CN113383082A - 包含α疱疹病毒启动子序列的重组核酸 - Google Patents

Abstract

提供了用于在宿主细胞中表达靶基因的重组核酸(例如载体)及相关方法。所述重组核酸包含：含有与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的序列具有至少70％序列同一性的核酸序列的启动子；用于插入编码靶基因的核酸的克隆位点；和至少一个在宿主细胞中表达靶基因所需的非启动子调控元件。

Description

包含α疱疹病毒启动子序列的重组核酸

相关申请

本申请要求2019年2月5日提交的美国临时申请号62/801,524和2019年12月19日提交的美国临时申请号62/950,848的权益，前述申请的全部内容通过引用并入本文。

背景技术

病毒感染其宿主细胞，并将其遗传物质作为宿主复制周期的部分引入宿主的细胞中。这种遗传物质包含用于通过劫持人体正常生产机构以满足病毒需求来生产这些病毒的更多拷贝的基础“指令”。宿主细胞将执行这些指令并产生病毒的额外拷贝，从而导致越来越多的宿主细胞被感染。因此，病毒可被用作携带可提供治疗益处的基因到细胞中的载体。

发明内容

在一个方面，本发明提供了一种在宿主细胞中表达靶基因的重组载体，其包含：启动子，所述启动子包含与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4中的序列具有至少70％序列同一性的核酸序列；克隆位点，所述克隆位点用于插入编码靶基因的核酸；和至少一个在宿主细胞中表达靶基因所需的非启动子调控元件。

在另一个方面，本发明提供了一种在宿主细胞中表达靶基因的重组载体，其包含：启动子，所述启动子包含与选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8中的序列具有至少70％序列同一性的核酸序列；克隆位点，所述克隆位点用于插入编码靶基因的核酸；和至少一个在宿主细胞中表达靶基因所需的非启动子调控元件。

在另一个方面，本发明提供了一种在宿主细胞中表达靶基因的重组载体，其包含：启动子，所述启动子包含与SEQ ID NO：9具有至少70％序列同一性的核酸序列；克隆位点，所述克隆位点用于插入编码靶基因的核酸；和至少一个在宿主细胞中表达靶基因所需的非启动子调控元件。

在一些实施方案中，所述至少一个非启动子调控元件包括增强子元件。在一些实施方案中，所述至少一个非启动子调控元件包括诱导物元件(inducer element)。

在一些实施方案中，所述重组载体进一步包含选择标记元件。

在一些实施方案中，所述载体是病毒载体。在某些实施方案中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。

在一些实施方案中，所述载体是非病毒载体。

在一些实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是神经元细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是非神经元细胞(例如肝细胞、肾细胞、视网膜细胞)。

在另一个方面，本发明提供了包含本文所述的重组载体的宿主细胞。

在一个方面，本发明提供了重组多核苷酸分子，其包含与选自SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的序列具有至少70％序列同一性的核酸序列的启动子。在另一个方面，本发明提供了包含编码靶基因的核酸的重组多核苷酸分子，其中所述核酸可操作地连接包含与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的序列具有至少70％序列同一性的核酸序列的启动子。

在另一个方面，本发明提供了重组多核苷酸分子，其包含与选自SEQ ID NO：5、SEQID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的序列具有至少70％序列同一性的核酸序列的启动子。在另一个方面，本发明提供了包含编码靶基因的核酸的重组多核苷酸分子，其中所述核酸可操作地连接包含与选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的序列具有至少70％序列同一性的核酸序列的启动子。

在另一个方面，本发明提供了重组多核苷酸分子，其包含与SEQ ID NO：9具有至少70％序列同一性的核酸序列的启动子。在另一个方面，本发明提供了包含编码靶基因的核酸的重组多核苷酸分子，其中所述核酸可操作地连接包含与SEQ ID NO：9具有至少70％序列同一性的核酸序列的启动子。

在另一个方面，本发明提供了一种重组多核苷酸分子，其包含用于插入编码靶基因的核酸的克隆位点，其中所述克隆位点可操作地连接包含与选自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的序列具有至少70％序列同一性的核酸的启动子。

在另一个方面，本发明提供了一种重组多核苷酸分子，其包含用于插入编码靶基因的核酸的克隆位点，其中所述克隆位点可操作地连接包含与选自SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的序列具有至少70％序列同一性的核酸的启动子。

在另一个方面，本发明提供了一种重组多核苷酸分子，其包含用于插入编码靶基因的核酸的克隆位点，其中所述克隆位点可操作地连接包含与SEQ ID NO：9具有至少70％序列同一性的核酸序列的启动子。

在另一个方面，本发明提供了一种在宿主细胞中表达靶基因的方法，包括：使宿主细胞与重组多核苷酸分子接触，使得所述重组核苷酸分子被引入宿主细胞中，其中所述重组多核苷酸分子包含编码所述靶基因的核酸，并且其中所述核酸可操作地连接包含与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的序列具有至少70％序列同一性的核酸序列的启动子，由此靶基因的表达在宿主细胞中发生。

在另一个方面，本发明提供了一种在宿主细胞中表达靶基因的方法，包括：使宿主细胞与重组多核苷酸分子接触，使得所述重组核苷酸分子被引入宿主细胞中，其中所述重组多核苷酸分子包含编码所述靶基因的核酸，并且其中所述核酸可操作地连接包含与选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的序列具有至少70％序列同一性的核酸序列的启动子，由此靶基因的表达在宿主细胞中发生。

在另一个方面，本发明提供了一种在宿主细胞中表达靶基因的方法，包括：使宿主细胞与重组多核苷酸分子接触，使得所述重组核苷酸分子被引入宿主细胞中，其中所述重组多核苷酸分子包含编码所述靶基因的核酸，并且其中所述核酸可操作地连接包含与SEQID NO：9具有至少70％序列同一性的核酸序列的启动子，由此靶基因的表达在宿主细胞中发生。

在一些实施方案中，所述重组多核苷酸分子在所述宿主细胞与所述重组多核苷酸接触时通过转导被引入所述宿主细胞中。在另一实施方案中，所述重组多核苷酸分子在所述宿主细胞与所述重组多核苷酸接触时通过转染被引入所述宿主细胞中。

本文公开的LAP序列的特征包括：i)相比于类似的启动子(例如EF1α、CAG、TH、CaMKIIa等)较小的尺寸。这在基因负载有限的AAV载体的情况下具有优势。ii)较不易受到转录的抑制的长期表达。本文公开的LAP序列实现转基因的长期、慢性转录，这对于其中可能需要在患者/宿主的生命周期中表达治疗性转基因的基因治疗尤其有用。

附图说明

本专利或申请文件包括至少一个彩色附图。含有彩色附图的本专利或专利申请公开文本的复印件在请申并支付必要费用后由专利局提供。

从以下对示例性实施方案更具体的描述中可明显看出前述内容，如附图所示，在附图中相似的参考字符指不同视角的相同部分。附图并非按比例绘制，而是重点在于说明实施方案。

图1A-1D描绘了PRV潜伏相关转录物启动子(LAPs)。图1A描绘902碱基对(bp)的PRVLAP的完整核苷酸序列、498bp的亚区域LAP1(加粗且下划线)、404bp的LAP2(下划线)和880bp的LAP1_2。LAP1_2包含了LAP1和LAP2序列的大部分，但缺少LAP1的前22个核苷酸。黑色方框描绘转录因子(TFs)的共有序列，包括：GC盒：特异性蛋白1和3(Sp1和Sp3)；CCAAT盒：核因子Y(NF-Y)；和TATA盒：TATA-结合蛋白(TBP)。彩色方框表示TFs的结合基序位点的坐标：1，绿色：SRY-盒(SOX10)；2，红色：cAMP响应元件结合蛋白(CREB)；3，蓝色：CCCTC-结合因子(CTCF)；4，棕色：少突细胞转录因子2(Olig2)；5，粉色：信号转导及转录激活子(STAT1)。图1B描绘被设计用于从LAP1、LAP2、LAP1_2及EF1α启动子转录mCherry荧光报告体的四种AAVs的质粒图谱。609bp的WPRE是土拨鼠肝炎病毒转录后增强子元件。所有AAVs均包含479bp人类生长激素(hGH polyA)聚腺苷化序列，且各自侧邻141bp的AAV2末端反向重复(ITRs)。载体被包装到AAV-PhP.eB血清型衣壳中。增强子-启动子元件及启动子序列的总尺寸为：AAV-LAP1：1.87Kb；AAV-LAP2：1.77Kb；AAV-LAP1_2：2.25Kb以及AAV-EF1α：2.63Kb。图1C描绘用于转导大鼠SCG神经元初代培养物以量化90天时间内的mCherry表达的四种AAVs。在3x10¹¹AAV基因组感染后3、5、7、9、11、14、17、21、24、28、31、34、38、41、45、49、52、59、67、73、82和90天(bpi)测量mCherry表达的相关荧光强度。比例尺＝100μm。数据表示为平均值±SEM；n＝每组3个SCG培养皿。图1D显示了通过LAP1-mCherry、LAP2-mCherry、LAP1_2-mCherry或EF1a-mCherry的AAV转导后第28天，SCG细胞体内AAV-驱动的mCherry表达。

图2A-2P显示了稳定且长期的LAP-介导的转基因表达。图2A是AAV施用的系统性途径和CNS组织处理的示意图。通过单侧注射入小鼠眼眶后窦进行AAV载体的静脉内施用(4x10¹¹vg/小鼠)。收集30dpi和190dpi的脑和脊髓。对脑的右半球进行处理用于iDISCO+组织透明(tissue clearing)和光片显微分析。对脑左半球进行50μm矢状切片以用于免疫荧光和共焦显微镜分析。对脊髓进行20μm横向切片用于免疫荧光和共焦显微镜分析。图2B-2P量化了30dpi和190dpi时，iDISCO+透明的组织样品中不同脑区域上每mm³的mCherry阳性细胞的密度。数据表示为平均值±SEM；n＝每组2只动物，每只动物5-10个500μm切片。将数据针对注射媒介的对照动物的数据标准化。显著性由Smdent’s t检验(如果仅比较两组)或单因素方差分析(ANOVA)之后Bonferroni事后检验(如果比较两组以上)确定。p值＜0.05具有统计学显著性(*p＜0.033；**p＜0.002；***p＜0.001)。

图3A-3J4显示了眼眶后注射后在整个大脑中全部三种AAV-LAP序列驱动广泛和长期的转基因表达通过量。矢状切片的代表性免疫荧光图像显示了190dpi时AAV-LAP1(图3A)、AAV-LAP2(图3B)、AAV-LAP1_2(图3C)和AAV-EF1α(图3D)的抗-mCherry染色(绿色)的全脑分布。Cx，皮层；Hip，海马结构；MRN，中脑网状核；Cb，小脑；Thal，丘脑；Pn，脑桥；Hypo，下丘脑；Str，纹状体；OB，嗅球。比例尺＝1毫米。代表性共焦图像显示了30dpi和190dpi时，皮层(图3E)、齿状回(图3F)、纹状体(图3G)和小脑(图3H)中的抗-mCherry信号(绿色)。所有图像均为堆叠共焦截面。比例尺＝100μm。图3I1-3I4量化了30dpi和190dpi时，由AAV-LAP序列和AAV-EF1α驱动的抗-mCherry信号在皮层、齿状回、纹状体和小脑中的间接荧光强度。图3J1-3J4量化了190dpi时通过免疫组织化学(IHC)在皮质、齿状回、纹状体和小脑中每像素²的表达mCherry信号的细胞数量。数据表示为平均值±SEM；n＝2只动物且每只动物6个组织切片。将数据针对注射媒介的对照动物的数据标准化。显著性由Student’s t检验(如果仅比较两组)或单因素方差分析(ANOVA)后Bonferroni事后检验(如果比较两组以上)确定。p值＜0.05具有统计学显著性(*p＜0.033；**p＜0.002；***p＜0.001)。

图4A-4E4显示了LAP2在脑中驱动稳定和长期的转基因表达。代表性共焦图像显示了30dpi和190dpi时皮层(图4A)、齿状回(图4B)、纹状体(图4C)和小脑(图4D)中AAV-LAP1、AAV-LAP2、AAV-LAP1_2和AAV-EF1α的天然mCherry荧光(红色)。所有图像为堆叠共焦截面。比例尺＝100μm。图4E1-4E4量化了在皮质、齿状回、纹状体和小脑中30dpi和190dpi时由AAV-LAP序列和AAV-EF1α驱动的天然mCherry信号的直接荧光强度。数据表示为平均值±SEM；n＝2只动物，且每只动物6个组织切片。将数据针对注射媒介的对照动物的数据标准化。显著性由Student’s t检验(如果仅比较两组)或单因素方差分析(ANOVA)后的Bonferroni事后检验(如果比较两组以上)确定。p值＜0.05具有统计学显著性(*p＜0.033；**p＜0.002；***p＜0.001)。

图5A-5E显示了在CNS中AAV-LAP2驱动长期转基因转录。在190dpi时利用对mCherry特异性的核糖探针(绿色)通过脑组织中的FISH验证mCherry mRNA的存在。利用DAPI复染色细胞核(蓝色)。图5A-5E分别显示了皮层、齿状回、纹状体、小脑和嗅球中AAV-LAP2或AAV-EF1α的20μm矢状脑切片。图面2和4分别描绘了图面1和3中所示区域(正方形)的较高放大倍数的图像。图像为堆叠共焦截面。比例尺＝100μm。

图6A-6F显示了AAV-LAP转基因表达主要在神经元而非少突细胞中。30dpi时皮层或齿状回中的神经元(图6A和图6B：绿色标记用于泛神经元标志物NeuN)或少突细胞(图6C和图6D：绿色标记用于少突细胞标志物Olig2)中AAV介导的mCherry表达(红色)的代表性共焦图像。用DAPI复染细胞(蓝色)。NeuN信号可定位于神经元胞核以及胞质，而Olig2信号的染色主要为细胞核。箭头表示细胞标志物和mCherry之间的共同标记。比例尺＝100μm。图6E和6F量化了对于每个启动子在皮层(Cx)或齿状回(DG)中对应于神经元(NeuN-阳性)或少突细胞(Olig2-阳性)的mCherry标记细胞的百分比。图像为堆叠共焦截面。数据表示为平均值±SEM；n＝2只动物，且每只动物6个组织切片。

图7A-7D显示了小胶质细胞和星形胶质细胞中未检测到AAV-LAP转基因表达。30dpi时皮层和齿状回中抗-mCherry信号(红色)、小胶质细胞(图7A和7B：绿色，标记为Ibal-阳性)、星形胶质细胞(图7C和7D：绿色，标记为S100阳性)的代表性共焦免疫荧光图像。星形胶质细胞和小胶质细胞中mCherry之间共同标记的缺乏用星号(*)表示。用DAPI(蓝色)复染细胞。图像为堆叠共焦截面。比例尺＝100μm。

图8A-8F显示了LAP序列在脊髓中驱动广泛且长期的转基因表达。脊髓(腰区)以横向方式以20μm进行切片。190dpi时天然AAV介导的mCherry表达(红色，图面1和4)、泛神经元标志物NeuroTrace(绿色，图面2和5)及AAV-LAP1、AAV-LAP2、AAV-LAP1_2和AAV-EF1α的合并信号(黄色，图面3和6)的代表性共焦图像。图像为堆叠共焦截面。DH：背角；VH：腹角。较高放大倍数的图像见图面4-6。比例尺＝100μm。

图9A-9C显示了LAP序列在猪肾细胞中驱动高效的转基因表达。包含由LAP1(图9A)、LAP2(图9B)或LAP1_2(图9C)驱动的mCherry的报告质粒转染48小时后的PK15细胞的代表性图像。图面1：亮场；图面2：荧光；图面3：合并。比例尺＝50μm。

图10A和10B显示了LAP2在人肾细胞中驱动高效的转基因表达。包含由LAP2(图10A)或EF1α-启动子(图10B)驱动的mCherry的报告质粒转染后48小时的HEK-293细胞的代表性图像。图面1：亮场；图面2：荧光；图面3：合并。比例尺＝50μm。

图11A和图11B显示了LAP2驱动在人肝细胞中高效的转基因表达。包含由LAP2(图11A)或EF1α-启动子驱动的mCherry的报告质粒转染后48小时的HepG2细胞的代表性图像(图11B)。图面1：亮场；图面2：荧光；图面3：合并。比例尺＝50μm。

图12A1-12B4显示了在整个肝脏中LAP2驱动长期转基因表达。通过单侧注射入小鼠眼眶后窦(4x10¹¹vg/小鼠)中进行AAV-LAP2(图12A1-12A4)或AAV-EF1α-载体(图12B1-12B4)的静脉内施用。190dpi时收集肝脏，并以20μm纵向切片用于IHC和共焦显微镜分析。天然mCherry荧光(图12A1和12B1：红色)、抗mCherry免疫染色(图12A2和12B2：绿色)、DAPI核复染色(图12A3和12B3：蓝色)及合并的免疫荧光和DAPI图像(图12A4和12B4)的代表性共焦图像。CV：中央静脉。比例尺＝75μm。

图13A1-13B4显示了在小鼠肾脏中LAP2驱动长期转基因表达。通过单侧注射入小鼠眼眶后窦(4x10¹¹vg/小鼠)中进行AAV-LAP2(图13A1-13A4)或AAV-EF1α-载体(图13B1-13B4)的静脉内施用。190dpi时收集肾脏，并以20μm纵向切片用于IHC和共焦显微分析。天然mCherry荧光(图13A1和13B1：红色)、抗mCherry免疫染色(图13A2和13B2：绿色)、DAPI核复染色(图13A3和13B3：蓝色)及合并的免疫荧光和DAPI图像(图13A4和13B4)的代表性共焦图像。AV：弓状血管。比例尺＝75μm。

图14A1-14B4显示了在小鼠视网膜中LAP2驱动长期转基因表达。通过单侧注射入小鼠眼眶后窦(4x10¹¹vg/小鼠)中进行AAV-LAP2(图14A1-14A4)或AAV-EF1α-载体(图14B1-14B4)的静脉内施用。190dpi时收集视网膜，并以20μm横向冷冻切片用于IHC和共焦显微分析。代表性共焦图像显示天然mCherry荧光(图14A1和14B1：红色)、抗mCherry免疫染色(图14A2和14B2：绿色)、DAPI核复染(图14A3和14B3：蓝色)及合并的免疫荧光和DAPI图像(图14A4和14B4)。GCL：神经节细胞层；INL：内核层；ONL：外核层。比例尺＝75μm。

具体实施方式

示例实施方案的描述如下。

本发明的几个方面参考仅用于说明目的示例如下所述。应当理解的是，描述大量具体细节、关系和方法是为了提供对本发明的全面理解。然而，本领域技术人员将容易认识到，本发明可以在没有一个或多个具体细节的情况下实施，或通过其他方法、实验方案、试剂、细胞系和动物实施。本发明不限于本文公开的动作或事件的顺序，因为一些动作可依照不同顺序发生和/或与其他动作或事件同时发生。此外，并不是全部说明的动作、步骤或事件是实施根据本发明的方法所需要的。本领域技术人员使用常规方法能够很好地理解并通常应用本文所描述或引用的许多技术或程序。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号和其他科学术语或术语是指本发明所属技术领域的技术人员通常理解的含义。在某些情况下，为了清楚和/或便于参考，本文定义了具有通常理解的含义的术语，本文中包括这些定义不一定被解释为与本领域一般理解的存在实质性区别。还应理解，术语(例如那些常用字典中定义的术语)应当被解释为具有与其在相关领域情况中一致的含义和/或本文另外所定义的含义。

本文所使用的术语仅以描述特定实施方案为目的，并不旨在进行限制。如本文所用，除非上下文另有明确说明，不定冠词“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”应理解为包括复数形式。

如本文所用，“克隆位点”指载体中的短核苷酸片段，其包含一个或多个允许核苷酸“靶基因”或“目的基因”插入载体中的独特的限制性位点。

如本文所用，“启动子”指RNA聚合酶与其结合并启动转录(例如基因的转录)的DNA区域。

如本文所用，“非启动子调控元件”指能够增加或减少重组载体内特定基因的表达的核酸分子的非启动子序列。这种非启动子调控元件包括但不限于，例如增强子元件、诱导物元件、沉默子元件、5’非翻译区(UTRs)、3’UTRs、终止子元件、CAAT盒、CCAAT盒、Pribnow盒、SECIS元件、聚腺苷酸化信号、A-盒、Z-盒、C-盒、E-盒、G-盒和Cis-调控元件。

如本文所用，短语“可操作地连接”指核酸以在与其所连接的元件(例如启动子)的控制下能够表达核酸的方式定位于重组多核苷酸(例如载体)中。

如本文所用，“选择标记元件”是赋予适合人工选择的属性的元件。可用于本发明的选择标记元件的示例包括但不限于β-内酰胺酶、新霉素抗性基因、赋予三氯生抗性的突变Fabl基因、URA3元件、荧光基因产物、亲和性标签(例如GST、His、CBP、MBP)以及表位标签(例如Myc HA、FLAG)。选择标记元件可以是阴性或阳性选择标记。

在各个实施方案中，本发明提供了载体，如病毒载体(例如，腺相关病毒载体(AAV))，其包含尺寸较小但仍能够提供目的基因的持久转录的启动子序列。所述启动子序列的尺寸小于许多常用启动子，并且可以在大部分组织和细胞类型中(例如在哺乳动物中)驱动转基因转录。本文公开的启动子序列不易发生阻抑或失活，使其特别适用于需要治疗性转基因长期表达的基因治疗。

在一个方面，本发明提供了表达目的基因的基因递送载体。在一些实施方案中，基因递送载体包含源自α疱疹病毒基因组的基因组区域(例如源自伪狂犬病毒)的启动子。在一些实施方案中，启动子包括源自α疱疹病毒基因组的潜伏相关启动子(LAP)区域。

在特定实施方案中，本发明的载体中使用的LAP区域选自SEQ ID NO：1(本文中也称为LAP1)、SEQ ID NO：2(本文中也称为LAP2)、SEQ ID NO：3(本文中也称为LAP1_2)和SEQID NO：4(表1)。LAP1_2(880bp)包含LAP1(498bp)的476-bp序列和完整的LAP2序列(404bp)，即LAP1和LAP2串联，但缺少LAP1序列的前22bp。SEQ ID NO：4(902bp)包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的完整序列，且比SEQ ID NO：3长22bp。

在一些实施方案中，启动子包含与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，启动子包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的核酸序列。

不希望受理论束缚，据信来自α疱疹病毒基因组的LAP区域的某些活性部分或片段可以驱动转基因在多种细胞和组织类型中的表达。在一些实施方案中，本发明所使用的启动子包含与SEQ ID NO：9(表1)具有至少70％序列同一性的核酸序列。SEQ ID NO：9由LAP2的232-bp“核心”序列组成，且包含TATA盒序列。在一些实施方案中，启动子包含与SEQ IDNO：9具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，启动子包含SEQ ID NO：9。

不希望受理论束缚，进一步包含SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和/或SEQ ID NO：12(表1)的LAP序列可能具有改善的转录性能。因此，在一些实施方案中，启动子进一步包含SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或其组合，例如在SEQ ID NO：9的5’或3’处。SEQ ID NO：10(“CTCF”基序)已被证明参与了疱疹病毒基因表达的表观遗传调节、染色质重塑以及转录因子和蛋白质的募集(Lang等人，2017；Lee等人，2018)。SEQ ID NO：11(“具有上游稳定剂的可选CTCF(alternative CTCF with upstream stabilizer)”基序)已被证实稳定可选CTCF基序并促进另外四个锌指结构域的结合(Zimmerman等人，2018)。SEQ ID NO：12(“核转录因子Y(NF-Y)”基序)被与位于几种真核细胞的启动子区域中的CAAT盒结合的转录因子识别(Chikhirzhina等人，2008；Fleming等人，2013)。

在一些实施方案中，所述启动子包含与选自SEQ ID NO：13-58(表1)的核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，启动子包含选自SEQ IDNO：13-58的核酸序列。

本文公开的包含LAP序列的载体可被用于基因递送(例如在哺乳动物(例如人)中)及基础和翻译研究。宿主细胞可以是培养细胞(即体外)或位于受试者体内(例如动物模型中(即体内))。

在一些实施方案中，载体是慢病毒基因递送载体、反转录病毒基因递送载体或腺病毒基因递送载体。本文公开的LAP序列的一个优势在于，相比于病毒载体中其他常用启动子，它们具有相对较小的尺寸，但仍可以在不同细胞类型中维持持久的转录。

相对较小的LAP区域可能是有利的，因为载体中的DNA有效负载容量非常有限。例如，AAV载体的包装容量或有效载荷限制于约5,000bp的最大大小。在一些实施方案中，本发明所述载体中所用的LAP区域的长度在约200bp至约410bp之间，例如长度为约220-410bp、约220-400bp、约240-400bp、约240-380bp、约260-380bp、约260-360bp、约280-360bp、约280-340bp、约300-340bp或约320-340bp。

在特定实施方案中，当培养的细胞、动物或人类中需要转基因的强且长期的表达时，可使用本发明的启动子序列。所述启动子可用于在具有基因组空间限制但需要持久的启动子转录活性的情况。AAVs尤其适用于人类基因治疗；因此，本发明的LAP序列提供了与AAVs一起使用时的基因治疗应用。

在一些实施方案中，目的基因在体外在本文提供的LAP序列的控制下表达至少约30天、约60天、约90天、约120天、约150天、约180天或约190天。在一些实施方案中，目的基因在体内(例如，在组织(如脑)中)在本文提供的LAP序列的控制下表达至少约30天、约60天、约90天、约120天、约150天、约180天或约190天。在一些实施方案中，目的基因离体(例如，在培养的细胞如神经元中)在本文提供的LAP序列的控制下表达至少约30天、约60天、约90天、约120天、约150天、约180天或约190天。

在一个方面，本发明提供了用于在宿主细胞中表达靶基因的重组载体，其包含：启动子，所述启动子包含与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的序列具有至少70％序列同一性的核酸序列；克隆位点，所述克隆位点用于插入编码靶基因的核酸；和至少一个在宿主细胞中表达靶基因所需的非启动子调控元件

在一些实施方案中，所述启动子包含与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：4的核酸序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，所述启动子包含选自SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的核酸序列。

本文所述的LAP序列可用于多种基因表达载体(例如质粒、细菌人工染色体(BAC)、粘粒或其他非病毒或病毒系统)中以表达转基因。

在一些实施方案中，载体是病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。本发明可使用的病毒载体的非限制性示例包括DNA或RNA病毒载体，其包括但不限于逆转录病毒载体、疱疹病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体、狂犬病毒载体、慢病毒性载体、VSV载体、牛痘病毒载体、呼肠孤病毒载体、塞姆利基森林病毒、黄热病病毒和辛德比斯病毒载体。

在一些实施方案中，载体是非病毒载体。非病毒载体可以是质粒DNA、脂质体-DNA复合物(脂质复合体(lipoplexes))和聚合物-DNA复合物(人工合成多聚物(polyplexes))。非病毒载体可以是质粒RNA、脂质体-RNA复合物(脂质复合体)和聚合物-RNA复合物(人工合成多聚物)。寡核苷酸及其类似物，无论是单独还是复合物，也可能是非病毒载体介导的基因转移构建体。

本文所提供的载体(例如病毒载体)可用于在动物模型和人类的器官或组织中表达治疗性转基因，例如，用于治疗获得性或遗传性疾病(例如神经系统疾病)的基因治疗。

本文公开的LAP序列源自伪狂犬病毒(PRV)的基因组。PRV是一种能够感染各种动物的α疱疹病毒。尽管天然宿主是成年猪，但PRV可以感染广泛的脊椎动物，包括牛、绵羊、狗、鸟、猫、山羊、浣熊、鸡、臭鼬、负鼠、豚鼠、马、兔、大鼠、小鼠和非人类灵长动物(Pomeranz等人，2005年)。据报道，培养的人类细胞也易感PRV病毒感染和在人类中的动物源性PRV感染(Wong等人，2019年)。

除能够感染多种不同动物种类外，PRV还是泛嗜性病毒。这意味着，被感染宿主的大部分组织和器官可能是PRV感染易感的且允许其复制(Blanchard等人，2006年；Boldogkoi等人，2000年；Fan等人，2019；Gasparini等人，2019年；Pomeranz等人，2005)。因此，LAP序列可潜在地用于多样细胞和组织类型中的基因治疗。

在另一个方面，本发明提供了一种包含本文所述重组载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞(例如神经元细胞)。在其他实施方案中，宿主细胞选自鸟细胞、鱼细胞、两栖动物细胞和爬行动物细胞。在一些实施方案中，宿主细胞包括体外神经元细胞、离体神经元细胞或二者。在一些实施方案中，宿主细胞是受试者的神经元细胞。在一些实施方案中，神经元细胞位于受试者的初级运动区、次级运动区、初级躯体感觉区、补充躯体感觉区、视觉区、海马结构、纹状体、苍白球、丘脑、下丘脑、中脑区、后脑、嗅觉区或其组合中。在一些实施方案中，中脑区包括运动相关区、感觉相关区或二者。在一些实施方案中，神经元细胞位于受试者的皮层、齿状回、纹状体、小脑、嗅球或其组合。在一些实施方案中，神经元细胞包括神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞或其组合。在一些实施方案中，神经元细胞包括神经元。

在一些实施方案中，宿主细胞选自膀胱细胞、血细胞、骨细胞、内皮细胞、上皮细胞、脂肪细胞、心脏细胞、肠细胞、胃细胞、肾细胞、肝细胞、肺细胞、肌肉细胞、胰腺细胞、视网膜细胞、性细胞、皮肤细胞、脾细胞、干细胞及其组合。在一些实施方案中，宿主细胞是癌细胞。

在另一个方面，本发明提供了包含编码靶基因的核酸的重组多核苷酸分子，其中所述核酸可操作地连接包含与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的序列具有至少70％序列同一性的核酸序列的启动子。在一些实施方案中，启动子包含与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的核酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，启动子包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：4的核酸序列。在一些实施方案中，编码靶基因的核酸包含超过约4kb。

在进一步的方面，本发明提供了一种重组多核苷酸分子，其包含用于插入编码靶基因的核酸的克隆位点，其中所述克隆位点可操作地连接包含与选自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的序列具有至少70％序列同一性的核酸的启动子。在一些实施方案中，启动子包含与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的核酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，启动子包含选自SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的核酸序列。

在另一个方面，本发明提供了一种用于在宿主细胞中表达靶基因的重组载体，其包含：启动子，所述启动子包含与选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ IDNO：8中的核酸序列具有至少70％序列同一性的核酸序列；用于插入编码靶基因的核酸的克隆位点；和至少一个在宿主细胞中表达靶基因所需的非启动子调控元件。SEQ ID NO：5包含马疱疹病毒的LAP序列；SEQ ID NO：6包含牛疱疹病毒的LAP序列；SEQ ID NO：7包含水痘带状疱疹病毒的LAP序列；和SEQ ID NO：8包含Macacine疱疹病毒1的LAP序列(表1)。在一些实施方案中，启动子包含与选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的核酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，启动子包含选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的核酸序列。

在另一个方面，本发明提供了包含编码靶基因的核酸的重组多核苷酸分子，其中所述核酸可操作地连接包含与选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的序列具有至少70％序列同一性的核酸序列的启动子。在一些实施方案中，启动子包含与选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的核酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，启动子包含选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：8的核酸序列。在一些实施方案中，编码靶基因的核酸包含超过约4kb。

在进一步的方面，本发明提供了一种重组多核苷酸分子，其包含用于插入编码靶基因的核酸的克隆位点，其中该克隆位点可操作地连接包含与选自SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的序列具有至少70％序列同一性的核酸的启动子。在一些实施方案中，启动子包含与选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的核酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，启动子包含选自SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的核酸序列。

在另一个方面，本发明提供了一种用于在宿主细胞中表达靶基因的重组载体，其包含：启动子，所述启动子包含与SEQ ID NO：9具有至少70％序列同一性的核酸序列的启动子；用于插入编码靶基因的核酸的克隆位点；以及在宿主细胞中表达目的基因所需的至少一种非启动子调控元件。在一些实施方案中，启动子包含与SEQ ID NO：9具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，启动子包含SEQ ID NO：9。在一些实施方案中，启动子进一步包含SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或其组合的核酸序列。在一些实施方案中，启动子包含与选自SEQ ID NO：13-58的核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，启动子包含选自SEQ ID NO：13-58的核酸序列。

在一些实施方案中，至少一种非启动子调控元件包括增强子元件。在一些实施方案中，至少一种非启动子调控元件包括诱导物元件。在一些实施方案中，重组载体进一步包含选择标记元件。

在另一个方面，本发明提供了包含编码靶基因的核酸的重组多核苷酸分子，其中所述核酸可操作地连接包含与SEQ ID NO：9具有至少70％序列同一性的核酸序列的启动子。在一些实施方案中，启动子包含与SEQ ID NO：9具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，启动子包含SEQ ID NO：9。在一些实施方案中，启动子进一步包含SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或其组合的核酸序列。在一些实施方案中，启动子包含与选自SEQ ID NO：13-58的核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，启动子包含选自SEQ ID NO：13-58的核酸序列。在一些实施方案中，编码靶基因的核酸包含超过约4kb。

在进一步的方面，本发明提供了一种重组多核苷酸分子，其包含用于插入编码靶基因的核酸的克隆位点，其中所述克隆位点可操作地连接包含与SEQ ID NO：9具有至少70％序列同一性的核酸序列的启动子。在一些实施方案中，启动子包含与SEQ ID NO：9具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，启动子包含SEQ ID NO：9。在一些实施方案中，启动子进一步包含SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或其组合的核酸序列。在一些实施方案中，启动子包含与选自SEQ ID NO：13-58的核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，启动子包含选自SEQ ID NO：13-58的核酸序列。

在另一个方面，本发明提供了在宿主细胞中表达靶基因的方法，包括：使宿主细胞与重组多核苷酸分子接触，使得所述重组核苷酸分子被引入宿主细胞中，其中所述重组多核苷酸分子包含编码靶基因的核酸，并且其中所述核酸可操作地连接包含与选自SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的序列具有至少70％序列同一性的核酸序列的启动子，由此靶基因的表达在宿主细胞中发生。在一些实施方案中，启动子包含与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的核酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，启动子包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：4的核酸序列。

在另一个方面，本发明提供了在宿主细胞中表达靶基因的方法，包括：使宿主细胞与重组多核苷酸分子接触，使得所述重组核苷酸分子被引入宿主细胞中，其中所述重组多核苷酸分子包含编码靶基因的核酸，并且其中所述核酸可操作地连接包含与选自SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的序列具有至少70％序列同一性的核酸序列的启动子，由此靶基因的表达在宿主细胞中发生。在一些实施方案中，启动子包含与选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的核酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，启动子包含选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：8的核酸序列。

在另一个方面，本发明提供了在宿主细胞中表达靶基因的方法，包括：使宿主细胞与重组多核苷酸分子接触，使得所述重组核苷酸分子被引入宿主细胞中，其中所述重组多核苷酸分子包含编码靶基因的核酸，并且其中所述核酸可操作地连接包含与SEQ ID NO：9具有至少70％序列同一性的核酸序列的启动子，由此靶基因的表达在宿主细胞中发生。在一些实施方案中，启动子包含与SEQ ID NO：9具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，启动子包含SEQ ID NO：9。在一些实施方案中，启动子进一步包含SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或其组合的核酸序列。在一些实施方案中，启动子包含与选自SEQ ID NO：13-58的核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，启动子包含选自SEQ ID NO：13-58的核酸序列。

在一些实施方案中，神经元细胞位于受试者的脊髓中。在一些实施方案中，神经元细胞位于脊髓的背角中。在一些实施方案中，神经元细胞位于腰脊髓、胸脊髓、颈脊髓或其组合中。

在一些实施方案中，重组多核苷酸分子在宿主细胞与所述重组多核苷酸接触时通过转导(例如通过病毒载体的感染)被引入所述宿主细胞中。在另一个实施方案中，重组多核苷酸分子在所述宿主细胞与所述重组多核苷酸接触时通过转染被引入所述宿主细胞中。在另一个实施方案中，重组多核苷酸分子在所述宿主细胞与所述重组多核苷酸接触时通过电穿孔被引入所述宿主细胞中。

重组腺相关病毒(AAV)载体是确定中枢神经系统(CNS)的连接性和功能的重要神经科学工具。此外，AAV被用作治疗遗传性和获得性CNS疾病的基因治疗载体。尽管具有安全性和广泛的向性，但仍有一些需要纠正的重要问题，例如有效负载能力有限，以及缺乏在CNS中提供长期的泛神经元转基因表达的小基因启动子。常用基因启动子相对较大，且在病毒CNS转导后几个月会受到阻抑，从而危及单剂量基因治疗应用的长期性能。

最近对重组AAVs的改进(包括衣壳工程和优化转基因表达的新型基因启动子)极大地改善了基因治疗应用(Mak，Rajapaksha等人，2017；Hudry和Vandenberghe，2019年；Ogden，Kelsic等人，2019)。鉴于AAV载体的安全性、血清型依赖性的广泛向性和转导效率，其在神经科学和临床应用中被广泛使用(Aschauer，Kreuz等人，2013；Samulski和Muzyczka，2014年；Mak，Rajapaksha等人，2017)。AAV-9变体PHP.eB(Chan，Jang等人，2017)是最近衣壳改进的一个示例，其在外周血管给药后，具有增强的渗透鼠血脑屏障(BBB)和在大脑和脊髓中广泛转导神经元的能力(Dayton，Grames等人，2018)。重组AAV的主要限制是其小衣壳而具有仅约4.9kb的有限有效负载容量(Russell和Hirata 1998)。因此，维持强且长期的转录的短启动子序列的发现对于扩展转基因有效负荷和实现一个病毒剂量的长期治疗效果至关重要。

几种强启动子，例如神经元特异性烯醇化酶(NSE，1800bp)(Peel，Zolotukhin等人1997；Delzor，Dufour等人2012)、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIα(CaMKIIa，1300bp)(Sohal，Zhang等人，2009年)和人延伸因子1α(EF1α，1264bp)(Sohal，Zhang等人，2009年；Qin，Zhang等人，2010年)已被用于系统性AAV递送(Bedbrook，Deverman等，2018年)。然而，这些启动子序列的相当大的尺寸(Bedbrook，Deverman等，2018年)限制了大的治疗性转基因或多个小转基因的使用。此外，短启动子(例如人巨细胞病毒即时早期增强子和启动子(CMV，600bp)(Gray，Foti等，2011)或人突触蛋白启动子的截短类型(hSyn，468bp)(Jackson，Dayton等，2016))驱动基因转录和表达的能力相当弱，且在某些情况下，在递送后数周被完全阻抑或灭活(Brooks，Harkins等，2004；Nathanson，Jappelli等，2009；Qin，Zhang等，2010；Back，Dossat等，2019)。相似地，普遍存在的小启动子(例如β-葡萄糖醛酸酶(GUSB，378bp)(Husain，Passini等，2009)或泛素C(UBC，403bp)(Qin，Zhang等，2010；Powell，Rivera-Soto等，2015))显示弱的转录水平。

本文公开并验证了从疱疹病毒伪狂犬病毒(PRV)基因组中获得的被称为LAP1(498bp)、LAP2(404bp)和LAP1_2(880bp)的三种α疱疹病毒潜伏相关启动子(LAP)。疱疹病毒科的α疱疹病毒亚科包括牛疱疹病毒1(BHV-1)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、单纯疱疹病毒(HSV)和PRV。这些病毒共有基因组组构，并在不同哺乳动物宿主的感觉神经节中形成潜在感染(Koyuncu，Hogue等，2013)

PRV的LAP区域包含两个独立的启动子LAP1和LAP2(Cheung1989；Cheung和Smith，1999；Jin和Scherba，1999；Jin，Schnitzlei等，2000)(图1A)。PRV LAP1包含第一TATA盒上游的两个GC盒和三个CAAT盒，PRV LAP2在第二TATA盒前包含两个GC盒(Cheung，1989；Jin和Scherba，1999；Taharaguchi，Kobayashi等，2002)。有人提出不同的转录因子(TFs)与LAP中存在的共有启动子元件的结合可能有助于在潜伏感染期间避免核小体沉默(Deshmane和Fraser 1989；Leib，Bogard等1989；Devi-Rao，Goodart等人，1991年；Jin，Schnitzlein等，2000；Ono，Tomioka等2007)。在转基因小鼠品系中，在没有PRV感染的情况下，PRV LAP促进的转录具有神经元特异性(Taharaguchi，Yoshino等，2003)。但是，在瞬时表达分析中，PRVLAP1和LAP2促进培养的神经细胞及非神经细胞中的转录(Cheung和Smith 1999；Taharaguchi，Kobayashi等2002)。此外，与单独的LAP1或LAP2相比，串联的LAP1和LAP2序列的活性显著增加(Cheung和Smith 1999)。

本文中采用了基于AAV-PHP.eB眼眶后系统递送、iDisco+组织透明和光片显微分析的全CNS筛选方法以鉴定来自疱疹病毒伪狂犬病毒(PRV)的三种小潜伏相关启动子(LAP)。这些启动子为LAP1(404bp)、LAP2(498bp)和LAP1_2(880bp)。它们在PRV感染周期的生产和潜伏阶段中驱动病毒编码的潜伏相关转录物(LAT)的长期转录。AAV转导后六个月，在大脑的脊髓中对于AAV-LAP发现稳定的泛神经元转基因转录和翻译。数据表明，LAPs是适用于需要在一次病毒载体给药后长期转基因表达的基于病毒载体的CNS基因治疗的合适候选者，PRV LAP1、LAP2和串联LAP1_2启动子很可能适用于可能在单次给药后需要稳定且长期的转基因表达的系统性的、微创的泛神经元基因递送应用。

实施例1、材料和方法

PRV LAP序列的构建

PRV潜伏相关转录物启动子(LAP)从PRV Becker株基因组(GenBank：JF797219.1)坐标95106-96007PCR扩增。LAP1区域(498bp)使用引物LAP1F(5’-GCA CGC GTA TCT CCGGAA AGA GGA AAT TGA-3’)(SEQ ID NO：59)和LAP1R(5’-GCG GAT CCT ATA TAC ACG ATGTGC ATC CAT AAT-3’)(SEQ ID NO：60)进行扩增。LAP2区域(404bp)使用引物对LAP2F(5’-GCA CGC GTA TCC CCG GTC CGC GCT CCG CCC ACC CA-3’)(SEQ ID NO：61)和LAP2R(5’-GCG GAT CCG AGC TCC CTC TTC CTC GCC GCG GAC TGG-3’)(SEQ ID NO：62)进行扩增。跨越整个LAP区域的LAP1_2(902bp)使用LAP1F和LAP2R进行扩增(Cheung和Smith1999)。这些PCR序列的5’和3’区域分别包含MluI和BamHI限制性位点，其用于定向克隆到载体pAAV-Ef1α-mCherry中。pAAV-Ef1α-mCherry由Karl Deisseroth惠赠(Addgene质粒#114470)。三种AAV-LAP质粒通过用MluI和BamHI双重消化载体pAAV-Ef1α-mCherry然后将适当的LAP片段亚克隆到mCherry报告子基因的上游后，构建，侧邻AAV2末端反向重复序列(ITRs)，并以SV40 polyA信号终止。

AAV载体的构建

所有表达盒均在Princeton Neuroscience Institute Viral Core Facility处被包装到AAV-PhP.eB衣壳(由Daniela Gradinaru惠赠，Addgene质粒#103005)中，并如之前所述的通过碘克沙醇阶梯梯度和柱超滤进行纯化(Zolotukhin，Byrne等，1999；Chan，Jang等，2017)。通过TaqMan qPCR测量衣壳保护的病毒基因组，并以每毫升基因组拷贝数(GC/m1)进行报告。

动物

依据普林斯顿大学实验动物使用与管理委员会(Institutional Animal Careand Use Committee of Princeton University)批准的指南及实验方案(实验方案#1943-16和1047)进行动物实验。从Hilltop Labs Inc.(Scottsdale，PA)获得定时怀孕的Sprague-Dawley大鼠。获取E17大鼠胚胎用于分离交感神经SCG神经元。从JacksonLaboratory(The Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)获得成年(4-6周龄)野生型C57BL/6J雄性小鼠。在进行实验程序前，小鼠在普林斯顿神经科学研究所动物饲养所中适应饲养设施至少48小时。

原代颈上神经节细胞培养

如前所述，在三腔(trichambers)中培养来自大鼠胚胎(E17)的SCG神经元(Curanovic，Ch′ng等人，2009年)。简而言之，用胰蛋白酶(2.5mg/ml，Sigma-Aldrich，TheWoodlands，TX)解离SCG，并接种在具有含补充2％B-27、100ng/ml神经生长因子(NGF)和1％青霉素-链霉素-谷氨酰胺的神经基础培养基(Thermo Fisher Scientific，Rockford，IL)的培养基的聚-O-鸟氨酸和层粘连蛋白涂覆的培养皿上，大约三分之二的单个神经节被放置在三腔的S(体细胞)区室。接种三天后，利用0.1mM胞嘧啶-D-阿拉伯呋喃糖苷、Ara C(Sigma-Aldrich，The Woodlands，TX)处理培养基至少2天以消除分裂的非神经元细胞。每5天更换培养基，并且神经元在37℃、5％CO₂下孵育。

眼眶后窦注射

通过单侧注射到眼眶后静脉窦中对小鼠进行AAV载体的静脉内施用(Yardeni，Eckhaus等，2011年)。手术前使用氯胺酮(80mg/kg)/赛拉嗪(10mg/kg)混合物麻醉动物。一旦无反应，将动物置于侧卧位用于注射至内眦中。注射量为100μl，其包含总共4x10¹¹的病毒基因组，使用29G1/2胰岛素注射器施用。将动物放在可调节加热垫上，并对其进行监测直至可走动。

组织处理和组织学程序

在感染后30和190天(dpi)，用过量的氯胺酮(400mg/kg)/赛拉嗪(i.p.)麻醉小鼠并灌注4％多聚甲醛(PFA)，4℃下将脑和脊髓在4％PFA中后固定过夜。用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后，将脑保存于4℃下含0.1％叠氮钠的PBS中。脑被分成两部分，左半球用LeicaVT1200振动切片机进行50μm矢状切片，并用Leica CM3050S低温恒温器进行20μm矢状切片。右半球用于iDISCO+组织透明方案(见下文)。在用于低温保护的4℃下，将固定的脑和脊髓连续地在10％蔗糖、20％蔗糖和30％蔗糖中温育。将组织包埋在OCT(tissue-Tek，Torrance，CA)，干冰中冷冻并保存于-80℃直至切片。为进行冷冻切片，将脊髓放置在嵌入模具(Sigma-Aldrich，The Woodlands，TX)中，并在37℃下填充超纯低熔点琼脂糖(ThermoFisher Scientific，Rockford，IL)。取出半固体琼脂糖立方体并以水平方向粘住(Loctite，Rocky Hill，CT)以使用低温恒温器进行20μm横向切片。

免疫染色

对于免疫组织化学，用PBS洗涤自由漂浮的脑切片，并用3％牛血清白蛋白(BSA)、2％驴血清和0.5％Triton X-100(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)封闭1小时。样品在4℃下与一抗孵育过夜，并在RT(室温)下与二抗孵育1小时(其用含1％牛血清、1％驴血清和0.5％Triton X-100的PBS稀释)。用0.5μg/ml DAPI复染细胞核5分钟(Thermo FisherScientific，Rockford，IL)。使用以下一抗：兔抗-RFP Rockland(1∶1000；Limerick，PA)、鸡抗-mCherry Abcam(1∶500；Cambridge，MA)、小鼠抗-NeuN(1∶500；Millipore BioscienceResearch Reagents，Temecula，CA)、兔抗-Olig2(1∶500，EMD Millipore，Temecula，CA)、兔抗-Iba1(1∶1000，Wako Chemical，Richmond，VA)和兔抗-S100(1∶5000，Dako，Glostrup，Denmark)。使用以下二抗：Alexa Fluor 488驴抗-兔IgG、Alexa Fluor 488驴抗-小鼠IgG、Alexa Fluor 647驴抗-兔IgG、Alexa Fluor 647驴抗-鸡IgG(1∶1000，Thermo FisherScientific，Rockford，IL)。用1∶300稀释的NeuroTrace 500/525绿色荧光Nissl染料(Molecular Probes，Eugene，OR)对自由漂浮的脊髓切片进行染色1小时。切片用PBS中的0.1％Triton X-100透化10分钟，且先用PBS洗涤，再用含0.1％Triton X-100的PBS洗涤10分钟。样品用0.5μg/ml DAPI孵育5分钟，然后在室温下用PBS洗涤2小时。装片前将Fluoromount-G装片介质(Southern Biotech，Birmingham，AL)施用于脑和脊髓切片。

显微分析

用包含Cool Snap ES2照相机(Photometrics，Tucson，AZ)和4X物镜的尼康Ti-E倒置落射荧光显微镜(Nikon Instruments Inc，Tokyo，Japan)对神经元SCG培养物进行成像。整个S区室的拼接图像由尼康NIS Elements软件拼装。为了量化各个不同脑区域的AAV转导效率，使用NanoZoomer S60荧光显微扫描仪(Hamamatsu，Hamamatsu，Japan))对脑切片进行成像。使用Leica STP8000共焦激光扫描显微镜(Leica Microsystems，Wetzlar，German y)对脑切片进行成像，采用20X和63X物镜、用于灵敏检测的混合(HyD)检测器，且在1024x1024像素区域上。如前所述，使用ImageJ软件计算校正的总细胞荧光(Maturana，Aguirre等，2017)。选择绘制目标区域(ROI)的细胞，并针对来自非荧光细胞的背景强度标准化。考虑到每个细胞的积分面积、密度和平均灰度值，校正的总细胞荧光的计算被测量为相对荧光强度(RFI)。

iDISCO+组织透明

透化作用

右脑半球用于iDISCO+组织透明。如前所述，组织透明前，将脑样品于4％PFA中固定过夜(Renier，Wu等，2014)。固定的样品在20、40、60、80、100％甲醇/水溶液中各洗涤/脱水1小时，然后用5％过氧化氢/甲醇过夜洗涤(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，并以甲醇/水100、80、60、40、20％的反向梯度各复水1小时。最后，用0.2％Triton X-100/PBS洗涤脑，然后在37℃下，用20％DMSO(Thermo Fisher Scientiftc，Rockford，IL)/0.3M甘氨酸(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)/0.2％Triton X-100/PBS洗涤2天。

免疫标记

将样品于10％DMSO/驴血清(EMD Millipore，Temecula，CA)/0.2％Triton X-100/PBS的封闭溶液中37℃下孵育2-3天，然后在含有10μg/ml肝素的PBS/0.2％Tween-20(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)(下文称为PTwH的溶液，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)中洗涤2次，1小时/洗涤。脑与一级兔抗-RFP抗体(1∶1000；Rockland，Limerick，PA)在5％DMSO/3％驴血清/PTwH中37℃下孵育7天。然后，用PTwH洗涤脑5次(洗涤间隔：10分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时)，并在3％驴血清/PTwH中与二级Alexa Fluor 647驴抗-兔IgG(1∶450，Thermo Fisher Scientific，Rockford，IL)37℃下孵育7天，然后用PTwH中洗涤5次。

组织透明

脑依次在20、40、60、80、100％甲醇/水中脱水，每步骤1小时，随后2∶1二氯甲烷(DCM；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)/甲醇和100％DCM洗涤。最后样品用DBE(Sigma-Aldrich，St.Louis，M)透明，并在室温下保存于黑暗中直至成像。

透明组织的光片显微和分析

进行免疫标记和透明后，使用光片超显微镜II(LaVision Biotec，Bielefeld，Germany)获取脑体积。脑半球沿水平方向胶粘在定制设计的3D打印支架上(Renier，Wu等，2014；Renier，Adams等，2016)并浸没在DBE中。利用488-nm激光二极管激发和525-nm最大发射滤光器(FF01-525/39-25，Semrock，Rochester，NY)在自发荧光通道中对脑进行成像用于配准目的，并使用680-nm最大发射滤光器(FF01-680/42-25，Semrock)以640-nm激发用于AAV感染细胞的细胞成像(抗RFP)。使用0.017激发片NA和1.3倍放大倍数每10微米(z-阶尺寸)采集单独的左侧和右侧照明自发荧光图像。左侧和右侧图像在中线处呈S形混合。如Renier及其同事(Renier，Wu等，2014；Renier，Adams等，2016)描述的，使用仿射和b-样条转换将自发荧光量配准到体积艾伦脑图谱(2015年)。考虑到采集过程中的移动和通道间不同的成像参数，细胞信号量利用仿射转换与自发荧光量配准。使用与高性能计算集群相容的我们改良的ClearMap软件“ClearMap_cluster”(github.com/PrincetonUniversity/clearmap_cluster)分析脑量。对于所有分析的样本，在脑边缘和心室上的检测对象从结构边缘消蚀75μm以最上化假阳性。

RNAscope原位杂交

将脑冷冻切片装载于superfrost plus粘附玻片(Thermo Fisher，Waltham，MA)上并储存于-80℃下。依照制造商的方案，使用RNAscope多重荧光试剂盒(Advanced CellDiagnosics(ACD)，Newark，CA)进行RNA染色。使用mCherry探针ACD#431201-C2。40℃下用蛋白酶IV预处理切片30分钟，然后在40℃下探针孵育2小时。然后，40℃下不同扩增溶液进行30分钟、30分钟和15分钟的。用TSA+荧光素系统(Perkin Elmer，Waltham，MA)检测信号。在ACD HybEZ杂交系统中进行孵育步骤。室温下用DAPI复染载玻片30秒，然后用PBS洗涤两次。玻片用VECTASHIELD振动防褪色封片介质(Vector Laboratories，Burlingame，CA)装载。

统计学

使用GraphPad Prism 7软件(GraphPad Software，Inc.，La Jolla，CA)进行统计学数据分析。双侧Student’s t检验被用于两个组的比较，且使用非参数单因素ANOVA检验之后Bonferroni多重后验比较进行多个组之间的比较。p值＜0.05具有统计学显著性。数据表示为平均值与SEM。

实施例2、小PRV LAP序列可独立于疱疹病毒感染驱动神经元中的转基因表达。

PRV LAP区域包括至少两个启动子区域，本文中定义为LAP1和LAP2(图1A)。在PRV基因组中，LAP1和LAP2作为PRV LAP1_2串联存在。当用于AAV载体时，这些序列单独或组合能够在无PRV感染的情况下在原代交感神经元中高效表达报告转基因(图1C和1D)。使用Jasper软件(Sandelin，Alkema等，2004；Wasserman和Sandelin 2004)、RSAT软件(Nguyen，Contreras-Moreira等，2018)和CTCFBSDB 2.0软件(Ziebarth，Bhattacharya等，2013年)分析LAP序列以识别推定的调控元件。LAP1 TATA盒上游检测到三个环状AMP响应元件结合蛋白(CREB)结合基序，且LAP2 TATA盒上游检测到一个。此外，LAP1 TATA盒上游检测到两个CCCTC-结合因子(CTCF)结合基序，且LAP2 TATA盒下游检测到一个。LAP2中识别了下游启动子元件(DPE)，包括三个CG盒和四个信号转导子和转录激活子1(STAT1)结合基序。此外，在LAP1 TATA盒和LAP2 TATA盒的上游分别存在谱系决定性TFs(Wang，Pol等，2014年)，例如SRY-盒10(SOX10)和少突细胞转录因子2(Olig2)(图1A)。

通过标准方法将四种AAV重组体包装到血清型PHP.eB衣壳中。制备了三个启动子构建体，即LAP1(498bp，对应于SEQ ID NO：1)、LAP2(404bp，对应于SEQ ID NO：2)和LAP1_2(880bp，对应于SEQ ID NO：3)。普遍存在的EF-1α启动子(1264bp)被用作转基因表达的阳性对照。所有四种AAV重组体均表达了荧光报告体mCherry(图1B)。为了验证每个启动子的体外性能，使用每种AAV的3×10¹¹基因组转导大鼠原代颈上神经节(SCG)神经元培养物，并于90天内定量相对mCherry荧光强度(RFI)。

对于用AAV-LAP1转导的神经元，mCherry表达在11dpi时突然增强(64220RFI)，但相比于AAV-LAP2、AAV-LAP1_2和AAV-EF1α，达到较低表达水平。17dpi时AAV-EF1α表达增加～120倍(分别为8.70x10⁶；2.39x10⁶；8.01x10⁶RFI)(图1C)。所有四种重组体的最高表达水平在28dpi时：LAP1(291,242RFI)；lap2(1.36x10⁷RFI)；LAP1_2(4.36x10⁶RFI)和EF1α(1.40x10⁷RFI)(图1C和1D)。LAP2和EF1α具有最高mCherry RFI(LAP2＝EF1α＞LAP1_2＞LAP1)。38dpi至90dpi之间，所有四种AAV重组体均显示出轻微但持续的RFI下降(图1C)，最可能是由于培养中超过100天后原代SCG神经元的衰老。重要的是，在AAV转导和不存在PRV感染的情况下，所有三种AV-LAP重组体在原代神经元中显示出mCherry转录达90天。

实施例3、全CNS筛选显示六个月后泛神经元AAV-LAP转基因表达。

鉴于系统性血管内递送后增强的通过BBB和转导C57/BL6小鼠CNS的能力，AAV血清型PHP.eB被用于启动子筛选分析(Chan，Jang等，2017)。AAV-LAP1-mCherry、AAV-LAP2-mCherry、AAV-LAP1_2-mCherry和AAV-EF1α-mCherry是通过单侧眼眶后静脉窦注射4×10¹¹病毒基因组/小鼠(vg/小鼠)进行递送。如图2A所示，在AAV转导后30天和190天收获脑和脊髓以定量mCherry的转录和翻译。在组织透明，用iDISCO+免疫染色(溶剂透明的器官的免疫标记实现的三维成像)，和通过光片显微镜和体积配准(Renier，Wu等，2014；Renier，Adams等，2016)后测定整个完整脑中的LAP-mCherry表达。

如图2B-2P所示，所有四个启动子在30dpi和190dpi时均显示稳定的mCherry表达。LAP2的密度(每mm³脑组织中mCherry阳性细胞的数量)高于LAP1和LAP1_2的密度，且在脑的不同区域中与EF1α的密度无显著差异：皮层：初级运动、次级运动、初级躯体感觉和补充躯体感觉(图2B-2E)；海马结构(图2G)、苍白球(图2I)、下丘脑(图2K)和嗅觉区(图2P)。在小脑中，LAP2显示的mCherry密度高于LAP1、LAP1_2和EF1α(图2O)。此外，在纹状体(图2H)；丘脑(图2J)；中脑，运动和感觉区(图2L和2M)，以及后脑(图2N)中，LAP2和LAP1_2显示的密度明显高于EF1α(p＜0.05)。请注意，LAP2的核苷酸序列比EF1α短68％，但在几个脑区域中优于EF1α。

为进一步验证CNS中的LAP转基因表达，通过免疫组织化学(IHC)评估30dpi和190dpi时的矢状脑切片中的mCherry蛋白表达(图3A-3H)。共焦显微分析显示，30dpi时整个皮质躯体感觉区(图3E)、海马结构中的齿状回(图3F)、纹状体中的尾壳核(图3G)和小脑皮质(图3H)的丰富mCherry染色。重要的是，190dpi时所有三个LAP序列的mCherry表达是稳定的，并且与较大的AAV-EF1α-mCherry启动子的表达相似(图3E-3H，图面5-8)。接下来，30dpi和190dpi时的mCherry表达被定量。mCherry RFI对所有AAV启动子是相似的，无显著差异(图3I1-3I4)。随后量化190天后的每像素²mCherry阳性细胞数量。在皮层中，LAP2 mCherry表达细胞的数量高于对于LAP1-mCherry和LAP1_2-mCherry所观察到的数量[LAP2：297±19.82vs LAP1：149±5.61vs LAP1_2：168±9.22(n＝6，p＜0.001)(图3J1)。在齿状回、纹状体和小脑中，mCherry阳性细胞数量对于所有LAP变体和EF1α相似(图3J2-3J4)。因此，所有AAV-LAP变体促进脑中的mCherry表达，进一步证明AAV-LAP重组体的单次施用可能足以驱动小鼠CNS中长期的泛神经元转基因表达。

实施例4、小LAP2启动子变体在系统性AAV施用后驱动强和稳定的泛神经元转基因 表达。

比较不同PRV LAP序列控制下的mCherry表达的效能。30dpi和190dpi时，观测到皮层(图4A和4E1)、齿状回(图4B和4E2)、纹状体(图4C和4E3)和小脑(图4D和4E4)中的丰富信号。此外，30dpi和190dpi时，AAV-LAP2 RFI是稳定的且与AAV-EF1α相似(p＜0.05)(图4E1-4E4；表2)。尽管30dpi和190dpi时，在皮质、齿状回、纹状体和小脑中AAV-LAP1和AAV-LAP1_2mCherry RFI水平稳定且它们之间无显著差异(图4E1-4E4；表2)，但是与LAP2和EF1α相比，这两种启动子显示出明显较少的转基因表达。

表2.使用不同AAV-PHP.eB-启动子在小鼠脑中的mCherry表达

^adpi：AAV注射后天数

^bRFI：相对荧光强度

因为mRNA的半衰期通常比翻译后蛋白质短(Chan，Mugler等，2018年)，因此测量了AAV-LAP转导的小鼠脑切片中的mCherry转录物。30dpi(数据未显示)和190dpi时，使用mCherry-特异性核糖探针测量AAV-LAP2-mCherry mRNA。荧光原位杂交(FISH)显示在皮层、齿状回、纹状体、小脑和嗅球中的丰富AAV-LAP2mCherry RNA(图5A-5E)，进一步证实了PRVLAP2可以驱动CCNS中的长期且强有力的转基因转录。

实施例5、脑中的AAV-LAP转基因表达主要在神经元而非胶质细胞中。

AAV转导和后续转基因表达的向性和特异性取决于AAV血清型(Aschauer，Kreuz等，2013，Bedbrook；Deverman等，2018)及启动子(von Jonquieres，Frohlich等，2016；Hammond，Leek等，2017；Dayton，Grames等，2018)。为确定系统性AAV-PHP.eB递送后哪些细胞类型显示出AAV-LAP-mCherry表达，在皮层和齿状回中进行mCherry蛋白与神经元(NeuN)、少突细胞(Olig2)、小胶质细胞(Ibal)和星形胶质细胞(S100)标志物的共免疫染色。NeuN和mCherry的共染色显示，皮层和齿状回中超过90％的成像神经元表达由不同的AAV-LAP变体驱动的mCherry(图6A、图6B和图6E)。相反，对于所有LAP变体检测到少于4％的mCherry阳性少突细胞(图6C、6D和6F)。此外，对于任何LAP重组体未观察到mCherry与小胶质细胞和星形胶质细胞标志物的共同标记(图7A-7D)。总的来说，这些结果表明在使用AAV-PHP.eB进行系统性脑转导的情况下，LAP-mCherry表达在神经元而非神经胶质细胞中是丰富的。

实施例6、AAV-LAP构建体在整个脊髓表现出广泛、稳定且长期的转基因表达。

除了脑，还评估了脊髓中的AAV-LAP性能，在脊髓中血清型PHP.eB显示了广泛分布的灰质转导(Chan，Jang等2017；Dayton，Grames等2018)。

190dpi时检测到颈椎、胸椎(数据未显示)和腰椎节段处的脊髓背角和腹角中丰富的天然mCherry表达(图8A-8D)。所有启动子的天然mCherry荧光(RFI)的定量相似，无统计学显著差异(图8E)。但是，LAP2和LAP1_2重组体显示出最高的每像素²mCherry阳性细胞密度，其次为EF1α和LAP1；LAP2＝LAP1_2＞EF1α＞LAP1(图8F)。因此，所有三个PRV LAP序列均有效介导脊髓中泛神经元的长期转基因表达。

基因治疗已被用于恢复神经和神经变性疾病中特定目标细胞的基因功能(Deverman，Ravina等，2018)。通过外周血管转导的系统性载体递送进行的基因转移可能难以在CNS中以神经元特异性或泛神经元方式有效表达(Ingusci，Verlengia等，2019)。重组AAV载体是CNS中实现基因表达的最有效媒介之一(Hudry和Vandenberghe，2019；Wang，Tai等，2019)。此外，工程化的AAV衣壳已经表现出改进的CNS转导以及以比自然发生的血清型更高的效率跨越BBB的增强的能力(Chan，Jang等，2017；Bedbrook，Deverman等，2018；hallaux，Yuan等，2019；Qin Huang和Alejandro B.Balazs，2019)。尽管取得了这些进展，但AAV基因治疗受到了AAV衣壳4.9Kb的小有效负载大小的阻碍(Chamberlain，Riyad等，2016)。例如，庞贝氏病(Colella，Sellier等，2019)和帕金森氏病(Wang，Muramatsu等，2002)的CNS治疗是基于相对较大的基因(如GAA(2.9Kb)和GDNF(2.5Kb))的递送。对于这些和其他类似情况，较大的启动子或甚至较小的CMV和hSyn启动子的使用已被证明在递送后被快速抑制(Gray，Foti等，2011；Jackson，Dayton等，2016)。

如本文所述，鉴定了从α疱疹病毒PRV基因组中分离的三个小的泛神经元启动子，其在系统性AAV PHP.eB递送后在小鼠CNS中显示出高效且长期的转基因表达。本文所提供的结果表明，这些小的PRV LAP序列可以驱动报告转基因在脑和脊髓中的长期表达(超过6个月)。PRV LAP在脑皮层、纹状体、齿状回和小脑中均匀地转导神经元。齿状回、纹状体和小脑中mCherry阳性细胞的分布在LAP序列之间无显著差异。但是，与LAP1和LAP1_2相比，LAP2转基因的表达在皮层中显著更高。全脑筛选分析表明，相比于较大的LAP1和LAP1_2序列，仅402bp的LAP2变体可驱动更强的mCherry表达。190dpi时每个筛选脑区中均检测到从LAP2转录的丰富mCherry mRNA。这些结果证明，在无PRV感染的情况下，系统性AAV-LAP2递送后小PRV LAP2在CNS中驱动的高效的转录和翻译。

尽管LAP1-mCherry细胞密度明显低于LAP2，但mCherry表达仍保持稳定且持久。因此，LAP1可用于其中需要少量的治疗性蛋白质(例如酶缺陷)的情况或用于相对于非转导细胞的交叉校正。例如，针对溶酶体酶缺陷(Husain，Passini等，2009)和粘多糖病VII型(Cearley和Wolfe，2007)疾病，其中通过AAV治疗恢复的酶可从转导细胞分泌并改善邻近的患病细胞。

AAV向性主要由衣壳与易感和受纳细胞中的特定受体之间的相互作用决定(Aschauer，Kreuz等，2013；Bedbrook，Deverman等，2018)。不同的AAV血清型具有不同的组织向性。但是，启动子序列和载体中包含的其他序列(例如末端反向重复序列(ITR))可能对向性产生实质性影响(Haberman和McCown 2002)。此外，转录转基因的启动子区域对于优化AAV载体性能至关重要。无论是以广泛的方式还是细胞类型特异性的方式，高效的转基因表达都需要细胞来源的TFs与启动子区域的结合和作用(Dayton，Grames等，2018；Andersson和Sandelin，2019)。神经元环境的变化(例如老化或分化)也可能改变细胞特异性调控蛋白的募集，从而改变CNS中的基因表达(Herdegen和Leah，1998)。分析本文所提供的PRV LAP序列鉴定了LAP2中的DPE，其可控制转基因表达的起始、持续时间和细胞类型特异性。此外，还鉴定了四个STAT1基序，其在HSV-1LAP中似乎调节病毒从潜伏期的再激活(Kriesel，Jones等，2004)。引人注目的是，发现PRV LAP2中的这些STAT1基序中的一个与TATA盒和Olig2基序共定位，所述Olig2基序是已知的促进神经元和少突胶质细胞命运的多层面TFs(Emery和Lu，2015)。与这些基序和转录起始位点相关的邻近效应可以解释LAP2、LAP1和LAP1_2之间CNS转基因表达的不同水平。此外，LAP2 TATA盒的下游发现一个CTCF基序，其可能在对于潜伏期中针对表观遗传沉默的抗性中发挥作用，如对于HSV-1所示的(Lang，Li等，2017；Lee，Raja等2018)。事实上，Zimmerman及其同事(Zimmerman，Patel等，2018)发现，相比于天然EF1α和CMV启动子，在EF1α启动子下游插入CTCF基序显著增强转基因表达。有趣的是，在CMVTATA盒下游插入第二CTCF基序对荧光素酶报告基因表达没有影响，推测是因为天然CTCF基序的丰富存在(Zimmerman，Patel等，2018)。因此，基因表达容易因遗传背景和序列特异性DNA结合蛋白而发生变化。募集来自不同宿主细胞的特异性TFs可以通过与调节潜伏期中的灭活抗性相同的机制调节转基因的转录。绝缘子元件(例如CTCF-结合因子)被独立地调节(Washington，Musarrat等，2018)并可保护启动子区域不受异染色质抑制，从而维持持久的转录(Lang，Li等，2017)。

通过LAP-mCherry、神经胶质和神经元标志物的共定位对细胞特异性转导进行组织学评估，显示在皮质和齿状回中LAP序列在神经元中的表达效率高于神经胶质细胞。LAP-mCherry阳性细胞主要与神经元特异性标记物共定位，且较少程度上与少突细胞共定位，但不与小胶质细胞或星形胶质细胞共定位。这些发现表明在PHP.eB系统性递送后，PRV LAP序列在CNS中具有泛神经元启动子分布。由于TATA盒上游存在CRE基序，该活性也对于HSV LAP序列发现(Leib，Nadeau等，1991；Kenny，Krebs等，1994；Bloom，Stevens等，1997)。其他病毒蛋白不存在的情况下，PRV LAP1和LAP2是神经元特异性启动子，并且转基因表达水平在不同的神经元类型之间变化(Taharaguchi，Yoshino等，2003)。重要的是，AAV-PHP.eB主要转导神经元(Chan，Jang等，2017)，并且这种衣壳变体与PRV LAP序列的组合在CNS中表现出强的、持久的泛神经元表达谱。因此，PRV LAP序列不仅可用于重组病毒载体(AAV、腺病毒、慢病毒、疱疹病毒)的情况中，还可用于非病毒基因递送平台。PRV的自然宿主是成年猪，但该病毒具有极其广泛的向性，可感染某些鸟、鱼和包括某些灵长动物在内的多种类型的哺乳动物(Baskerville和Lloyd，1977)。此外，培养中的人类细胞易受PRV感染且已有一些人畜共患感染的报告(Wong，Lu等，2019)。因此，PRV LAP序列可优化用于在包括人类在内的几种不同哺乳动物中需要高效且长期的转基因表达的基因治疗应用。

综上所述，本文提供的数据表明，PRV LAP启动子活性独立于PRV病毒感染，并且小的AAV-PHP.eB-LAP序列在脑和脊髓(CNS)中以稳定的泛神经元方式表达转基因。长期转基因转录和翻译对于有效和持久的单剂量基因治疗应用至关重要。因此，PRV LAP序列可用于治疗遗传性CNS疾病。

实施例7、LAP序列有效驱动非神经元细胞和组织中的转基因表达。

以下实施例中，LAP序列被证实在几种细胞和组织类型(包括肾、肝和视网膜)中有效驱动荧光报告蛋白(mCherry)的转基因表达。此外，还发现LAP与病毒载体(如AAV)和非病毒载体(如质粒DNA的直接转染)相容。

如图9A-9C所示，LAP序列在猪肾细胞中驱动高效的转基因表达。包含由LAP1(图9A)、LAP2(图9B)或LAP1_2(图9C)驱动的报告质粒转染后48小时获得PK15细胞(猪肾上皮细胞，ATCC CCL-33)的代表性图像。

如图10A和10B所示，LAP2在人肾细胞中驱动高效的转基因表达。包含由LAP2(图10A)或EF1α启动子(图10B)驱动的mCherry的报告质粒转染后48小时获得HEK-293细胞(人胚胎肾上皮细胞，ATCC CRL-1573)的代表性图像。

如图11A和图11B所示，LAP2在人肝细胞中驱动高效的转基因表达。包含由LAP2(图11A)或EF1α启动子(图11B)驱动的mCherry的报告质粒转染后48小时获得HepG2细胞(人肝上皮细胞，ATCC HB-8065)的代表性图像。

如图12A1-12B4所示，LAP2在整个肝脏驱动长期转基因表达。通过单侧注射到小鼠眼眶后窦(4x10¹¹vg/小鼠)中进行AAV-LAP2(图12A1-12A4)或AAV-EF1α-载体(图12B1-12B4)的静脉内施用。190dpi时收集肝脏，并进行20μm纵向切片用于后续的IHC和共焦显微镜分析。代表性共焦图像显示天然mCherry荧光(图12A1和12B1：红色)、抗-mCherry免疫染色(图12A2和12B2：绿色)、DAPI核复染(图12A3和12B3：蓝色)以及合并的免疫荧光和DAPI图像(图12A4和12B4)。

如图13A1-13B4所示，LAP2在小鼠肾脏中驱动长期转基因表达。通过单侧注射到小鼠眼眶后窦(4x10¹¹vg/小鼠)中进行AAV-LAP2(图13A1-13A4)或AAV-EF1α-载体(图13B1-13B4)的静脉内施用。190dpi时收集肾脏，并进行20μm纵向切片用于后续的IHC和共焦显微镜分析。代表性共焦图像显示天然mCherry荧光(图13A1和13B1：红色)、抗-mCherry免疫染色(图13A2和13B2：绿色)、DAPI核复染(图13A3和13B3：蓝色)以及合并的免疫荧光和DAPI图像(图13A4和13B4)。

如图14A1-14B4所示，LAP2在小鼠视网膜中驱动长期转基因表达。通过单侧注射到小鼠眼眶后窦(4x10¹¹vg/小鼠)中进行AAV-LAP2(图14A1-14A4)或AAV-EF1α-载体(图14B1-14B4)的静脉内施用。190dpi时收集视网膜，并进行20μm横向冷冻切片用于后续的IHC和共焦显微镜分析。代表性共焦图像显示天然mCherry荧光(图14A1和14B1：红色)、抗-mCherry免疫染色(图14A2和14B2：绿色)、DAPI核复染(图14A3和14B3：蓝色)以及合并的免疫荧光和DAPI图像(图14A4和14B4)。

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本文引用的所有专利、公开的申请和参考文献的教导均通过引用整体引用并入本文。

虽然已经具体表明和描述了示例性实施方案，但是本领域技术人员应当理解，在不脱离所附权利要求所包含的实施方案的范围的情况下，可以在形式和细节上进行各种改变。

Claims (149)

1.一种用于在宿主细胞中表达靶基因的重组载体，所述重组载体包含：

启动子，所述启动子包含与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4的序列具有至少70％序列同一性的核酸序列；

克隆位点，所述克隆位点用于插入编码所述靶基因的核酸；和

至少一个在宿主细胞中表达所述靶基因所需的非启动子调控元件。

2.根据权利要求1所述的重组载体，其中所述载体是病毒载体。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。

4.根据权利要求1所述的重组载体，其中所述载体是非病毒载体。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的重组载体，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的重组载体，其中所述宿主细胞包括体外神经元细胞、离体神经元细胞或二者。

7.根据权利要求1-5中任一项所述的重组载体，其中所述宿主细胞包括受试者的神经元细胞。

8.根据权利要求7所述的重组载体，其中所述神经元细胞位于所述受试者的初级运动区、次级运动区、初级躯体感觉区、补充躯体感觉区、视觉区、海马结构、纹状体、苍白球、丘脑、下丘脑、中脑区、后脑、嗅觉区或其组合中。

9.根据权利要求8所述的重组载体，其中所述中脑区包括运动相关区、感觉相关区或二者。

10.根据权利要求7所述的重组载体，其中所述神经元细胞位于所述受试者的皮层、齿状回、纹状体、小脑、嗅球或其组合中。

11.根据权利要求6-10中任一项所述的重组载体，其中所述神经元细胞包括神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞或其组合。

12.根据权利要求11所述的重组载体，其中所述神经元细胞包括神经元。

13.根据权利要求7所述的重组载体，其中所述神经元细胞位于所述受试者的脊髓中。

14.根据权利要求13所述的重组载体，其中所述神经元细胞位于所述脊髓的背角中。

15.根据权利要求13或14所述的重组载体，其中所述神经元细胞位于腰脊髓、胸脊髓、颈脊髓或其组合中。

16.根据权利要求1-5中任一项所述的重组载体，其中所述宿主细胞选自膀胱细胞、血细胞、骨细胞、内皮细胞、上皮细胞、脂肪细胞、心脏细胞、肠细胞、肾细胞、肝细胞、肺细胞、肌肉细胞、胰腺细胞、视网膜细胞、性细胞、皮肤细胞、脾细胞、干细胞及其组合。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的重组载体，其中所述启动子包含与选自由SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成的组的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸序列。

18.根据权利要求17所述的重组载体，其中所述启动子包含选自由SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成的组的核酸序列。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的重组载体，其中所述至少一个非启动子调控元件包括增强子元件。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的重组载体，其中所述至少一个非启动子调控元件包括诱导物元件。

21.根据权利要求1-20中任一项所述的重组载体，所述重组载体进一步包含选择标记元件。

22.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求1-21中任一项所述的重组载体。

23.一种包含编码靶基因的核酸的重组多核苷酸分子，其中所述核酸可操作地连接与包含与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的序列具有至少70％序列同一性的核酸序列的启动子。

24.根据权利要求23所述的重组多核苷酸分子，其中所述启动子包含与选自由SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成的组的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸序列。

25.根据权利要求24所述的重组多核苷酸分子，其中所述启动子包含选自由SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成的组的核酸序列。

26.根据权利要求24-25中任一项所述的重组多核苷酸分子，其中所述编码靶基因的核酸包含超过4千碱基。

27.一种重组多核苷酸分子，其包含用于插入编码靶基因的核酸的克隆位点，其中所述克隆位点可操作地连接包含与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的序列具有至少70％序列同一性的核酸序列的启动子。

28.根据权利要求27所述的重组多核苷酸分子，其中所述启动子包含与选自由SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成的组的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸序列。

29.根据权利要求28所述的重组多核苷酸分子，其中所述启动子包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的核酸序列。

30.一种在宿主细胞中表达靶基因的方法，包括：

使所述宿主细胞与重组多核苷酸分子接触，使得所述重组核苷酸分子被引入所述宿主细胞中，其中所述重组多核苷酸分子包含编码所述靶基因的核酸，并且其中所述核酸可操作地连接包含与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的序列具有至少70％序列同一性的核酸序列的启动子，

由此所述靶基因的表达在所述宿主细胞中发生。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述启动子包含与选自由SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成的组的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸序列。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述启动子包含选自由SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成的组的核酸序列。

33.根据权利要求30-32中任一项所述的方法，其中所述重组多核苷酸分子在所述宿主细胞与所述重组多核苷酸接触时通过转导被引入所述宿主细胞中。

34.根据权利要求30-32中任一项所述的方法，其中所述重组多核苷酸分子在所述宿主细胞与所述重组多核苷酸接触时通过转染被引入所述宿主细胞中。

35.根据权利要求30-34中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。

36.根据权利要求30-35中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞包括体外神经元细胞、离体神经元细胞或二者。

37.根据权利要求30-35中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞包括受试者的神经元细胞。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述神经元细胞位于所述受试者的初级运动区、次级运动区、初级躯体感觉区、补充躯体感觉区、视觉区、海马结构、纹状体、苍白球、丘脑、下丘脑、中脑区、后脑、嗅觉区或其组合中。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述中脑区包括运动相关区、感觉相关区或二者。

40.根据权利要求37所述的方法，其中所述神经元细胞位于所述受试者的皮层、齿状回、纹状体、小脑、嗅球或其组合中。

41.根据权利要求36-40中任一项所述的方法，其中所述神经元细胞包括神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞或其组合。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述神经元细胞包括神经元。

43.根据权利要求37所述的方法，其中所述神经元细胞位于所述受试者的脊髓中。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述神经元细胞位于所述脊髓的背角中。

45.根据权利要求43或44所述的方法，其中所述神经元细胞位于腰脊髓、胸脊髓、颈脊髓或其组合中。

46.根据权利要求30-35中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞选自膀胱细胞、血细胞、骨细胞、内皮细胞、上皮细胞、脂肪细胞、心脏细胞、肠细胞、肾细胞、肝细胞、肺细胞、肌肉细胞、胰腺细胞、视网膜细胞、性细胞、皮肤细胞、脾细胞、干细胞及其组合。

47.一种用于在宿主细胞中表达靶基因的重组载体，所述重组载体包含：

启动子，所述启动子包含与选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8中的序列具有至少70％序列同一性的核酸序列；

克隆位点，所述克隆位点用于插入编码所述靶基因的核酸；和

至少一个在所述宿主细胞中表达所述靶基因所需的非启动子调控元件。

48.根据权利要求47所述的重组载体，其中所述载体是病毒载体。

49.根据权利要求48所述的重组载体，其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。

50.根据权利要求47所述的重组载体，其中所述载体是非病毒载体。

51.根据权利要求47-50中任一项所述的重组载体，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。

52.根据权利要求47-51中任一项所述的重组载体，其中所述宿主细胞包括体外神经元细胞、离体神经元细胞或二者。

53.根据权利要求47-51中任一项所述的重组载体，其中所述宿主细胞包括受试者的神经元细胞。

54.根据权利要求53所述的重组载体，其中所述神经元细胞位于所述受试者的初级运动区、次级运动区、初级躯体感觉区、补充躯体感觉区、视觉区、海马结构、纹状体、苍白球、丘脑、下丘脑、中脑区、后脑、嗅觉区或其组合中。

55.根据权利要求54所述的重组载体，其中所述中脑区包括运动相关区、感觉相关区或二者。

56.根据权利要求53所述的重组载体，其中所述神经元细胞位于所述受试者的皮层、齿状回、纹状体、小脑、嗅球或其组合中。

57.根据权利要求52-56中任一项所述的重组载体，其中所述神经元细胞包括神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞或其组合。

58.根据权利要求57所述的重组载体，其中所述神经元细胞包括神经元。

59.根据权利要求53所述的重组载体，其中所述神经元细胞位于所述受试者的脊髓中。

60.根据权利要求59所述的重组载体，其中所述神经元细胞位于所述脊髓的背角中。

61.根据权利要求59或60所述的重组载体，其中所述神经元细胞位于腰脊髓、胸脊髓、颈脊髓或其组合中。

62.根据权利要求47-51中任一项所述的重组载体，其中所述宿主细胞选自膀胱细胞、血细胞、骨细胞、内皮细胞、上皮细胞、脂肪细胞、心脏细胞、肠细胞、肾细胞、肝细胞、肺细胞、肌肉细胞、胰腺细胞、视网膜细胞、性细胞、皮肤细胞、脾细胞、干细胞及其组合。

63.根据权利要求47-62中任一项所述的重组载体，其中所述启动子包含与选自由SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸序列。

64.根据权利要求63所述的重组载体，其中所述启动子包含选自由SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的核酸序列。

65.根据权利要求47-64中任一项所述的重组载体，其中所述至少一个非启动子调控元件包括增强子元件。

66.根据权利要求47-65中任一项所述的重组载体，其中所述至少一个非启动子调控元件包括诱导物元件。

67.根据权利要求47-66中任一项所述的重组载体，所述重组载体进一步包含选择标记元件。

68.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求47-67中任一项所述的重组载体。

69.一种包含编码靶基因的核酸的重组多核苷酸分子，其中所述核酸可操作地连接包含与选自由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的序列具有至少70％序列同一性的核酸序列的启动子。

70.根据权利要求69所述的重组多核苷酸分子，其中所述启动子包含与选自由SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸序列。

71.根据权利要求70所述的重组多核苷酸分子，其中所述启动子包含选自由SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的核酸序列。

72.根据权利要求69-71中任一项所述的重组多核苷酸分子，其中所述编码靶基因的核酸包含超过4千碱基。

73.一种重组多核苷酸分子，其包含用于插入编码靶基因的核酸的克隆位点，其中所述克隆位点可操作地连接包含与选自由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8组成的组的序列具有至少70％序列同一性的核酸序列的启动子。

74.根据权利要求73所述的重组多核苷酸分子，其中所述启动子包含与选自由SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸序列。

75.根据权利要求74所述的重组多核苷酸分子，其中所述启动子包含选自由SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的核酸序列。

76.一种在宿主细胞中表达靶基因的方法，包括：

使所述宿主细胞与重组多核苷酸分子接触，使得所述重组核苷酸分子被引入所述宿主细胞中，其中所述重组多核苷酸分子包含编码所述靶基因的核酸，并且其中所述核酸可操作地连接包含与选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的序列具有至少70％序列同一性的核酸序列的启动子，

由此所述靶基因的表达在所述宿主细胞中发生。

77.根据权利要求76中所述的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。

78.根据权利要求76或77所述的方法，其中所述宿主细胞包括体外神经元细胞、离体神经元细胞或二者。

79.根据权利要求76或77所述的方法，其中所述宿主细胞包括受试者的神经元细胞。

80.根据权利要求79所述的方法，其中所述神经元细胞位于所述受试者的初级运动区、次级运动区、初级躯体感觉区、补充躯体感觉区、视觉区、海马结构、纹状体、苍白球、丘脑、下丘脑、中脑区、后脑、嗅觉区或其组合中。

81.根据权利要求80所述的方法，其中所述中脑区包括运动相关区、感觉相关区或二者。

82.根据权利要求79所述的方法，其中所述神经元细胞位于所述受试者的皮层、齿状回、纹状体、小脑、嗅球或其组合中。

83.根据权利要求78-82中任一项所述的方法，其中所述神经元细胞包括神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞或其组合。

84.根据权利要求83所述的方法，其中所述神经元细胞包括神经元。

85.根据权利要求79所述的方法，其中所述神经元细胞位于所述受试者的脊髓中。

86.根据权利要求85所述的方法，其中所述神经元细胞位于所述脊髓的背角中。

87.根据权利要求85或86所述的方法，其中所述神经元细胞位于腰脊髓、胸脊髓、颈脊髓或其组合中。

88.根据权利要求76或77所述的方法，其中所述宿主细胞选自膀胱细胞、血细胞、骨细胞、内皮细胞、上皮细胞、脂肪细胞、心脏细胞、肠细胞、肾细胞、肝细胞、肺细胞、肌肉细胞、胰腺细胞、视网膜细胞、性细胞、皮肤细胞、脾细胞、干细胞及其组合。

89.根据权利要求76-88中任一项所述的方法，其中所述启动子包含与选自由SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸序列。

90.根据权利要求89所述的方法，其中所述启动子包含选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的核酸序列。

91.根据权利要求76-90所述的方法，其中所述重组多核苷酸分子在所述宿主细胞与所述重组多核苷酸接触时通过转导被引入所述宿主细胞中。

92.根据权利要求76-90中任一项所述的方法，其中所述重组多核苷酸分子在所述宿主细胞与所述重组多核苷酸接触时通过转染被引入所述宿主细胞中。

93.一种用于在宿主细胞中表达靶基因的重组载体，所述重组载体包含：

启动子，所述启动子包含与SEQ ID NO:9具有至少70％序列同一性的核酸序列；

克隆位点，所述克隆位点用于插入编码所述靶基因的核酸；和

至少一个在所述宿主细胞中表达所述靶基因所需的非启动子调控元件。

94.根据权利要求93所述的重组载体，其中所述载体是病毒载体。

95.根据权利要求94所述的重组载体，其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。

96.根据权利要求93所述的重组载体，其中所述载体是非病毒载体。

97.根据权利要求93-96中任一项所述的重组载体，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。

98.根据权利要求93-97中任一项所述的重组载体，其中所述宿主细胞包括体外神经元细胞、离体神经元细胞或二者。

99.根据权利要求93-97中任一项所述的重组载体，其中所述宿主细胞包括受试者的神经元细胞。

100.根据权利要求99所述的重组载体，其中所述神经元细胞位于所述受试者的初级运动区、次级运动区、初级躯体感觉区、补充躯体感觉区、视觉区、海马结构、纹状体、苍白球、丘脑、下丘脑、中脑区、后脑、嗅觉区或其组合中。

101.根据权利要求100所述的重组载体，其中所述中脑区包括运动相关区、感觉相关区或二者。

102.根据权利要求99所述的重组载体，其中所述神经元细胞位于所述受试者的大脑皮层、齿状回、纹状体、小脑、嗅球或其组合中。

103.根据权利要求98-102中任一项所述的重组载体，其中所述神经元细胞包括神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞或其组合。

104.根据权利要求103所述的重组载体，其中所述神经元细胞包括神经元。

105.根据权利要求99所述的重组载体，其中所述神经元细胞位于受试者的脊髓中。

106.根据权利要求105所述的重组载体，其中所述神经元细胞位于所述脊髓的背角中。

107.根据权利要求105或106所述的重组载体，其中所述神经元细胞位于腰脊髓、胸脊髓、颈脊髓或其组合中。

108.根据权利要求93-97中任一项所述的重组载体，其中所述宿主细胞选自膀胱细胞、血细胞、骨细胞、内皮细胞、上皮细胞、脂肪细胞、心脏细胞、肠细胞、肾细胞、肝细胞、肺细胞、肌肉细胞、胰腺细胞、视网膜细胞、性细胞、皮肤细胞、脾细胞、干细胞及其组合。

109.根据权利要求93-108中任一项所述的重组载体，其中所述启动子包含与SEQ IDNO:9的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸序列。

110.根据权利要求109所述的重组载体，其中所述启动子包含SEQ ID NO:9。

111.根据权利要求93-110中任一项所述的重组载体，其中所述启动子进一步包含SEQID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或其组合的核酸序列。

112.根据权利要求93-108中任一项所述的重组载体，其中所述启动子包含与选自由SEQ ID NO:13-58组成的组的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸序列。

113.根据权利要求112所述的重组载体，其中所述启动子包含选自由SEQ ID NO:13-58组成的组的核酸序列。

114.根据权利要求93-113中任一项所述的重组载体，其中所述至少一个非启动子调控元件包括增强子元件。

115.根据权利要求93-114中任一项所述的重组载体，其中所述至少一个非启动子调控元件包括诱导物元件。

116.根据权利要求93-115中任一项所述的重组载体，所述重组载体进一步包含选择标记元件。

117.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求93-116中任一项所述的重组载体。

118.一种包含编码靶基因的核酸的重组多核苷酸分子，其中所述核酸可操作地连接包含与SEQ ID NO:9具有至少70％序列同一性的核酸序列的启动子。

119.根据权利要求118所述的重组多核苷酸分子，其中所述启动子包含与SEQ ID NO:9的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸序列。

120.根据权利要求119所述的重组多核苷酸分子，其中所述启动子包含SEQ ID NO:9。

121.根据权利要求118-120中任一项所述的重组多核苷酸分子，其中所述启动子进一步包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或其组合的核酸序列。

122.根据权利要求118所述的重组多核苷酸分子，其中所述启动子包含与选自由SEQID NO:13-58组成的组的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸序列。

123.根据权利要求118-122中任一项所述的重组多核苷酸分子，其中所述编码靶基因的核酸包含超过4千碱基。

124.一种重组多核苷酸分子，其包含用于插入编码靶基因的核酸的克隆位点，其中所述克隆位点可操作地连接包含与SEQ ID NO:9具有至少70％序列同一性的核酸序列的启动子。

125.根据权利要求124所述的重组多核苷酸分子，其中所述启动子包含与SEQ ID NO:9的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸序列。

126.根据权利要求125所述的重组多核苷酸分子，其中所述启动子包含SEQ ID NO:9。

127.根据权利要求124-126中任一项所述的重组多核苷酸分子，其中所述启动子进一步包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或其组合的核酸序列。

128.根据权利要求124所述的重组多核苷酸分子，其中所述启动子包含与选自由SEQID NO:13-58组成的组的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸序列。

129.根据权利要求128所述的重组多核苷酸分子，其中所述启动子包含选自由SEQ IDNO:13-58组成的组的核酸序列。

130.一种在宿主细胞中表达靶基因的方法，包括：

使所述宿主细胞与重组多核苷酸分子接触，使得所述重组核苷酸分子被引入所述宿主细胞中，其中所述重组多核苷酸分子包含编码所述靶基因的核酸，并且其中所述核酸可操作地连接包含与SEQ ID NO:9具有至少70％序列同一性的核酸序列的启动子，

由此所述靶基因的表达在所述宿主细胞中发生。

131.根据权利要求130所述的方法，其中所述启动子包含与SEQ ID NO:9的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸序列。

132.根据权利要求131所述的方法，其中所述启动子包含SEQ ID NO:9。

133.根据权利要求130-132中任一项所述的方法，其中所述启动子进一步包含SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或其组合的核酸序列。

134.根据权利要求130所述的方法，其中所述启动子包含与选自SEQ ID NO:13-58的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸序列。

135.根据权利要求134所述的方法，其中所述启动子包含选自SEQ ID NO:13-58的核酸序列。

136.根据权利要求130-135中任一项所述的方法，其中所述重组多核苷酸分子在所述宿主细胞与所述重组多核苷酸接触时通过转导被引入所述宿主细胞中。

137.根据权利要求130-135中任一项所述的方法，其中所述重组多核苷酸分子在所述宿主细胞与所述重组多核苷酸接触时通过转染被引入所述宿主细胞中。

138.根据权利要求130-137中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。

139.根据权利要求130-138中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞包括体外神经元细胞、离体神经元细胞或二者。

140.根据权利要求130-138中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞包括所述受试者的神经元细胞。

141.根据权利要求140所述的方法，其中所述神经元细胞位于所述受试者的初级运动区、次级运动区、初级躯体感觉区、补充躯体感觉区、视觉区、海马结构、纹状体、苍白球、丘脑、下丘脑、中脑区、后脑、嗅觉区或其组合中。

142.根据权利要求141所述的方法，其中所述中脑区包括运动相关区、感觉相关区或二者。

143.根据权利要求140所述的方法，其中所述神经元细胞位于所述受试者的皮层、齿状回、纹状体、小脑、嗅球或其组合中。

144.根据权利要求140-143中任一项所述的方法，其中所述神经元细胞包括神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞或其组合。

145.根据权利要求144所述的方法，其中所述神经元细胞包括神经元。

146.根据权利要求140所述的方法，其中所述神经元细胞位于所述受试者的脊髓中。

147.根据权利要求146所述的方法，其中所述神经元细胞位于所述脊髓的背角中。

148.根据权利要求146或147所述的方法，其中所述神经元细胞位于腰脊髓、胸脊髓、颈脊髓或其组合中。

149.根据权利要求130-138中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞选自膀胱细胞、血细胞、骨细胞、内皮细胞、上皮细胞、脂肪细胞、心脏细胞、肠细胞、肾细胞、肝细胞、肺细胞、肌肉细胞、胰腺细胞、视网膜细胞、性细胞、皮肤细胞、脾细胞、干细胞及其组合。

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