板的单菌落数量要高于野生型质粒平板(图3中的A、图3中的B)，说明密码子优化后的RPGR ORF15序列的克隆效率要高于野生型。

质粒DNA的小量提取：

1.挑取单菌落于适量的LA(添加的抗生素取决于质粒抗性)液体培养基中，37℃，200rpm摇过夜(16-20h)；

2.将培养液分装于1.5mLEP管中，每管分装1mL，12000rpm离心3min，颠倒EP管弃去上清；

3.加入100μL溶液I，涡旋混匀至菌体充分悬浮；加入200μL溶液II，轻柔颠倒混匀，至液体澄清而粘稠；加入150μL溶液III，迅速上下颠倒混匀，冰上放置5min后，12000rpm离心10min；

4.吸取上清于新的EP管中，加入2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，颠倒混匀，在-20℃放置30min；12000rpm离心10min，弃上清，加入70％酒精180μL，12000rpm离心2-3min，弃上清；

5.室温晾干质粒DNA，加入TE溶解，可室温放置，短期保存置于4℃，长期保存置于-20℃。

质粒DNA的酶切验证：

按照以下体系配制反应溶液，置于37℃孵育1-4h，取适量体积上样电泳检测。

sample	volume(μL)
		1X Buffer	2
质粒DNA	1-2
		Hind III	1
XhoI	1
		ddH2O	补充至20μL

分别提取质粒双酶切后电泳观察条带大小，发现优化质粒酶切结果RPGR ORF15保持完整大小，而野生型质粒酶切结果显示RPGRORF15未能保持完整大小(图3中C)，说明密码子优化后的RPGRORF15在克隆过程中的保真度高于野生型。

实施例2 AAV介导的RPGR在体外细胞以及小鼠体内的表达

将包含密码子优化的RPGRORF15序列和野生型RPGRORF15序列的质粒分别转染661W细胞，48小时后裂解细胞，提取蛋白后利用WesternBlot确认蛋白表达量。

一、细胞转染：

1.转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90％。

2.对于每孔细胞，使用50μl无血清DMEM培养基稀释DNA。

3.混合稀释的DNA和稀释的LIPOFECTAMINE 2000在室温保温20分钟。

4.直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。

5.在37℃，5％的CO₂中培养，在细胞中加入复合物24-72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。

二、病毒感染细胞：

1.消化HEK293T细胞，铺板6孔板。

2.培养过夜后，取部分孔的细胞以合适的MOI感染目的病毒和其对照病毒。

3.感染36-48h后，收取细胞进行后续实验。

三、qPCR测定mRNA含量：经总RNA抽提、反转录、定量PCR等步骤，WesternBlot检测蛋白表达：

1.蛋白样品制备，按1:100的比例在裂解液中加入PMSF(按用量现配现用)。

2.使用强裂解液裂解细胞。

3.使用BCA法测定蛋白浓度。

4.电泳

a、根据所检测蛋白大小配制相应的分离胶(5ml/块)，待分离胶凝固。

b、配制5％的浓缩胶(2ml/块)，加满玻璃板，插入梳子。

c、将5μl预染蛋白质分子marker SDS-PAGE加入加样孔内，使用1x的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液10μl上样到样品孔边上的空白加样孔内。

5.转膜

将转膜白夹子上面放上湿的垫层，垫层上面铺三张叠在一起的湿滤纸，滤纸上面依次放置湿pvdf膜、胶、滤纸、垫层、黑夹板，将装好的夹板放入装有转膜缓冲液的电泳槽，把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。

6.封闭

转膜完毕后，漂洗1-2分钟，用滴管吸尽缓冲液，加入5％的脱脂奶粉，在侧摆摇床上缓慢摇动，室温封闭15-60min。加入TBS洗涤液洗涤5分钟。共洗涤3次。

7.一抗孵育

按照比例使用5％的脱脂奶粉/PBS+2％BSA稀释适量的一抗，4℃缓慢摇动孵育过夜或室温在侧摆摇床上缓慢摇动孵育2h。孵育后洗涤。

8.二抗孵育

加入稀释好的二抗，室温侧摆摇床上缓慢摇动孵育40min-1h。孵育后洗涤。

9.蛋白检测

使用ECL类试剂来检测蛋白，各取1ml混匀后，滴加在蛋白膜表面，避光孵育1-2min。用镊子将蛋白膜整齐的摆放在塑料纸上，放入凝胶成像仪上曝光。

如图4所示，发现密码子优化的RPGRopt1蛋白表达量要高于野生型和优化序列RPGRopt2(图4中的A)，优化后的RPGRopt1蛋白体外表达量相对于野生型序列提高了3.6倍(表1)。

表1蛋白条带相对灰度值

样品名称	相对灰度值
		RPGRopt1	4.6
RPGRopt2	1.1
		RPGRwt	1

优化的AAV-RPGRopt1载体包装AAV5血清型病毒，以不同感染复数(MOI)对661W细胞进行感染，72小时后裂解细胞提取RNA，利用qPCR确认mRNA表达量，结果显示RPGRopt1mRNA在体外的表达水平随病毒剂量的增加而升高，存在明显的剂量依赖效应(图4中的B，表2)。

表2不同剂量病毒感染661W细胞后RPGR mRNA的表达水平

分组	RPGRmRNA的相对表达水平均值(n＝3)
		PBS	1
AAV-GFP	0.89
		AAV-RPGRopt1(1E4)	310.84
AAV-RPGRopt1(3E4)	1046.95
		AAV-RPGRopt1(1E5)	2779.96

四、病毒包装，病毒药物注射小鼠：

1.聚合度90％以上的HEK293T细胞按1：3比例传盘。

2.转质粒前1-2h左右，换成无血清培养基，用转染试剂将目的基因质粒和辅助质粒转入HEK293T中。

3.质粒转化24h后，换新的无血清培养基。

4.转染72h收毒。带着培养基，吹下细胞，离心；然后分别收获培养基上清与细胞沉淀。用PEG8000沉淀培养基上清中的病毒，沉淀过夜后收集病毒沉淀。

5.将病毒的混合液用碘克沙醇密度梯度离心进行纯化，然后用超滤管进行浓缩。

6.构建人源化的RPGR敲除小鼠。

7.准备好1×10¹³vg/ml的AAV-RPGRopt1药物，进行不同剂量的稀释。

8.将1μl/眼的AAV-RPGRopt1药物和PBS通过视网膜下注射进小鼠视网膜区域。

将AAV5-RPGRopt1病毒药物以视网膜下注射的方式给药到6-8周龄的C57小鼠眼部，然后在给药4周后取视网膜，提取组织中蛋白进行WesternBlot检测，观察RPGR在小鼠视网膜组织中的表达。

如图5所示，敲除小鼠的治疗眼能够检测到RPGR蛋白的表达，而对照眼组织中未能检测到相应的蛋白表达，且蛋白的表达水平与给药剂量同样存在线性增长关系。

五、免疫荧光染色：

1、将切片或样品铺片用PBS洗2遍，每次5min。

2、弃去PBS，每孔加入200μl的1％Triton打孔15min。打孔结束后用0.05％Triton洗3遍。

3、每个样品加入30μl的碧云天封闭液，室温静置封闭2小时。

4、在每片样品上滴加30μl的合适浓度的一抗(1:200)。整个封口膜放入湿盒内，4℃静置过夜。

5、用添加0.05％Triton的PBS清洗3遍，每遍5min。

6、在每片样品上滴加40-50μl的合适浓度的二抗(1:1000)抗体。整个封口膜放入湿盒内，室温静置1小时。

7、用添加0.05％Triton的PBS清洗3遍。

8、每个样品加入30μl的DAPI染液，染色15min。

9、用PBS清洗3遍。

在盖玻片上滴加15μl的抗荧光淬灭封片液，小心的将盖玻片封到载玻片上，指甲油封片。

如图6所示，视网膜铺片结果显示优化的RPGRopt1药物在视网膜的分布面积更大，且单位面积内阳性信号的密度高于野生型的RPGR药物和优化序列RPGRopt2(图6中的A)，意味着蛋白丰度更高；经过计算，野生型的药物在视网膜中的表达占比为7.82％，优化的药物RPGRopt2在视网膜中的表达占比为15.7％，优化的药物RPGRopt1在视网膜中的表达占比为36.3％(图6中的B，表3)。

表3阳性表达细胞在整体视网膜中的占比

分组	阳性面积均值	阳性信号密度均值	视网膜总体占比均值(n＝12)
				RPGRwt	17.7％	44.2％	7.82％
RPGRopt1	67.8％	53.5％	36.3％
				RPGRopt2	34.6％	45.6％	15.7％

如图7所示，切片结果显示RPGR蛋白(红色荧光信号，箭头所示)能够正确地定位于感光细胞内段(IS)，且优化的药物opt1信号强于优化的药物opt2和未优化的药物。

以上结果表明AAV-RPGRopt1病毒药物在体内能够正确地表达蛋白，且优化的药物在体内的表达效率相对于未优化的药物有显著的提升。

实施例3 AAV-RPGRopt1基因治疗药物改善RPGR敲除小鼠眼部功能，修复视网膜结构

实施例1-2证实了RK1启动子控制的密码子优化的RPGRORF15编码序列在体外的和体内的正确表达，为了进一步证明AAV5-RPGRopt1基因治疗药物对RPGR突变引起的X染色体连锁视网膜色素变性的治疗作用，利用RPGR敲除小鼠模型进行了体内实验，注射后18个月观察药物治疗对小鼠眼部病变的改善情况。

首先，我们利用视网膜电图分析对药物治疗眼和对照眼的功能进行评估。

病毒包装、病毒药物注射小鼠的方法同前所述。

一、视网膜电图分析：

1.对小鼠进行麻醉和瞳孔扩张处理，同时向眼部滴入包含电极的2.5％羟丙甲纤维素液体，记录角膜电位反应。

2.暗适应条件下让小鼠适应黑暗过夜，用LED灯给予-2到+3logsc cd.s/m²强度的短暂闪光刺激，记录暗适应ERG，根据刺激强度的不同，以3到60秒的间隔对反应进行记录。

3.光适应条件下，LED灯给予-0.5到+2logsc cd.s/m²强度的短暂闪光刺激，记录光适应ERG，以2分钟的间隔对反应进行记录。

如图8所示，发现光照条件下，随着光刺激强度增大，治疗眼的b波振幅逐渐高于对照眼(图8中的A,表4)；黑暗条件下，治疗眼的b波振幅在不同光刺激强度下均显著高于对照眼(P<0.5)，与野生型接近(图8中的B，表5)，这说明药物治疗对眼部功能起到了明显的改善作用。

表4光照条件下小鼠ERG眼部b波振幅

表5黑暗条件下小鼠ERG眼部b波振幅

随后小鼠的眼部组织被用来进行OCT分析。

二、小鼠OCT检测

1.动物准备

动物麻醉后，滴加扩瞳保持2～3分钟，后用棉签轻轻擦去扩瞳液，涂布卡波姆凝胶，使动物眼部保持湿润；

检查左眼时，将小鼠放在摄像机前平台中心偏右的位置，调节小鼠位置，使左眼正对摄像机镜头；同理，检查右眼时，将小鼠放在摄像机前平台中心偏左的位置，调节小鼠位置，使左眼正对摄像机镜头。

2.图像采集

在本实验，选择IR及IR+OCT两种模式：

选择IR模式(30°镜头)，定位到小鼠视盘中央区域，图像采集并保存

3.外核层图像分析

将所要测量厚度的层次用两条水平红线标记出来，移动绿色竖线至45°、90°、135°、225°、270°和315°的位置，将绿色竖线右侧显示的数字记录下来。

将所测量不同小鼠视网膜的该层厚度整理至EXCEL中，计算平均值并分析。

对外核层厚度的定量分析表明，治疗眼的外核层厚度明显大于对照眼(图8中的C，表6)，说明药物注射后治疗眼视网膜中得以保留更多的视细胞，同时基本维持了视网膜的结构。

表6小鼠视网膜外核层(ONL)厚度

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综合以上结果，AAV-RPGRopt1基因治疗药物通过在RPGR敲除小鼠体内提供能正常发挥功能的蛋白，弥补基因缺失对眼部病变造成的不利影响，我们证明了AAV-RPGRopt1基因治疗药物对RPGR突变引起的X染色体连锁视网膜色素变性的治疗作用，为进一步的临床应用开发奠定了基础。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 武汉纽福斯生物科技有限公司

<120> 编码RPGR的核酸及其应用

<130> MP22012736

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3456

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgagagaac ccgaggaact gatgccagat tcaggggctg tctttacctt cggcaagtct 60

aagtttgctg aaaacaatcc tggaaagttc tggtttaaaa acgacgtccc cgtgcacctg 120

tcttgtggcg atgaacattc cgccgtggtc acggggaaca acaagttgta tatgtttggt 180

tccaataact ggggccagtt gggcctcggc tcaaagagcg ctataagcaa acctacatgc 240

gtgaaagccc tcaagcctga aaaagtcaag ttggcagcct gcggacggaa ccacaccctt 300

gtgtcaactg agggcggcaa cgtttacgcc acgggtggaa ataacgaggg ccagcttggg 360

ctcggcgata cagaggagcg aaatactttc catgttatat ccttttttac atctgaacac 420

aagattaagc aattgagtgc cggaagcaat acatcagcag ccctgacaga ggatggtaga 480

ttgtttatgt ggggggataa ttccgagggt cagatcggac tgaagaatgt gagcaatgtg 540

tgtgtacccc agcaggtgac tatcggcaaa ccagtctctt ggatctcctg cgggtactat 600

cattctgcct ttgtgaccac ggacggcgaa ctgtatgttt tcggagagcc agaaaatgga 660

aaactgggtc tgcccaatca gctgttgggc aatcacagaa ccccgcagtt ggtgagtgaa 720

attccagaga aggtaataca ggtggcgtgc ggtggcgagc ataccgttgt tctgaccgag 780

aatgcagtgt atacgtttgg gctcggtcaa ttcggacaac tcggactggg aaccttcctg 840

tttgaaacga gcgagcccaa agtgattgag aacataagag atcagacaat cagctatatc 900

tcttgcggcg aaaaccatac cgcactgatc acagatatcg gtctcatgta cacttttggc 960

gatgggcgcc atggaaaatt ggggctgggc ctggaaaatt tcactaatca cttcataccg 1020

actctgtgca gtaattttct tcgatttatt gtaaaacttg tggcatgtgg cggctgccac 1080

atggtcgttt tcgctgcacc acacaggggc gtcgctaaag aaattgaatt tgacgagatc 1140

aacgacacct gtctttccgt ggcgacattc cttccctact caagcctcac atctggaaat 1200

gtgctccaga ggacactctc agctcgaatg agacgcaggg aaagagagcg aagcccagac 1260

agcttttcta tgagacgcac acttcctccc atcgagggga ctttgggact tagtgcttgt 1320

tttctgccta attctgtctt tccgagatgt agcgagagga acctccagga atccgtgttg 1380

tccgagcagg atctgatgca gccagaagag cctgattacc tgctcgatga gatgactaag 1440

gaggctgaga tcgataatag ttccaccgtg gaatccctcg gcgagaccac tgacattctc 1500

aatatgacac atatcatgtc cctgaactcc aatgaaaagt cactgaagct ctctccagtg 1560

caaaaacaga agaagcagca gacaatcgga gagctgactc aagacaccgc cctgacagaa 1620

aatgacgaca gcgacgaata cgaagagatg tcagagatga aggagggcaa ggcatgtaaa 1680

cagcacgtct cccagggcat cttcatgaca cagccagcca ccactatcga ggctttcagt 1740

gatgaagagg tggaaatccc tgaggaaaag gagggggctg aggactccaa ggggaatggg 1800

attgaggagc aggaggttga ggcaaacgaa gaaaacgtta aggtccatgg gggcagaaag 1860

gagaaaactg agattctttc agatgacctg actgataagg ctgaggtttc cgagggaaaa 1920

gccaaaagcg taggggaggc tgaggatggc cccgaaggaa gaggtgatgg cacatgtgaa 1980

gagggcagca gtggtgccga acactggcag gacgaggaga gagagaaggg ggaaaaggat 2040

aaggggcgcg gagagatgga aagacctgga gaaggggaga aggaactcgc cgaaaaggaa 2100

gagtggaaaa agcgggatgg agaagagcag gaacaaaagg aaagggagca gggacaccag 2160

aaggagcgaa atcaggaaat ggaagagggt ggtgaagagg agcacggaga gggtgaggaa 2220

gaagaaggcg atagggaaga ggaagaggag aaagaaggcg aggggaaaga ggagggagaa 2280

ggggaggagg ttgaagggga gagggaaaag gaggagggcg aaagaaagaa agaagagcgg 2340

gctggcaaag aggaaaaagg cgaagaagaa ggagatcagg gcgaagggga ggaggaagag 2400

actgagggca gaggggagga gaaggaggaa gggggtgaag tggaaggggg agaggttgaa 2460

gagggcaagg gcgagcggga agaggaagaa gaggagggag aaggagaaga ggaagagggg 2520

gagggagaag aagaagaagg cgaaggggaa gaagaagaag gggaaggtaa gggtgaagag 2580

gaaggcgagg agggggaagg cgaagaggaa ggagaagagg gtgaaggtga aggcgaagaa 2640

gaagaaggtg aaggagaggg cgaggaagaa ggagagggcg aaggcgaaga agaagagggc 2700

gaaggagagg gggaggaaga gggagagggg gaaggagagg aggaggaggg agaaggtaag 2760

ggagaagagg aaggtgaaga aggcgaggga gagggggaag aagaagaggg ggaaggagaa 2820

ggggaagatg gcgagggcga aggagaggaa gaagaagggg aatgggaagg agaagaagag 2880

gaaggagaag gtgaaggtga agaggaaggt gagggggaag gagaagaggg cgaaggtgag 2940

ggcgaagaag aagagggtga gggagaagga gaggaagagg aaggggaaga agaaggcgaa 3000

gaggaaggtg aaggcgagga agagggcgaa ggggaaggtg aagaagaaga agaaggggag 3060

gttgagggag aagttgaggg cgaagaggga gaaggggaag gagaagagga agaaggagaa 3120

gaggaaggag aagaacggga aaaggaaggc gagggggagg aaaataggcg aaatagggag 3180

gaggaagaag aggaggaggg taagtatcag gagactggcg aggaagaaaa cgaaaggcag 3240

gacggcgaag agtacaaaaa agtgagtaaa attaaaggct ccgtgaagta cggtaaacat 3300

aagacctacc agaaaaagtc cgttacaaat acacaaggta acggcaagga acagcgatct 3360

aagatgcccg tccagtcaaa acgactcctg aagaatgggc ctagtgggag caaaaaattc 3420

tggaataatg tcctccctca ctatctggaa ctcaag 3456

<210> 2

<211> 3456

<212> DNA

<213> 人类(homo sapiens )

<400> 2

atgagggagc cggaagagct gatgcccgat tcgggtgctg tgtttacatt tgggaaaagt 60

aaatttgctg aaaataatcc cggtaaattc tggtttaaaa atgatgtccc tgtacatctt 120

tcatgtggag atgaacattc tgctgttgtt accggaaata ataaacttta catgtttggc 180

agtaacaact ggggtcagtt aggattagga tcaaagtcag ccatcagcaa gccaacatgt 240

gtcaaagctc taaaacctga aaaagtgaaa ttagctgcct gtggaaggaa ccacaccctg 300

gtgtcaacag aaggaggcaa tgtatatgca actggtggaa ataatgaagg acagttgggg 360

cttggtgaca ccgaagaaag aaacactttt catgtaatta gcttttttac atccgagcat 420

aagattaagc agctgtctgc tggatctaat acttcagctg ccctaactga ggatggaaga 480

ctttttatgt ggggtgacaa ttccgaaggg caaattggtt taaaaaatgt aagtaatgtc 540

tgtgtccctc agcaagtgac cattgggaaa cctgtctcct ggatctcttg tggatattac 600

cattcagctt ttgtaacaac agatggtgag ctatatgtgt ttggagaacc tgagaatggg 660

aagttaggtc ttcccaatca gctcctgggc aatcacagaa caccccagct ggtgtctgaa 720

attccggaga aggtgatcca agtagcctgt ggtggagagc atactgtggt tctcacggag 780

aatgctgtgt atacctttgg gctgggacaa tttggtcagc tgggtcttgg cacttttctt 840

tttgaaactt cagaacccaa agtcattgag aatattaggg atcaaacaat aagttatatt 900

tcttgtggag aaaatcacac agctttgata acagatatcg gccttatgta tacttttgga 960

gatggtcgcc acggaaaatt aggacttgga ctggagaatt ttaccaatca cttcattcct 1020

actttgtgct ctaatttttt gaggtttata gttaaattgg ttgcttgtgg tggatgtcac 1080

atggtagttt ttgctgctcc tcatcgtggt gtggcaaaag aaattgaatt cgatgaaata 1140

aatgatactt gcttatctgt ggcgactttt ctgccgtata gcagtttaac ctcaggaaat 1200

gtactgcaga ggactctatc agcacgtatg cggcgaagag agagggagag gtctccagat 1260

tctttttcaa tgaggagaac actacctcca atagaaggga ctcttggcct ttctgcttgt 1320

tttctcccca attcagtctt tccacgatgt tctgagagaa acctccaaga gagtgtctta 1380

tctgaacagg acctcatgca gccagaggaa ccagattatt tgctagatga aatgaccaaa 1440

gaagcagaga tagataattc ttcaactgta gaaagccttg gagaaactac tgatatctta 1500

aacatgacac acatcatgag cctgaattcc aatgaaaagt cattaaaatt atcaccagtt 1560

cagaaacaaa agaaacaaca aacaattggg gaactgacgc aggatacagc tcttactgaa 1620

aacgatgata gtgatgaata tgaagaaatg tcagaaatga aagaagggaa agcatgtaaa 1680

caacatgtgt cacaagggat tttcatgacg cagccagcta cgactatcga agcattttca 1740

gatgaggaag tagagatccc agaggagaag gaaggagcag aggattcaaa aggaaatgga 1800

atagaggagc aagaggtaga agcaaatgag gaaaatgtga aggtgcatgg aggaagaaag 1860

gagaaaacag agatcctatc agatgacctt acagacaaag cagaggtgag tgaaggcaag 1920

gcaaaatcag tgggagaagc agaggatggg cctgaaggta gaggggatgg aacctgtgag 1980

gaaggtagtt caggagcaga acactggcaa gatgaggaga gggagaaggg ggagaaagac 2040

aagggtagag gagaaatgga gaggccagga gagggagaga aggaactagc agagaaggaa 2100

gaatggaaga agagggatgg ggaagagcag gagcaaaagg agagggagca gggccatcag 2160

aaggaaagaa accaagagat ggaggaggga ggggaggagg agcatggaga aggagaagaa 2220

gaggagggag acagagaaga ggaagaagag aaggagggag aagggaaaga ggaaggagaa 2280

ggggaagaag tggagggaga acgtgaaaag gaggaaggag agaggaaaaa ggaggaaaga 2340

gcggggaagg aggagaaagg agaggaagaa ggagaccaag gagaggggga agaggaggaa 2400

acagagggga gaggggagga aaaagaggag ggaggggaag tagagggagg ggaagtagag 2460

gaggggaaag gagagaggga agaggaagag gaggagggtg agggggaaga ggaggaaggg 2520

gagggggaag aggaggaagg ggagggggaa gaggaggaag gagaagggaa aggggaggaa 2580

gaaggggaag aaggagaagg ggaggaagaa ggggaggaag gagaagggga gggggaagag 2640

gaggaaggag aaggggaggg agaagaggaa ggagaagggg agggagaaga ggaggaagga 2700

gaaggggagg gagaagagga aggagaaggg gagggagaag aggaggaagg agaagggaaa 2760

ggggaggagg aaggagagga aggagaaggg gagggggaag aggaggaagg agaaggggaa 2820

ggggaggatg gagaagggga gggggaagag gaggaaggag aatgggaggg ggaagaggag 2880

gaaggagaag gggaggggga agaggaagga gaaggggaag gggaggaagg agaaggggag 2940

ggggaagagg aggaaggaga aggggagggg gaagaggagg aaggggaaga agaaggggag 3000

gaagaaggag agggagagga agaaggggag ggagaagggg aggaagaaga ggaaggggaa 3060

gtggaagggg aggtggaagg ggaggaagga gagggggaag gagaggaaga ggaaggagag 3120

gaggaaggag aagaaaggga aaaggagggg gaaggagaag aaaacaggag gaacagagaa 3180

gaggaggagg aagaagaggg gaagtatcag gagacaggcg aagaagagaa tgaaaggcag 3240

gatggagagg agtacaaaaa agtgagcaaa ataaaaggat ctgtgaaata tggcaaacat 3300

aaaacatatc aaaaaaagtc agttactaac acacagggaa atgggaaaga gcagaggtcc 3360

aaaatgccag tccagtcaaa acgactttta aaaaacgggc catcaggttc caaaaagttc 3420

tggaataatg tattaccaca ttacttggaa ttgaag 3456

<210> 3

<211> 3456

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgagggagc ccgaggagct gatgccagac tctggggcag tgttcacctt cggtaagagt 60

aagtttgctg aaaacaatcc cggaaagttc tggtttaaaa acgacgtacc cgttcatttg 120

tcttgcggag atgagcacag cgctgtagta acaggcaata acaagttgta tatgtttgga 180

agcaataatt ggggccaact tgggctggga agtaaatccg caatttctaa gcctacttgc 240

gtaaaagcat tgaagccgga aaaagtaaaa cttgcggcgt gcgggcgcaa tcacactctc 300

gtctccacag agggtggaaa tgtatatgca accggaggga ataacgaggg ccagctgggc 360

cttggcgata cagaagagcg aaataccttt catgtaatat ctttttttac ctccgaacat 420

aagatcaagc agctctctgc cggcagcaac acatccgctg cactcacaga ggacggtcga 480

ctcttcatgt ggggggacaa ttccgaaggg cagatagggc tcaagaatgt atcaaacgtg 540

tgtgtaccgc agcaggttac tatcggcaag cccgtgtctt ggatcagctg cggctattac 600

catagcgctt tcgtaactac ggatggagag ctctatgtat ttggcgaacc tgaaaatggc 660

aaactcggcc tccctaacca gttgctgggc aatcatagaa cccctcaatt ggtcagcgaa 720

ataccagaaa aagtaattca ggtagcgtgc ggtggggaac atacagtggt acttacggaa 780

aacgctgtat acacttttgg gcttggacag ttcggtcaac tgggacttgg gacatttctt 840

tttgaaacgt cagagcccaa ggttattgag aatatacggg accaaacaat atcttacatc 900

agttgcggag aaaaccatac ggctctgatt actgatatcg gtctgatgta taccttcggg 960

gatggcaggc acggaaaact cggattgggt ctggagaact tcaccaacca cttcattcct 1020

accttgtgca gcaatttcct ccggttcatc gtaaaactcg tcgcttgtgg cggatgccat 1080

atggttgtat tcgccgctcc ccatcgaggt gtggctaaag aaattgagtt tgacgaaata 1140

aacgatacat gtctttctgt tgcgaccttc ctcccgtatt ctagtttgac gagtggtaac 1200

gtgctccaaa gaacgttgtc agcaagaatg agacgacgag agcgcgaaag atccccagat 1260

tcattctcaa tgcggaggac actcccgcca attgaaggaa cacttgggct ctccgcatgc 1320

tttcttccaa atagcgtctt tccacgatgc tcagagagga acctccaaga aagtgttctc 1380

agcgagcaag accttatgca accagaggaa cctgattatc tgcttgatga aatgactaag 1440

gaggcggaga ttgacaattc tagcaccgta gagtccttgg gcgagacaac cgacatcctt 1500

aatatgaccc atataatgtc actgaactca aacgaaaagt cactgaagct gtcccctgta 1560

caaaagcaaa agaaacaaca gacaatcggg gaactcactc aagacacggc attgactgag 1620

aacgacgatt ctgatgagta cgaagagatg tccgaaatga aggagggaaa agcatgtaag 1680

cagcacgtgt cacaaggtat ctttatgacc caaccagcga ccactattga agccttttca 1740

gatgaggagg tcgagatacc agaggagaaa gagggtgcag aggatagtaa gggtaacggg 1800

atcgaggagc aggaggtaga agcaaatgaa gaaaatgtaa aggtgcatgg cggtcggaaa 1860

gagaaaacag aaatccttag tgacgacttg accgataaag ccgaagttag cgagggcaaa 1920

gcgaaatcag tcggtgaggc ggaggacggt ccggaagggc ggggagacgg tacttgcgag 1980

gaagggtcca gtggtgccga gcattggcaa gatgaagaac gagagaaagg cgagaaagat 2040

aaagggagag gagaaatgga gagaccgggg gaaggggaga aagaactcgc agaaaaagaa 2100

gaatggaaaa aaagagatgg tgaagagcaa gaacaaaaag agagggagca aggtcaccag 2160

aaagagcgaa atcaagagat ggaagagggg ggtgaagaag aacatgggga aggagaggaa 2220

gaagaagggg accgcgagga ggaagaagaa aaagaagggg agggcaaaga ggagggcgag 2280

ggcgaggagg tagaaggaga gcgcgagaaa gaagagggtg agcgaaagaa ggaagagcgg 2340

gccggcaaag aagagaaggg cgaggaagaa ggagatcagg gcgaaggcga ggaagaggag 2400

accgagggaa gaggcgagga aaaggaggaa gggggagaag tcgaaggcgg agaagtagaa 2460

gaggggaaag gggagcgaga ggaagaagaa gaagaagggg agggagaaga agaagaaggt 2520

gagggtgagg aagaggaagg ggaaggcgaa gaagaagagg gggaaggaaa gggggaagag 2580

gagggcgaag aaggcgaagg tgaagaagag ggagaagagg gcgaggggga gggcgaggag 2640

gaggaggggg aaggcgaggg agaggaggag ggggagggcg agggggagga ggaagaagga 2700

gagggtgaag gcgaggaaga gggcgagggc gaaggcgaag aagaagaagg ggaaggaaaa 2760

ggagaagaag aaggggagga aggggagggt gagggggagg aagaggaagg ggaaggggag 2820

ggtgaggatg gtgagggaga gggagaagaa gaagagggag aatgggaagg cgaagaggag 2880

gagggggaag gagaaggcga agaagaagga gagggtgagg gagaagaggg cgaaggggag 2940

ggtgaggagg aagagggcga gggagaagga gaggaagagg aaggggagga agagggagaa 3000

gaagaaggtg agggggaaga ggaaggtgaa ggggagggcg aggaggagga agagggcgaa 3060

gttgagggcg aggtagaggg tgaagaaggt gagggtgagg gtgaagagga ggaaggtgaa 3120

gaagaagggg aagaaagaga aaaagaggga gaaggggagg aaaacaggcg caatagggag 3180

gaagaagagg aggaggaagg taagtatcag gagactggcg aagaagagaa tgagagacaa 3240

gatggtgagg agtacaaaaa agtatctaag attaaggggt cagttaagta cgggaagcac 3300

aagacctacc agaagaaatc cgtcaccaac actcaaggta atggcaagga gcaacgctca 3360

aagatgccgg tccaaagtaa gcggctgctc aaaaacgggc cgtcaggttc taagaagttc 3420

tggaacaatg tccttccgca ctacttggaa ctgaag 3456

<210> 4

<211> 292

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gggccccaga agcctggtgg ttgtttgtcc ttctcagggg aaaagtgagg cggccccttg 60

gaggaagggg ccgggcagaa tgatctaatc ggattccaag cagctcaggg gattgtcttt 120

ttctagcacc ttcttgccac tcctaagcgt cctccgtgac cccggctggg atttcgcctg 180

gtgctgtgtc agccccggtc tcccaggggc ttcccagtgg tccccaggaa ccctcgacag 240

ggcccggtct ctctcgtcca gcaagggcag ggacgggcca caggccaagg gc 292

<210> 5

<211> 97

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtaagtttag tctttttgtc ttttatttca ggtcccggat ccggtggtgg tgcaaatcaa 60

agaactgctc ctcagtggat gttgccttta cttctag 97

Claims (15)

1.编码RPGR的核酸，包括I)～IV)中至少一种：

I)、具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的核酸；

II)、在I)所述的片段中取代、缺失或添加一个或多个核苷酸的核酸；

III)、与I)所述核酸的序列至少具有90％的同源性，且编码RPGR的核酸；

IV)、与I)～III)中任一项部分互补或完全互补的核酸。

2.根据权利要求1所述的核酸，其特征在于，其序列如SEQ ID NO:1所示。

3.重组载体，其包括骨架载体和权利要求1所述的核酸。

4.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，其为病毒载体；

所述病毒载体选自慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体中至少一种；其中，腺相关病毒载体的血清型为AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV2.7M8或AAV2-TYF突变型。

5.根据权利要求3或4所述的重组载体，其特征在于，其骨架载体上含有RK1启动子和/或SV40内含子。

6.一种质粒组合，其特征在于，包括权利要求3～5任一项所述的重组载体、辅助功能质粒和附属功能质粒。

7.根据权利要求6所述的质粒组合，其特征在于，所述辅助功能质粒为pAdHelper；所述附属功能质粒为pAAV-r2c5。

8.表达RPGR的腺相关病毒的制备方法，其包括：将权利要求6所述的质粒组合转染宿主细胞，经纯化获得RPGR的腺相关病毒。

9.权利要求8所述制备方法制备获得的表达RPGR的腺相关病毒。

10.权利要求3～5任一项所述的重组载体，或权利要求6或7所述的质粒组合、或权利要求9所述的腺相关病毒在制备防治眼部疾病的药物中的应用。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述眼部疾病为视网膜色素变性。

12.根据权利要10或11所述的应用，其特征在于，所述防治包括修复视网膜结构，提高视细胞数量和/或改善眼部功能。

13.一种药物，其特征在于，包括权利要求3～5任一项所述的重组载体，或权利要求6或7所述的质粒组合、或权利要求9所述的腺相关病毒。

14.根据权利要求13所述的药物，其特征在于，其剂型为注射液剂，其中权利要求10所述的腺相关病毒的滴度为1×10¹³vg/mL。

15.根据权利要求13或14所述的药物，其特征在于，其给药方式包括视网膜下注射、玻璃体腔注射、前房注射或者结膜下注射。