CN116376972A - 一种基于CRISPR/Cas9技术的人胚胎干细胞基因敲除方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基于CRISPR/Cas9技术的人胚胎干细胞基因敲除方法，包括S1:根据目的基因序列，设计与目标基因序列互补的成对向导RNA(gRNA)，分别将成对双gRNA、CRISPR/Cas9、增强绿色荧光蛋白和嘌呤霉素抗性克隆至载体中，通过脂质体将成对双gRNA表达质粒转染到细胞中，S2：待步骤S1中转染成功后，挑选单个荧光细胞建立单克隆，S3：进行PCR测序检测目的基因序列，S4：待步骤S3中测序验证基因纯和敲除后，通过对干细胞多能性标志物OCT4、NANOG进行免疫荧光染色检测基因敲除后人胚胎干细胞多能性。本发明具有较强的基因编辑活性，可实现大片段基因的定向敲除，在现有敲除人胚胎干细胞的技术基础上，与其它转染方法相比，该发明提供了一种更加安全、高效、低成本的转染体系。
Description
技术领域
本发明涉及细胞基因敲除方法技术领域，具体为一种基于CRISPR/Cas9技术的人胚胎干细胞基因敲除方法。
背景技术
在现有基因工程研究领域，研究者在进行基因功能与代谢途径分析时常常会碍于基因敲除的高成本、周期长等原因选用小干扰RNA(siRNA)对预研究的目的基因进行敲降处理，阻断基因的表达，来研究该基因在功能代谢过程中是否起着关键作用，是研究信号传导通路的良好工具。与基因敲降相比，基因敲除可以实现在DNA层面使基因表达出现“全”或“无”的结果，更有助于科研工作者全面、透彻地分析目的基因的表达与功能，该技术可以应用于建立某种特定基因缺失的细胞或动物模型，对了解疾病的根源或者是寻找基因治疗的靶目标有重大的意义，此外器官来源稀少以及移植免疫排斥的发生是人体器官移植的制约因素，如果能将与免疫排斥有关的基因敲除，降低移植后免疫排斥反应，这将为患者带来极大的福音。
目前基于CRISPR/Cas9的基因敲除实验多使用电转染或慢病毒包装质粒的方法进行转染，与其它细胞相比，人胚胎干细胞难转染，目前常用的转染方法为电转染，电转染需要昂贵的设备，转染效率低，细胞致死率高，且干细胞在转染后的培养中容易发生分化等都限制了干细胞基因编辑的研究；病毒转染技术难度高，耗时长，且存在潜在的生物安全问题。
为此，通过设置一种基于CRISPR/Cas9技术的人胚胎干细胞基因敲除方法解决上述问题。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种基于CRISPR/Cas9技术的人胚胎干细胞基因敲除方法，具有较强的基因编辑活性，在现有的敲除技术基础上，可实现大片段的基因敲除。与其它转染方法相比，该发明提供了一种更加安全、高效、低成本的转染体系，操作简便，且CRISPR/Cas9基因编辑技术发展成熟，现已被广泛应用于细菌、动物及人类细胞等多领域的科学研究中；人胚胎干细胞具有体外培养无限增殖，自我更新和多向分化的潜能，在损伤修复和再生医学中有很大的应用前景。
为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：
一种基于CRISPR/Cas9技术的人胚胎干细胞基因敲除方法，包括：
S1:根据目的基因序列，设计与目标基因序列互补的成对向导RNA(gRNA)，分别将成对双gRNA、CRISPR/Cas9、增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)和嘌呤霉素(puromysin,Puro)抗性克隆至载体中，通过脂质体将成对双gRNA表达质粒转染到细胞中；
S2：待步骤S1中转染成功后，挑选单个荧光细胞建立单克隆；
S3：待步骤S2中单克隆细胞长至足量，进行PCR测序检测目的基因序列。
S4：待步骤S3中测序验证基因纯和敲除后，通过对干细胞多能性标志物OCT4、NANOG进行免疫荧光染色检测基因敲除后人胚胎干细胞多能性。
作为本发明所述的一种基于CRISPR/Cas9技术的人胚胎干细胞基因敲除方法的一种优选方案，其中，所述S1步骤中，在6孔板中，转染细胞密度为1.5×105个细胞/孔，在细胞传代第二天进行转染。
作为本发明所述的一种基于CRISPR/Cas9技术的人胚胎干细胞基因敲除方法的一种优选方案，其中，所述S1步骤中，转染过程中分别用25μlOpti-MEM稀释2μlLipofectamineTM Stem Reagent脂质体转染试剂(A管)和0.5μg质粒(B管)。
作为本发明所述的一种基于CRISPR/Cas9技术的人胚胎干细胞基因敲除方法的一种优选方案，其中，所述步骤S1中，A管和B管两管混合均匀，室温静置10min后进行细胞转染。
作为本发明所述的一种基于CRISPR/Cas9技术的人胚胎干细胞基因敲除方法的一种优选方案，其中，所述S2步骤中，在转染后的细胞中挑选单个荧光细胞建立单克隆。所述S3步骤中，待单克隆细胞长至足量，提取基因组DNA，通过PCR、正反双向测序进行目的基因验证，结果显示纯和敲除目的基因184bp碱基对。所述S4步骤中：OCT4、NANOG免疫荧光染色表明基因敲除后人胚胎干细胞仍具有多能性。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：具有较强的基因编辑活性，在现有的人胚胎干细胞基因敲除技术基础上，与其它转染方法相比，该发明提供了一种更加安全、高效、低成本的敲除大片段基因的转染体系，操作简便，且CRISPR/Cas9基因编辑技术发展成熟，现已被广泛应用于细菌、动物及人类细胞等多领域的科学研究中；人胚胎干细胞具有体外培养无限增殖，自我更新和多向分化的潜能，在损伤修复和再生医学中有很大的应用前景，在具体使用时，根据目的基因序列，设计与目标基因序列互补的成对向导RNA(gRNA)，分别将成对双gRNA、CRISPR/Cas9、增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescentprotein,eGFP)和嘌呤霉素(puromysin,Puro)抗性克隆至载体中，通过脂质体将成对双gRNA表达质粒转染到细胞中，挑选单个荧光细胞建立单克隆，PCR测序检测目的基因序列。详细过程如下：在6孔板中，转染细胞密度为1.5×105个/孔，传代第二天进行转染，分别用25μl Opti-MEM稀释2μl LipofectamineTM Stem Reagent脂质体转染试剂(A管)和0.5μg质粒(B管)，然后将A、B两管混合均匀，室温静置10min后进行细胞转染；转染成功后挑选单个荧光细胞，待单克隆细胞长至足量，提取基因组DNA，通过PCR、正反双向测序进行验证，结果显示纯和敲除目的基因184bp碱基对。对敲除细胞进行免疫荧光染色，结果表明人胚胎干细胞仍具有多能性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将结合附图和详细实施方式对本发明进行详细说明，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为荧光显微镜下表达绿色荧光蛋白的细胞显示图；
图2为基因敲除前后序列比对图；
图3为敲除前后细胞测序结果数据图；
图4为基因敲除后多能性免疫荧光染色图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施方式的限制。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的实施方式作进一步地详细描述。
本发明提供一种基于CRISPR/Cas9技术的人胚胎干细胞基因敲除方法，具有较强的基因编辑活性，在现有的敲除技术基础上，与其它转染方法相比，该发明提供了一种更加安全、高效、低成本的大片段基因敲除的转染体系，操作简便，且CRISPR/Cas9基因编辑技术发展成熟，现已被广泛应用于细菌、动物及人类细胞等多领域的科学研究中；人胚胎干细胞具有体外培养无限增殖，自我更新和多向分化的潜能，在损伤修复和再生医学中有很大的应用前景。
一种基于CRISPR/Cas9技术的人胚胎干细胞基因敲除方法，包括：
S1:根据目的基因序列，设计与目标基因序列互补的成对向导RNA(gRNA)，分别将成对双gRNA、CRISPR/Cas9、增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)和嘌呤霉素(puromysin,Puro)抗性克隆至载体中，通过脂质体将成对双gRNA表达质粒转染到细胞中，在6孔板中转染，转染细胞密度为1.5×105个细胞/孔，在细胞传代第二天进行转染，转染过程中分别用25μl Opti-MEM稀释2μl LipofectamineTM Stem Reagent脂质体转染试剂(A管)和0.5μg质粒(B管)，A管和B管两管混合均匀，室温静置10min后进行细胞转染。
S2：待步骤S1中转染成功后，挑选单个荧光细胞建立单克隆；
S3：待单克隆细胞长至足量，提取基因组DNA，通过PCR、正反双向测序进行目的片段验证，结果显示纯和敲除目的基因184bp碱基对。
S4：待步骤S3中测序验证基因纯和敲除后，通过对干细胞多能性标志物OCT4、NANOG进行免疫荧光染色检测基因敲除后人胚胎干细胞多能性。
综上，本发明在具体使用时，根据目的基因序列，设计与目标基因序列互补的成对向导RNA(gRNA)，分别将成对双gRNA、CRISPR/Cas9、增强绿色荧光蛋白(enhanced greenfluorescent protein,eGFP)和嘌呤霉素(puromysin,Puro)抗性克隆至载体中，通过脂质体将成对双gRNA表达质粒转染到细胞中，挑选单个荧光细胞建立单克隆，PCR测序检测目的基因序列。详细过程如下：在6孔板中转染，种植细胞密度为1.5×105个/孔，种植后第二天进行转染，分别用25μl Opti-MEM稀释2μl LipofectamineTM Stem Reagent脂质体转染试剂(A管)和0.5μg质粒(B管)，然后将A、B两管混合均匀，室温静置10min后进行细胞转染；转染成功后挑选单个荧光细胞，待单克隆细胞长至足量，提取基因组DNA，通过PCR、正反双向测序进行验证，结果显示与实验设计方案一致，纯和敲除目的基因184bp碱基对，对敲除细胞进行免疫荧光染色，结果表明人胚胎干细胞仍具有多能性。本发明的技术方案具有较强的基因编辑活性，在现有的敲除技术基础上，与其它转染方法相比，该发明提供了一种更加安全、高效、低成本的大片段基因敲除的转染体系，操作简便，且CRISPR/Cas9基因编辑技术发展成熟，现已被广泛应用于细菌、动物及人类细胞等多领域的科学研究中；人胚胎干细胞具有体外培养无限增殖，自我更新和多向分化的潜能，在损伤修复和再生医学中有很大的应用前景。
虽然在上文中已经参考实施方式对本发明进行了描述，然而在不脱离本发明的范围的情况下，可以对其进行各种改进并且可以用等效物替换其中的部件。尤其是，只要不存在结构冲突，本发明所披露的实施方式中的各项特征均可通过任意方式相互结合起来使用，在本说明书中未对这些组合的情况进行穷举性的描述仅仅是出于省略篇幅和节约资源的考虑。因此，本发明并不局限于文中公开的特定实施方式，而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案。
Claims (5)
1.一种基于CRISPR/Cas9技术的人胚胎干细胞基因敲除方法，其特征在于，包括：
S1:根据目的基因序列，设计与目标基因序列互补的成对向导RNA(gRNA)，分别将成对双gRNA、CRISPR/Cas9、增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)和嘌呤霉素(puromysin,Puro)抗性克隆至载体中，通过脂质体将成对双gRNA表达质粒转染到细胞中；
S2：待步骤S1中转染成功后，挑选单个荧光细胞建立单克隆；
S3：待步骤S2中单克隆细胞长至足量，进行PCR测序检测目的基因序列；
S4：待步骤S3中测序验证基因纯和敲除后，通过对干细胞多能性标志物OCT4、NANOG进行免疫荧光染色检测基因敲除后人胚胎干细胞多能性。
2.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR/Cas9技术的人胚胎干细胞基因敲除方法，其特征在于，所述S1步骤中，在6孔板中转染，转染细胞密度为1.5×105个细胞/孔，在细胞传代第二天进行转染。
3.根据权利要求2所述的一种基于CRISPR/Cas9技术的人胚胎干细胞基因敲除方法，其特征在于，所述S1步骤中，转染过程中分别用25μl Opti-MEM稀释2μl LipofectamineTMStem Reagent脂质体转染试剂(A管)和0.5μg质粒(B管)。
4.根据权利要求3所述的一种基于CRISPR/Cas9技术的人胚胎干细胞基因敲除方法，其特征在于，所述步骤S1中，A管和B管两管混合均匀，室温静置10min后进行细胞转染。
5.根据权利要求4所述的一种基于CRISPR/Cas9技术的人胚胎干细胞基因敲除方法，其特征在于，所述S2步骤中，在转染后的细胞中挑选单个荧光细胞建立单克隆；所述S3步骤中，待单克隆细胞长至足量，提取基因组DNA，通过PCR、正反双向测序进行验证，结果显示纯和敲除目的基因184bp碱基对；所述S4步骤中，免疫荧光染色结果显示人胚胎干细胞仍具有多能性。
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