CN111411072B - SLC30A8基因表达下调的抗糖尿病胰岛β细胞及其应用 - Google Patents

SLC30A8基因表达下调的抗糖尿病胰岛β细胞及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及SLC30A8基因表达下调的抗糖尿病胰岛β细胞及其应用。本发明利用诱导分化得到大量具有抗糖尿病功能的胰岛β细胞，并探讨SLC30A8基因对人类胰岛β细胞功能成熟过程的调控作用，在体外诱导分化体系中对人类胰岛β细胞功能成熟过程进行调控，提高其血糖敏感度，使其高效定向分化为具有抗凋亡和高效分泌胰岛素能力的功能性胰岛β细胞，为糖尿病机制研究及糖尿病干细胞治疗提供了新思路。

Description

SLC30A8基因表达下调的抗糖尿病胰岛β细胞及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种SLC30A8基因表达下调的抗糖尿病胰岛β细胞及其应用。
背景技术
糖尿病对人类健康危害极大。在世界范围内，糖尿病患病率、发病率和糖尿病患者数量急剧上升，据国际糖尿病联盟统计：2017年全世界糖尿病患者数已达4.25亿，较2011年的3.66亿增加近16％，中国已成为全球糖尿病发病第一大国，发展态势十分严峻。糖尿病主要分为1型和2型，其中2型糖尿病发病更为广泛。2型糖尿病与衰老和肥胖相关，患者的外周靶器官对胰岛素产生抵抗，造成胰岛素分泌的相对不足。2型糖尿病中存在着胰岛β细胞功能缺损，越来越多的研究表明胰岛β细胞功能缺损是2型糖尿病发病的重要因素之一。因此，从胰岛β细胞发育及功能成熟的角度，系统地、深入地阐明2型糖尿病的发病机理，可以为2型糖尿病的预防与治疗提供新思路。
目前，糖尿病的治疗主要是通过降糖药的服用，外源胰岛素的注射，然后再配合合理的饮食控制和适当的体育锻炼以达到保持体内血糖稳定的目的。然而，长期服用降糖药会使病人产生抗药性，引起药物继发性的失效，长期外源性胰岛素的注射会引起患者皮下脂肪营养不良，皮下脂肪萎缩。包括胃束带术，袖状胃成形术，胃旁路术，胆胰分流术等手术方案仍可能造成一定的病死率和不同程度的术后并发症。移植胰岛β细胞可以有效地治疗由自身免疫系统破坏β细胞或β细胞功能缺陷引起的糖尿病，然而，胰腺供体短缺严重的阻碍了移植胰岛治疗的广泛应用。因此，研究人员将目标转向体外培养胰岛β细胞。然而，由干细胞衍生β细胞技术仍然有未满足的需求和未来发展的方向，目前市场上常用的干细胞衍生的胰岛β细胞不具有强大的生理功能，分泌胰岛素水平低，达不到正常胰岛β细胞的功能，需要提高其分化效率、抑制凋亡及增加胰岛素分泌能力等。如何诱导产生大量的功能性胰岛β细胞仍是一个巨大挑战。
全基因组关联研究(GWAS，genome-wide association study)发现了许多与2型糖尿病和胰岛β细胞功能失活相关的基因突变，表明部分2型糖尿病病人的胰岛β细胞可能具有天生的“脆弱性”，因而较易受到损伤引发糖尿病，最近一项GWAS研究发现：SLC30A8(主要表达于胰岛中)的表达下调可以显著降低人类2型糖尿病的发生，这一发现为预防和治疗2型糖尿病提供了新的思路。
目前，现有技术过程中尚无在人类胰岛β细胞中深入研究SLC30A8基因的功能的报道，也并无能够结合干细胞诱导分化技术与CRISPR/Cas9基因编辑技术，研究人类胰岛β细胞的发育与功能成熟过程及糖尿病发病机制与治疗的报道。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于调控SLC30A8基因表达和/或功能的物质在制备用于调控胰岛β细胞的试剂盒中的用途，用于解决现有技术过程中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种用于调控SLC30A8基因表达和/或功能的物质在制备用于调控胰岛β细胞的试剂盒中的用途。
优选地，所述用于调控SLC30A8基因表达和/或功能的物质用于调控所述胰岛β细胞的胰岛素分泌水平，优选地，用于调控在葡萄糖刺激的环境下，所述胰岛β细胞的胰岛素分泌水平。
优选地，所述胰岛β细胞来源于人。
优选地，所述用于调控SLC30A8基因表达和/或功能的物质选自核酸分子、蛋白分子或化合物。
本发明第二方面提供一种如上所述的胰岛β细胞，所述胰岛β细胞为SLC30A8基因表达下调的胰岛β细胞。
优选地，所述胰岛β细胞来源于人。
本发明第三方面提供一种如上所述的胰岛β细胞的构建方法，包括：诱导分化SLC30A8基因敲除的胚胎干细胞，以提供所述胰岛β细胞。
本发明第四方面提供一种如上所述的胰岛β细胞在制备用于治疗胰岛素缺乏相关疾病的药物中的用途。
优选地，所述胰岛素缺乏相关疾病选自糖尿病。
本发明第五方面提供一种药物组合物，包括如上所述的胰岛β细胞。
如上所述，本发明通过利用CRISPR/Cas9基因编辑技术使胰岛β细胞中的SLC30A8基因表达下调，使人胚胎干细胞中SLC30A8编码的锌离子转运蛋白ZnT8的功能失活，通过体外模拟人胰岛β细胞的发育及功能成熟过程，逐步诱导分化获得具有对糖尿病发病具有抵抗力的β细胞。此外，本发明关注了SLC30A8在胰岛β细胞分化中的功能，相较于市面上多数单一未进行功能化的胰岛β细胞，该诱导分化方式可以促进胰岛β细胞的成熟，提高其对血糖变化的敏感度，并使其具有更高效的胰岛素分泌能力和抗凋亡能力。本发明建立了研究人类胰岛β细胞的发育与功能成熟过程及糖尿病发病机制平台，深入研究SLC30A8功能，诱导分化出大量具有抗糖尿病功能的胰岛β细胞，为糖尿病机制研究及糖尿病干细胞治疗提供了新思路。
附图说明
图1显示为本发明实施例2中体外分化的SLC30A8基因敲除的胰岛β细胞的胰岛素分泌水平。
图2显示为本发明实施例2中移植SLC30A8基因敲除的β细胞的小鼠的血糖水平。
图3显示为本发明实施例2中移植SLC30A8基因敲除的β细胞的小鼠的胰岛素分泌水平。
图4显示为本发明实施例2中移植SLC30A8基因敲除的β细胞的小鼠在葡萄糖刺激下的血糖水平。
图5显示为本发明实施例3中在棕榈酸刺激下，SLC30A8基因敲除的β细胞的凋亡细胞数水平。
图6显示为本发明实施例3中在棕榈酸刺激下，SLC30A8基因敲除的β细胞响应葡萄糖刺激时的胰岛素分泌水平。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术，这些技术在现有文献中已有完善说明。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明中术语“基因表达下调”是指细胞基因组中的某基因表达水平下降，包括但不限于敲除、敲低等其他基因表达下调的技术。
本发明中术语“β细胞”是指在来源人体或动物等的生物体的胰岛中能分泌胰岛素的胰岛β细胞。
本发明首先设计获得人SLC30A8基因的sgRNA1、sgRNA2，并分别构建SLC30A8基因的sgRNA1、sgRNA2到携带Cas9蛋白基因与嘌呤霉素抗性基因的载体；然后将携带sgRNA1、sgRNA2，Cas9蛋白基因的质粒转染进入胚胎干细胞中，通过挑取单克隆，得到SLC30A8基因敲除的细胞。详细过程如下描述：
实施例1
构建SLC30A8基因敲除的人胚胎干细胞系
1质粒构建
(1)质粒设计及sgRNA筛选
利用工具网站(http://crispr.mit.edu/)针对人SLC30A8基因靠近5’端外显子的上游和下游各设计一条23bp的sgRNA，并将其通过PCR与酶切连接的方式插入携带Cas9蛋白基因与嘌呤霉素抗性基因的载体中。根据sgRNA打靶位置与脱靶率评分高低，筛选出如下sgRNA：
sgRNA1(SEQ ID NO.1):GACTGGCGTGCTAGTGTACCTGG；
sgRNA2(SEQ ID NO.2):CGATGATCATCACAGTCGCCTGG。
质粒序列如下(SEQ ID NO.3)：
aattgaaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccggttcggcaagatctcgggcgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttgtttaaacacacggttcctagtatcggtccgaaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgttcatcgtctttgatggacgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatgggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgttgccttcgccccgtgccccgctccgcgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggctcgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttaaagggctccgggagggccctttgtgcgggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggcccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcgtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcgggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcggcggtcgggctgtaacccccccctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtacggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggcccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctgtgcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagcgggcgcggggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccatctccagcctcggggctgtccgcagggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagtgcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaagaattctctagagatatcgctagcaccatggactacaaagaccatgacggtgattataaagatcatgacatcgattacaaggatgacgatgacaagatggcccccaagaagaagaggaaggtgggcattcaccgcggggtacccatggacaagaagtactccattgggctcgatatcggcacaaacagcgtcggctgggccgtcattacggacgagtacaaggtgccgagcaaaaaattcaaagttctgggcaataccgatcgccacagcataaagaagaacctcattggcgccctcctgttcgactccggggagacggccgaagccacgcggctcaaaagaacagcacggcgcagatatacccgcagaaagaatcggatctgctacctgcaggagatctttagtaatgagatggctaaggtggatgactctttcttccataggctggaggagtcctttttggtggaggaggataaaaagcacgagcgccacccaatctttggcaatatcgtggacgaggtggcgtaccatgaaaagtacccaaccatatatcatctgaggaagaagcttgtagacagtactgataaggctgacttgcggttgatctatctcgcgctggcgcatatgatcaaatttcggggacacttcctcatcgagggggacctgaacccagacaacagcgatgtcgacaaactctttatccaactggttcagacttacaatcagcttttcgaagagaacccgatcaacgcatccggagttgacgccaaagcaatcctgagcgctaggctgtccaaatcccggcggctcgaaaacctcatcgcacagctccctggggagaagaagaacggcctgtttggtaatcttatcgccctgtcactcgggctgacccccaactttaaatctaacttcgacctggccgaagatgccaagcttcaactgagcaaagacacctacgatgatgatctcgacaatctgctggcccagatcggcgaccagtacgcagacctttttttggcggcaaagaacctgtcagacgccattctgctgagtgatattctgcgagtgaacacggagatcaccaaagctccgctgagcgctagtatgatcaagcgctatgatgagcaccaccaagacttgactttgctgaaggcccttgtcagacagcaactgcctgagaagtacaaggaaattttcttcgatcagtctaaaaatggctacgccggatacattgacggcggagcaagccaggaggaattttacaaatttattaagcccatcttggaaaaaatggacggcaccgaggagctgctggtaaagcttaacagagaagatctgttgcgcaaacagcgcactttcgacaatggaagcatcccccaccagattcacctgggcgaactgcacgctatcctcaggcggcaagaggatttctacccctttttgaaagataacagggaaaagattgagaaaatcctcacatttcggataccctactatgtaggccccctcgcccggggaaattccagattcgcgtggatgactcgcaaatcagaagagaccatcactccctggaacttcgaggaagtcgtggataagggggcctctgcccagtccttcatcgaaaggatgactaactttgataaaaatctgcctaacgaaaaggtgcttcctaaacactctctgctgtacgagtacttcacagtttataacgagctcaccaaggtcaaatacgtcacagaagggatgagaaagccagcattcctgtctggagagcagaagaaagctatcgtggacctcctcttcaagacgaaccggaaagttaccgtgaaacagctcaaagaagactatttcaaaaagattgaatgtttcgactctgttgaaatcagcggagtggaggatcgcttcaacgcatccctgggaacgtatcacgatctcctgaaaatcattaaagacaaggacttcctggacaatgaggagaacgaggacattcttgaggacattgtcctcacccttacgttgtttgaagatagggagatgattgaagaacgcttgaaaacttacgctcatctcttcgacgacaaagtcatgaaacagctcaagaggcgccgatatacaggatgggggcggctgtcaagaaaactgatcaatgggatccgagacaagcagagtggaaagacaatcctggattttcttaagtccgatggatttgccaaccggaacttcatgcagttgatccatgatgactctctcacctttaaggaggacatccagaaagcacaagtttctggccagggggacagtcttcacgagcacatcgctaatcttgcaggtagcccagctatcaaaaagggaatactgcagaccgttaaggtcgtggatgaactcgtcaaagtaatgggaaggcataagcccgagaatatcgttatcgagatggcccgagagaaccaaactacccagaagggacagaagaacagtagggaaaggatgaagaggattgaagaggg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(2)质粒转化及测序
将克隆用的化学感受态细胞置于冰上解冻，取10μL连接产物加入到100μL感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰上静置30min，42℃水浴热激45s后，立即置于冰上冷却2min。加入900μL的LB液体培养基(不加抗生素)，37℃摇菌1h(转速200-250rpm)。将相应抗性的LB固体培养基平板在37℃培养箱中预热，5000rpm离心5min，弃掉900μL上清，用剩余培养基将菌液重悬，用涂平板，37℃培养箱中倒置培养12h。挑取克隆送测序公司进行测序，挑选连接成功的质粒，并进行大规模质粒抽提。
2胚胎干细胞培养条件：
(1)配制hESC培养基，其包括DMEM/F12(Invitrogen，#11330-082)，20％血清替代物(Invitrogen，#10828028)，1mM非必需氨基酸(Gibco，#11140-050)，1X L-谷氨酰胺(Gibco，#25-005-CI)，0.05mMβ-巯基乙醇(Invitrogen，#21985023)和青霉素/链霉素(Gibco，#30-002-CI)，10ng/mL bFGF(R&D，#233-FB/CF)；
(2)将1:6稀释的基质胶(Corning,#354230)铺在细胞培养皿上，37℃孵育0.5h以使胶凝固；
(3)将小鼠滋养层细胞接种于基质胶覆盖的细胞培养皿上，并在37℃，含5％的CO2培养箱中过夜培养；
(4)将人类胚胎干细胞系Mel1(中科院实验室提供)接种在小鼠滋养层细胞上，并在37℃，含5％的CO2培养箱中进行细胞培养。细胞每3-4天进行传代。
3质粒电转与细胞系筛选
(1)将培养至80％密度的胚胎干细胞用TrypLE进行消化，并用0.25μm的细胞滤网进行过滤，使细胞分散成为单细胞；
(2)取0.3-0.4M总量的细胞通过电转染的方式使携带sgRNA及Cas9蛋白基因的质粒进入细胞当中；
(3)在电转后，将细胞在hESC培养基中重新悬浮并接种于3.5cm的细胞培养皿中。在培养两天后，加入400ng/mL的嘌呤霉素进行细胞筛选。48-60h后，移除嘌呤霉素，每天更换培养基直至克隆长至30-50μM；
(4)挑取细胞单克隆，并将其转移至96孔板中扩大培养，每个孔取部分细胞用裂解液裂解提取细胞基因组，并进行测序检验SLC30A8基因是否被敲除；另一部分冷冻待用。测序结果表明，SLC30A8的4号外显子有46bp被敲除，导致终止密码子提前，基因终止表达。
4胚胎干细胞体外诱导分化为功能成熟的β细胞
在人胚胎干细胞中敲除SLC30A8基因后，通过体外诱导分化将SLC30A8基因敲除的胚胎干细胞及其野生型逐步培养为具有成熟功能的胰岛β细胞。现有分化系统经定形内胚层细胞、胰腺前体细胞、胰腺内分泌前体细胞、未成熟胰岛β细胞及成熟胰岛β细胞5个主要阶段，例如可以参考Rezania,A.et al.Reversal of diabetes with insulin-producingcells derived in vitro fromhuman pluripotent stem cells.Nature biotechnology32,1121-1133,doi:10.1038/nbt.3033(2014)和Nostro,M.C.et al.Efficientgeneration of NKX6.1+pancreatic progenitors from multiple human pluripotentstem cell lines.Stem cell reports 4,591-604,doi:10.1016/j.stemcr.2015.02.017(2015)，采用2D与3D培养相结合的方式，可在培养皿中模拟人胰岛β细胞发育及功能成熟的过程。
以上结果表明，由上述实验过程可获取SLC30A8基因敲除的胰岛β细胞。
实施例2
SLC30A8基因敲除对β细胞胰岛素分泌功能促进的研究
响应葡萄糖刺激的胰岛素分泌能力是衡量胰岛β细胞功能的重要指标。将实施例1诱导分化成熟的胰岛β细胞作为SLC30A8基因敲除组(SLC30A8)，并将其与未进行基因编辑的野生对照组(WT)β细胞，通过以下方法进行体内外功能的检测，研究SLC30A8基因敲除对胰岛素分泌功能的影响
1体外功能检测
体外研究主要检测成熟胰岛β细胞胰岛素合成及分泌功能。胰岛素合成方面我们监测了胰岛素原到胰岛素的转换效率：利用胰岛素原(Proinsulin)与胰岛素(Insulin)抗体识别位点的不同，分别用流式细胞术筛选出胰岛素原阳性和胰岛素阳性的细胞，统计二者阳性细胞的数量，计算出SLC30A8基因敲除组和野生对照组的细胞胰岛素转化效率的差异。
对胰岛素分泌功能的检测，我们首先进行随机胰岛素分泌量的测量：对体外分化的成熟胰岛β细胞，随机取其培养基进行胰岛素分泌量测定，比较随机状态下SLC30A8基因敲除和野生对照组的胰岛β细胞基础胰岛素分泌水平；其次，对葡萄糖刺激下的胰岛素分泌功能进行检测：将SLC30A8基因敲除组和野生对照组分别诱导分化为成熟胰岛β细胞后，将细胞团从原培养基中取出，放入Kreb溶液中饥饿处理(Fasting)2小时后分别进行低浓度葡萄糖(Cycle1，2mM)与高浓度葡萄糖(Cycle2，20mM)刺激，每个刺激时长为0.5小时；交替刺激两个循环；每个刺激结束后取上清检测胰岛素的含量，即为胰岛β细胞分泌胰岛素量。比较SLC30A8基因敲除组和野生对照组的胰岛β细胞分别在高糖刺激下胰岛素分泌量与低糖刺激下胰岛素分泌量的倍数改变，监测胰岛β细胞的成熟度。如图1所示，实验结果表明，相较于野生对照组，SLC30A8基因敲除组的β细胞在低糖与高糖分别刺激下倍数变化明显更高，因此，SLC30A8基因敲除的β细胞具有更加成熟的功能。
2体内功能检测
在小鼠体内研究SLC30A8基因敲除对诱导分化而来的成熟胰岛β细胞功能的影响，主要监测体外分化至成熟阶段的胰岛β细胞移植到糖尿病模型小鼠体内后，是否能够响应葡萄糖的刺激分泌胰岛素，继而使糖尿病小鼠的血糖恢复至正常水平。
具体方案如下：以免疫缺陷小鼠SCID-Beige为诱导分化而来的胰岛β细胞移植的受体，提供链脲佐菌素(STZ)腹腔注射(170mg/Kg)诱导β细胞急性杀伤(表现为高血糖)的SCID-Beige小鼠，模拟糖尿病小鼠。
将SLC30A8基因敲除组和野生对照组的成熟胰岛β细胞团(3million)分别移植至上述STZ建模后的小鼠的左侧肾包膜下，分别作为移植组(Transplantation)：SLC30A8基因敲除组(SLC30A8)和野生对照组(WT)，同时取未移植的STZ建模后的小鼠，作为未移植组(No-transplantation)进行参照。移植后开始对糖尿病小鼠的血糖水平进行监控，每5天检测随机血糖水平1次，研究SLC30A8基因敲除对诱导分化而来的成熟胰岛β细胞调控血糖水平的功能是否有影响。如图2所示，实验结果表明，相较于野生对照组，移植SLC30A8基因敲除组的β细胞的小鼠血糖恢复更快，且血糖水平更低。
同时在移植4-6周后对不同处理组的小鼠进行饥饿处理(饥饿16小时)，然后腹腔注射葡萄糖3mg/kg，分别在注射前以及注射30分钟后进行取血，通过ELISA检测小鼠血清中人胰岛素水平，比较不同处理组小鼠中诱导分化而来的胰岛β细胞响应葡萄糖刺激分泌胰岛素的能力。如图3所示，实验结果表明，相较于野生对照组，SLC30A8基因敲除组的β细胞在移植小鼠体内具有更强的胰岛素分泌能力。
最后，在观察到糖尿病小鼠血糖水平恢复后，对不同处理组小鼠的糖耐受水平进行检测，具体方法为将小鼠饥饿过夜(16-20h)，腹腔注射3mg/kg葡萄糖，分别在葡萄糖注射后的0min,15min,30min,60min,120min测试小鼠血糖水平，如图4所示，实验结果表明，相较于野生对照组，移植SLC30A8基因敲除组的β细胞的小鼠在15min-30min这一血糖水平峰值处血糖值更低，说明SLC30A8基因敲除的β细胞具有更强的胰岛素分泌能力和降血糖效果。
实验结果表明，由上述公开的技术方案体外诱导分化而来的SLC30A8基因敲除的胰岛β细胞响应葡萄糖刺激的胰岛素分泌能力显著提升，即，SLC30A8基因敲除的胰岛β细胞在体内外均具有较好的抵抗糖尿病的功能。
实施例3SLC30A8基因敲除对β细胞抵抗二型糖尿病发病的研究
将实施例1诱导分化成熟的SLC30A8基因敲除组与野生对照组的胰岛β细胞，通过以下方法研究SLC30A8基因敲除的胰岛β细胞抵抗二型糖尿病发病的机制。
1体外模拟棕榈酸诱导的脂毒性β细胞凋亡
将SLC30A8基因敲除组和野生对照组，分别形成两组对照组(Control，Ct)及两组加1mM棕榈酸溶液组(PA)，其中两组对照组均加入等计量棕榈酸溶剂，经48h培养后将细胞球取出进行Annexin V活细胞染色(该染料可鉴别早期凋亡细胞)，并进行共聚焦显微镜拍摄，统计Annexin V表达量。如图5所示，结果显示，在棕榈酸刺激下，野生对照组的β细胞早期凋亡数量增加明显，但SLC30A8基因敲除组的β细胞凋亡细胞数量并未有明显提升。
2检测棕榈酸诱导的脂毒性对β细胞胰岛素分泌功能的影响
将SLC30A8基因敲除组和野生对照组，分别形成两组对照组及两组加1mM棕榈酸溶液组，其中两组对照组均加入等计量棕榈酸溶剂，经48h培养后将细胞球取出，在20mM葡萄糖刺激进行胰岛素分泌实验(具体步骤可以见实施例2)。如图6所示，实验结果表明，在棕榈酸刺激下，野生对照组的β细胞对葡萄糖刺激的响应下降剧烈，胰岛素分泌显著下降；SLC30A8基因敲除组的β细胞对葡萄糖刺激响应略微下降，胰岛素分泌量略微降低。
由上述实验结果可证实SLC30A8基因敲除的β细胞可抵抗机体二型糖尿病环境下脂毒性诱导的细胞凋亡，且胰岛素分泌能力不受影响。
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
SEQUENCE LISTING
<110> 同济大学
<120> SLC30A8基因表达下调的抗糖尿病胰岛β细胞及其应用
<130> 2020
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工序列
<400> 1
gactggcgtg ctagtgtacc tgg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列
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cgatgatcat cacagtcgcc tgg 23
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<211> 9983
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工序列
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aattgaaggt cgggcaggaa gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac 60
gatacaaggc tgttagagag ataattagaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag 120
tacaaaatac gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat 180
gttttaaaat ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt 240
tatatatctt gtggaaagga cgaaacaccg gttcggcaag atctcgggcg ttttagagct 300
agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc 360
ggtgcttttt ttgtttaaac acacggttcc tagtatcggt ccgaaggtcg ggcaggaaga 420
gggcctattt cccatgattc cttcatattt gcatatacga tacaaggctg ttagagagat 480
aattagaatt aatttgactg taaacacaaa gatattagta caaaatacgt gacgtagaaa 540
gtaataattt cttgggtagt ttgcagtttt aaaattatgt tttaaaatgg actatcatat 600
gcttaccgta acttgaaagt atttcgattt cttggcttta tatatcttgt ggaaaggacg 660
aaacaccgtt catcgtcttt gatggacgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 720
gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttt acgcgttgac 780
attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat 840
atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg 900
acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt 960
tccattgacg tcaatgggtg gactatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag 1020
tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc 1080
attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag 1140
tcatcgctat taccatgggt cgaggtgagc cccacgttct gcttcactct ccccatctcc 1200
cccccctccc cacccccaat tttgtattta tttatttttt aattattttg tgcagcgatg 1260
ggggcggggg gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg 1320
ggcgaggcgg agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt 1380
tatggcgagg cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcgggagt 1440
cgctgcgttg ccttcgcccc gtgccccgct ccgcgccgcc tcgcgccgcc cgccccggct 1500
ctgactgacc gcgttactcc cacaggtgag cgggcgggac ggcccttctc ctccgggctg 1560
taattagcgc ttggtttaat gacggctcgt ttcttttctg tggctgcgtg aaagccttaa 1620
agggctccgg gagggccctt tgtgcggggg ggagcggctc ggggggtgcg tgcgtgtgtg 1680
tgtgcgtggg gagcgccgcg tgcggcccgc gctgcccggc ggctgtgagc gctgcgggcg 1740
cggcgcgggg ctttgtgcgc tccgcgtgtg cgcgagggga gcgcggccgg gggcggtgcc 1800
ccgcggtgcg ggggggctgc gaggggaaca aaggctgcgt gcggggtgtg tgcgtggggg 1860
ggtgagcagg gggtgtgggc gcggcggtcg ggctgtaacc cccccctgca cccccctccc 1920
cgagttgctg agcacggccc ggcttcgggt gcggggctcc gtacggggcg tggcgcgggg 1980
ctcgccgtgc cgggcggggg gtggcggcag gtgggggtgc cgggcggggc ggggccgcct 2040
cgggccgggg agggctcggg ggaggggcgc ggcggccccc ggagcgccgg cggctgtcga 2100
ggcgcggcga gccgcagcca ttgcctttta tggtaatcgt gcgagagggc gcagggactt 2160
cctttgtccc aaatctgtgc ggagccgaaa tctgggaggc gccgccgcac cccctctagc 2220
gggcgcgggg cgaagcggtg cggcgccggc aggaaggaaa tgggcgggga gggccttcgt 2280
gcgtcgccgc gccgccgtcc ccttctccat ctccagcctc ggggctgtcc gcagggggac 2340
ggctgccttc gggggggacg gggcagggcg gggttcggct tctggcgtgt gaccggcggc 2400
tctagtgcct ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctacagct cctgggcaac 2460
gtgctggtta ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat tctctagaga tatcgctagc 2520
accatggact acaaagacca tgacggtgat tataaagatc atgacatcga ttacaaggat 2580
gacgatgaca agatggcccc caagaagaag aggaaggtgg gcattcaccg cggggtaccc 2640
atggacaaga agtactccat tgggctcgat atcggcacaa acagcgtcgg ctgggccgtc 2700
attacggacg agtacaaggt gccgagcaaa aaattcaaag ttctgggcaa taccgatcgc 2760
cacagcataa agaagaacct cattggcgcc ctcctgttcg actccgggga gacggccgaa 2820
gccacgcggc tcaaaagaac agcacggcgc agatataccc gcagaaagaa tcggatctgc 2880
tacctgcagg agatctttag taatgagatg gctaaggtgg atgactcttt cttccatagg 2940
ctggaggagt cctttttggt ggaggaggat aaaaagcacg agcgccaccc aatctttggc 3000
aatatcgtgg acgaggtggc gtaccatgaa aagtacccaa ccatatatca tctgaggaag 3060
aagcttgtag acagtactga taaggctgac ttgcggttga tctatctcgc gctggcgcat 3120
atgatcaaat ttcggggaca cttcctcatc gagggggacc tgaacccaga caacagcgat 3180
gtcgacaaac tctttatcca actggttcag acttacaatc agcttttcga agagaacccg 3240
atcaacgcat ccggagttga cgccaaagca atcctgagcg ctaggctgtc caaatcccgg 3300
cggctcgaaa acctcatcgc acagctccct ggggagaaga agaacggcct gtttggtaat 3360
cttatcgccc tgtcactcgg gctgaccccc aactttaaat ctaacttcga cctggccgaa 3420
gatgccaagc ttcaactgag caaagacacc tacgatgatg atctcgacaa tctgctggcc 3480
cagatcggcg accagtacgc agaccttttt ttggcggcaa agaacctgtc agacgccatt 3540
ctgctgagtg atattctgcg agtgaacacg gagatcacca aagctccgct gagcgctagt 3600
atgatcaagc gctatgatga gcaccaccaa gacttgactt tgctgaaggc ccttgtcaga 3660
cagcaactgc ctgagaagta caaggaaatt ttcttcgatc agtctaaaaa tggctacgcc 3720
ggatacattg acggcggagc aagccaggag gaattttaca aatttattaa gcccatcttg 3780
gaaaaaatgg acggcaccga ggagctgctg gtaaagctta acagagaaga tctgttgcgc 3840
aaacagcgca ctttcgacaa tggaagcatc ccccaccaga ttcacctggg cgaactgcac 3900
gctatcctca ggcggcaaga ggatttctac ccctttttga aagataacag ggaaaagatt 3960
gagaaaatcc tcacatttcg gataccctac tatgtaggcc ccctcgcccg gggaaattcc 4020
agattcgcgt ggatgactcg caaatcagaa gagaccatca ctccctggaa cttcgaggaa 4080
gtcgtggata agggggcctc tgcccagtcc ttcatcgaaa ggatgactaa ctttgataaa 4140
aatctgccta acgaaaaggt gcttcctaaa cactctctgc tgtacgagta cttcacagtt 4200
tataacgagc tcaccaaggt caaatacgtc acagaaggga tgagaaagcc agcattcctg 4260
tctggagagc agaagaaagc tatcgtggac ctcctcttca agacgaaccg gaaagttacc 4320
gtgaaacagc tcaaagaaga ctatttcaaa aagattgaat gtttcgactc tgttgaaatc 4380
agcggagtgg aggatcgctt caacgcatcc ctgggaacgt atcacgatct cctgaaaatc 4440
attaaagaca aggacttcct ggacaatgag gagaacgagg acattcttga ggacattgtc 4500
ctcaccctta cgttgtttga agatagggag atgattgaag aacgcttgaa aacttacgct 4560
catctcttcg acgacaaagt catgaaacag ctcaagaggc gccgatatac aggatggggg 4620
cggctgtcaa gaaaactgat caatgggatc cgagacaagc agagtggaaa gacaatcctg 4680
gattttctta agtccgatgg atttgccaac cggaacttca tgcagttgat ccatgatgac 4740
tctctcacct ttaaggagga catccagaaa gcacaagttt ctggccaggg ggacagtctt 4800
cacgagcaca tcgctaatct tgcaggtagc ccagctatca aaaagggaat actgcagacc 4860
gttaaggtcg tggatgaact cgtcaaagta atgggaaggc ataagcccga gaatatcgtt 4920
atcgagatgg cccgagagaa ccaaactacc cagaagggac agaagaacag tagggaaagg 4980
atgaagagga ttgaagaggg tataaaagaa ctggggtccc aaatccttaa ggaacaccca 5040
gttgaaaaca cccagcttca gaatgagaag ctctacctgt actacctgca gaacggcagg 5100
gacatgtacg tggatcagga actggacatc aatcggctct ccgactacga cgtggatcat 5160
atcgtgcccc agtcttttct caaagatgat tctattgata ataaagtgtt gacaagatcc 5220
gataaaaata gagggaagag tgataacgtc ccctcagaag aagttgtcaa gaaaatgaaa 5280
aattattggc ggcagctgct gaacgccaaa ctgatcacac aacggaagtt cgataatctg 5340
actaaggctg aacgaggtgg cctgtctgag ttggataaag ccggcttcat caaaaggcag 5400
cttgttgaga cacgccagat caccaagcac gtggcccaaa ttctcgattc acgcatgaac 5460
accaagtacg atgaaaatga caaactgatt cgagaggtga aagttattac tctgaagtct 5520
aagctggtct cagatttcag aaaggacttt cagttttata aggtgagaga gatcaacaat 5580
taccaccatg cgcatgatgc ctacctgaat gcagtggtag gcactgcact tatcaaaaaa 5640
tatcccaagc ttgaatctga atttgtttac ggagactata aagtgtacga tgttaggaaa 5700
atgatcgcaa agtctgagca ggaaataggc aaggccaccg ctaagtactt cttttacagc 5760
aatattatga attttttcaa gaccgagatt acactggcca atggagagat tcggaagcga 5820
ccacttatcg aaacaaacgg agaaacagga gaaatcgtgt gggacaaggg tagggatttc 5880
gcgacagtcc ggaaggtcct gtccatgccg caggtgaaca tcgttaaaaa gaccgaagta 5940
cagaccggag gcttctccaa ggaaagtatc ctcccgaaaa ggaacagcga caagctgatc 6000
gcacgcaaaa aagattggga ccccaagaaa tacggcggat tcgattctcc tacagtcgct 6060
tacagtgtac tggttgtggc caaagtggag aaagggaagt ctaaaaaact caaaagcgtc 6120
aaggaactgc tgggcatcac aatcatggag cgatcaagct tcgaaaaaaa ccccatcgac 6180
tttctcgagg cgaaaggata taaagaggtc aaaaaagacc tcatcattaa gcttcccaag 6240
tactctctct ttgagcttga aaacggccgg aaacgaatgc tcgctagtgc gggcgagctg 6300
cagaaaggta acgagctggc actgccctct aaatacgtta atttcttgta tctggccagc 6360
cactatgaaa agctcaaagg gtctcccgaa gataatgagc agaagcagct gttcgtggaa 6420
caacacaaac actaccttga tgagatcatc gagcaaataa gcgaattctc caaaagagtg 6480
atcctcgccg acgctaacct cgataaggtg ctttctgctt acaataagca cagggataag 6540
cccatcaggg agcaggcaga aaacattatc cacttgttta ctctgaccaa cttgggcgcg 6600
cctgcagcct tcaagtactt cgacaccacc atagacagaa agcggtacac ctctacaaag 6660
gaggtcctgg acgccacact gattcatcag tcaattacgg ggctctatga aacaagaatc 6720
gacctctctc agctcggtgg agacagcagg gctgacccca agaagaagag gaaggtgacc 6780
ggtgcaacaa acttctctct gctgaaacaa gccggagatg tcgaagagaa tcctggaccg 6840
accgagtaca agcccacggt gcgcctcgcc acccgcgacg acgtccccag ggccgtacgc 6900
accctcgccg ccgcgttcgc cgactacccc gccacgcgcc acaccgtcga tccggaccgc 6960
cacatcgagc gggtcaccga gctgcaagaa ctcttcctca cgcgcgtcgg gctcgacatc 7020
ggcaaggtgt gggtcgcgga cgacggcgcc gcggtggcgg tctggaccac gccggagagc 7080
gtcgaagcgg gggcggtgtt cgccgagatc ggcccgcgca tggccgagtt gagcggttcc 7140
cggctggccg cgcagcaaca gatggaaggc ctcctggcgc cgcaccggcc caaggagccc 7200
gcgtggttcc tggccaccgt cggagtctcg cccgaccacc agggcaaggg tctgggcagc 7260
gccgtcgtgc tccccggagt ggaggcggcc gagcgcgccg gggtgcccgc cttcctggag 7320
acctccgcgc cccgcaacct ccccttctac gagcggctcg gcttcaccgt caccgccgac 7380
gtcgaggtgc ccgaaggacc gcgcacctgg tgcatgaccc gcaagcccgg tgcctgatgt 7440
acaagtaact gcagcgcggg gatctcatgc tggagttctt cgcccacccc aacttgttta 7500
ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat 7560
ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct 7620
gtataccgtc gacctctagc tagagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt 7680
gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag 7740
cctagggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt 7800
tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 7860
gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 7920
ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat 7980
caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 8040
aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 8100
atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 8160
cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 8220
ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca 8280
gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 8340
accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 8400
cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 8460
cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct 8520
gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 8580
aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 8640
aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa 8700
actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt 8760
taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca 8820
gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca 8880
tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc 8940
ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa 9000
accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc 9060
agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca 9120
acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat 9180
tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag 9240
cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac 9300
tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt 9360
ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt 9420
gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc 9480
tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat 9540
ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca 9600
gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga 9660
cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg 9720
gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg 9780
ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcga cggatcggga gatcgatctc 9840
ccgatcccct agggtcgact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagt 9900
atctgctccc tgcttgtgtg ttggaggtcg ctgagtagtg cgcgagcaaa atttaagcta 9960
caacaaggca aggcttgacc gac 9983

Claims (5)

1.一种胰岛 β 细胞，所述胰岛 β 细胞为 SLC30A8 基因表达下调的胰岛 β 细 胞；所述胰岛β细胞的构建方法，包括：诱导分化 SLC30A8 基因敲除的胚胎干细胞，以提供所述胰岛β细胞，所述基因敲除采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，所述CRISPR/Cas9基因编辑技术中sgRNA的序列包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
2.如权利要求 1 所述的胰岛 β 细胞，其特征在于，所述胰岛 β 细胞来源于人。
3.如权利要求 1或2所述的胰岛 β 细胞在制备用于治疗胰岛素缺乏相关疾病的药物中的用途。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述胰岛素缺乏相关疾病选自糖尿病。
5.一种药物组合物，包括如权利要求1或2所述的胰岛 β 细胞。
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