EA044679B1 - Вариантные аденоассоциированные вирусы и способы их применения - Google Patents
Вариантные аденоассоциированные вирусы и способы их применения Download PDFInfo
- Publication number
- EA044679B1 EA044679B1 EA201990033 EA044679B1 EA 044679 B1 EA044679 B1 EA 044679B1 EA 201990033 EA201990033 EA 201990033 EA 044679 B1 EA044679 B1 EA 044679B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- protein
- aav
- aav particle
- neurons
- retrograde
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 46
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 65
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 62
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 57
- 210000001176 projection neuron Anatomy 0.000 claims description 49
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 41
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 40
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 claims description 39
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 38
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 38
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 36
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 35
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 35
- 210000001577 neostriatum Anatomy 0.000 claims description 33
- 230000007441 retrograde transport Effects 0.000 claims description 32
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 26
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 claims description 22
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 20
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 18
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 17
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 claims description 16
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 claims description 16
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 claims description 15
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 claims description 15
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 15
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 15
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims description 15
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 claims description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 12
- 241000701114 Canine adenovirus 2 Species 0.000 claims description 11
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 claims description 11
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims description 10
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 10
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 claims description 10
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 9
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 claims description 9
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 claims description 9
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 9
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 9
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 9
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 claims description 9
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims description 8
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 7
- -1 CMV Proteins 0.000 claims description 7
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 claims description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 7
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 7
- 102000004547 Glucosylceramidase Human genes 0.000 claims description 6
- 108010017544 Glucosylceramidase Proteins 0.000 claims description 6
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 claims description 6
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 claims description 6
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 claims description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 6
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 5
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 claims description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 claims description 4
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims description 4
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 4
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 claims description 4
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- 206010003805 Autism Diseases 0.000 claims description 3
- 208000020706 Autistic disease Diseases 0.000 claims description 3
- 102000004657 Calcium-Calmodulin-Dependent Protein Kinase Type 2 Human genes 0.000 claims description 3
- 108010003721 Calcium-Calmodulin-Dependent Protein Kinase Type 2 Proteins 0.000 claims description 3
- 108010035848 Channelrhodopsins Proteins 0.000 claims description 3
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 claims description 3
- 102000003869 Frataxin Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000217 Frataxin Proteins 0.000 claims description 3
- 208000024412 Friedreich ataxia Diseases 0.000 claims description 3
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 claims description 3
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 claims description 3
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 claims description 3
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 claims description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 3
- 108010050754 Halorhodopsins Proteins 0.000 claims description 3
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 claims description 3
- 241000288906 Primates Species 0.000 claims description 3
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 claims description 3
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 claims description 3
- 201000007737 Retinal degeneration Diseases 0.000 claims description 3
- 102000017299 Synapsin-1 Human genes 0.000 claims description 3
- 108050005241 Synapsin-1 Proteins 0.000 claims description 3
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 claims description 3
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 claims description 3
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 claims description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 claims description 3
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 230000004656 cell transport Effects 0.000 claims description 3
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 3
- 230000025563 intercellular transport Effects 0.000 claims description 3
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 claims description 3
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 claims description 3
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 claims description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 3
- 230000003227 neuromodulating effect Effects 0.000 claims description 3
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 claims description 3
- 108010040003 polyglutamine Proteins 0.000 claims description 3
- 230000004258 retinal degeneration Effects 0.000 claims description 3
- 201000000980 schizophrenia Diseases 0.000 claims description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 3
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 claims description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 claims description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 claims description 2
- 208000002320 spinal muscular atrophy Diseases 0.000 claims description 2
- 101150116191 Hsp23 gene Proteins 0.000 claims 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 claims 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 claims 1
- 208000009668 Neurobehavioral Manifestations Diseases 0.000 claims 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 claims 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 claims 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 claims 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 claims 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 claims 1
- 230000032405 negative regulation of neuron apoptotic process Effects 0.000 claims 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 36
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 36
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 36
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 30
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 26
- 229920001184 polypeptide Chemical group 0.000 description 25
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 21
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 20
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 19
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 17
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 description 16
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 16
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 15
- 210000000857 visual cortex Anatomy 0.000 description 15
- 210000001103 thalamus Anatomy 0.000 description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 10
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 9
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 9
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 9
- 238000011160 research Methods 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 101150044789 Cap gene Proteins 0.000 description 7
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 7
- 101100166144 Staphylococcus aureus cas9 gene Proteins 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 7
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 6
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 6
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 6
- 210000003863 superior colliculi Anatomy 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 5
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 5
- 210000004727 amygdala Anatomy 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 5
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 5
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 5
- 241001655883 Adeno-associated virus - 1 Species 0.000 description 4
- 241001634120 Adeno-associated virus - 5 Species 0.000 description 4
- 241001164825 Adeno-associated virus - 8 Species 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 210000004227 basal ganglia Anatomy 0.000 description 4
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 4
- DVGHHMFBFOTGLM-UHFFFAOYSA-L fluorogold Chemical compound F[Au][Au]F DVGHHMFBFOTGLM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 4
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 4
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 3
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 210000001029 dorsal striatum Anatomy 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 210000001353 entorhinal cortex Anatomy 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 3
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 3
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 3
- 210000003523 substantia nigra Anatomy 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 3
- 241000972680 Adeno-associated virus - 6 Species 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010055325 EphB3 Receptor Proteins 0.000 description 2
- 102100031982 Ephrin type-B receptor 3 Human genes 0.000 description 2
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 2
- 101150068227 HSP104 gene Proteins 0.000 description 2
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101000821100 Homo sapiens Synapsin-1 Proteins 0.000 description 2
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000270322 Lepidosauria Species 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 2
- 238000002679 ablation Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000013528 artificial neural network Methods 0.000 description 2
- 230000003376 axonal effect Effects 0.000 description 2
- 230000003925 brain function Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 210000003618 cortical neuron Anatomy 0.000 description 2
- 230000000401 corticothalamic effect Effects 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 210000000609 ganglia Anatomy 0.000 description 2
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 2
- 102000054767 gene variant Human genes 0.000 description 2
- 210000001905 globus pallidus Anatomy 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 2
- 239000012120 mounting media Substances 0.000 description 2
- 230000002276 neurotropic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000003518 presynaptic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000976 primary motor cortex Anatomy 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 239000013646 rAAV2 vector Substances 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 210000001202 rhombencephalon Anatomy 0.000 description 2
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000002739 subcortical effect Effects 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000580270 Adeno-associated virus - 4 Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- 239000012114 Alexa Fluor 647 Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 102220478243 Alpha-endosulfine_E36G_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 102100038909 Caveolin-2 Human genes 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000122205 Chamaeleonidae Species 0.000 description 1
- 241001573498 Compacta Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 102000005362 Cytoplasmic Dyneins Human genes 0.000 description 1
- 108010070977 Cytoplasmic Dyneins Proteins 0.000 description 1
- 102220581530 DNA dC->dU-editing enzyme APOBEC-3G_E67A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 102100025907 Dyslexia-associated protein KIAA0319-like protein Human genes 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 101000740981 Homo sapiens Caveolin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101001076904 Homo sapiens Dyslexia-associated protein KIAA0319-like protein Proteins 0.000 description 1
- 101001092197 Homo sapiens RNA binding protein fox-1 homolog 3 Proteins 0.000 description 1
- 208000001021 Hyperlipoproteinemia Type I Diseases 0.000 description 1
- 102100029137 L-xylulose reductase Human genes 0.000 description 1
- 108010080643 L-xylulose reductase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 208000015439 Lysosomal storage disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007476 Maximum Likelihood Methods 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 206010028289 Muscle atrophy Diseases 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 240000007817 Olea europaea Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 208000006735 Periostitis Diseases 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 102220644061 Prostaglandin E synthase 3_E12V_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000508269 Psidium Species 0.000 description 1
- 102100035530 RNA binding protein fox-1 homolog 3 Human genes 0.000 description 1
- 244000286916 Ratibida columnifera Species 0.000 description 1
- 235000009413 Ratibida columnifera Nutrition 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 108010046722 Thrombospondin 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100036034 Thrombospondin-1 Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- RMRJXGBAOAMLHD-IHFGGWKQSA-N buprenorphine Chemical compound C([C@]12[C@H]3OC=4C(O)=CC=C(C2=4)C[C@@H]2[C@]11CC[C@]3([C@H](C1)[C@](C)(O)C(C)(C)C)OC)CN2CC1CC1 RMRJXGBAOAMLHD-IHFGGWKQSA-N 0.000 description 1
- 229960001736 buprenorphine Drugs 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000003198 cerebellar cortex Anatomy 0.000 description 1
- 210000003591 cerebellar nuclei Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000019771 cognition Effects 0.000 description 1
- 230000003920 cognitive function Effects 0.000 description 1
- 230000001427 coherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 210000001787 dendrite Anatomy 0.000 description 1
- 239000003479 dental cement Substances 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000003291 dopaminomimetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000001159 endocytotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002964 excitative effect Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000009459 flexible packaging Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 210000001222 gaba-ergic neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000012246 gene addition Methods 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 238000011239 genetic vaccination Methods 0.000 description 1
- 210000001362 glutamatergic neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000001339 gustatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- NBQNWMBBSKPBAY-UHFFFAOYSA-N iodixanol Chemical compound IC=1C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C=1N(C(=O)C)CC(O)CN(C(C)=O)C1=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C1I NBQNWMBBSKPBAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004359 iodixanol Drugs 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- DKYWVDODHFEZIM-UHFFFAOYSA-N ketoprofen Chemical compound OC(=O)C(C)C1=CC=CC(C(=O)C=2C=CC=CC=2)=C1 DKYWVDODHFEZIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000991 ketoprofen Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 210000000337 motor cortex Anatomy 0.000 description 1
- 201000000585 muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000007658 neurological function Effects 0.000 description 1
- 210000004179 neuropil Anatomy 0.000 description 1
- 238000001216 nucleic acid method Methods 0.000 description 1
- 210000001009 nucleus accumben Anatomy 0.000 description 1
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 230000008447 perception Effects 0.000 description 1
- 210000003460 periosteum Anatomy 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 210000000063 presynaptic terminal Anatomy 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000272 proprioceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 210000002804 pyramidal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000009844 retrograde axon cargo transport Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 102220035002 rs199476061 Human genes 0.000 description 1
- 102200066852 rs5918 Human genes 0.000 description 1
- 102200163548 rs63751094 Human genes 0.000 description 1
- 102220176249 rs886054322 Human genes 0.000 description 1
- 210000004761 scalp Anatomy 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000002805 secondary assay Methods 0.000 description 1
- 210000001044 sensory neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000009919 sequestration Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 210000001679 solitary nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004092 somatosensory cortex Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002889 sympathetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002504 synaptic vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000979 synthetic dye Substances 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 210000001364 upper extremity Anatomy 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 210000005111 ventral hippocampus Anatomy 0.000 description 1
- 210000001030 ventral striatum Anatomy 0.000 description 1
- 230000028973 vesicle-mediated transport Effects 0.000 description 1
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Description
Описание изобретения
Заявление, касающееся исследований или разработок, спонсированных федеральными органами.
Настоящее изобретение выполнено при государственной поддержке в рамках гранта EY022975 Национального института здравоохранения. Правительство обладает определенными правами на изобретение.
Перекрестные ссылки на родственные заявки
По настоящей заявке испрашивается приоритет согласно ст. 35 U.S.C. 119(е) по заявке на патент США 62/350,361, поданной 15 июня 2016 г., и по заявке на патент США 62/404,585, поданной 5 октября 2016 г.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение в целом относится к вариантным адено-ассоциированным вирусам и способам их получения и применения.
Уровень техники
Функции головного мозга, такие как восприятие, познавательные функции и контроль движения, зависят от скоординированного действия крупномасштабных нейронных сетей, которые состоят из локальных модулей в виде цепей, выполняющих конкретные вычисления, и связанных между собой длинными связями, по которым распространяются результаты этих вычислений. Такие длинные связи формируются специализированными проекционными нейронами, которые часто включают несколько частично пересекающихся классов, каждый из которых проецируется на другую нижерасположенную в сети мишень. Проекционные нейроны также участвуют в распространении нескольких нейродегенеративных заболеваний из пространственно локализованных участков их возникновения. Таким образом, способность избирательно нацеливаться на определенные классы проекционных нейронов для доставки трансгена (например, для мониторинга/манипуляции активностью или для редактирования генома с целью направленного нокаута гена или исправления патологических мутаций) является важной как для понимания того, каким образом крупномасштабные сети задействованы в работе мозга и, в конечном итоге, для терапевтического вмешательства при нейродегенеративных заболеваниях.
Вирусные векторы представляют собой важный класс инструментов для введения трансгенов в специфические популяции нейронов, и безусловно, являются наилучшим вариантом генетического доступа к целевым проекционным нейронам через вход в терминали аксонов и ретроградный транспорт их полезной нагрузки в ядра клеток. Несколько видов естественно эволюционирующих нейротропных вирусов, среди которых следует упомянуть вирус бешенства, вирус полиомиелита и вирус простого герпеса (ВПГ), демонстрируют ретроградное распространение в течение своего жизненного цикла. Из них вирус бешенства является особенно нейроинвазивным и быстро распространяется по нервной системе посредством межклеточного переноса. Однако его возможное применение как в биологических исследованиях, так и в генной терапии затруднено из-за чрезмерной вирулентности, хотя в настоящее время наблюдается прогресс в снижении его токсичности. В дополнение к естественным нейротропным штаммам, многие другие вирусы могут инфицировать нейроны при непосредственном введении в нервную систему с помощью вируса псевдобешенства (SuHV1, фактически герпесвируса), аденовирусов и лентивирусов, которые чаще всего используются в исследованиях на животных. Собачий аденовирус-2 (CAV-2) демонстрирует наилучшую инфицирующую способность и ретроградный транспорт в этом классе вирусов и все чаще становится предпочтительным реагентом для доступа к проекционным нейронам. Однако CAV2 обеспечивает только умеренные уровни экспрессии трансгена, является потенциально токсичным и в настоящее время в слабой степени совместим с масштабируемым устойчивым производством для обеспечения клинических исследований или даже исследований на крупных животных. Таким образом, насущной необходимостью остается разработка нетоксичного, легко производимого вирусного вектора, который обеспечивает гибкую упаковку различных трансгенов, устойчиво интернализируется и ретроградно транспортируется аксонами, а также поддерживает длительную высокоэффективную экспрессию полезной нагрузки.
Сущность изобретения
Эффективный ретроградный доступ к проекционным нейронам для доставки сенсоров и эффекторов представляет собой важную и полезную возможность для анализа структуры цепи. Такой подход также был бы полезен для генной терапии, включая лечение нейродегенеративных расстройств, для которых характерно распространение патологии через функционально связанные и высоко распределенные сети. В частности, вирусные векторы являются эффективной несущей средой для доставки генов для нервной системы, но недостатком всех доступных инструментов является неэффективный ретроградный транспорт или ограниченные клинические возможности. Чтобы удовлетворить эту потребность, была применена направленная эволюция in vivo для введения эффективной ретроградной функциональности в капсид аденоассоциированного вируса (AAV) вектора, который показал себя многообещающим в исследованиях в области неврологии и в клинике. Описанный здесь вариант, называемый rAAV2-retro, обеспечивает устойчивый ретроградный доступ к проекционным нейронам с эффективностью, сравнимой с классическими синтетическими ретроградными реагентами для мечения, а также высокий уровень экспрессии, достаточный для изучения функциональных цепей и редактирования генома in vivo с помощью
- 1 044679
CRISPR/Cas9 в целевых популяциях нейронов.
В одном из аспектов изобретение относится к вирусному капсидному белку, который включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из xxDxTKx (SEQ ID NO: 1) и xDxTKxx (SEQ ID NO: 2). В одном из вариантов осуществления вирусный капсидный белок имеет по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 или 78. В одном из вариантов осуществления вирусный капсидный белок имеет последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 или 78. В одном из вариантов осуществления вирусный капсидный белок кодируется нуклеиновой кислотой, имеющей по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 или 77. В одном из вариантов осуществления вирусный капсидный белок кодируется нуклеиновой кислотой, имеющей последовательность, приведенную в SEQ ID NO: SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 и 77.
В еще одном аспекте изобретение относится к вирусной частице, которая включает вирусный капсидный белок, описанный в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления вирусная частица демонстрирует предпочтение к ретроградному движению. В некоторых вариантах осуществления вирусная частица обладает способностью к ретроградному транспорту.
В некоторых вариантах осуществления вирусная частица, описанная в настоящей заявке, дополнительно включает нуклеиновую кислоту, кодирующую полезную нагрузку. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая полезную нагрузку, включает промоторную последовательность, функционально связанную с кодирующей последовательностью, которая кодирует полезную нагрузку. Типичные промоторные последовательности включают, без ограничения, синапсин-1, CMV, GFAP, CAG, CaMKII, MBP, EF1альфа, TRE и mDlx. В некоторых вариантах осуществления кодирующую последовательность, которая кодирует полезную нагрузку, выбирают из группы, состоящей из кодирующего белок гена и нуклеиновой кислоты - ингибирующей РНК. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, ингибирующая РНК, представляет собой антисмысловой олигонуклеотид, миРНК или РНКи.
В некоторых вариантах осуществления полезная нагрузка представляет собой эффекторный белок. Типичные эффекторные белки включают, без ограничения, рекомбиназу (например, Cre или Flp), систему редактирования генов (например, CRISPR/Cas9, TALEN, нуклеазу цинкового пальца), оптогенетические реагенты (активаторы (например, канальный родопсин или его варианты)) или ингибиторы (например, галородопсин или Arch), хемогенетические реагенты (например, версии активатор/ингибитор систем DREADD или PSAM/PSEM), активаторы и/или ингибиторы клеточных сигнальных путей и ферменты эпигенетического контроля.
В некоторых вариантах осуществления полезная нагрузка представляет собой оптическую репортерную конструкцию. Типичные оптические репортерные конструкции включают, без ограничения, GCaMP6 (s, m или f), флуорофор (например, зеленый флуоресцентный белок (GFP), усиленный GFP (EGFP), красный флуоресцентный белок (RFP), желтый флуоресцентный белок (YFP), tdTomato), изменяющую цвет конструкцию (например, полезную нагрузку, которая экспрессирует один репортер в одной клеточной популяции, а другой репортер - в другой популяции), сенсоры глюкозы, jRCaMP, jRGECO и CaMPARI, индикаторы напряжения, вторичные мессенджеры, сигнализаторы рецепторов, транскрипционные репортеры, эпигенетические репортеры и нейромодуляторные репортеры.
В некоторых вариантах осуществления полезная нагрузка представляет собой вирусный белок. Типичным вирусным белком является G белок вируса бешенства. В некоторых вариантах осуществления вирусный белок представляет собой белок, который дополняет функцию вируса, отличного от AAV, или белок, который относится к клеточному и межклеточному транспорту.
В некоторых вариантах осуществления кодирующая последовательность, которая кодирует полезную нагрузку, представляет собой терапевтический ген. В некоторых вариантах осуществления терапевтический ген предназначен для лечения нейродегенеративного заболевания. В некоторых вариантах осуществления терапевтический ген представляет собой HSP104 для лечения болезни Альцгеймера или другого заболевания, связанного с токсичными агрегатами белков. В некоторых вариантах осуществления терапевтический ген представляет собой фратаксин для лечения атаксии Фридрейха. В некоторых вариантах осуществления терапевтический ген представляет собой лизосомальную глюкоцереброзидазу (GBA) для лечения болезни Прксинсона. В некоторых вариантах осуществления терапевтический ген представляет собой полиQ-связывающий белок для лечения болезни Хантингтона. В некоторых вариантах осуществления терапевтический ген представляет собой мотонейрон выживания 1 для лечения мышечной атрофии позвоночника, бокового амиотрофического склероза (ALS), аутизма, деменции, периферической невропатии, шизофрении или дегенерации сетчатки.
В некоторых вариантах осуществления полезная нагрузка представляет собой терапевтический фрагмент. Типичным терапевтическим фрагментом является антитело или его фрагмент. Типичным те
- 2 044679 рапевтическим фрагментом является иммуномодуляторный белок. Типичным терапевтическим фрагментом является молекула, действующая по принципу РНК-интерференции.
В некоторых вариантах осуществления вирусные частицы, описанные в настоящей заявке, демонстрируют на два порядка более высокий уровень ретроградного доступа к кортико-понтинным проекционным нейронам по сравнению с собачьим аденовирусом-2 (CAV-2). В некоторых вариантах осуществления ретроградный доступ к кортико-понтинным проекционным нейронам или афферентам к дорсомедиальному стриатуму (DMS) сравним с синтетическим индикатором, флуоресцентными гранулами Fluoro-Gold.
В некоторых аспектах изобретение относится к способу доставки полезной нагрузки в один или более нейронов. Такой способ обычно включает контактирование одного или более нейронов с вариантным аденоассоциированным вирусом (AAV), который включает полезную нагрузку, упакованную в нем, причем вариантный AAV включает капсидный белок, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из xxDxTKx (SEQ ID NO: 1) и xDxTKxx (SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах осуществления вариантный AAV имеет ретроградное движение в нейронах.
В некоторых вариантах осуществления нейроны являются проекционными нейронами. В некоторых вариантах осуществления нейроны находятся у пациента (например, в центральной нервной системе (ЦНС) пациента). В некоторых вариантах осуществления пациент является человеком. В некоторых вариантах осуществления пациент не является человеком (например, является приматом, грызуном, рептилией или птицей). В некоторых вариантах осуществления этап контактирования происходит в культуре клеток. В некоторых вариантах осуществления этап контактирования происходит in vivo посредством внутричерепной, внутриспинальной или внутримышечной инъекции.
Если не указано иное, все технические и научные термины, которые используются в настоящей заявке, имеют те же самые значения, как их обычно понимают специалисты в области техники, к которой относятся способы и композиции по настоящему изобретению. Несмотря на возможность использования на практике или в испытаниях настоящего изобретения способов и материалов, подобных или эквивалентных тем, которые описаны в настоящем документе, ниже описаны подходящие способы и материалы. В дополнение к этому, материалы, способы и примеры являются всего лишь иллюстрацией и не предназначены для ограничения. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие цитируемые документы, упомянутые в настоящем документе, полностью включены в настоящее описание путем ссылки.
Описание фигур
На фиг. 1 показана направленная эволюция rAAV2-retro. На панели А фиг. 1 схематически представлена процедура направленной эволюции. Библиотеки плазмид, содержащие вариантные гены cap AAV, предварительно созданные методом ПЦР с внесением ошибок, вставки пептидов, рандомизированные петлевые участки и ДНК с перестановками упаковывали и инъецировали в черную субстанцию или глубокие ядра мозжечка. Через 3 недели ткани стриатума или заднего мозга, соответственно, удаляли, выделяли вирусные геномы и отобранные гены cap амплифицировали и упаковывали для следующего цикла отбора. На панели В фиг. 1 показаны перекрывающиеся субпопуляции корковых нейронов, выступающих в стриатум (полосатое тело) (СР: caudate-putamen (дорсальный стриатум)), таламус и верхнее двухолмие (SC, superior colliculus), ретроградно меченные путем инъекции rAAV2-retro, несущие различные флуоресцентные белки в соответствующее аксональную область.
На фиг. 2 показаны результаты экспериментов по количественной оценке эффективности ретроградного транспорта. На панели А фиг. 2 показан кортико-понтинный тракт, меченный путем инъекции rAAV2-retro в базальное ядро понтинов [В верхней части панели А показана схема эксперимента; соответствие нацеливания и качество инъекции контролировали путем совместно введенной AAV1-CAGEGFP. В нижней части панели А показан уровень экспрессии через 3 недели после инъекции. Масштабная полоска: 1 мм]. На панели В фиг. 2 показана схема выполнения количественного анализа [В верхней части панели В показана схема эксперимента; стрелка указывает на ожидаемое мечение ядерным GFP в корковых нейронах кортико-понтинного тракта. В средней части панели В представлено репрезентативное изображение мозга с инъецированным AAV2. В нижней части панели В представлено репрезентативное изображение мозга с инъецированным rAAV2retro. Масштабная полоска: 1 мм]. На панели С фиг. 2 показана схема полуавтоматической процедуры количественного определения. Флуоресцентные ядра (зеленые) автоматически детектировали и подсчитывали вдоль нарисованной вручную линии, указывающей длину кортикального слоя V (черный). На панели D фиг. 2 показана эффективность ретроградного транспорта для различных серотипов AAV и для собачьего аденовируса-2 (CAV-2). Планки погрешности представляют SEM. См. также фиг. 8.
На фиг. 3 показаны результаты экспериментов, демонстрирующие общий принцип ретроградного транспорта, обеспечиваемого rAAV2-retro. На панели А фиг. 3 представлены репрезентативные изображения, показывающие обширные меченные зоны в основных входных структурах дорсального стриатума, включая кору (изображение № 1), миндалину (изображение № 3) и таламус (изображение № 4). На панели В фиг. 3 показана схема автоматического количественного определения ретроградного мечения во всем мозге. Получали изображения мозга Rosa26-LSL-H2B-GFP с инъецированным hSyn1-Cre rAAV2
- 3 044679 retro для визуализации окрашенных DAPI ядер и зеленой флуоресценции в ядрах, экспрессирующих H2B-GFP. Зеленый канал используется для обнаружения меченых нейронов; синий канал выровнен с изображениями Nissl для стандартного мышиного мозга из института исследования мозга Аллена. Выравнивание позволяет распределить обнаруженные нейроны по различным областям, используя аннотацию, предоставленную в атласе мозга. Масштабная полоска: 1,25 мм. На панели С фиг. 3 показано количественное определение в масштабе всего мозга ретроградного мечения небольшой зоны дорсомедиального стриатума. Сокращения, используемые для обозначения различных областей мозга, даны в соответствии с Атласом мозга Аллена. Стрелка указывает на SNc. Планки погрешности представляют SEM.
На фиг. 4 представлены данные экспериментов, в которых систему rAAV2-retro объединяли с линиями драйвера Cre. На панели А фиг. 4 показана схема эксперимента. rAAV2-retro, несущий Creзависимый изменяющий цвет флуоресцентный репортер, инъецировали в стриатум Cre-линии, специфической в отношении кортикального слоя V. На панели В фиг. 4 показаны два кортикостриарных пути, меченные разными способами: в одном из путей - посредством Cre-зависимой инверсии репортера.
На фиг. 5 приведены данные экспериментов, показывающие, что rAAV2-retro поддерживает экспрессию трансгена на уровне, достаточном для изучения функциональной цепи. На панели А фиг. 5 представлена схема эксперимента. Экспрессия индикатора кальция GCaMP6f ограничена кортикопонтинными нейронами при помощи локализованной инъекции rAAV2-retro в базальные ядра понтинов. Панель В фиг. 5 представляет собой поперечное сечение мозга, на котором показана экспрессия GCaMP6f во всем кортико-понтинном тракте. На панели С фиг. 5 показана максимальная проекция изображения, полученного методом двухфотонной кальциевой визуализации, показывающего сомы пирамидного тракта слоя V и апикальные дендриты. На панели D фиг. 5 показана активность 89-ти представляющих интерес областей во время выполнения движений с одной свободной рукой (вторая рука зафиксирована) (ломаная линия означает тональный сигнал go). Панель Е и панель F на фиг. 5 представляют собой два примера одиночных кортико-понтинных нейронов во время 40 последовательных испытаний (результаты на панели В и на панели D фиг. 5 показаны для одного и того же животного).
На фиг. 6 приведены данные, показывающие, что система rAAV2-retro позволяет редактировать геном in vivo с помощью CRISPR/Cas9. На панели А фиг. 6 представлена схема эксперимента [В верхней части панели А показано, что система rAAV2-retro использовалась для доставки Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9) - единственной комбинации гидовой РНК, разработанной для уменьшения уровня экспрессии tdTomato. В нижней части панели А показано, что rAAV2-retro, несущий полезную нагрузку SaCas9anti-tdTomato, инъецировали в базальные ядра понтинов мышей, экспрессирующие tdTomato из одного геномного локуса в нейронах слоя V]. На панели В фиг. 6 представлены репрезентативные изображения срезов головного мозга животных, которым вводили систему CRISPR/Cas9, нацеленную на tdTomato или несущую нецелевую гидовую РНК. SaCas9, меченный эпитопом, позволяет идентифицировать ретроградно меченные нейроны (канал зеленого цвета). Направленные вверх стрелки показывают ожидаемое мечение после успешной абляции tdTomato; направленные вниз стрелки показывают ожидаемое мечение, если экспрессия tdTomato не подверглась воздействию. На панели С фиг. 6 показана эффективность абляции. Планки погрешности представляют SEM.
На фиг. 7 представлены данные, показывающие, что rAAV2-retro участвует в эффективном доступе к проекционным нейронам у крысы (данные, показанные на фиг. 7, относятся к данным, показанным на фиг. 1). На панели А фиг. 7 представлена схема инъекции. Отдельные партии rAAV2-retro, экспрессирующего EGFP или tdTomato, вводили в стриатум или в верхний бугорок четверохолмия, соответственно. На панелях В-Е фиг. 7 показаны проекционные нейроны в различных областях мозга, к которым получен доступ посредством этих локализованных инъекций, с получением изображений через 3 недели после доставки вируса.
На фиг. 8 представлены репрезентативные изображения головного мозга животных, которым инъецировали различные серотипы AAV в базальные ядра понтинов, показывающие, что ни один из встречающихся в природе серотипов AAV не соответствует характеристикам rAAV2-retro в кортикопонтинной цепи (данные, показанные на фиг. 8, относятся к данным, показанным на фиг. 2).
Фиг. 9 представлены данные, показывающие пониженное сродство rAAV2-retro к гепарину по сравнению с его родительским серотипом AAV2 (данные, показанные на фиг. 9, относятся к данным, показанными на фиг. 1). На панели А фиг. 9 представлена схема оценки связывания гепарина. На панели В фиг. 9 показана фракция вируса, элюированная путем повышения концентраций NaCl после загрузки в 150 мМ NaCl. Фракция загрузки представляет собой вирус, извлеченный из проточной колонки после загрузки образца в 150 мМ NaCl. Планки погрешности представляют SD.
Подробное описание изобретения
Рекомбинантные аденоассоциированные вирусы (rAAV) стали эффективной платформой для генной терапии in vivo, поскольку они обеспечивают высокий уровень экспрессии трансгена, нетоксичны и вызывают минимальные иммунные ответы. Эти свойства лежали в основе решения по предоставлению первого полного официального одобрения лечения методами генной терапии путем rAAVопосредованного восстановления дефицита липопротеинлипазы (см., например, Gaudet et al., 2010, Supplem Atherosclerosis Supplem., 11:55-60). В клинических испытаниях rAAV демонстрируют большие пер
- 4 044679 спективные возможности лечения ряда неврологических расстройств и являются одними из наиболее распространенных векторов, используемых в исследованиях по нейробиологии. После открытия того факта, что AAV может подвергаться ретроградному транспорту (Kaspar et al., 2002, Mol. Ther., 5:50-56), rAAV стали использовать в некоторых исследованиях для ретроградного доступа к проекционным нейронам в избранных цепях, но их природная предрасположенность к ретроградному транспорту является низкой, что затрудняет изучение роли проекционных нейронов в выполнении вычислений цепей или прогрессировании заболеваний.
В настоящей заявке описан новый вариант rAAV (rAAV2-retro), который в дополнение к своей обычной способности инфицировать тела нейронных клеток в месте воздействия надежно интернализуется в аксонах и обеспечивает ретроградный доступ к проекционным нейронам с эффективностью, сравнимой с классическим реагентами ретроградного мечения, такими как синтетические красители. Описанная в настоящей заявке система rAAV2-retro доставки генов может быть использована сама по себе или в комбинации с линиями драйвера рекомбиназы Cre для достижения долгосрочной экспрессии трансгена на высоком уровне, которая является достаточной для эффективного функционального изучения функции нервной цепи, а также для редактирование генома в целевых популяциях нейронов.
При ретроградном транспорте молекулы и/или органеллы доставляются из концов аксонов к телу клетки. Ретроградный аксональный транспорт опосредуется цитоплазматическим динеином и используется, например, для отправки химических сообщений и продуктов эндоцитоза, направляемых в эндолизосомы, из аксона обратно в клетку. Работая in vivo со средней скоростью примерно 2 мкм/с, быстрый ретроградный транспорт может охватывать 10-20 сантиметров в сутки. Быстрый ретроградный транспорт возвращает использованные синаптические везикулы и другие материалы в сому и сообщает соме о состоянии на концах аксонов. Таким образом, используемый в настоящем описании ретроградный транспорт относится к движению в аксоне в направлении к телу клетки.
Последовательности нуклеиновых кислот и полипептидов аденоассоциированного вируса (AAV).
Как описано в настоящей заявке, были идентифицированы консенсусные последовательности, которые, если они присутствуют в капсидном белке AAV, приводят к значительному повышению эффективности ретроградного транспорта. Такими консенсусными последовательностями являются xxDxTKx (SEQ ID NO: 1) или xDxTKxx (SEQ ID NO: 2). Для демонстрации эффективности описанных в настоящей заявке консенсусных последовательностей, используемых для обеспечения способности к ретроградному транспорту, создавали семнадцать различных капсидных последовательностей, каждая из которых содержит описанные в настоящей заявке консенсусные последовательности, и было показано их предпочтение к ретроградному движению в нейронах. Последовательности нуклеиновых кислот этих 40 капсидных последовательностей приведены в SeQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 и 77, а кодируемые капсидные полипептиды, каждый из которых содержит одну из консенсусных последовательностей, описанных в настоящей заявке, приведены в SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 и 78, соответственно.
Дополнительно к капсидным полипептидам, имеющим последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 и 78, представлены полипептиды, которые имеют, по меньшей мере, 95% идентичность последовательности (например, по меньшей мере, 96%, по меньшей мере, 97%, по меньшей мере, 98%, по меньшей мере, 99% или 100% идентичность последовательности) по отношению к капсидным полипептидам, имеющим последовательности, приведенные в SEQ ID NO: SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 и 78. Аналогично, дополнительно к молекулам нуклеиновой кислоты, имеющим последовательности, приведенные в SEQ ID NO: SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 и 77, приведены молекулы нуклеиновых кислот, которые имеют по меньшей мере 95% идентичность последовательности (например, по меньшей мере, 96%, по меньшей мере, 97%, по меньшей мере, 98%, по меньшей мере, 99% или 100% идентичность последовательности) по отношению к молекулам нуклеиновых кислот, имеющим последовательности, приведенные в SEQ ID NO: SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 и 77.
При вычислении процентной идентичности последовательностей две последовательности выравнивают и определяют количество идентичных совпадений нуклеотидов или аминокислотных остатков между двумя последовательностями. Количество идентичных совпадений делят на длину выровненной области (т.е., количество выровненных нуклеотидов или аминокислотных остатков) и умножают на 100, получая значение идентичности последовательности, выраженное в процентах. Понятно, что длина выровненной области может быть частью одной или обеих последовательностей вплоть до полной длины самой короткой последовательности. Также должно быть понятно, что одна последовательность может быть выровнена с более чем одной другими последовательностями и, следовательно, может иметь разные процентные значения идентичности последовательности в каждой выровненной области.
Выравнивание двух или более последовательностей для определения процента идентичности по
- 5 044679 следовательностей может быть выполнено с помощью алгоритма, описанного у Altschul et al. (1997, Nucleic Acids Res., 25:3389 3402) в том виде, как он включен в программы BLAST (основной инструмент поиска локального выравнивания), доступные по адресу ncbi.nlm.nih.gov во Всемирной паутине. Поиск BLAST можно использовать для определения процента идентичности последовательности между последовательностью (нуклеиновой кислоты или аминокислотных остатков) и любой другой последовательностью или ее частью, выровненной с помощью алгоритма, описанного у Altschul et al., BLASTN - это программа, используемая для выравнивания и сравнения последовательностей нуклеиновых кислот для определения уровня идентичности, в то время как BLASTP - это программа, используемая для выравнивания и сравнения аминокислотных последовательностей для определения уровня идентичности. При использовании программ BLAST для расчета процента идентичности между одной последовательностью и другой последовательностью обычно используются параметры по умолчанию соответствующих программ.
Также предлагаются векторы, содержащие молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептиды. Векторы, включая векторы экспрессии, являются коммерчески доступными или могут быть получены рекомбинантными методами. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, может иметь один или более элементов для экспрессии, функционально связанных с такой молекулой нуклеиновой кислоты, и дополнительно может включать последовательности, такие как последовательности, кодирующие селектируемый маркер (например, ген устойчивости к антибиотику), и/или последовательности, которые могут быть использованы при очистке полипептида (например, метки 6xHis). Элементы для экспрессии включают последовательности нуклеиновых кислот, которые направляют и регулируют экспрессию кодирующих последовательностей нуклеиновой кислоты. Одним из примеров элемента экспрессии является промоторная последовательность. Элементы экспрессии также могут включать одну или более интронных, энхансерных последовательностей, элементы ответа или индуцибельные элементы, которые модулируют экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты. Элементы экспрессии могут быть бактериальными, дрожжевыми, полученными от насекомого, млекопитающего или вирусными, а векторы могут содержать комбинацию элементов экспрессии из разных источников. Используемый в настоящей заявке термин функционально связанный означает, что элементы экспрессии расположены в векторе относительно кодирующей последовательности таким образом, чтобы они могли направлять или регулировать экспрессию кодирующей последовательности.
Молекула нуклеиновой кислоты, например, молекула нуклеиновой кислоты в векторе (например, векторе экспрессии, вирусном векторе) может быть введена в клетку-хозяина. Термин клетка-хозяин относится не только к конкретной клетке(-ам), в которую была введена молекула нуклеиновой кислоты, но также к потомству или потенциальному потомству такой клетки. Специалистам в данной области известны многие подходящие клетки-хозяева; клетки-хозяева могут быть прокариотическими клетками (например, E.coli) или эукариотическими клетками (например, дрожжевыми клетками, клетками насекомых, растительными клетками, клетками млекопитающих). Типичные клетки-хозяева могут включать, без ограничения, А549, WEHI, 3T3, 10Т1/2, ВНК, MDCK, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, WI38, HeLa, клетки 293, Saos, C2C12, L клетки, НТ1080, HepG2 и первичные фибробласты, гепатоциты и миобласты, полученные от млекопитающих, включая человека, обезьяну, мышь, крысу, кролика и хомяка. Способы введения молекул нуклеиновых кислот в клетки-хозяева хорошо известны в данной области и включают, без ограничения, осаждение фосфатом кальция, электропорацию, тепловой шок, липофекцию, микроинъекцию и вирус-опосредованный перенос нуклеиновой кислоты (например, трансдукцию).
Что касается полипептидов, термин очищенный относится к полипептиду (т.е., пептиду или полипептиду), который был отделен или очищен от клеточных компонентов, окружающих в естественных условиях указанный полипептид. Как правило, полипептид считается очищенным, когда он составляет по меньшей мере 70% (например, по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99%) относительно сухого веса, не содержит полипептидов и молекул, связанных с ним в естественных условиях. Поскольку химически синтезированный полипептид по природе отделен от сопровождающих его компонентов, синтетический полипептид считается очищенным, но в дальнейшем его можно выделить из компонентов, используемых для синтеза этого полипептида (например, аминокислотных остатков). Что касается молекул нуклеиновой кислоты, изолированный относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая отделена от других молекул нуклеиновых кислот, обычно связанных с ней в геноме. Кроме того, изолированная молекула нуклеиновой кислоты может включать сконструированную молекулу нуклеиновой кислоты, такую как рекомбинантная или синтетическая молекула нуклеиновой кислоты.
Полипептиды могут быть получены (например, очищены) из природных источников (например, из биологического образца) известными методами, такими как ионообменная DEAE, гель-фильтрация и/или гидроксиапатитная хроматография. Очищенный полипептид также может быть получен, например, путем экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты в векторе экспрессии или химическим синтезом. Степень чистоты полипептида может быть измерена любым подходящим методом, например колоночной хроматографией, электрофорезом в полиакриламидном геле или ВЭЖХ анализом. Аналогично, молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены (например, выделены) обычными методами, такими как, без ограничения, методами рекомбинантных нуклеиновых кислот (например, расщеплением и лигирова
- 6 044679 нием рестриктазой) или полимеразной цепной реакцией (ПЦР; см., например, PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach & Dveksler, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995). Кроме того, изолированные молекулы нуклеиновых кислот могут быть химически синтезированы.
Методы получения вирусных частиц, которые демонстрируют предпочтение к ретроградному движению в нейронах.
После получения капсидного полипептида или после создания и экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты для получения капсидного полипептида, полипептид может быть упакован в вирусную частицу при помощи, например, упаковывающей клетки-хозяина. Компоненты вирусной частицы (например, последовательности rep, последовательности cap, последовательности инвертированного концевого повтора (ITR)) могут быть временно или стабильно введены в упаковывающую клетку-хозяина с использованием одного или более векторов. В то время как капсидный полипептид вирусной частицы может содержать консенсусную последовательность, описанную в настоящей заявке, остальные компоненты могут быть из одного или более известных серотипов AAV (например, AAV2, AAV8 и т.д.).
Такие вирусные частицы могут быть очищены обычными методами. Используемый в настоящей заявке термин очищенные вирусные частицы относится к вирусным частицам, освобожденным от компонентов смеси, в которой они были сконструированы, таких как, без ограничения, вирусных компонентов (например, последовательностей rep, последовательностей cap), упаковывающих клеток-хозяев, и частично или не полностью собранных вирусных частиц.
После сборки вирусные частицы могут быть подвергнуты скринингу, например, на способность к репликации; свойства переноса генов; способность связываться с рецептором; и/или доминирование серотипа в популяции (например, в популяции людей). Определение того, может ли вирусная частица реплицироваться, является обычным в данной области техники и обычно включает инфицирование клеткихозяина некоторым количеством вирусных частиц и определение, увеличивается ли количество вирусных частиц с течением времени. Определение, способна ли вирусная частица осуществлять перенос гена, также является обычным в данной области и обычно включает инфицирование клеток-хозяев вирусными частицами, содержащими трансген (например, обнаруживаемый трансген, такой как репортерный ген). После заражения и очистки от вируса клетки-хозяева могут быть оценены на наличие или отсутствие трансгена. Определение того, связывается ли вирусная частица со своим рецептором, является обычным методом в данной области техники, и такие методы могут быть выполнены in vitro или in vivo.
В данной области техники обычно выполняют определение доминирования серотипа вирусной частицы, которое как правило включает использование иммуноанализа для определения доминирования одного или более антител в образцах (например, образцах крови), пролученных из конкретной популяции индивидуумов. В данной области техники под доминированием серотипа понимают долю пациентов в популяции, которая является серопозитивной (т.е., подверглась воздействию определенного патогена или иммуногена), и рассчитывается как число пациентов в популяции, которые продуцируют антитело против конкретного патогена или иммуногена, деленное на общее количество индивидуумов в популяции. В данной области техники хорошо известны иммуноанализы, которые включают, без ограничения, иммунодот, вестерн-блот, иммуноферментный анализ (EIA), твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) или радиоиммуноанализ (RIA). Аналогично, известно несколько методов определения уровня нейтрализующих антител в образце сыворотки. Например, в анализе нейтрализующих антител измеряют титр, при котором экспериментальный образец содержит концентрацию антитела, которая нейтрализует инфекцию на 50% или более по сравнению с контрольным образцом, не содержащем антитела. См. также, Fisher et al. (1997, Nature Med., 3:306-12); и Manning et al. (1998, Human Gene Ther., 9:477-85).
Методы использования вирусов, которые демонстрируют предпочтение к ретроградному движению в нейронах.
Вирус или его часть, как описано в настоящем документе, можно использовать в различного рода исследованиях и/или для применения в терапии. Например, вирус или его часть, описанные в настоящей заявке, можно использовать в медицине человека или животных для генной терапии (например, в векторе или векторной системе для переноса генов) или для вакцинации (например, для презентации антигена). Более конкретно, вирус или его часть, описанные в настоящей заявке, можно использовать для добавления генов, воспроизводства генов, генетической доставки терапевтического полипептида, генетической вакцинации, сайленсинга генов, редактирования генома, генной терапии, доставки РНКи, доставки кДНК, доставки мРНК, доставки микроРНК, поглощения микроРНК, генетической иммунизации, оптогенетической генной терапии, трансгенеза, ДНК-вакцинации или ДНК-иммунизации.
Клетка-хозяин может быть трансдуцирована или инфицирована вирусом или его частью in vitro (например, растущая в культуре клетка) или in vivo (например, у пациента, например человека или не человека). Клетки-хозяева, которые могут быть трансдуцированы или инфицированы вирусом или его частью in vitro описаны в настоящей заявке; клетки-хозяева, которые могут быть трансдуцированы или инфицированы вирусом или его частью in vivo, включают, без ограничения, проекционные нейроны (например, кортико-понтинные проекционные нейроны, симпатические проекционные нейроны, проекционные нейроны центральной нервной системы), афференты к дорсомедиальному стриатуму (DMS), спинальные кортикальные/грибовидные нейроны, прецеребеллярные нейроны, входы в базальные ганглии,
- 7 044679 преталамические нейроны, двигательные нейроны, сенсорные нейроны или другие нейроны или клетки центральной нервной системы.
Вирус или его часть, описанные в настоящей заявке, могут быть модифицированы путем включения полезной нагрузки. Полезная нагрузка обычно включает по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту (например, промоторную последовательность, функционально связанную с кодирующей последовательностью, которая кодирует полезную нагрузку). В определенных случаях полезной нагрузкой может быть ингибирующая нуклеиновая кислота. В данной области техники известны ингибирующие нуклеиновые кислоты, которые включают, например, антисмысловые олигонуклеотиды, малые интерферирующие РНК (миРНК) и молекулы РНК-интерференции (РНКи). В определенных случаях полезная нагрузка может представлять собой один или более генов, кодирующих белок. Гены, кодирующие белок, включают, без ограничения, оптическую репортерную конструкцию, терапевтический ген или эффекторный белок.
В данной области техники известны многие типы оптических репортерных конструкций, и приведенный ниже список служит в качестве примера и не является исчерпывающим. Например, оптические репортерные конструкции включают, без ограничения, GCaMP6 (GCaMP6s, GCaMP6m или GCaMP6f; см. WO 2014/059154), флуорофор (например, зеленый флуоресцентный белок (GFP), усиленный GFP (EGFP), красный флуоресцентный белок (RFP), желтый флуоресцентный белок (YFP), tdTomato), изменяющую цвет конструкцию (например, полезную нагрузку, которая экспрессирует один репортерный белок в одной клеточной популяции, а другой репортерный белок - в другой популяции), сенсоры глюкозы, (см., например, заявку на патент США 2015/0111222), jRCaMP (патент США 9,644,007), jRGECO (см., например, патент США 9,644,007), CaMPARI (см., например, патент США 9,518,996), индикаторы напряжения, вторичные мессенджеры, сигнализаторы рецепторов, транскрипционные репортеры, эпигенетические репортеры и нейромодуляторные репортеры.
Терапевтические гены также известны в данной области техники и их выбор зависит от конкретного заболевания или расстройства, подверженного лечению. Например, терапевтический ген может быть предназначен для лечения нейродегенеративного расстройства. Типичные терапевтические гены (или кодируемый полипептид) и связанные с ними нейродегенеративные расстройства включают, без ограничения, HSP104 для лечения болезни Альцгеймера, Ataxis (например, фратаксин) для лечения атаксии Фридрейха, лизосомальную глюкоцереброзидазу (GBA) для лечения болезни Паркинсона, полиQсвязывающий белок для лечения болезни Хантингтона, мотонейрон выживания 1 для лечения атрофии мышц позвоночника и бокового амиотрофического склероза (ALS), аутизма, деменции, периферической невропатии, шизофрении и дегенерации сетчатки. В некоторых случаях полезная нагрузка может представлять собой терапевтический фрагмент (в отличие от гена). Терапевтические фрагменты включают, например, антитело или его фрагмент, иммуномодулирующий белок или молекулу, действующую по принципу РНК-интерференции (РНКи).
Используемый в настоящей заявке термин эффекторный белок относится к любому типу белка, который оказывает влияние на клетку или ее содержимое (например, нуклеиновые кислоты, белки, органеллы или процессы, в которых участвует любой элемент из вышеперечисленных). Например, типичные эффекторные белки включают, без ограничения, рекомбиназы (например, Cre или Flp), системы редактирования генов (например, CRISPR/Cas9, TALEN, нуклеазу цинкового пальца), оптогенетические реагенты (активаторы (например, канальный родопсин или его варианты)) или ингибиторы (например, галородопсин или Arch), хемогенетические реагенты (например, версии активатор/ингибитор систем DREADD или PSAM/PSEM), активаторы и/или ингибиторы клеточных сигнальных путей и ферменты эпигенетического контроля.
Понятно, что может оказаться желательной доставка вирусного белка, который дополняет или подавляет функцию вируса (например, вируса, отличного от AAV). Например, вирусный белок, который является рецептором для проникновения в клетку (например, белок G бешенства, белок, который связан с клеточным и/или межклеточным транспортом).
Для управления последовательностью, кодирующей полезную нагрузку, можно использовать любое количество промоторов. В данной области известны конститутивные промоторы, а также тканеспецифические промоторы (например, нейрон-специфические промоторы). Исключительно в качестве примера, промотор может быть промотором синапсина-1, CMV, GFAP, CAG, CaMKII, MBP, EF1альфа, mDlx или TRE.
Вирус или его часть, обычно суспендированная в физиологически совместимом носителе, может быть введена пациенту (например, человеку или пациенту, не являющемуся человеком (например, примату, грызуну, рептилии или птице)). Подходящие носители включают физиологический раствор, который может быть приготовлен путем использования различных буферных растворов (например, забуференного фосфатом солевого раствора), лактозы, сахарозы, фосфата кальция, желатина, декстрана, агара, пектина и воды. Вирус или его часть вводят в количествах, достаточных для осуществления трансдукции или инфицирования клеток и для обеспечения уровней, достаточных для переноса и экспрессии генов, позволяющих получить терапевтический эффект, не вызывая при этом чрезмерных побочных эффектов. Обычные и фармацевтически приемлемые пути введения включают, без ограничения, внутричерепную, внутриспинальную или внутримышечную инъекцию. Дополнительные пути введения включают, напри
- 8 044679 мер, пероральный, интраназальный, интратрахеальный, ингаляционный, внутривенный, внутриглазной, подкожный, внутрикожный, трансмукозальный или другие пути введения. При желании пути введения могут быть объединены.
Доза вируса или его части, вводимая пациенту, зависит главным образом от таких факторов, как состояние, подвергаемое лечению, а также возраст, вес и состояние здоровья пациента. Например, терапевтически эффективная доза вируса или его части, вводимой человеку, обычно находится в диапазоне от примерно 0,1 мл до примерно 10 мл раствора, содержащего концентрации от примерно 1x101 до 1х1012 копий генома (GC) вирусов (например, от 1x103 до 1x109 GC). Трансдукцию и/или экспрессию трансгена можно контролировать в различные моменты времени после введения с помощью анализа ДНК, РНК или белка. В некоторых случаях уровни экспрессии трансгена можно контролировать для определения частоты и/или количества дозы.
Важно отметить, что описанные в настоящей заявке частицы AAV-retro имеют на два порядка более высокий уровень ретроградного доступа к кортико-понтинным проекционным нейронам, чем, например, собачий аденовирус-2 (CAV-2), а ретроградный доступ к некоторым нейронам (например, кортикопонтинным проекционным нейронам или афферентам к дорсомедиальному стриатуму (DMS)) сопоставим с доступом, наблюдаемым в случае синтетического индикатора, такого как флуоресцентные гранулы Fluoro-Gold®.
В соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы общепринятые методы молекулярной биологии, микробиологии, биохимии и методы рекомбинантной ДНК, известные специалистам в данной области. Такие методы подробно описаны в литературе. Изобретение дополнительно описано в приведенных ниже примерах, которые не следует рассматривать как ограничивающие объем способов и композиций, описанных в формуле изобретения.
Примеры
Пример 1. Экспериментальные процедуры.
Все процедуры выполняли в соответствии с протоколами, утвержденными Исследовательским кампусом Джанелиа (Janelia) и Комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Калифорнии в Беркли.
Пример 2. Создание библиотеки и продуцирование вируса.
В начале процедуры направленной эволюции использовали четыре ранее созданные вирусные библиотеки: 1) библиотеку случайного мутагенеза, созданную из гена cap AAV2 (кодирующего вирусные белки VP1-3 и активирующий сборку белок (ААР)) методом ПЦР с внесением ошибок (Maheshri et al., 2006, Nat. Biotechnol., 24:198-204); 2) библиотеку вариантов гена cap AAV2, содержащих 7-мерные пептидные вставки между N587 и R588 (Muller et al., 2003, Nat. Biotechnol., 21:1040-6); 3) библиотеку вариантов гена cap AAV2, содержащих рандомизированные петлевые области (Koerber et al., 2009, Mol. Ther., 17:2088-95); и 4) библиотеку ДНК перестановок, созданную из последовательностей гена cap дикого типа AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8 и AAV9 (Koerber et al., 2008, Mol. Ther., 16:1703-9). Каждый пул мутантной ДНК сначала субклонировали в компетентную по репликации пакующую плазмиду AAV для создания библиотеки вирусных плазмид, которые, будучи упакованными в вирионы AAV, могут быть подвергнуты отбору в отношении любого нового свойства или функции. Компетентная по репликации система AAV вводит мутантный ген cap в вирусную полезную нагрузку, и, таким образом, генотип каждого варианта связан с его фенотипом. Капсидные последовательности с нужным свойством могут быть затем извлечены путем анализа последовательности ДНК инкапсулированного генома AAV.
Четыре компетентные по репликации библиотеки AAV были упакованы путем временной кальцийфосфатной трансфекции клеток НЕК2 93-Т с последующим сбором вируса, центрифугированием в градиенте йодиксанола и фильтрацией на устройстве Amicon (Maheshri et al., 2006, Nat. Biotechnol., 24:198204).
Пример 3. In vivo инъекция вируса и индикатора.
Для локализованной in vivo доставки вируса мышей или крыс анестезировали изофлураном (~2% по объему в О2; SurgiVet, Smiths Medical), и в черепе просверлили небольшое отверстие над местом введения инъекции (см. табл. 1). В некоторых участках инъекции вводили несколько инъекций на разную глубину (см. табл. 1). В случае инъекции вируса на каждую глубину в ткань медленно вводили ~50-100 нл (мыши) или 250-500 нл (крысы) содержащего вирус раствора. В случае инъекции индикатора в тех же участках, предназначенных для каждой целевой инъекции, вводили 50 нл 5% раствор гранул Fluoro-Gold (Fluorochrome, Denver, CO) в 0,9% NaCl или 100 нл ретро-гранул (LumaFluor, Durham, NC), разведенных в отношении 1:1 в 0,9% NaCl. Инъекции выполняли при помощи вытянутой стеклянной пипетки (проколотой и скошенной до 25-30 мкм (наружный диаметр); Drummond Scientific, KWiretrol II Capillary Microdispenser), заполненной минеральным маслом. В пипетку вставляли подходящий поршень и продвигали вперед для перемещения содержимого с помощью гидравлического манипулятора (Narashige, МО-10).
Для загрузки пипетки вирусом втягивали плунжер. Инъекционную пипетку устанавливали с помощью манипулятора Sutter MP-285.
- 9 044679
Таблица 1
Координаты, использованные в этом исследовании
| Мишень для инъекции | Координаты инъекции, мм* |
| Мышиный SNr | А/Р: -3,5; M/L: 1,5; D/V: -4,0 и -4,5 |
| Мозжечок мыши | А/Р: 7,1; M/L: 1,4; D/V: -0,8 и -0,5 |
| Дорсомедиальный стриатум мыши | А/Р: 0,5; M/L: 1,5; D/V: -2,5 и -2,3 |
| Мышиное ядро понтинов (BPN) | А/Р: 0,40; M/L: 0,40; D/V: -5,5, -5,75 и -6,0 |
| Дорсомедиальный стриатум крысы | А/Р: 2,16; M/L: 1,7; D/V: -4,3 |
| Верхнее двухолмие крысы | А/Р: -6,0; M/L: ±1,8; D/V: -5,45 |
*Все координаты А/Р даны относительно Брегмы.
Пример 4. Выбор и оценка библиотеки.
Четыре мутантные вирусные библиотеки объединяли и инъецировали либо в SNr, либо в мозжечок взрослых (6-8 недель) мышей дикого типа C57/B16J (любого пола; Charles River). Через три недели после инъекций ткань стриатума или заднего мозга удаляли соответствующим образом, ДНК извлекали, и вирионы, которые успешно достигли удаленной ретроградной ткани-мишени, амплифицировали методом ПЦР и повторно клонировали в пакующую плазмиду rcAAV для создания новой компетентной по репликации библиотеки AAV для следующего цикла отбора. После трех этапов отбора спасенные гены cap были случайным образом мутированы методом ПЦР с внесением ошибок с использованием 5'-ACG CGG AAG CTT CGA TCA ACT ACG CAG-3' (SEQ ID NO: 79) и 5'-AGA CCA AAG ТТС AAC TGA AAC GAA TTA AAC GG-3' (SEQ ID NO: 80) в качестве прямого и обратного праймеров, соответственно.
Затем проводили два дополнительных цикла отбора in vivo. Отдельные изоляты секвенировали после циклов 4 и 5 для оценки степени обогащения библиотеки (табл. 2).
Таблица 2
Конвергенция последовательностей пептидной вставки для вариантов, изолированных в циклах 4 и 5
| Клон | SEQ ID NO клона (нуклеиновая | Петля | SEQ ID NO петл и | E36G | Е67А | V182 | S207 G | N382 D | N408 S | Т567 А | Q598 L | 1648 V | V708 I | М235 L | F284 Y | S492 | N496 | друг ие |
| 4R-H- 3 | 3/4 | LAISDQTKH А | 81 | X | ||||||||||||||
| 4R-H4 | 5/6 | LAISDQTKH А | 81 | X | X | D | L59P | |||||||||||
| 4R-H5 | 7/8 | LAKDQTKST А | 82 | X | X | |||||||||||||
| 4R-H9 | 9/10 | LANQDYTKT А | 83 | Р | ||||||||||||||
| 4R-H10 | 11/1 2 | LAISDQTKH А | 81 | X | Y | |||||||||||||
| 4R-H12 | 13/1 4 | LANQDYTKT А | 83 | X | X | |||||||||||||
| 4R-H15 | 15/1 6 | LAISDQTKH А | 81 | X | ||||||||||||||
| 4R-H16 | 17/1 8 | LAHDITKNI А | 84 | X | X | |||||||||||||
| 4R-H17 | 19/2 0 | LAHDITKNI А | 84 | X | X | |||||||||||||
| 4R- SD-2 | 21/2 2 | LAHDITKNI А | 84 | X | X | X | X | |||||||||||
| 4R- SD-3 | 23/2 4 | LAHDITKNI А | 84 | X | X | |||||||||||||
| 4R- SD-10 | 25/2 6 | LAISDQTKH А | 81 | X | X | |||||||||||||
| 4R- SD-11 | 27/2 8 | LANQDYTKT А | 83 | Е | X | Р | ||||||||||||
| 4R- SD-12 | 29/3 0 | LAISDQTKH А | 81 | X | X | Q186 R, D5 94N |
- 10 044679
| 4R- SD-15 | 31/3 2 | LADQDYTKT A | 85 | X | X | X | ||||||||||||
| 4R- SD-16 | 33/3 4 | LAISDQTKH A | 81 | E | X | X | D69E | |||||||||||
| 4R- SD-17 | 35/3 6 | LAISDQTKH A | 81 | E | X | Y | ||||||||||||
| 4R- SD-18 | LAHDITKNI A | 84 | X | X | ||||||||||||||
| 5R- Hindl | 37/3 8 | LAQPDATKN A | 86 | X | I | X | ||||||||||||
| 5R- Hind2 | 39/4 0 | LAHDITKNI A | 84 | X | X | X | E12V ,K13 7E | |||||||||||
| 5R- Hind3 | 41/4 2 | LANQDYTKT A | 83 | X | X | R585 G, S6 62C | ||||||||||||
| 5R- Hind6 | 43/4 4 | LADQDYTKT A | 85 | X | X | |||||||||||||
| 5R- Hind8 | 45/4 6 | LANQDYTKT A | 83 | X | X | |||||||||||||
| 5RHindl 0 | 47/4 8 | LADQDYTKT A | 85 | X | X | X | ||||||||||||
| 5RHindl 1 | 49/5 0 | LANQDYTKT A | 83 | X | X | X | N335 К | |||||||||||
| 5RHindl 2 | 51/5 2 | LAHDITKNI A | 84 | X | X | |||||||||||||
| 5RHindl 4 | 53/5 4 | LAISDQTKH A | 81 | X | S423 N | |||||||||||||
| 5RHindl 5 | 55/5 6 | LAISDQTKH A | 81 | X | N214 D | |||||||||||||
| 5RHindl 6 | 57/5 8 | LAHDITKNI A | 84 | X | X | |||||||||||||
| 5RHindl 7 | 59/6 0 | LADQDYTKT A | 85 | X | X | X | ||||||||||||
| 5RHindl 8 | 61/6 2 | LAISDQTKH A | 81 | X | ||||||||||||||
| 5RHindl 9 | 63/6 4 | LAHDITKNI A | 84 | X | X | X | X | H38L ,E14 7A | ||||||||||
| 5RHind2 2 | 65/6 6 | LANQDYTKT A | 83 | X | X | P | N227 D,N5 87S | |||||||||||
| 5RHind2 3 | 67/6 8 | LAHDITKNI A | 84 | X | X | X | X | |||||||||||
| 5RCel | 69/7 0 | LANQDYTKT A | 83 | X | X | P | D41G ,K10 5E,G 163D | |||||||||||
| 5R- Ce5 | 71/7 2 | LADQDYTKT A | 85 | X | X | |||||||||||||
| 5R- Ce6 | 73/7 4 | LAQPDATKN A | 86 | X | X | X | P2 9A | |||||||||||
| 5R- Ce8 | 75/7 6 | LAKDQTKST A | 82 | X | ||||||||||||||
| 5R- Ce9 | 77/7 8 | LANQDYTKT A | 83 | X | X | X | X | P |
Для вторичного скрининга в конце цикла 5 отбирали семнадцать вариантов, и соответствующие последовательности гена cap повторно клонировали в хелперную плазмиду rAAV. Затем, используя Vector BioLabs, Inc (Philadelphia, PA), готовили отдельные препараты с высоким титром родительского AAV2 дикого типа и каждого из 17 выбранных мутантных вариантов, несущих полезную нагрузку CMV-EGFP. Промотор CMV обычно является слабым в нейронах, и, следовательно, этот вторичный скрининг обеспечил жесткую оценку эффективности ретроградного транспорта. Отдельные варианты AAV вводили либо в мозжечок, либо в бледный шар. Через 3 недели эндогенную неамплифицированную флуоресценцию EGFP визуализировали в областях, которые, согласно ожиданиям, в случае эффективного ретроградного транспорта оказались бы меченными. Мутантный 5R-Hind6 (SEQ ID NO: 43, кодирующая SEQ ID NO: 44) показал наиболее сильный ретроградный транспорт в обеих цепях и, таким образом, был выбран для дальнейшего анализа и получил название rAAV2-retro.
Пример 5. Анализ связывания гепарина.
Сродство AAV2-retro и AAV2 дикого типа к гепарину анализировали, как описано ранее (Jang et al., 2011, Mol. Ther., 19:667-75). Вкратце, примерно 1011 очищенных геномных частиц загружали в колонку с гепарином HiTrap объемом 1 мл (GE Healthcare Sciences, Piscataway, NJ), предварительно уравновешенную 150 мМ NaCl и 50 мМ Трис при рН 7,5. Затем выполняли элюцию путем пошагового увеличения концентрации NaCl с 50 мМ до конечной концентрации 950 мМ с последующей промывкой 1М NaCl. Небольшую фракцию каждой элюции использовали для инфицирования клеток НЕК2 93Т, и через 48 ч после инфицирования выполняли количественное определение процентного содержания GFPположительных клеток при помощи проточного цитометра Guava EasyCyte 6HT (EMD/Millipore).
- 11 044679
Пример 6. Полезная нагрузка, используемая в исследованиях.
Для всех последующих экспериментов промотор CMV заменяли промотором, который, как известно, является более устойчивым во взрослых нейронах. Рекомбиназа Cre и кальциевый индикатор GCaMP6f находились под управлением человеческого промотора синапсина-1 (hSyn1). Все флуорофоры находились под управлением промотора CAG, а изменяющая цвет конструкция находилась под управлением промотором EF1-αльфа.
Пример 7. Продуцирование вируса для количественного определения ретроградной эффективности.
Полезную нагрузку hSyn-Cre упаковывали при помощи капсидов AAV1, AAV2, AAV5, AAV8, AAV9, DJ и AAV2-retro в Janelia Viral Shared Resource. Все семь вирусных препаратов обрабатывали параллельно и перед инъекцией in vivo сопоставляли титры. Все партии разбавляли до наименьшего измеренного титра (1,3Е12 GC/мл), и каждый вирус вводили в правое ядро понтинов трех взрослых мышей Rosa26Lox-STOP-LoxH2B-GFP (Не et al., 2012, Neuron, 73:35-48).
Пример 8. Гистология.
Животных умерщвляли через три недели после инъекции вируса, затем вынимали мозг и выполняли сагиттальные срезы правого полушария толщиной 50 мкм. Срезы помещали в невыцветающие монтажные среды (Antifade Mounting Media) VECTASHIELD, содержащие DAPI (Vector Laboratories), и отображали с помощью панорамного слайд-сканера P-E (3D Histech) с использованием объектива 20х и фильтров FITC и DAPI.
Пример 9. Количественная оценка ретроградного транспорта.
Изображения, полученные с помощью слайд-сканера с функциями панорамного сканирования, сшивали, а затем анализировали с помощью специального программного обеспечения, написанного на языке Matlab (Mathworks), для обнаружения GFP-меченных ядер во всей коре. Представляющую интерес область (ROI) очерчивали вручную вокруг коры, выделяя область на изображении для автоматического подсчета клеток. Для улучшения обнаружения ядер, выполняли свертку изображения с помощью ядра Mexican Hat, содержащего разность двух гауссианов (дисперсия 26,00 мкм и дисперсия 3,25 мкм). Шум изображения уменьшали с помощью медианного фильтра, и затем выполняли обнаружение основных пиков.
Пример 10. Анализ общности ретроградного транспорта.
Мышам Rosa26-LSL-H2B-GFP инъецировали 25 нл hSyn1-Cre rAAV2-retro в дорсальный стриатум. Через три недели после инъекции при помощи панорамного сканера получали изображения коронарных срезов головного мозга для визуализации окрашенных DAPI ядер и зеленой флуоресценции из ядер, экспрессирующих H2B-GFP. Выполняли свертку зеленого канала с разницей в два гауссиана, и затем на этих пороговых изображениях обнаруживали пики в виде локальных максимумов при помощи пользовательских функций, написанных в Matlab. Синий канал каждого среза выравнивали с изображениями Nissl из атласа стандартизованного мозга мыши Института Аллена, используя обычные пользовательские процедуры, написанные при помощи пакета Matlab Image Processing Toolbox. Затем использовали области из атласа мозга мыши ABI с прилагаемой аннотацией для установления соответствия с обнаруженными нейронами в выровненных участках с конкретными областями мозга.
Было отмечено, что конечная точность эталонного атласа в совокупности с анатомической изменчивостью отдельного головного мозга ограничивает надежность этого полуавтоматического процесса до крупных афферентных входов.
Пример 11. Визуализация активности популяции нейронов in vivo после ретроградной доставки GCaMP6f.
Семь взрослых мышей анестезировали изофлураном (2%) и помещали в стереотаксическую рамку (Kopf Instruments; Tujunga, CA) с обогреваемой до 37°С подставкой. Кожу на голове и надкостнице над черепом удаляли, наносили слой УФ-отверждаемого клея OptiBond (Kerr; Orange, CA), и изготовленный на заказ шлем (Osborne and Dudman, 2014, PLoS One, 9 (2) :e89007) прикрепляли зубным цементом. AAV2-retro, несущий полезную нагрузку hSynGCaMP6f, инъецировали в BPN (3,9 мм назад и на 0,4 мм вбок от брегмы на глубину 5,8, 5,6 и 5,4 мм по 100 нл для каждой глубины) с помощью инжектора Nanoliter 2010 (WPI). Окно в черепе (одна пластина диаметром 2 мм и толщиной 170 мкм из стекла, вырезанного лазером) помещали поверх первичной двигательной коры (на 0,7 мм вперед и на 1,6 мм вбок от брегмы).
После операции вводили подкожную инъекцию кетопрофена (5 мг/кг) и бупренорфина (0,1 мг/кг; Henry Schein Animal Health; Melville, NY). Мышам давали 1 неделю на выздоровление после операции, а затем выполняли краткую визуализацию под 2-фотонным микроскопом для оценки экспрессии вируса. Через неделю послеинъекции у всех животных визуально идентифицировали клетки, экспрессирующие GCaMP6f, в слое V M1. Затем животных приучали к фиксации головы в изготовленном на заказ устройстве и обучали извлекать пищевой шарик, как описано ранее (Guo et al., 2014, Nat. Med., 20:130-8).
GCaMP6f возбуждали при 920 нм (подавая обычно 20-40 мВт на заднюю апертуру) с помощью лазера Ti:Sapphire (Chameleon, когерентный) и регистрировали через объектив Nikon 16х, 0,8 N.A. Испускаемый свет пропускали через дихроичный фильтр 565 DCXR (Chroma Technology) и фильтр ET525/70m
- 12 044679
2p (Chroma Technology) и детектировали с помощью трубки фотоумножителя GaAsP (10770PB-40, Hamamatsu). Изображения (512x512 пикселей) получали при ~30 Гц с помощью резонирующих сканеров, используя программное обеспечение Scanlmage.
Пример 12. Редактирование генома CRISPR/Cas9.
Промотор CMV в pAAV-CMV-SaCas9-empty (Slaymaker et al., 2016, Science, 351:84-8) заменяли промотором hSyn1 для создания pAAV-hSynl-SaCas9-empty.
Заказывали олигонуклеотиды, кодирующие протоспейсерные последовательности sgPHK, фосфорилировали их, гибридизовали и лигировали в сайты рестрикции BsaI pAAV-hSynl- SaCas9 emtpy, получая pAAV-hSynl-SaCas9-tdTomato-l до io.
Используемые олигонуклеотидные последовательности были следующими:
tdTomato sgPHK 1 Fwd: САС CGC AAG GGC GAG GAG GTC АТС A (SEQ
ID NO:108) tdTomato sgPHK 1 Rev: AAA CTG ATG ACC TCC TCG CCC TTG C (SEQ
ID NO:87) tdTomato sgPHK 2 Fwd: CAC CGT GGA GGG CTC CAT GAA CGG CC (SEQ
ID NO:88) tdTomato sgPHK 2 Rev: AAA CGG CCG TTC ATG GAG CCC TCC AC (SEQ
ID NO:89) tdTomato sgPHK 3 Fwd: CAC CGA GGA CGG CGG CCA СТА CCT GG (SEQ
ID NO:90) tdTomato sgPHK 3 Rev: AAA CCC AGG TAG TGG CCG CCG TCC TC (SEQ
ID NO:91)
- 13 044679 tdTomato sgPHK 4 Fwd: CAC CGA CAA CAA CAT GGC CGT CAT CA (SEQ ID NO:92) tdTomato sgPHK 4 Rev: AAA CTG ATG ACG GCC ATG TTG TTG TC (SEQ ID NO:93) tdTomato sgPHK 5 Fwd: CAC CGA AGG ACG GCG GCC ACT ACC TGG (SEQ ID NO:94) tdTomato sgPHK 5 Rev: AAA CCC AGG TAG TGG CCG CCG TCC TTC (SEQ ID NO:95) tdTomato sgPHK 6 Fwd: CAC CGA CAA CAA CAT GGC CGT CAT CA (SEQ ID NO:96) tdTomato sgPHK 6 Rev: AAA CTG ATG ACG GCC ATG TTG TTG TC (SEQ ID NO:97) tdTomato sgPHK 7 Fwd: CAC CGG TCA CCT TCA GCT TGG CGG T (SEQ ID NO:98) tdTomato sgPHK 7 Rev: AAA CAC CGC CAA GCT GAA GGT GAC C (SEQ ID NO:99) tdTomato sgPHK 8 Fwd: CAC CGC CGT АСА TGA ACT GGG GGG A (SEQ ID NO:100) tdTomato sgPHK 8 Rev: AAA CTC CCC CCA GTT CAT GTA CGG (SEQ ID NO:101) tdTomato sgPHK 9 Fwd: CAC CGT CTT GTA АТС GGG GAT GTC GG (SEQ ID NO:102) tdTomato sgPHK 9 Rev: AAA CCC GAC АТС CCC GAT TAC AAG AC (SEQ ID NO:103) tdTomato sgPHK 10 Fwd: CAC CGC CGT CCT GCA GGG AGG AGT C (SEQ ID NO:104) tdTomato sgPHK 10 Rev: AAA CGA CTC CTC CCT GCA GGA CGG C (SEQ ID NO:105)
Сначала оценивали in vitro способность каждого олигонуклеотида направлять редактирование генома. Клетки Neuro2A трансфицировали 800 нг pAAV-hSynl-SaCas9-tdTomato-l до -щ, iqo нг pAAV-FLEX-CAGtdTomato и iqq нг pAAV-CAG-EGFP, используя полиэтиленимин. Через 72 ч после трансфекции клетки собирали, и ~70000 EGFP-положительных клеток Neuro2A выделяли, используя флуоресцентно-активированный сортинг клеток (FACS) при помощи BD Influx сортера (BD Biosciences). Затем геномную ДНК экстрагировали, и частоту модификации гена tdTomato оценивали при помощи нуклеазного анализа Surveyor (Integrated DNA Technologies), как описано ранее (Cong et al., 2013, Science, 339:819-23). Одну из двух sgPHK 7, которые, по-видимому, управляли двумя событиями расщепления в последовательности tdTomato, упаковывали в retro-AAV2 и использовали для редактирования генома in vivo. Затем, ~100 нл (5x1013 векторных геномов (vg)/мл) AAV2-retro-hSynl-SaCas9-tdTomato или AAV2retro-hSynl-SaCas9-empty инъецировали в BPN мышей Rbp4-CrextdTomato, как описано выше. Через шесть недель после инъекции головной мозг вынимали, делали коронарные срезы толщиной 4 0 мкм и окрашивали НА-меченной Cas9 (анти-НА антителом C29F4 от Cell Signaling, разведенным 1:1600; вторичное антитело: ослиное анти-мышиное Alexa Fluor 488 (1:250; Jackson ImmunoRe
- 14 044679 search) и нейрональным маркером NeuN (анти-NeuN антителом А60 от Millipore, разведенным 1:250; вторичное антитело: ослиное анти-кроличье Alexa Fluor 647 (1:500; ThermoFisher, A-31573)). После окрашивания антителом срезы помещали на предметные стекла в невыцветающую монтажную среду VECTASHIELD, содержащую DAPI (Vector Laboratories), и визуализировали при помощи инвертированного микроскопа Zeiss Axio Observer A1 (Zeiss). Количественную оценку иммуноокрашивания проводили, используя программное обеспечение для анализа ImageJ (NIH). Пример 13 - направленная эволюция rAAV2-retro Для создания новых rAAV с усиленным ретроградным транспортом, разрабатывали подход направленной эволюции in vivo, приводящий обогащению вариантами капсидов rAAV, которые эффективно транспортируются в клеточные тела нейронов, посылая длинные проекции в участке инъекции вируса в мозге мыши (фиг. 1А). Для обеспечения максимальной вероятности извлечения варианта с нужными свойствами, в качестве исходного материала использовали разнородную смесь ранее описанных библиотек вариантов cap rAAV (Koerber et al., 2008, Mol. Ther., 16:1703-9; Koerber et al., 2009, Mol. Ther., 17:2088-95; Koerber et al., 2006, Nat. Protocols, 1:701-6; Muller et al., 2003, Nat. Biotechnol., 21:1040-6). Вирусные частицы упаковывали таким образом, чтобы каждый вариантный капсид был связан с геном AAV, содержащим соответствующий ген cap, и окончательный пул вариантов капсида включал точечные мутанты, варианты со случайной вставкой 7-мерного пептида в область AAV2, используемую для связывания его корецептора, гепарансульфата, со случайными химерами последовательностей капсидных генов из семи родительских серотипов (фиг. 1А). Для идентификации вариантов с широким ретроградным тропизмом выбирали две независимые популяции проекционных нейронов: стриарные ГАМКэргические нейроны, проецирующие сигналы в ретикулярную часть черной субстанции (SNr), и глутаматергические нейроны задней части мозга, проецирующие сигналы в кору мозжечка. Через три недели после инъекции всего пула вариантов rAAV в SNr или мозжечок (одна инъекция на животное), ткань стриатума или ткань задней части мозга, соответственно, вынимали, последовательности cap восстанавливали методом ПЦР, и вирус переупаковывали (фиг. 1В). После еще двух этапов отбора выполняли ПЦР с внесением ошибок для дальнейшей диверсификации библиотек, за которой следовали два заключительных этапа отбора in vivo.
вариантов cap секвенировали после 4-го цикла эволюции, большинство из которых происходило из инсерционной библиотеки и содержало экзогенные 7-мерные пептиды между N587 и R588 гена капсида AAV2 VP1 дикого типа. Интересным оказалось то, что все восстановленные вставки имели форму LAxxDxTKxA (SEQ ID NO: 106) или LAxDxTKxxA (SEQ ID NO: 107) (где остатки, выделенные жирным шрифтом и курсивом, получены из вставки); мутации в других местах последовательности также были обогащенными (табл. 2). После 5-го цикла эволюции секвенировали еще 22 клона, и после этого дополнительного цикла эволюции все последовательности оказались мутантами AAV2 со вставками LAxxDxTKxA (SEQ ID NO: 106)/LAxDxTKxxA (SEQ ID NO:107) (табл. 2), демонстрируя заметную степень дальнейшей конвергенции. Такая конвергенция предполагает, что специфические пептидные вставки в гепарин-связывающую петлю являются очень важными для проявления ретроградной функциональности с потенциальным вторичным вкладом других сайтов. Затем выполняли вторичный скрининг семнадцати выделенных вариантов, имеющих различные комбинации пептидных вставок и точечных мутаций в последовательности капсида. Для обеспечения очень жестких условий, выбранные варианты упаковывали с трансгеном усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP), управляемым промотором CMV, который обычно слаб в нейронах. Для каждого варианта капсида оценивали его способность доставлять достаточный уровень полезной нагрузки к клеточным телам в ключевых афферентных областях, что позволяло обнаруживать сигнал EGFP, не усиленный антителами, через три недели после инъекции. Для дальнейшего анализа отбирали клон (вставка LADQDYTKTA (SEQ ID NO: 85)+V708I+N382D), который демонстрировал наиболее сильный ретроградный транспорт в двух независимых цепях в этом вторичном тесте (из коры в бледный шар и из нижней оливы/базального ядра понтинов к мозжечку), который назвали rAAV2-retro. При оценке двух дополнительных промоторов, обычно используемых в исследованиях на грызунах in vivo (CAG - фиг. 1B или человеческого синапсина-1, данные не показаны), в ряде различных цепей у мышей и крыс была отмечена заметная эффективность ретроградного мечения с этим вариантом rAAV (фиг. 1В и фиг. 7). Замена 7-мерной вставки на одну из других восстановленных последовательностей или добавление дополнительных точечных мутаций, идентифицированных в тесте, не привели к дальнейшему увеличению ретроградного транспорта.
Пример 14. Эффективный ретроградный доступ к проекционным нейронам.
В нисходящих моторных путях кортико-понтинный тракт является заметно конвергентным и, как известно, вносит более 95% афферентов в базальные ядра понтинов (BPN). Таким образом, этот путь представляет собой особенно выгодную систему для количественной оценки эффективности поглощения вирусов и ретроградного транспорта аксональными окончаниями проекционных нейронов. Действительно, инъекция rAAV2-retro в BPN приводила к получению плотной окраски нейронов слоя V (фиг. 2А), что согласуется с результатами предыдущих исследований по мечению (Legg et al., 1989, J. Comp. Neurol., 286 (4):427-41).
Затем при идентичных условиях заражения и обработки сравнивали эффективность ретроградного транспорта в кортико-понтинной цепи для rAAV2-retro по сравнению с несколькими обычно используе
- 15 044679 мыми серотипами AAV (фиг. 2B-D). Для обеспечения точности количественного определения и устранения возможного искажения результатов по межклеточной изменчивости в уровне экспрессии трансгена для доставки рекомбиназы Cre в трансгенных мышах Rosa26-Lox-STOP-Lox-H2B-GFP использовали AAV (He et al. 2012, Neuron, 73:35-48). Было показано, что даже низкой концентрации фермента Cre достаточно для запуска экспрессии такой Cre-зависимой кассеты, а жесткая ядерная локализация слитого с гистоном репортера позволяет однозначно идентифицировать инфицированные клетки, без искажений сигнала из нейропиля.
Расчет линейной плотности инфицированных проекционных нейронов коры головного мозга в визуализированных сагиттальных срезах из мозга мышей, полученного через три недели после локальной инъекции вируса в BPN выполняли в режиме полуавтоматического анализа (фиг. 2С). У животных, инфицированных rAAV2, наблюдали минимальную экспрессию кортикального GFP (линейная плотность 0,98±0,20 нейронов/мм, среднее ±sem, n=5; фиг. 2В, средняя панель). По всей ростро-каудальной оси коры у животных, которым инъецировали rAAV2-retro, напротив, согласно более ранним наблюдениям (фиг. 2А), можно наблюдать плотный слой проекционных нейронов GFP-позитивного слоя V (линейная плотность 130,11±11,08 нейронов/мм, n=4; фиг. 2В, нижняя панель). Ни один из других широко используемых серотипов AAV, ни собачий аденовирус-2, не соответствовал ретроградной эффективности сконструированного варианта rAAV2-retro (линейная плотность AAV1: 0,05±0,04, AAV2: 0,98±0,2, AAV5: 2,38±1,24, AAV8: 1,43±1,43, AAV9: 1,98±0,86, DJ: 24,82±14,32, CAV-2: 5,56±4,13, n=3-5 для каждого; фиг. 2D, фиг. 8). Кроме того, плотность проекционных нейронов коры, меченных rAAV2-retro, была сопоставима с плотностью, достигнутой с помощью гранул Fluoro-Gold (Schmued and Fallon, 1986, Brain Res., 377:147-54), надежного синтетического ретроградного индикатора (линейная плотность 81.03±11.08 нейронов/мм, n=3). Таким образом, rAAV2-retro демонстрирует усиление ретроградного доступа к кортико-понтинным проекционным нейронам на два порядка по сравнению с существующими серотипами и конкурирует с эффективностью синтетических ретроградных индикаторов.
Пример 15. Общность ретроградной функциональности.
Далее изучали, распространяется ли ретроградная функциональность rAAV2-retro на другие цепи, в частности, путем определения степени, в которой им оказались меченными различные афференты в дорсомедиальном стриатуме (DMS) - части базальных ганглиев, которая получает длинные входные сигналы из множества корковых и подкорковых областей. Было обнаружено, что эффективность опосредованного rAAV2-retro ретроградного доступа к наиболее сильным афферентным входам в DMS - кору, таламус и миндалину - была сопоставима с эффективностью флуоресцентных гранул, классически используемых для ретроградного мечения (фиг. 3А). Для обеспечения объективности в оценке количества ретроградно меченных нейронов во всех областях мозга, о которых известно, что они обеспечивают значительный длинный входной сигнал в DMS, разработали алгоритм, который позволяет соотносить любую обнаруживаемую флуоресцентную метку в визуализированном участке мозга мыши с определенными областями мозга путем выравнивания секции, используя атлас мозга Аллена с аннотацией (фиг. 3В-С). Количественный анализ (фиг. 3С) показал, что сильное ретроградное мечение было обнаружено в подавляющем большинстве областей, о которых ранее сообщалось, что они посылают заметные проекции к стриатуму (Pan et al., 2010, Front Neuroanat., 4:147). В одном явновыраженном исключении, наблюдается только слабое мечение в компактной части черной субстанции, несмотря на то, что она является источником сильных дофаминергических входных сигналов в DMS (фиг. 3С, стрелка, указывающая на количестве клеток для SNc). Было обнаружено, что в некоторых других протестированных цепях небольшое подмножество классов проекционных нейронов также является невосприимчивым к ретроградному доступу, обеспечиваемому rAAV2-retro (табл. 3; следует отметить, что эти проекции также оказались не мечеными всеми другими протестированными серотипами AAV). Несмотря на эти исключения, rAAV2-retro является широко применимым в центральной нервной системе.
- 16 044679
Таблица 3
Эффективность rAAV2-retro в различных цепях. Низкая эффективность, а не отсутствие ретроградного транспорта в кортико-таламической и кортико-колликулярной проекциях, подтверждается эффективным мечением проекционных нейронов после локальной доставки Сге-зависимых полезных нагрузок в тела проекционных нейронных клеток.
| Место инъекции | Местоположение целевых | Эффективность | Трансген |
| проекционных нейронов | мечения | ||
| мышиный mPFC (IL/PL) | МЕС | сильная | Сге |
| мышиный mPFC (IL/PL) | LEC | сильная | Сге |
| мышиный mPFC (IL/PL) | Контр-mPFC | сильная | Сге |
| мышиный mPFC (IL/PL) | Медиадорсальный таламус | средняя | Сге |
| мышиный mPFC (IL/PL) | Соединяющее ядро таламуса | средняя | Сге |
| мышиный mPFC (IL/PL) | Островковая область | сильная | Сге |
| мышиный mPFC (IL/PL) | Гиппокамп- вентральный СА1 | сильная | Сге |
| мышиный mPFC (IL/PL) | AcG | сильная | Сге |
| OFC | МЕС | сильная | Сге |
| OFC | LEC | сильная | Сге |
| OFC | Контр-ОЕС | сильная | Сге |
| OFC | Островковая область | сильная | Сге |
| OFC | Гиппокамп- вентральный СА1 | средняя | Сге |
| дорсальный CAI | МЕС | сильная | Сге |
| дорсальный CA2 | LEC | сильная | Сге |
| дорсальный САЗ | САЗ | слабая | Сге |
| дорсальный СА4 | Соединяющее ядро таламуса | слабая | Сге |
| дорсальный СА4 | Соединяющее ядро таламуса | слабая | СгеСге |
| миндалина | mPFC | сильная | Сге |
| Латеральный гипоталамус | mPFC | сильная | Сге |
| Дорсомедиальный стриатум | mPFC | сильная | Сге |
| Вентральный стриатум (NAcc) | mPFC | сильная | Сге |
| МЕС | mPFC | средняя | FLPo |
| mPFC | Вентральный CAI | средняя | FLPo |
| mPFC | МЕС | средняя | FLPo |
| Опорная структура | Прилежащее ядро | средняя | Сге |
| Опорная структура | Вентральный гиппокамп | сильная | Сге |
| Опорная структура | Переднее промежуточное ядро таламуса | средняя | Сге |
| Опорная структура | Ретроспинальная кора | сильная | Сге |
| Опорная структура | Латеральная энторинальная кора | сильная | Сге |
| Опорная структура | Медиальная энторинальная кора | сильная | Сге |
| Верхнее двухолмие | Слой 5 в зрительной коре | очень слабая | Gcamp6s |
| Верхнее двухолмие | Слой 5 в зрительной коре | сильная | Сге |
| dLGN | Слой 6 в зрительной коре | очень слабая | Gcamp6s |
| dLGN | Слой 6 в зрительной коре | сильная | Сге |
| Зрительная кора | Контралатеральная зрительная кора | сильная | Сге |
| Зрительная кора | Контралатеральная зрительная кора | сильная | GFP |
| Зрительная кора | Контралатеральная зрительная | слабая | Gcamp6s |
- 17044679
| кора | |||
| Зрительная кора | Контралатеральная зрительная кора | сильная | tdtomato |
| Зрительная кора | LGN | сильная | tdtomato |
| Зрительная кора | Ограда | сильная | tdtomato |
| Зрительная кора | Ограда | средняя | tdtomato |
| Зрительная кора | LM | сильная | tdtomato |
| Дорсолатеральный стриатум | Ml | сильная | tdtomato |
| Дорсолатеральный стриатум | Ml | средняя | GFP |
| Дорсолатеральный стриатум | М2 | сильная | tdtomato |
| Дорсолатеральный стриатум | Соматосенсорная кора | сильная | tdtomato |
| Дорсолатеральный стриатум | Базолатеральная миндалина | сильная | tdtomato |
| Дорсолатеральный стриатум | Островковая область | сильная | tdtomato |
| Дорсолатеральный стриатум | Энторинальная кора | сильная | tdtomato |
| Дорсолатеральный стриатум | Бледный шар | средняя | tdtomato |
| Дорсолатеральный стриатум | Таламус | средняя | tdtomato |
| Дорсолатеральный стриатум | Интраламинарное ядро таламуса | сильная | GFP |
| Дорсолатеральный стриатум | Ядро шва | очень слабая | tdtomato |
| Дорсолатеральный стриатум | VTA | слабая | tdtomato |
| Базолатеральная миндалина | Вкусовая зона коры | сильная | flex-tdtomato |
| Моторная зона коры передних конечностей | Моторный таламус | слабая | GFP |
| Ядро одиночного пути | Латеральная миндалина | средняя | tdtomato |
| Спинной мозг | Кора | сильная | flex-tdtomato |
| Спинной мозг | Кора | сильная | GFP |
| Спинной мозг, пластинка IX | Спинной мозг: пресинаптические ингибирующие нейроны | сильная | flex-tdtomato |
| Мышцы | Спинальные моторные нейроны | средняя | Cre |
| Мышцы | Проприоцептивные нейроны | сильная | Cre |
Пример 16. Ретроградный доступ к генетически определенной популяции нейронов.
Также определяли, можно ли комбинировать ретроградную функциональность rAAV2-retro со специфичностью Сге-трансгенных линий для возможности изучения проекционных нейронов определенных классов. В частности, проводили эксперименты по определению, можно ли комбинировать rAAV2-retro и Сге-трансгенные линии для разделения двух функционально разных длинных связей, которые проходят параллельно между двумя областями мозга. Проекции от коры головного мозга к стриатуму возникают в основном из нейронов в слое V, но некоторые нейроны в слоях II и III также обеспечивают входы в стриатум. Было высказано предположение, что входы в стриатум из разных кортикальных слоев формируют отдельные пути, причем нейроны в слое V проецируют в стриосомный (patch) компартмент стриатума, а в слоях II и III - в матриксный компартмент. Пальцеобразная форма микрокомпартментов patch и матрикса затрудняет избирательное нацеливание на эти пути для функционального изучения только с помощью системы rAAV2-retro. Поэтому была проанализирована возможность разделения двух входов путем объединения rAAV2-retro с трансгенной линией, экспрессирующей рекомбиназу Сге во всех нейронах слоя V (Gerfen et al., 2013, Neuron, 80: 1368-83), но не в нейронах слоев II и III (фиг. 4А).
Для демонстрации обоих путей в одном и том же эксперименте, была выбрана Cre-зависимая изменяющая цвет полезная нагрузка, которая экспрессирует tdTomato в отсутствие Сге, но в Сге-позитивных клетках преобразуется, запуская экспрессию EGFP (Saunders et al., 2012, Front Neural Circuits, 6:47). Ko
- 18 044679 гда rAAV2-retro, несущий эту полезную нагрузку, вводили в дорсомедиальный стриатум линии драйвера Cre, специфического в отношении V слоя, Rbp4_KL100 Cre (Gerfen et al., 2013, Neuron, 80: 1368-83), экспрессия EGFP в стриатуме наблюдалась только в этих нейронах слоя V. Кроме того, кортикостриарный путь слоев II и III был четко отличим по экспрессии tdTomato (фиг. 4В). В соответствии с топографической природой кортикостриарной проекции, в результате точно локализованных инъекций вируса в дорсомедиальный стриатум меченными оказались соответственно небольшие участки коры. Однако во всех случаях мечение также наблюдали в слое V и популяции кортикостриарных слоев II и III (фиг. 4В, нижняя панель), что служит подтверждением того, что два эти два пути из одной и той же области коры проходят внутри стриатума через соседние компартменты матрикса и patch.
Хотя этот эксперимент выявил оба пути, выбор полезной нагрузки Cre-on или ''Cre-off позволит получить селективный доступ к одному из них, исключая другой. Следовательно, этот пример подчеркивает дополнительную стратегию в изучении цепи, которая может быть достигнута путем объединения высокоэффективного ретроградного вируса с доступными линиями драйвера Cre (или Flp).
Пример 17. Использование rAAV2-retro для изучения цепи и манипуляции генами.
Польза rAAV2-retro для изучения цепи будет зависеть от его способности обеспечивать высокий уровень экспрессии генетически кодируемых индикаторов и эффекторов. Способность отслеживать нейронную активность в определенных классах проекционных нейронов была впервые оценена с помощью rAAV2-retro-опосредованной экспрессии GCaMP6f (Chen et al., 2013, Nature, 499:295-300) (фиг. 5A-C). Используя in vivo двухфотонную Са2+ визуализацию, дендритные и соматические Са2+ импульсы обнаруживали в первичной моторной коре уже через 7 дней после доставки вируса в BPN (фиг. 5D). Временной профиль сигналов Са2+ отражал структуру задания по контролируемому достижению цели, причем сигнал во многих кортико-понтинных нейронах тесно связан с сигналом go (фиг. 5E-F) (Li et al., 2015, Nature, 519:51-6). Повторную запись данных из идентифицированных нейронов можно было осуществлять в ходе испытаний как во время сеанса с момента начала экспрессии в зависимости от времени (фиг. 5Е, F), так и во время проведения многочисленных поведенческих сеансов в течение более двух месяцев после инфицирования. Таким образом, rAAV2-retro обеспечивает возможность экспрессировать сенсоры в проекционных нейронах на уровнях, достаточных для визуализации, обеспечивая целый ряд новых возможностей для расшифровки участия конкретных проекций в вычислениях цепей.
Наконец, пользу rAAV2-retro оценивали в отношении доставки эффекторов, таких как система редактирования генов CRISPR/Cas9, к проекционным нейронам (фиг. 6). В частности, в rAAv2-retro упаковывали Cas9 Staphylococcus aureus (SaCas9 (Slaymaker et al., 2016, Science, 351:84-8)) и отдельную гидовую РНК, предназначенную для уменьшения экспрессии tdTomato. Доставка rAAV2-retro-SaCas9antitdTomato в BPN животных, экспрессирующих tdTomato в возбуждающих нейронах кортикального слоя V, приводила к подавлению экспрессии tdTomato в 88,6±0,7% нейронов, экспрессирующих SaCas9 в слое V (фиг. 6В, нижняя панель и фиг. 6С, n=3). Напротив, доставка нецелевого SaCas9 не приводила к каким-либо заметным изменениям, при этом только у 4,4±3,2% клеток наблюдали потенциальное снижение экспрессии tdTomato (фиг. 6В, верхняя панель и фиг. 6С, n=3). Кроме того, экспрессия tdTomato оставалась нетронутой в нейронах слоя V, которые были недоступны через инъекцию в ядро понтинов. Таким образом, система rAAV2-retro позволяет осуществлять эффективную селективную модификацию генов в нейронах, проецирующих в определенные представляющие интерес области.
В совокупности эти наблюдения показывают, что rAAV2-retro является эффективным реагентом для генетически доступных проекционных нейронов для функционального изучения нервных цепей и, в конечном счете, для осуществления терапии.
Пример 18. Обсуждение.
Рекомбинантные аденоассоциированные вирусы могут в значительной степени облегчить функциональное разделение нервных цепей у млекопитающих и являются перспективными для терапевтического вмешательства при расстройствах нервной системы. Направленную эволюцию использовали для обеспечения капсида AAV дополнительной способностью к эффективному ретроградному доступу к проекционным нейронам во многих цепях. Новый сконструированный rAAV2-retro обеспечивает усиление ретроградного транспорта до двух порядков по сравнению с обычно используемыми серотипами AAV, что соответствует эффективности синтетических ретроградных индикаторов во многих цепях. Уровень экспрессии трансгена, достигаемый с помощью rAAV2-retro через ретроградный доступ, является достаточным для изучения функции нервной цепи, а также для целенаправленных манипуляций с геномом нейронов. Таким образом, благодаря возможности избирательного мониторинга и манипулирования проекционными нейронами, соединяющими разные области мозга, инструменты на основе rAAV2-retro способны дать представление о том, каким образом крупномасштабные сети обеспечивают функционирование мозга, и являются перспективными для терапевтического вмешательства при заболеваниях, характеризующихся обширной прогрессирующей дисфункцией сети.
Заметно повышенная эффективность ретроградного доступа, обеспечиваемая rAAV2-retro, по сравнению с его родительским серотипом AAV2, может быть обеспечена за счет опосредованного вставкой разрушения нативного сайта связывания гепарансульфата и/или путем создания новой поверхности свя
- 19 044679 зывания, которая включает вставленный пептид. Этот вариант имеет пониженное сродство к гепарину (фиг. 9), что может уменьшить секвестрацию вируса во внеклеточном матриксе синаптической щели и увеличить распространение локального вектора, как это наблюдалось с AAV1 и AAV6. Однако полученное увеличение за счет только распространения вектора не может объяснить эффективность ретроградного транспорта, так как другие вставленные 7-мерные последовательности аналогичным образом нарушают связывание гепарина, но не влияют на ретроградный транспорт. Кроме того, AAV5 и AAV9 не связывают гепарин, однако их ретроградная транспортная эффективность аналогична эффективности AAV2. Альтернативное толкование подтверждается и тем, что пептидные вставки, выбранные в начальном отборе (LAxxDxTKxA (SEQ ID NO: 106)/LAxDxTKxxA (SEQ ID NO: 107)), имеют одинаковую общую композицию, отличающуюся только консервативным мотивом. Сконструированная пептидная вставка может поддерживать усиленное связывание с существующим клеточным кофактором в пути AAV (например, недавно идентифицированным общим для AAV рецептором), или она может создавать новое взаимодействие с клеточным механизмом - рецептором клеточной поверхности и/или компонентом везикулярного транспорта или пути проникновения в ядро.
Несмотря на улучшение ретроградного транспорта на несколько порядков, обеспечиваемого rAAV2-retro, по сравнению с существующими серотипами, небольшой набор классов проекционных нейронов, по-видимому, является невосприимчивым к эффективной ретроградной инфекции с помощью этого нового варианта rAAV (табл. 3). Однако следует отметить, что эти проекции также остаются не меченными и другими серотипами AAV. Является ли уровень экспрессии критического клеточного фактора, который взаимодействует с этим новым вариантом AAV в этих нейронах, просто чрезвычайно низким - заключение, подтвержденное для кортико-таламической и кортико-колликулярной проекций, например, путем наблюдения того, что rAAV2-retro все еще способен доставлять достаточное количество рекомбиназы Cre в клеточные тела, обеспечивая высокий уровень экспрессии локально доставляемой Cre-зависимой полезной нагрузки (табл. 3, выделенные записи) - либо этот фактор полностью отсутствует, еще предстоит определить для каждого случая. Дополнительные будущие модификации капсида в этом или других вариантах могли бы обеспечить усиленную ретроградную трансдукцию этих классов нейронов.
Система на основе вектора rAAV2-retro обеспечивает важное дополнение к генетическому набору инструментов для анализа функции нейронных цепей, поскольку получение доступа к отдельным классам проекционных нейронов является критически важным шагом, позволяющим выяснить, каким образом происходит координация динамики локальной цепи и функции крупномасштабной сети. Предполагается, что вычисления локальных цепей зависят в большой степени от динамики всей популяции нейронов в конкретном модуле локальных цепей. Каким образом эта динамика отображается на различные классы проекционных нейронов - и, следовательно, какая информация передается различным нижестоящим целям - остается неразрешенным вопросом для большинства цепей. Векторы на основе rAAV2-retro, отдельно или в комбинации с конкретными трансгенными линиями Cre, обеспечивают генетический доступ к специфическим популяциям проекционных нейронов. В свою очередь, гликопротеин G бешенства, несущий rAAV2-retro, может быть использован для транс-комплемента недавно разработанного нетоксичного условного вектора бешенства для доступа к пресинаптическим микроцепям, воздействующим на определенные классы проекционных нейронов. Приобретенная способность избирательно контролировать и управлять активностью проекционных нейронов отдельных классов и их локальных микроцепей должна дать представление о том, каким образом проекционные нейроны транслируют динамику локальной цепи для своих соответствующих крупномасштабных сетей.
rAAV2-retro также является перспективным для терапевтического вмешательства по нескольким возможным направлениям. Например, в ситуациях, когда патология воздействует на большие объемы нервной ткани - например, болезнь Альцгеймера или болезнь лизосомального накопления - многократные инъекции являются рискованными с точки зрения безопасности и могут быть недостаточными для достижения необходимых уровней трансдукции. Однако небольшое количество инъекций в стратегических участках может обеспечить распространение вектора на большие объемы (например, в кортикопонтинный тракт - от точки конвергенции в BPN) или труднодоступные ткани (например, спинномозговые двигательные нейроны из мышцы). Кроме того, крупномасштабные функциональные сети вовлечены в распространение многих нейродегенеративных расстройств от места их возникновения. Согласно широко распространенной точке зрения, отложение аномальных агрегатов белков в уязвимых популяциях нейронов вызывает патологический каскад аберрантной активности нейронов внутри и распад крупномасштабных функциональных сетей, в конечном итоге приводя к нарушению неврологических функций. Интересно, что затронутые нейронные сети, по-видимому, способны на ранних стадиях заболевания временно преодолевать аберрантную динамику, так как у пациентов со многими нейродегенеративными заболеваниями часто наблюдаются периоды значительного улучшения. Таким образом, раннее вмешательство, направленное на замедление распространения агрегатов коркового происхождения, вызванных патологией, может быть достаточным для стабилизации или даже восстановления когнитивной функции. С этой точки зрения, субкортикальные проекционные нейроны в мезокортикальных областях, где впервые появляются патологические агрегаты белков, как при болезни Альцгеймера, так и при болезни Пар
-
Claims (41)
- кинсона, представляют собой привлекательную цель для вмешательства. Доступ к этим проекционным нейронам с помощью инструментов, основанных на rAAV2retro, предназначенных, например, для введения мутации, способной остановить дальнейшую агрегацию в cis, или для доставки шаперонов, способных расщеплять агрегаты, может замедлить развитие наиболее изнурительных, когнитивных симптомов. Оценка эффективности и долгосрочной безопасности реагентов rAAV2-retro у приматов, не являющихся людьми, проложит путь к их возможному применению в этих и других подходах генной терапии.Следует понимать, что, хотя способы и композиции вещества описаны в настоящей заявке в сочетании с рядом различных аспектов, вышеприведенное описание различных аспектов предназначено для иллюстрации, а не для ограничения объема способов и композиций вещества. В объем приведенной ниже формулы изобретения также входят и другие аспекты, преимущества и модификации.Раскрыты способы и композиции, которые могут быть использованы, могут быть использованы в комбинации, могут быть использованы для приготовления продуктов, раскрытых способов и композиций или являются такими продуктами, раскрытыми способами и композициями. Эти и другие материалы раскрыты в настоящей заявке, при этом подразумевается, что также раскрыты комбинации, подмножества, взаимодействия, группы и т.д. этих способов и композиций. То есть, хотя конкретная ссылка на каждую из различных отдельных и объединенных комбинаций и перестановки этих композиций и способов не может быть раскрыта в явном виде, каждая из них рассмотрена и описана конкретно в данном описании. Например, если раскрыта и обсуждается конкретная композиция вещества или конкретный способ и ряд композиций или способов, каждая комбинация и перестановка композиций и способов рассматриваются конкретно, если специально не указано иное. Аналогично, любое подмножество или их комбинация также рассмотрены и раскрыты специальным образом.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Капсидный белок аденоассоциированного вируса (AAV), где капсидный белок AAV содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 18, 22, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 54, 56, 60, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 и 78.
- 2. Капсидный белок AAV по п.1, где капсидный белок AAV содержит SEQ ID NO: 44.
- 3. Частица аденоассоциированного вируса (AAV), содержащая капсидный белок AAV по п.1 или 2.
- 4. Частица AAV по п.3, где частица AAV демонстрирует усиленное ретроградное движение по сравнению с вирусной частицей дикого типа.
- 5. Частица AAV по п.3, где частица AAV обладает способностью к ретроградному транспорту.
- 6. Частица AAV по любому из пп.3-5, дополнительно содержащая нуклеиновую кислоту, содержащую трансген.
- 7. Частица AAV по п.6, где нуклеиновая кислота содержит промоторную последовательность, функционально связанную с трансгеном.
- 8. Частица AAV по п.7, где промотор выбран из группы, состоящей из синапсина-1, CMV, GFAP, CAG, CaMKII, MBP, EF1альфа, TRE и mDlx.
- 9. Частица AAV по любому из пп.3-5, дополнительно содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую нуклеиновую кислоту - ингибирующую РНК.
- 10. Частица AAV по п.9, где нуклеиновая кислота - ингибирующая РНК представляет собой антисмысловой олигонуклеотид, миРНК или РНКи.
- 11. Частица AAV по п.6, где трансген кодирует эффекторный белок.
- 12. Частица AAV по п.11, где эффекторный белок выбран из группы, состоящей из рекомбиназы (например, Cre или Flp), системы редактирования генов (например, CRISPR/Cas9, TALEN, нуклеазы цинкового пальца), оптогенетических реагентов (активаторов (например, канального родопсина или его вариантов)) или ингибиторов (например, галородопсина или Arch)), хемогенетических реагентов (например, версии активатор/ингибитор систем DREADD или PSAM/PSEM), активаторов и/или ингибиторов клеточных сигнальных путей и ферментов эпигенетического контроля.
- 13. Частица AAV по п.6, где трансген кодирует конструкцию оптического репортера.
- 14. Частица AAV по п.13, где конструкция оптического репортера выбрана из группы, состоящей из GCaMP6 (s, m или f), флуорофора (например, зеленого флуоресцентного белка (GFP), усиленного GFP (EGFP), красного флуоресцентного белка (RFP), желтого флуоресцентного белка (YFP), tdTomato), изменяющей цвет конструкции (например, трансгена, который экспрессирует один репортер в одной клеточной популяции, а другой репортер - в другой популяции), сенсоров глюкозы, jRCaMP, jRGECO и CaMPARI, индикаторов напряжения, вторичных мессенджеров, рецепторных сигнализаторов, репортеров транскрипции, эпигенетических репортеров и нейромодуляторных репортеров.
- 15. Частица AAV по п.6, где трансген кодирует вирусный белок.
- 16. Частица AAV по п.15, где вирусный белок представляет собой белок G бешенства.
- 17. Частица AAV по п.15, где вирусный белок представляет собой белок, который дополняет функцию вируса, отличного от AAV, или белок, который имеет отношение к клеточному и межклеточному транспорту.- 21 044679
- 18. Частица AAV по п.6, где трансген кодирует терапевтический белок.
- 19. Частица AAV по п.18, где терапевтический белок предназначен для лечения нейродегенеративного заболевания.
- 20. Частица AAV по п.19, где терапевтический белок представляет собой HSP23 для лечения болезни Альцгеймера или другого заболевания, связанного с токсичными агрегатами белков.
- 21. Частица AAV по п.19, где терапевтический белок представляет собой фратаксин для лечения атаксии Фридрейха.
- 22. Частица AAV по п.19, где терапевтический белок представляет собой лизосомальную глюкоцереброзидазу (GBA) для лечения болезни Паркинсона.
- 23. Частица AAV по п.19, где терапевтический белок представляет собой полиQ-связывающий белок для лечения болезни Хантингтона.
- 24. Частица AAV по п.19, где терапевтический белок представляет собой белок выживания мотонейрона 1 для лечения мышечной атрофии позвоночника, бокового амиотрофического склероза (ALS), аутизма, деменции, периферической невропатии, шизофрении или дегенерации сетчатки.
- 25. Частица AAV по п.6, где трансген кодирует терапевтический фрагмент, где терапевтический фрагмент представляет собой антитело или его фрагмент, иммуномодулирующий белок или молекулу РНК интерференции.
- 26. Частица AAV по п.25, где терапевтический фрагмент представляет собой антитело или его фрагмент.
- 27. Частица AAV по п.25, где терапевтический фрагмент представляет собой иммуномодуляторный белок.
- 28. Частица AAV по п.25, где терапевтический фрагмент представляет собой молекулу, действующую по принципу РНК интерференции.
- 29. Частица AAV по любому из пп.3-25, где частица AAV демонстрирует на величину вплоть до двух порядков более высокий уровень ретроградного доступа к кортико-понтинным проекционным нейронам по сравнению с собачьим аденовирусом-2.
- 30. Частица AAV по любому из пп.3-25, где вирусная частица демонстрирует ретроградный доступ к кортико-понтинным проекционным нейронам или афферентам к дорсомедиальному стриатуму (DMS), сравнимый с синтетическим реагентом для ретроградного мечения.
- 31. Способ доставки трансгена или ингибирующей нуклеиновой кислоты РНК в один или более нейронов, включающий: контактирование одного или более нейронов с аденоассоциированным вирусом (AAV), содержащим трансген или ингибирующую нуклеиновую кислоту РНК, упакованный в нем, где AAV содержит капсидный белок, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 18, 22, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 54, 56, 60, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 и 78.
- 32. Способ по п.31, где AAV демонстрирует ретроградное движение в нейронах.
- 33. Способ по п.31 или 32, где нейроны представляют собой проекционные нейроны.
- 34. Способ по любому из пп.31-33, где нейроны находятся у пациента.
- 35. Способ по любому из пп.31-34, где нейроны находятся в центральной нервной системе (ЦНС) пациента.
- 36. Способ по п.34 или 35, где пациент представляет собой человека.
- 37. Способ по п.34, где пациент не является человеком.
- 38. Способ по п.37, где не являющийся человеком пациент представляет собой примата, грызуна и птицу.
- 39. Способ по любому из пп.31-33, где стадия контактирования происходит в клеточной культуре.
- 40. Способ по любому из пп.31-38, где стадию контактирования осуществляют in vivo через внутричерепную, внутриспинальную или внутримышечную инъекцию.
- 41. Способ по любому из пп.31-40, где капсидный белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44.-
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62/350,361 | 2016-06-15 | ||
| US62/404,585 | 2016-10-05 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA044679B1 true EA044679B1 (ru) | 2023-09-22 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11939355B2 (en) | Variant adeno-associated viruses and methods of using | |
| JP7066619B2 (ja) | アデノ随伴ウイルス（ａａｖ）を誘導するための標的指向性ペプチド | |
| Ulusoy et al. | Viral vector-mediated overexpression of α-synuclein as a progressive model of Parkinson’s disease | |
| El-Shamayleh et al. | Strategies for targeting primate neural circuits with viral vectors | |
| KR20200039617A (ko) | 아데노-연관 바이러스 캡시드 변이체 및 이의 사용 방법 | |
| CA3128525A1 (en) | Interneuron-specific therapeutics for normalizing neuronal cell excitability and treating dravet syndrome | |
| Li et al. | Anterograde transneuronal tracing and genetic control with engineered yellow fever vaccine YFV-17D | |
| CA3193406A1 (en) | Methods for treating neurological disease | |
| Kim et al. | Selective transgene expression in cerebellar Purkinje cells and granule cells using adeno-associated viruses together with specific promoters | |
| JP2023518980A (ja) | 非神経脳細胞での遺伝子発現を選択的に調節する人工発現構築物 | |
| KR20220130150A (ko) | 망막 신경절 세포의 재생 | |
| Surdyka et al. | Selective transduction of cerebellar Purkinje and granule neurons using delivery of AAV-PHP. eB and AAVrh10 vectors at axonal terminal locations | |
| EA044679B1 (ru) | Вариантные аденоассоциированные вирусы и способы их применения | |
| US20220378941A1 (en) | Recombinant nucleic acids containing alphaherpesvirus promoter sequences | |
| NZ789365A (en) | Variant adeno-associated viruses and methods of using | |
| TW202221119A (zh) | Dna結合域轉活化子及其用途 | |
| JP2023529833A (ja) | 抑制性新皮質ニューロンにおいて遺伝子発現を選択的に調節する人工発現構築物 | |
| Tang | New biological tools for genetic manipulation of the mouse brain |