CN111733183A - 用于构建肝损伤小鼠模型的打靶载体、核酸组合物和构建方法 - Google Patents

用于构建肝损伤小鼠模型的打靶载体、核酸组合物和构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于构建肝损伤小鼠模型的打靶载体、核酸组合物和构建方法，涉及基因工程和基因遗传修饰技术领域。本发明公开的打靶载体包括第一表达盒和位于第一表达盒下游的第二表达盒，第一表达盒具有依次串联的如下元件：肝脏特异性启动子、四环素转录激活调控因子以及第一polyA；第二表达盒具有依次串联的如下元件：第二polyA、小鼠尿激酶原激活剂编码基因以及四环素诱导型启动子。该打靶载体所构建的肝损伤小鼠模型具有自发肝损伤以及经诱导加重肝损伤的表型，其杂交后代的小鼠死亡率低，便于大规模的繁育；本发明为肝脏疾病的研究提供了可靠的肝损伤小鼠模型。

Description

用于构建肝损伤小鼠模型的打靶载体、核酸组合物和构建 方法
技术领域
本发明涉及基因工程和基因遗传修饰技术领域，具体而言，涉及一种用于构建肝损伤小鼠模型的打靶载体、核酸组合物和构建方法。
背景技术
肝脏疾病是威胁人类健康最严重的疾病之一，尤其是乙肝(HBV)、丙肝(HCV)、肝硬化、肝癌、非酒精脂肪肝(NAFLD)、酒精性肝病(ALD)和药物性肝损伤(DILI)，其中以病毒性肝炎最为广泛。病毒性肝炎具有嗜肝性，具有较强的种属特异性和组织特异性。如乙肝病毒和丙肝病毒的自然宿主仅限于人类和少数非人灵长类动物（黑猩猩），并且只感染宿主的肝脏组织。但使用黑猩猩进行病毒性肝炎的研究在伦理和经济上都受到限制。由于人类肝脏疾病的复杂性及缺乏合适的动物模型，限制了人类肝脏重大疾病的医学研究及转化。肝脏人源化小鼠模型由于嵌合了人肝细胞，可以模拟人类感染肝炎病毒的过程，从而使肝脏疾病的研究更加深入。
在药物研发中，通过临床前动物实验和人体实验的PK/PD来判断药物是否安全，对药物临床试验成功与否具有指导意义。但很多药物代谢酶具有物种特异性，而大鼠或小鼠的肝脏代谢功能与人的肝脏代谢功能不同，使用大鼠或小鼠进行药物PK/PD测试，不能真实地反应药物在人体内的代谢情况，因此有可能导致该药物在人体上的极大的安全性风险。为了阐明人体中的药物代谢途径，需人肝细胞进行试验。与体外人肝细胞代谢实验相比，肝脏人源化小鼠更能真实地反映药物在人体内的代谢途径。
肝脏人源化小鼠构建的基础是必须有肝损伤的小鼠作为受体，接受人源肝细胞的植入，人肝细胞在小鼠体内增殖发育为具有功能的人鼠嵌合肝脏。目前，常用的肝损伤模型包括uPA-SCID、Fah–/–Rag2–/–Il2rg–/–(FRG)、TK-NOG以及Alb-uPA等。尽管已报道在这些模型的人肝嵌合率可达到90%，但这些模型仍然存在一些缺陷，限制了其应用。例如uPA-SCID、Alb-uPA和FRG模型由于肝毒性造成子代小鼠在围产期频繁死亡，导致新生小鼠的死亡率非常高，难以大规模的繁育。TK-NOG模型小鼠雄性不育，使模型难以繁育传代，限制了模型的使用；uPA-SCID小鼠进行重建后，人肝细胞(h-heps)置换指数因同源重组缺失uPA基因而降低，且容易发生肾脏疾病。邓宏魁利用携带不同载体片段的小鼠联合带有uPA基因的腺病毒转染或者通过携带不同载体的两个模型配繁（但繁育过程相当繁琐），在小鼠体内实现了Tet on-uPA重组系统，在理论上，可控的uPA表达时机，改善了小鼠死亡。然而，由于维持uPA表达需要反复进行腺病毒感染，宿主小鼠易产生抗性，影响后续腺病毒感染率，降低了uPA的表达，导致肝细胞重建效率降低。此外，该模型注射腺病毒后可激活天然免疫，影响了对肝炎病毒激发免疫反应的观察，不适合用于肝炎病毒的感染研究。
由于以上限制，本领域非常需要一种合适的肝损伤小鼠模型进行人源化肝脏的构建，以及使用人源化肝脏小鼠模型进行后续的肝脏疾病研究和药物筛选。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的包括但不限于提供一种用于构建肝损伤小鼠模型的打靶载体、核酸组合物和构建方法。使用本发明提供的打靶载体所构建的肝损伤小鼠模型不需要使用诱导物诱导即可形成肝损伤，其可以自发形成肝损伤，使用诱导物可以加强肝损伤的程度，此外，该肝损伤小鼠模型的自发肝损伤程度即能够满足外源肝细胞的移植要求，且肝细胞移植后的重建率也较高；另外，该肝损伤小鼠模型可以通过杂交繁育后代肝损伤小鼠，后代小鼠的死亡率低，便于大规模的繁育；本发明为肝脏疾病的研究提供了可靠的肝损伤小鼠模型。
本发明是这样实现的：
一方面，本发明提供一种用于构建肝损伤小鼠模型的打靶载体，该打靶载体上含有目标序列以及用于介导所述目标序列插入到小鼠基因组中目标位点的5’端同源臂序列和3’端同源臂序列；所述目标序列包括第一表达盒和位于所述第一表达盒下游的第二表达盒；
所述第一表达盒具有依次串联的如下元件：肝脏特异性启动子、四环素转录激活调控因子以及第一polyA；所述第二表达盒具有依次串联的如下元件：第二polyA、小鼠尿激酶原激活剂编码基因以及四环素诱导型启动子；
其中，所述肝脏特异性启动子从上游往下游方向驱动所述四环素转录激活调控因子表达，所述四环素诱导型启动子从下游往上游方向驱动所述小鼠尿激酶原激活剂编码基因表达。
使用本发明的提供的打靶载体可以将上述目标序列插入至小鼠基因组中的目标位点，上述目标序列中的第一表达盒和第二表达盒的连接关系可以理解为以尾对尾的方式连接。本发明的研究结果显示，基因组中插入具有上述连接方式以及元件的第一表达盒和第二表达盒的目标序列的小鼠，其具有如下出乎预料的表型或特点，可以作为较为理想的肝损伤小鼠模型：
（1）不需要使用诱导物诱导即可形成肝损伤，其可以自发形成肝损伤，使用诱导物后可以加强肝损伤的程度，因此使用者可以根据移植需要，选择性地诱导或不诱导，移植程序更加简化；该种自发肝损伤表型打破了传统的对Tet on系统调控蛋白表达特点的认知，该表型大大地超乎了发明人的预料范围；
（2）该肝损伤小鼠模型的自发形成的肝损伤程度足以满足外源肝细胞的移植要求；如果再经过诱导，其肝损伤程度更严重，移植外源肝细胞后的重建率更高；
（3）该肝损伤小鼠模型可以通过杂交繁育出更多的子代肝损伤小鼠，且其后代小鼠的死亡率远低于同类自发肝损伤小鼠模型，为大规模繁育肝损伤小鼠模型提供了便利，该表型也大大地超乎了发明人的预料范围。
需要说明的是，在其他的一些实施例中，第一表达盒和第二表达盒的位置可以互换，即第二表达盒在上游，第一表达盒在下游，对应调整元件的位置顺序，第二表达盒往下游即往第一表达盒方向驱动，第一表达盒往上游即往第二表达盒方向驱动，此设置也能实现相同的效果。即无论以何种方向设置，只要使两个表达盒的polyA相邻，两个表达盒从两头往中间方向驱动表达即可。
在可选的实施方式中，所述第一表达盒还具有增强子序列；所述增强子序列位于所述肝脏特异性启动子的上游。
在可选的实施方式中，所述肝脏特异性启动子包括但不限于白蛋白启动子、载脂蛋白E启动子、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶启动子、α-I-抗胰蛋白酶启动子、甲状腺激素结合球蛋白启动子、α-甲胎蛋白启动子、醇脱氢酶启动子、IGF-II启动子、因子VIII启动子、HBV基础核心蛋白启动子、HBV前s2蛋白启动子、甲状腺素-结合球蛋白启动子、HCR-Ap0CII的杂合启动子、HCR-hAAT杂合启动子、与小鼠白蛋白基因的增强子元件结合的AAT启动子、低密度脂蛋白启动子、丙酮酸激酶启动子、卵磷脂-胆固醇酰基转移酶启动子、载脂蛋白H启动子、铁传递蛋白启动子、甲状腺素运载蛋白启动子、α-纤维蛋白原及β-纤维蛋白原的启动子、α-I-抗糜蛋白酶启动子、α-2-HS糖蛋白启动子、触珠蛋白启动子、血浆铜蓝蛋白启动子、血纤维蛋白溶酶原启动子、补体蛋白启动子、补体C3激活子的启动子、血液结合素启动子及α-I-酸性糖蛋白启动子中的任意一种。
在可选的实施方式中，所述肝脏特异性启动子为白蛋白启动子。
在可选的实施方式中，所述增强子序列包括但不限于白蛋白增强子。
在可选的实施方式中，所述四环素转录激活调控因子选自tTA、rtTA和Tet-On 3G中的任意一种。
在可选的实施方式中，所述四环素转录激活调控因子为Tet-On 3G。
在可选的实施方式中，所述第一polyA包括但不限于HGH polyA、SV40 polyA、BGHpolyA、rbGlob polyA、SV40 late polyA和rbGlob polyA。
在可选的实施方式中，所述四环素诱导型启动子选自TRE3G和TetO6中的任意一种。
在可选的实施方式中，所述四环素诱导型启动子为TRE3Gp。
在可选的实施方式中，所述小鼠尿激酶原激活剂编码基因所编码的小鼠尿激酶原激活剂的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
在可选的实施方式中，所述小鼠尿激酶原激活剂编码基因的核苷酸序列为SEQ IDNO.6中第1-1302位所示或其互补序列。
在可选的实施方式中，所述第二polyA包括但不限于rabbit polyA、SV40 polyA、hGH polyA、BGH polyA、rbGlob polyA、SV40 late polyA 和rbGlob polyA。
在可选的实施方式中，在所述第二表达盒中，所述小鼠尿激酶原激活剂编码基因与所述四环素诱导型启动子之间还插入有Kozak序列。
在可选的实施方式中，所述目标位点为Rosa26位点。
在Rosa26位点插入上述目标序列可以避免基因组上毗邻序列的干扰效应，且不会破坏任何内源性基因，保证小鼠生长发育正常及功能正常；此外，相较于其他的常见插入位点（例如H11），在Rosa26位点插入上述目标序列还使得该肝损伤小鼠模型表现出独特的表型，即其自发形成的肝损伤程度可满足外源肝细胞的植入。此外，该肝损伤小鼠模型对诱导物（例如Dox）响应更敏感，经诱导后，肝损伤程度出现加重的情形；在其他位点插入目标序列并没有出现类似的技术效果，该效果是本发明的发明人不曾预料的。
在可选的实施方式中，所述5’端同源臂序列为SEQ ID NO.4或其互补序列所示；所述3’端同源臂序列为SEQ ID NO.5或其互补序列所示。
在可选的实施方式中，所述打靶载体的骨架可以根据实际需要选择，无论选用何种骨架载体负载上述目标序列，其均是属于本发明的保护范围。
另一方面，本发明提供一种重组细胞，其含有上述的打靶载体。
在可选的实施方式中，重组细胞包括但不限于大肠杆菌。本领域技术人员可以选择合适的宿主细胞转化上述打靶载体以便于存放或扩增上述打靶载体，无论选用何种宿主细胞其均是属于本发明的保护范围。
另一方面，本发明提供一种用于构建肝损伤小鼠模型的核酸组合物，其包括如上任一项所述的打靶载体以及用于使小鼠基因组序列在所述目标位点发生双链断裂的CRISPR/Cas9组合物。
在可选的实施方式中，所述CRISPR/Cas9组合物包括：Cas9蛋白和sgRNA。
在可选的实施方式中，所述sgRNA的靶标序列如SEQ ID NO.9所示。
再一方面，本发明提供一种用于构建肝损伤小鼠模型的试剂盒，其包括如上任一项所述的打靶载体，或如上任一项所述的核酸组合物。
再一方面，本发明提供一种肝损伤小鼠模型的构建方法，使用如上任一项所述的打靶载体，或如上任一项所述的核酸组合物在目标小鼠的基因组上的所述目标位点插入所述目标序列。
使用本发明提供的构建方法所构建的肝损伤小鼠模型不需要使用诱导物诱导即可形成肝损伤，其可以自发形成肝损伤，使用诱导物可以加强肝损伤的程度。此外，该肝损伤小鼠模型的自发肝损伤程度即能够满足外源肝细胞的移植要求，移植后的重建率也较高；另外，该肝损伤小鼠模型可以通过杂交繁育后代肝损伤小鼠，后代小鼠的死亡率低，便于大规模的繁育。
在可选的实施方式中，所述目标小鼠为具有免疫缺陷的小鼠（NCG小鼠）。
在可选的实施方式中，所述方法包括：将所述核酸组合物注射至来自具有免疫缺陷的小鼠的受精卵中，再将所述受精卵移植至假孕雌鼠体内，从所述假孕雌鼠的后代中筛选出基因组中插入有所述目标序列的阳性小鼠，即为所述肝损伤小鼠模型。
在可选的实施方式中，所述受精卵的发育天数为0.5天。
在可选的实施方式中，所述假孕雌鼠为成功交配后0.5天的假孕雌鼠。
再一方面，本发明提供一种肝损伤小鼠模型的繁育方法，其包括：将由如上所述的构建方法得到的肝损伤小鼠模型与具有免疫缺陷的野生型小鼠进行交配。
使用上述构建方法得到的肝损伤小鼠模型，其可以通过与具有免疫缺陷的野生型小鼠进行交配，后代小鼠的死亡率低，可以大规模地获得与亲代肝损伤小鼠具有相同表型的子代肝损伤小鼠；这样，本领域技术人员可以不需要再重复前述构建方法，通过更为简单的杂交繁育方法即可大批量地获得理想的肝损伤小鼠模型，大大地提高了繁育效率，有效地满足了本领域对肝损伤小鼠模型的数量需求。
再一方面，本发明提供由如上所述的构建方法或繁育方法得到的肝损伤小鼠模型筛选用于治疗肝脏疾病的药物中的应用，所述应用以非疾病的诊断或治疗为目的。
在可选的实施方式中，所述应用包括：对所述肝损伤小鼠模型植入人源肝脏细胞进行肝脏人源化，再将经肝脏人源化的所述肝损伤小鼠模型用于筛选药物。
在可选的实施方式中，所述肝脏疾病包括但不限于选自病毒性肝炎（例如乙肝、丙肝等）、肝纤维化、肝硬化、脂肪肝（例如酒精性、非酒精性脂肪肝等）、药物性肝损伤和肝癌。
采用本发明的打靶载体以及构建方法所得到的肝损伤小鼠模型，经过外源肝细胞例如人源干细胞的植入即肝脏人源化后，可用于筛选治疗肝脏疾病的药物，例如评价候选药物对人源肝脏细胞是否有效或安全等，其能够更真实地反应候选药物在人体内的代谢情况，筛选出更为可靠的药物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1中的打靶载体上述的目标序列的结构示意图。
图2为实施例2中的部分含中间载体的菌液PCR鉴定的凝胶电泳结果图。
图3为实施例2中的部分中间载体的酶切鉴定的凝胶电泳结果图（DL：为DL2000Marker，条带大小分别为2000，1000，750，500，200，100；T14为EcoT14I digest Marker，条带大小分别为19329，7743，6223，4254，3472，2690，1882，1489）。
图4为实施例2中的含打靶载体的菌液PCR鉴定的凝胶电泳结果图。
图5为实施例2中的打靶载体酶切鉴定的凝胶电泳结果图。
图6为实施例3中的对照打靶载体的结构示意图。
图7为实施例3中的含对照打靶载体的菌液经PCR鉴定的凝胶电泳结果图。
图8为实施例3中的对照打靶载体的酶切鉴定的凝胶电泳结果图。
图9为部分F1代H11-alb-Tet On3G-uPA小鼠经PCR鉴定的凝胶电泳结果图（A：使用检测Rosa26-alb-Tet-On3G-uPA小鼠阳性和wt的鉴定结果；B：检测Rosa26-alb-Tet-On3G-uPA小鼠阳性打靶序列3’端和5’端的鉴定结果）。
图10为部分F1代Rosa26-alb-Tet On3G-uPA小鼠经PCR鉴定的凝胶电泳结果图（A：2号小鼠PCR鉴定的凝胶电泳结果图；B：15号小鼠PCR鉴定的凝胶电泳结果图）。
图11为H11-alb-Tet On3G-uPA小鼠Dox诱导后肝损伤规律检测结果（A：H11-alb-Tet On3G-uPA杂合小鼠给予Dox饮水诱导肝损伤；B：H11-alb-Tet On3G-uPA纯合子小鼠给予Dox饮水或灌胃（PO）诱导肝损伤）。
图12为Rosa26-alb-Tet On3G-uPA杂合子小鼠自发肝损伤的ALT活性检测结果。
图13为Rosa26-alb-Tet On3G-uPA小鼠在4周龄时HE染色结果，显示出现严重肝损伤。
图14为3-4周龄Rosa26-alb-Tet On3G-uPA小鼠给予Dox诱导加重肝损伤程度的检测结果（A：3-4周龄小鼠给予Dox诱导后，血清中ALT变化；B：3-4周龄小鼠给予Dox诱导后7天，小鼠肝脏HE染色）。
图15为6-8周龄Rosa26-alb-Tet On3G-uPA小鼠给予Dox诱导加重肝损伤程度的检测结果（A：6-8周龄小鼠给予Dox诱导后，血清中ALT变化；B：6-8周龄小鼠给予Dox诱导后7天，小鼠肝脏HE染色）。
图16为不同周龄Rosa26-alb-Tet On3G-uPA小鼠移植绿色荧光肝细胞后10周的肝脏形态（绿色荧光肝细胞在肝脏表面均匀分布）。
图17为不同周龄Rosa26-alb-Tet On3G-uPA小鼠移植肝细胞后10周绿色荧光细胞观察结果。
图18为pRosa26-Cas质粒载体图谱。
图19为PMD18T-H11-CAG-FLPo质粒载体图谱。
图20为Rosa26-alb-Tet On3G-uPA纯合子小鼠自发肝损伤的ALT活性检测结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行明确、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供用于构建肝损伤小鼠模型的打靶载体包括：目标序列以及用于介导该目标序列插入到小鼠基因组中目标位点（Rosa26）的5’端同源臂序列（Rosa26 arm1）和3’端同源臂序列（Rosa26 arm2）（各元件的位置关系见图1）。
其中，目标序列从上游往下游方向依次包括第一表达盒和位于第一表达盒下游的第二表达盒；
第一表达盒包括依次串联的如下元件：白蛋白增强子（Alb enhancer）、白蛋白启动子（Alb Promoter）、四环素转录激活调控因子（Tet-On 3G）以及第一polyA（HGH polyA）；相对于图1中方向而言，从左（上游）往右（下游）驱动表达。
第二表达盒包括依次串联的如下元件：第二polyA（rabbit polyA，图1中表示为pA）、小鼠尿激酶原激活剂编码基因（uPA）、Kozak序列以及四环素诱导型启动子（TRE3G）；相对于图1中方向而言，从右（下游）往左（上游）驱动表达。
Rosa26 arm1位于目标序列上游，Rosa26 arm2位于目标序列下游。
肝脏特异性启动子（Alb Promoter）从上游往下游方向驱动四环素转录激活调控因子（Tet-On 3G）表达（见图1中左侧折线箭头），四环素诱导型启动子（TRE3G）从下游往上游方向驱动小鼠尿激酶原激活剂编码基因（uPA）表达（见图1中右侧折线箭头）。
本实施例提供的打靶载体与CRISPR/Cas9组合物组合使用，可以在小鼠基因组中对应于5’端同源臂序列与3’端同源臂序列的位置插入目标序列（参见图1）。
实施例2
本实施例提供实施例1打靶载体的构建方法，包括如下步骤：
1.1 Alb enhancer-Alb promoter片段制备
使用表1引物扩增Alb enhancer-Alb promoter目的片段并回收备用。PCR扩增的条件根据本领域常识进行设置。
表1. Alb enhancer-Alb promoter扩增引物列表
Figure 901638DEST_PATH_IMAGE001
Alb enhancer-Alb promoter目的片段的其中一条链的核苷酸序列（SEQ ID NO.1）如下（5’-3’）：
ggtggttctcctgtcagtttcgagggggtacagcttgggctgcaggtcgactctagatcgaattcctgcagc ccgggggatcccggggttgataggaaaggtgatctgtgtgcagaaagactcgctctaatatacttctttaaccaat aactgtagatcattaaccatacttacctcgcatttcattggttcctaccccattacaaaatcataccatctttgcc aaaaagttgtttgactaaatcccttgcgtatgtttgccatctggagctgttcccctctaaccccacccccaccccc atgcacaagactttgtccattcattaaagttatgtaaaacagcaaattttacataagagcttaatctctttgtctc ccatttgagcatttcagtgtgggccttggcatggaagcatgcctgcaggtcgatcccaagctggagaacgagttcaagccaagctgcaccactgcttttcacacactcttcactctgcatcagcttagtatttcttaagaaattaaaagatggcaaaacacatctaaactgtattaataaagtgcttctttcatatttaatgtttttccagataaagaaaactatgatgaatgcctgcatgcttatctatgtttcatagatcagcaagtagaatgtataaaatggaagtgtcagtaattctgctcataattattgctgcagattgaattcacccctaagcaaatatacctctgaacatctgctcacagtctgtatgttctccagacacaatccaaaagacttattatctgaaagattaatgtcacaaagccagagctttataatctcttataaaacatagattgtagccaggcagtggtggcacatgcttttaatcctagcacttgcaaggcagaggcaagcagatctctgagttcaagaccaacctggtctacagagcaaggtccaggacagccaaagctagacagaaaaaactgtatctcaaaagaaaatagacaacaaattacattgttacagctaaaattatcttatgttgaaatttctgtagctcaactttggaatattttcattagagggtaatatttgattatgatcacttctaaaactttagaatttattgttttataatctcttggtttcagtacttacctaaaattttccaaccagtcacccagctaaaacttaaaatatttaagtcctagaattccagttagttttgcaagtaactataaatggtattacagtgagaaatggagcatctgatgtctactcacatgtaaactttacacatatcaaatagatgattgtctatggtctttcttcttttttagagtatatagagtatatagagatagattcatccataataagctcaataaacaaatgtttaaaaatgattgttagatattattgggtatataagtacctaattattaaaattgacttttttataacattgagataaattaaaattcatttattaaaataatatatatgaatttgaaggggttttttttgcaaaacaatttcagcaagcaataccatgacaaaagtgtgtattcaaatggaatgggaaacgaatgtcagtaacttatggtccccgtgtactcattcccagacatgcctgattggtagctgtgacagctccagcgtacttaacaccaagactttaaataagctgccaaaaatgtgtaagactgccatttcattagttttaatttttatatctataccctttctacagccacatactaaacgtagacaagttggccttttcctattgctttaaaggcagaggactgtattgatcagtccaaacttctttctgcatgtacatggaaaactggccaaggcaaacacgtccggaatgatggtatttaagaacaaacattccctggtatcagcaagtacagtgccctgctgacagagcaggagacacaaagtaccatctcgtccctatgttaagtagtgtcacctcatgctcaagggatactgagtggatgctgtaacgcaggttattttctaggctgtgaggatacaagaaaatgaaagtaattaaagtagaacattgctctgtgctatgcttgcagaatgtgtagtgtagtctaggaacagagaggggaaggttctaaatcaaaaaaaatcaagctcatgcctaaggatgtgtgggttgccacctctttagctacctatgcgatccaaacaactataaaacttagaatttattttctctggatgaatttgtgcttgtggagcaatgttggtagggggcagggtcagctggaaaagtggaatgagcaagcagaaaactgagagaagcagaagcttaggaagatgggtaatttccaaaagtttcacaaaagatcaaatcaaagaagtaagctccaccttagaaaaaagtggaacgtcatgctaaggaagcta。
下划线为Alb promoter，非下划线为Alb enhancer。
1.2 Tet-On 3G-HGH polyA融合片段制备
1.2.1 Tet-On 3G片段准备。以pCMV-Tet3G为模板，使用表2引物扩增Tet-On 3G目的片段并回收备用。
表2. Tet On 3G片段扩增引物列表
Figure 287620DEST_PATH_IMAGE002
Tet-On 3G目的片段的其中一条链的核苷酸序列（SEQ ID NO.2）如下（5’-3’），其互补链为编码序列：
Ttacccggggagcatgtcaaggtcaaaatcgtcaagagcgtcagcaggcagcatatcaaggtcaaagtcgtcaagggcatcggctgggagcatgtctaagtcaaaatcgtcaagggcgtcggtcggcccgccgctttcgcactttagctgtttctccaggccacatatgattagttccaggccgaaaaggaaggcaggttcggctccctgccggtcgaacagctcaattgcttgtttcagaagtgggggcatagaatcggtggtaggtgtctctctttcctcttttgctacttgatgctcctgttcctccaatacgcagcccagtgtaaagtggcccacggcggacagagcgtacagtgcgttctccagggagaagccttgctgacacaggaacgcgagctgattttccagggtttcgtactgtttctctgttgggcgggtgccgagatgcactttagccccgtcgcgatgtgagaggagagcacagcggtatgacttggcgttgttccgcagaaagtcttgccatgactcgccttccagggggcaggagtgggtatgatgcctgtccagcatctcgattggcagggcatcgagcagggcccgcttgttcttcacgtgccagtacagggtaggctgctcaactcccagcttttgagcgagtttccttgtcgtcaggccttcgataccgactccattgagtaattccagagcagagtttatgactttgctcttgtccagtctagacat。
1.2.2 HGH polyA片段准备。以pRosa26-Cas-CAG HGH为模板，使用表3引物扩增HGH polyA目的片段并回收备用。
表3. HGH polyA片段扩增引物列表
Figure 411565DEST_PATH_IMAGE003
HGH polyA目的片段的其中一条链的核苷酸序列（SEQ ID NO.3）如下（5’-3’）：
Ggctgcaggaattcaacaggcatctactgagtggacccaacgcatgagaggacagtgccaagcaagcaactcaaatgtcccaccggttgggccatggcaggtagcctatgctgtgtctggacgtcctcctgctggtatagttattttaaaatcagaaggacagggaagggagcagtggttcacgcctgtaatcccagcaatttgggaggccaaggtgggtagatcacctgagattaggagttggagaccagcctggccaatatggtgaaaccccgtctctaccaaaaaaacaaaaattagctgagcctggtcatgcatgcctggaatcccaacaactcgggaggctgaggcaggagaatcgcttgaacccaggaggcggagattgcagtgagccaagattgtgccactgcactccagcttggttcccaatagaccccgcaggccctacaggttgtcttcccaacttgccccttgctccataccacccccctccaccccataatattatagaaggacacctagtcagacaaaatgatgcaacttaattttattaggacaaggctggtgggcactggagtggcaacttccagggccaggagaggcactggggaggggtcacagggatgccacccatc。
1.2.3 Tet-On 3G-HGH polyA片段制备。使用表4引物，以Tet-On3G和HGH polyA为模板，通过融合PCR的方式，扩增回收目的片段Tet-On 3G-HGH polyA。
表4. Tet-On 3G-HGH polyA片段融合PCR引物列表
Figure 275616DEST_PATH_IMAGE004
Tet-On 3G-HGH polyA融合目的片段的其中一条链核苷酸序列如下（5’-3’）：
Ggctgcaggaattcaacaggcatctactgagtggacccaacgcatgagaggacagtgccaagcaagcaactc aaatgtcccaccggttgggccatggcaggtagcctatgctgtgtctggacgtcctcctgctggtatagttatttta aaatcagaaggacagggaagggagcagtggttcacgcctgtaatcccagcaatttgggaggccaaggtgggtagat cacctgagattaggagttggagaccagcctggccaatatggtgaaaccccgtctctaccaaaaaaacaaaaattag ctgagcctggtcatgcatgcctggaatcccaacaactcgggaggctgaggcaggagaatcgcttgaacccaggagg cggagattgcagtgagccaagattgtgccactgcactccagcttggttcccaatagaccccgcaggccctacaggt tgtcttcccaacttgccccttgctccataccacccccctccaccccataatattatagaaggacacctagtcagac aaaatgatgcaacttaattttattaggacaaggctggtgggcactggagtggcaacttccagggccaggagaggca ctggggaggggtcacagggatgccacccatcTtacccggggagcatgtcaaggtcaaaatcgtcaagagcgtcagcaggcagcatatcaaggtcaaagtcgtcaagggcatcggctgggagcatgtctaagtcaaaatcgtcaagggcgtcggtcggcccgccgctttcgcactttagctgtttctccaggccacatatgattagttccaggccgaaaaggaaggcaggttcggctccctgccggtcgaacagctcaattgcttgtttcagaagtgggggcatagaatcggtggtaggtgtctctctttcctcttttgctacttgatgctcctgttcctccaatacgcagcccagtgtaaagtggcccacggcggacagagcgtacagtgcgttctccagggagaagccttgctgacacaggaacgcgagctgattttccagggtttcgtactgtttctctgttgggcgggtgccgagatgcactttagccccgtcgcgatgtgagaggagagcacagcggtatgacttggcgttgttccgcagaaagtcttgccatgactcgccttccagggggcaggagtgggtatgatgcctgtccagcatctcgattggcagggcatcgagcagggcccgcttgttcttcacgtgccagtacagggtaggctgctcaactcccagcttttgagcgagtttccttgtcgtcaggccttcgataccgactccattgagtaattccagagcagagtttatgactttgctcttgtccagtctagacat。
下划线为HGH polyA，非下划线为Tet-On 3G。
1.3 中间载体的制备（含Rosa26 arm1-Alb enhancer-Alb promoter-Tet-On 3G-HGH polyA-Rosa26 arm2片段）。
1.3.1 用AscI酶切pRosa26-Cas质粒（由江苏集萃药康生物科技有限公司提供，载体本身含有Rosa26 arm1和Rosa26 arm2，图谱见图18），回收作为连接载体，该质粒含有Rosa26 arm1和Rosa26 arm2序列。
Rosa26 arm1的其中一条链的核苷酸序列(SEQ ID NO.4)如下：
TTggccggtgcgccgccaatcagcggaggctgccggggccgcctaaagaagaggctgtgctttggggctccggctcctcagagagcctcggctaggtaggggatcgggactctggcgggagggcggcttggtgcgtttgcggggatgggcggccgcggcaggccctccgagcgtggtggagccgttctgtgagacagccgggtacgagtcgtgacgctggaaggggcaagcgggtggtgggcaggaatgcggtccgccctgcagcaaccggagggggagggagaagggagcggaaaagtctccaccggacgcggccatggctcgggggggggggggcagcggaggagcgcttccggccgacgtctcgtcgctgattggcttcttttcctcccgccgtgtgtgaaaacacaaatggcgtgttttggttggcgtaaggcgcctgtcagttaacggcagccggagtgcgcagccgccggcagcctcgctctgcccactgggtggggcgggaggtaggtggggtgaggcgagctggacgtgcgggcgcggtcggcctctggcggggcgggggaggggagggagggtcagcgaaagtagctcgcgcgcgagcggccgcccaccctccccttcctctgggggagtcgttttacccgccgccggccgggcctcgtcgtctgattggctctcggggcccagaaaactggcccttgccattggctcgtgttcgtgcaagttgagtccatccgccggccagcgggggcggcgaggaggcgctcccaggttccggccctcccctcggccccgcgccgcagagtctggccgcgcgcccctgcgcaacgtggcaggaagcgcgcgctgggggcggggacgggcagtagggctgagcggctgcggggcgggtgcaagcacgtttccgacttgagttgcctcaagaggggcgtgctgagccagacctccatcgcgcactccggggagtggagggaaggagcgagggctcagttgggctgttttggaggcaggaagcacttgctctcccaaagtcgctctgagttgttatcagtaagggagctgcagtggagtaggcggggagaaggccgcacccttctccggaggggggaggggagtgttgcaatacctttctgggagttctctgctgcctcctggcttctgaggaccgccctgggcctgggagaatcccttccccctcttccctcgtgatctgcaactccagtctttgcagtctggtacttccaagctcattagatgccatcatgctctcactgcctcctcagcttcaagaggaatctggaaaaagcagtcccactggtcaggaaaggaacactagtgcacttatc。
Rosa26 arm2的其中一条链的核苷酸序列(SEQ ID NO.5)如下：
tgtgtgggcgttgtcctgcaggggaattgaacaggtgtaaaattggagggacaagacttcccacagattttcggttttgtcgggaagttttttaataggggcaaataaggaaaatgggaggataggtagtcatctggggttttatgcagcaaaactacaggttattattgcttgtgatccgcctcggagtattttccatcgaggtagattaaagacatgctcacccgagttttatactctcctgcttgagatccttactacagtatgaaattacagtgtcgcgagttagactatgtaagcagaattttaatcatttttaaagagcccagtacttcatatccatttctcccgctccttctgcagccttatcaaaaggtattttagaacactcattttagccccattttcatttattatactggcttatccaacccctagacagagcattggcattttccctttcctgatcttagaagtctgatgactcatgaaaccagacagattagttacatacaccacaaatcgaggctgtagctggggcctcaacactgcagttcttttataactccttagtacactttttgttgatcctttgccttgatccttaattttcagtgtctatcacctctcccgtcaggtggtgttccacatttgggcctattctcagtccagggagttttacaacaatagatgtattgagaatccaacctaaagcttaactttccactcccatgaatgcctctctcctttttctccatttataaactgagctattaaccattaatggtttccaggtggatgtctcctcccccaatattacctgatgtatcttacatattgccaggctgatattttaagacattaaaaggtatatttcattattgagccacatggtattgattactgcttactaaaattttgtcattgtacacatctgtaaaaggtggttccttttggaatgcaaagttcaggtgtttgttgtctttcctgacctaaggtcttgtgagcttgtattttttctatttaagcagtgctttctcttggactggcttgactcatggcattctacacgttattgctggtctaaatgtgat。
1.3.2 采用SLIC连接转化方法，在无菌管中加入连接2×HIFI Mix、线性化载体pRosa26-Cas和前述步骤制备的Alb enhancer-Alb promoter片段、Tet-On 3G-HGH polyA片段，用无菌水补足到20μL；50℃反应30min，以得到含有Rosa26 arm1-Alb enhancer-Albpromoter-Tet-On 3G-HGH polyA-Rosa26 arm2片段的中间载体，结束后Top 10化学感受态转化，结束后涂Spec抗性的LB固体琼脂培养基，37℃倒置培养过夜。
1.3.3 中间载体的鉴定。
平板挑取单克隆至含Spec抗性的4mL LB试管中培养。使用表5中引物对菌液进行PCR鉴定（结果见图2），PCR鉴定获得的阳性克隆再进行酶切（预期酶切条带见表6）鉴定确认（结果见图3），鉴定正确的即为中间载体（用Alb-pro表示）。PCR和酶切鉴定结果显示：5#和9#为正确的含有Rosa26 arm1-Alb enhancer-Alb promoter-Tet-On 3G-HGH polyA-Rosa26 arm2片段的中间载体。
表5. Alb-pro菌液PCR验证引物
Figure 683464DEST_PATH_IMAGE005
表6.中间载体的酶切鉴定的预期条带大小
Figure 974768DEST_PATH_IMAGE006
1.4 uPA-TRE3G融合片段的制备
1.4.1 uPA-rabbit polyA片段准备。以Alb-uPA-teton-final为模板，使用表7引物扩增 uPA-rabbit polyA片段并回收备用。
表7. uPA-rabbit polyA片段扩增引物列表
Figure 84544DEST_PATH_IMAGE007
其中，uPA-rabbit polyA-F引物中的加粗下划线部分是Kozak序列。
uPA-rabbit polyA目的片段的其中一条链核苷酸序列(SEQ ID NO.6)如下：
atgaaagtctggctggcgagcctgttcctctgcgccttggtggtgaaaaactctgaaggtggcagtgtactt ggagctcctgatgaatcaaactgtggctgtcagaacggaggtgtatgcgtgtcctacaagtacttctccagaattc gccgatgcagctgcccaaggaaattccagggggagcactgtgagatagatgcatcaaaaacctgctatcatggaaa tggtgactcttaccgaggaaaggccaacactgataccaaaggtcggccctgcctggcctggaatgcgcctgctgtc cttcagaaaccctacaatgcccacagacctgatgctattagcctaggcctggggaaacacaattactgcaggaacc ctgacaaccagaagcgaccctggtgctatgtgcagattggcctaaggcagtttgtccaagaatgcatggtgcatga ctgctctcttagcaaaaagccttcttcgtctgtagaccaacaaggcttccagtgtggccagaaggctctaaggccc cgctttaagattgttgggggagaattcactgaggtggagaaccagccctggttcgcagccatctaccagaagaaca agggaggaagtcctccctcctttaaatgtggtgggagtctcatcagtccttgctgggtggccagtgccgcacactg cttcattcaactcccaaagaaggaaaactacgttgtctacctgggtcagtcgaaggagagctcctataatcctgga gagatgaagtttgaggtggagcagctcatcttgcacgaatactacagggaagacagcctggcctaccataatgata ttgccttgctgaagatacgtaccagcacgggccaatgtgcacagccatccaggtccatacagaccatctgcctgcc cccaaggtttactgatgctccgtttggttcagactgtgagatcactggctttggaaaagagtctgaaagtgactat ctctatccaaagaacctgaaaatgtccgtcgtaaagcttgtttctcatgaacagtgtatgcagccccactactatg gctctgaaattaattataaaatgctgtgtgctgcggacccagagtggaaaacagattcctgcaagggcgattctgg aggaccgcttatctgtaacatcgaaggccgcccaactctgagtgggattgtgagctggggccgaggatgtgcagag aaaaacaagcccggtgtctacacgagggtctcacacttcctggactggattcaatcccacattggagaagagaaag gtctggccttctgagatctttttccctctgccaaaaattatggggacatcatgaagccccttgagcatctgacttctggctaataaaggaaatttattttcattgcaatagtgtgttggaattttttgtgtctctcactcggaaggacatatgggagggcaaatcatttaaaacatcagaatgagtatttggtttagagtttggcaacatatgcccatatgctggctgccatgaacaaaggttggctataaagaggtcatcagtatatgaaacagccccctgctgtccattccttattccatagaaaagccttgacttgaggttagattttttttatattttgttttgtgttatttttttctttaacatccctaaaattttccttacatgttttactagccagatttttcctcctctcctgactact。
下划线部分为uPA的编码序列；非下划线为rabbit polyA序列。uPA的氨基酸序列为SEQ ID NO.7，如下：
mkvwlaslflcalvvknseggsvlgapdesncgcqnggvcvsykyfsrirrcscprkfqgehceidasktcyhgngdsyrgkantdtkgrpclawnapavlqkpynahrpdaislglgkhnycrnpdnqkrpwcyvqiglrqfvqecmvhdcslskkpsssvdqqgfqcgqkalrprfkivggeftevenqpwfaaiyqknkggsppsfkcggslispcwvasaahcfiqlpkkenyvvylgqskessynpgemkfeveqlilheyyredslayhndiallkirtstgqcaqpsrsiqticlpprftdapfgsdceitgfgkesesdylypknlkmsvvklvsheqcmqphyygseinykmLcaadpewktdsckgdsggplicniegrptlsgivswgrgcaeknkpgvytrvshfldwiqshigeekglaf。
1.4.2 TRE3G片段准备。以pTRE3G为模板，使用表8引物扩增TRE3G片段并回收备用。
表8. TRE3G片段扩增引物列表
Figure 752285DEST_PATH_IMAGE008
TRE3G片段的核苷酸序列(SEQ ID NO.8)如下：
gagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgaagagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgcagactttactccctatcagtgatagagaacgtataaggagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgaccagtttactccctatcagtgatagagaacgtatctacagtttactccctatcagtgatagagaacgtatatccagtttactccctatcagtgatagagaacgtataagctttaggcgtgtacggtgggcgcctataaaagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagcaattccacaacacttttgtcttataccaactttccgtaccacttcctaccctcgtaaa。
1.4.3 TRE3G-uPA-rabbit polyA融合片段制备。使用表9引物，通过融合PCR，将片段uPA-rabbit polyA和TRE3G融合，回收目的条带备用。
表9. uPA-TRE3GP融合片段扩增引物列表
Figure 14640DEST_PATH_IMAGE009
TRE3G-uPA-rabbit polyA融合片段的其中一条链核苷酸序列如下：
gagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgaagagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgca gactttactccctatcagtgatagagaacgtataaggagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgaccagt ttactccctatcagtgatagagaacgtatctacagtttactccctatcagtgatagagaacgtatatccagtttac tccctatcagtgatagagaacgtataagctttaggcgtgtacggtgggcgcctataaaagcagagctcgtttagtg aaccgtcagatcgcctggagcaattccacaacacttttgtcttataccaactttccgtaccacttcctaccctcgt aaaatgaaagtctggctggcgagcctgttcctctgcgccttggtggtgaaaaactctgaaggtggcagtgtacttg gagctcctgatgaatcaaactgtggctgtcagaacggaggtgtatgcgtgtcctacaagtacttctccagaattcg ccgatgcagctgcccaaggaaattccagggggagcactgtgagatagatgcatcaaaaacctgctatcatggaaat ggtgactcttaccgaggaaaggccaacactgataccaaaggtcggccctgcctggcctggaatgcgcctgctgtcc ttcagaaaccctacaatgcccacagacctgatgctattagcctaggcctggggaaacacaattactgcaggaaccc tgacaaccagaagcgaccctggtgctatgtgcagattggcctaaggcagtttgtccaagaatgcatggtgcatgac tgctctcttagcaaaaagccttcttcgtctgtagaccaacaaggcttccagtgtggccagaaggctctaaggcccc gctttaagattgttgggggagaattcactgaggtggagaaccagccctggttcgcagccatctaccagaagaacaa gggaggaagtcctccctcctttaaatgtggtgggagtctcatcagtccttgctgggtggccagtgccgcacactgc ttcattcaactcccaaagaaggaaaactacgttgtctacctgggtcagtcgaaggagagctcctataatcctggag agatgaagtttgaggtggagcagctcatcttgcacgaatactacagggaagacagcctggcctaccataatgatat tgccttgctgaagatacgtaccagcacgggccaatgtgcacagccatccaggtccatacagaccatctgcctgccc ccaaggtttactgatgctccgtttggttcagactgtgagatcactggctttggaaaagagtctgaaagtgactatc tctatccaaagaacctgaaaatgtccgtcgtaaagcttgtttctcatgaacagtgtatgcagccccactactatgg ctctgaaattaattataaaatgctgtgtgctgcggacccagagtggaaaacagattcctgcaagggcgattctgga ggaccgcttatctgtaacatcgaaggccgcccaactctgagtgggattgtgagctggggccgaggatgtgcagaga aaaacaagcccggtgtctacacgagggtctcacacttcctggactggattcaatcccacattggagaagagaaagg tctggccttctga gatctttttccctctgccaaaaattatggggacatcatgaagccccttgagcatctgacttct ggctaataaaggaaatttattttcattgcaatagtgtgttggaattttttgtgtctctcactcggaaggacatatg ggagggcaaatcatttaaaacatcagaatgagtatttggtttagagtttggcaacatatgcccatatgctggctgc catgaacaaaggttggctataaagaggtcatcagtatatgaaacagccccctgctgtccattccttattccataga aaagccttgacttgaggttagattttttttatattttgttttgtgttatttttttctttaacatccctaaaatttt ccttacatgttttactagccagatttttcctcctctcctgactact。
其中，下划线序列为TRE3G序列，波浪线为uPA核苷酸序列，斜体为rabbit polyA序列。
1.5 打靶载体的制备
1.5.1 用AscI酶切线性化前述步骤制备的中间载体（Alb-pro），作为连接载体。
1.5.2 采用SLIC方法，在无菌管中加入连接2×HIFI Mix、RE3G-uPA-rabbitpolyA融合片段和线性化的中间载体（Alb-pro）片段，用无菌水补足到20μL；50℃反应30min，以得到含有Rosa26 arm1-Alb enhancer-Alb promoter-Tet-On 3G-HGH polyA-rabbit polyA-uPA-RE3G -Rosa26 arm2片段的打靶载体（即命名为Alb终载体）；结束后Top10化学感受态转化，结束后涂Spec抗性的LB固体琼脂培养基，37℃倒置培养过夜。
1.5.3 打靶载体的鉴定
平板挑取单克隆至含Spec抗性的4mL LB试管中培养。使用表10中引物对菌液进行PCR鉴定，PCR鉴定为阳性的克隆（见图4）再进行酶切鉴定确认（酶切鉴定预期条带大小见表11），结果见图5，鉴定正确的为打靶载体，并使用表12引物对正确的克隆测序（测序所用引物见表12）。
经PCR、酶切鉴定和测序，结果显示：3#、7#和10#为正确的如实施例1所述的打靶载体。
表10. 含打靶载体的菌液鉴定引物
Figure 476845DEST_PATH_IMAGE010
表11. 打靶载体的酶切鉴定方案
Figure 309803DEST_PATH_IMAGE011
表12. Rosa26 Alb-tet3G-upA-enhancer-pro-tetOn3G测序引物
Figure 515656DEST_PATH_IMAGE012
构建成功后的各元件在打靶载体的上位置关系示意图如图1所示。
实施例3
构建以小鼠基因组H11位点作为目标插入位点的对照打靶载体，其元件结构示意图见图6，其相对于实施例1的打靶载体，区别在于两端的同源臂序列不同。
该对照打靶载体的构建方法如下：
1载体骨架制备：以 PMD18T-H11-CAG-FLPo(由江苏集萃药康生物科技有限公司提供，图谱见图19)为模板，使用表13引物扩增得到4965bp的片段并回收，BglII酶切回收产物，作为骨架载体备用。
表13. 骨架载体扩增引物
Figure 632517DEST_PATH_IMAGE013
2 用BamHI酶切实施例1的测序正确的打靶载体，酶切后片段大小分别为5851bp和5159bp，回收5851bp片段。
3使用T4连接酶将上述骨架载体和5851bp片段连接，通过Top 10化学感受态转化，结束后涂Amp抗性的LB固体琼脂培养基，37℃倒置培养过夜。
平板挑取单克隆至含Amp抗性的4mL LB试管中培养。使用表14引物对菌液进行PCR鉴定，结果见图7；PCR阳性克隆再酶切鉴定确认（酶切预期条带见表15），结果见图8，鉴定正确的克隆即为对照打靶载体（命名为Alb-H11）。PCR和酶切鉴定结果显示：1#和7#为正确的Alb-H11质粒。
表14. Alb-H11菌液PCR验证引物
Figure 327940DEST_PATH_IMAGE014
表15. Alb-H11质粒酶切验证方案。
Figure 38407DEST_PATH_IMAGE015
对照打靶载体中：
H11 arm1的其中一条链的核苷酸序列如下：
ctcagcagacacccaggataagtgcactagtgttcctttcctgaccagtgggactgctttttccagattcctcttgaagctgaggaggcagtgagagcatgatggcatctaatgagcttggaagtaccagactgccctgatccacagccaggttttgctgaaaagtgaccagtttgtcctcctccagtagagtgggcagctgaaggattataatctactgtcaagacttggaggcccctgcagtcaaagtccaatagaatattatgaaatggagaatggcttattttaatctctatagtggaattaaaatagcatttatggccccagatccataattaatccaatgactggtcaaattagcttgaacctgactgaaaaacctgcaatcagtatagtatctttcagaatgctttacattcaatttataataccagacttcaagttgtaagttaacaattttgagagaaactaatgcagcagaggcaagggaaagacttaaattaatgtgaccattaattagttggagtcaggctggattaacattgtgccagtaaatttcagaaaaattactatatgacttctctgtaaactttgattttgtagagtataatattgattccttgatacttgccacaagctactttcagggttagtccagcttaaactaatgctatcagaactttatgtgcagaagaaattccagaagtcctaaggtaaaattaaaacgtgaaaggaactcatttagactgtcttagttcatggaagaaataaacacagtaccagccatatcgttcacacacgtggcatatgtaacttttaataaaccaaaagaaaaagtcccaaatattcaagtgaaaaaaatccaaacagttgacacaagcctaactgatagttactttatgtacagctgtatgtataagttcaaaaaaagctaccctatttgtatgtacaaaagtttatacacaggtctgtacataagggtctatacattttattttttcagaacccttaggtgtcacctctagaagacaccaacacttcattcacatattttataaaagaaagacttccaggactgacaatcttgtatcccttgtatttgaaccatgtaggttcattcgatttaacagccttctgtca。
H11 arm2的其中一条链的核苷酸序列如下：
tagctcaccttgaaaatggaaacatgtctgacaagagccttgagctgaatatcatccagagtatttgctagagacagggtcttaagtctcattaaattgcttagaagtgtgtttagtcctataaactatgtctcatttgtgtgtccttcacaaagagcgctagtgtcgatcatccattagcctagcctataaaggtgacacaacctggtcagtccctctgtatgtctactatttccccttctgatttctactatcttctcaagaactggttcttcagcttcctttgggaaatgtcactttttaatgatgtgtgttttgcttatgtatatgtctacatactacccatgtgcttggtcactgcagaggccagaagacggtgtcaggtgcactggaactagagttaatgacagatgtgagccatagggtgctttgttcacatctttccagtcccaaatgcgtctaaacttatgtgatacatactagattaccacaaaattgctccaaagacacctttctccctctgagatgaatctctggctggccttgctctaggcaatcctgtgttcaattcaaggactgaatttgattacatcggtaatccagtgccccaggcatttctgctttttctgtaaggttcttatcccctggaagactgtttacgtattcatttttttttgagactaagtttcaggtagaaaaagcttgccttgaacttcactatatagggcttatcttgaactcttgtgggtcttccacctttcttcagttagcttctgtacactgccagacatgaaaatcagatccatttatagatagatggtcatgagccaccatgtgggtgtctaaaattgatctcaggacctctgaaagaccagctagttctcttaactgctgagccatctctctagcgtgtctatacacatttaatatccccttgttccctttctgcttcatcttgctgatcatgattagtgtttgcctttgttacctgttccatcagcttcagcctgaagagtaagtagttctctattggcagtttgacacatcctgcccttac。
实施例4
将构建好的载体（打靶载体或对照打靶载体）和Cas9系统组成注射体系，见下表：
Figure 159204DEST_PATH_IMAGE016
打靶载体所用sgRNA的靶序列为：AGTCTTCTGGGCAGGCTTAA（SEQ ID NO.9）。
对照打靶载体所用sgRNA的靶序列为：CTGAGCCAACAGTGGTAGTA。
通过显微注射方式注射至NCG野生型小鼠0.5天（从向卵子培养皿中加入精子时起算12h）的受精卵(1-2PL/胚胎）中，并将胚胎移植（将胚胎通过输卵管移植的方式植入）至0.5天（从雌鼠与结扎公鼠成功交配后（成功检栓）起算12h）假孕雌鼠体内。小鼠出生后，经基因鉴定筛选出中靶小鼠，阳性小鼠命名为：H11-alb-Tet On3G-uPA（使用实施例3的对照打靶载体构建得到）和Rosa26-alb-Tet-On3G-uPA（使用实施例1的打靶载体构建得到）。阳性F0小鼠与背景鼠（NCG小鼠）回交获得F1，对F1代鼠尾进行基因鉴定。将阳性F1小鼠繁育建系，用于验证实验。
表16. H11-alb-Tet On3G-uPA小鼠鉴定引物列表
Figure 271516DEST_PATH_IMAGE017
图9鉴定结果显示：编号146#，149#，150#，152#，153#，155#，156#，157#，158#，161#，163#，166#，167#，168#，170#，172#为F1代阳性H11-alb-Tet On3G-uPA杂合鼠（ki/wt）；其余为野生型。
表17. Rosa26-alb-Tet-On3G-uPA F1代小鼠鉴定引物列表
Figure 200158DEST_PATH_IMAGE018
图10鉴定结果显示，15号小鼠为F1代阳性Rosa26-alb-Tet-On3G-uPA杂合小鼠。
实施例5
小鼠肝损伤规律检测
1 H11-alb-Tet On3G-uPA小鼠肝损伤规律检测
6-8周龄的背景鼠（WT）、H11-alb-Tet On3G-uPA杂合小鼠和纯合小鼠，给予2.0mg/mLDox灌胃或饮水，并在不同时间点进行眼眶采血，检测血清中ALT活性水平。
图11的实验结果显示：无论是H11-alb-Tet On3G-uPA杂合小鼠还是纯合小鼠，给予Dox后，ALT小鼠均出现升高，但仍未达到严重的肝损伤水平。
2 Rosa26-alb-Tet-On3G-uPA小鼠肝损伤规律检测
2周龄的NCG背景鼠及Rosa26-alb-Tet-On3G-uPA杂合子小鼠，分别在其2、4、6、8、10、12、14、16周龄进行眼眶采血，并检测血清中的ALT活性。令人意外的是，Rosa26-alb-Tet-On3G-uPA杂合小鼠在3-4周龄时ALT活性升高，且ALT活性随着周龄增加而升高，8-10周龄急剧下降（见图12）。
取4周龄Rosa26-alb-Tet-On3G-uPA小鼠的肝脏，经多聚甲醛固定后进行石蜡包埋、切片、HE染色分析。与NCG背景鼠相比，4周龄时的Rosa26-alb-Tet-On3G-uPA小鼠出现严重肝损伤，肝细胞气球样变，局部坏死，胞质溶解（见图13）。
由以上结果得出：Rosa26-alb-Tet-On3G-uPA杂合子小鼠可自发肝损伤，且肝损伤程度可满足外源肝细胞的植入要求。Rosa26-alb-Tet-On3G-uPA纯合子小鼠也可以自发肝损伤（见图20）。
3不同周龄的Rosa26-alb-Tet-On3G-uPA小鼠均对Dox有响应
取3-4周龄和6-8周龄的Rosa26-alb-Tet-On3G-uPA小鼠，给予1-2mg/mL 的Dox饮水，并在饮水的第0/3/5/7天采血(3-4周龄)和第0/2/4/6/8天采血(6-8周龄)，检测血清中的ALT活性。小鼠在第7天或第8天安乐死，取小鼠肝脏，经固定、石蜡包埋、切片和HE染色，分析肝细胞损伤情况。
结果见图14和图15：不论是3-4周龄还是6-8周龄的Rosa26-alb-Tet-On3G-uPA小鼠，均可对Dox响应。与普通饮水的Rosa26-alb-Tet-On3G-uPA小鼠相比，给予Dox饮水，小鼠ALT活性明显升高，肝损伤加重。
综合上述结果，可以看出：与H11-alb-Tet On3G-uPA小鼠相比，Rosa26-alb-Tet-On3G-uPA小鼠对Dox响应更敏感，且可自发损伤。因此，可以使用Rosa26-alb-Tet-On3G-uPA小鼠进行肝损伤后的肝脏重建。
实施例6
肝细胞移植测试
1绿色荧光肝细胞分离
选取5-6周龄的B6-G/R（由江苏集萃药康生物科技有限公司提供，品系编号为T006163）雄鼠。小鼠麻醉后，酒精清洗腹部。剪开暴露腹腔，暴露下腔静脉和门静脉，将滞留针从下腔静脉处插入。预灌流成功后，剪开门静脉。依次灌流预热的Preperfusion buffer-P1（HBSS配制终浓度5mM EDTA溶液）和Enzyme buffer-P2（HBSS配制终浓度5mM CaCl2溶液(pH7.2)，使用前加入Collagenase）。灌流完成后，将肝脏整体摘下，经PBS清洗后放入P2溶液中，刮破肝脏包膜，使肝细胞进入P2中，将细胞悬液过滤。向滤液添加10%FBS的DMEM，4℃，400rpm离心3min，去除上清。
向上述沉淀添加percoll混合液（10mL DMEM+1mL 10x PBS+9mL percoll）重悬细胞，4℃，1100rpm离心，3min，去除上清。
使用预冷DMEM清洗细胞，并检测细胞活率，根据计数结果，将细胞稀释到合适浓度备用。
2小鼠脾脏原位肝细胞移植
将Rosa26-alb-Tet-On3G-uPA小鼠和NCG小鼠随机分为以下各组（见表18）。每只小鼠通过脾内移植注射新鲜的绿色荧光肝细胞。小鼠完成移植手术后，放37℃热台保温，待小鼠自然苏醒后注射抗生素，并将小鼠放回饲养笼，按照下表要求给予正常饮水或者Dox饮水。小鼠完成肝细胞移植后10周，将所有小鼠进行终点取材。肝脏进行固定、包埋，通过冰冻切片，观察小鼠绿色荧光细胞分布，结果见图16和图17。
表18.小鼠肝细胞移植及条件处理分组
Figure 397921DEST_PATH_IMAGE019
图16和图17结果显示：
（1）3-4周龄和6-8周龄Rosa26-alb-Tet-On3G-uPA小鼠进行肝细胞移植后，给予一周正常饮水，外源肝细胞可在小鼠肝脏表面均匀分布，重建率可达50%。
（2）3-4周龄和6-8周龄Rosa26-alb-Tet-On3G-uPA小鼠接受肝细胞植入后，给予一周Dox饮水，绿色荧光肝细胞可在肝脏表面均匀分布，重建率达90%；与正常饮水组相比，给予小鼠Dox饮水，可明显提高外源肝细胞在小鼠体内的定植。
实施例7
检测Rosa26-alb-Tet-On3G-uPA小鼠存活率
采用Rosa26-alb-Tet-On3G-uPA杂合子小鼠与NCG背景鼠配繁的方式，获得子代Rosa26-alb-Tet-On3G-uPA杂合子小鼠用于实验。其中获得的Rosa26-alb-Tet-On3G-uPA杂合子小鼠1335只，围产期存活1299只，存活率高达97%，Rosa26-alb-Tet-On3G-uPA纯合子和杂合子存活率相似，其与uPA-SCID小鼠的围产期存活率相比（70%-75%），本发明实施例的方法大大提升了小鼠存活率。
综上结果，可以看出：
本发明实施例提供了一种携带有Rosa26位点同源臂的Tet on系统调控uPA在肝脏特异性表达的载体（实施例1），该载体可定点整合到Rosa26位点，使用该种元件组合的载体构建的小鼠模型Rosa26-alb-Tet-On3G-uPA，避免了基因组上毗邻序列的干扰效应，且不会破坏任何内源性基因，保证了小鼠生长发育正常及功能正常。
出乎意料的是，使用该载体构建的小鼠模型Rosa26-alb-Tet-On3G-uPA可自发肝损伤（2-3周龄出现肝损伤，8周龄时ALT值可达300 IU/L），且自发肝损伤的水平完全满足外源肝细胞的植入要求，即无需Dox诱导即可实现外源肝细胞的定植，使得移植程序更加简化。该种自发肝损伤表型打破了传统的对Tet on系统调控蛋白表达特点的认知。
此外，Rosa26-alb-Tet-On3G-uPA在自发肝损伤的基础上，在不同的生长阶段，均可对Dox有响应，即使用Dox诱导，可加重小鼠的肝损伤水平，提高外源肝细胞的定植率。
结合Rosa26-alb-Tet-On3G-uPA小鼠可自发肝损伤且可通过Dox诱导加重肝损伤的特点，可随意选择不同周龄小鼠利用自发肝损伤特点进行肝脏重建；或通过Dox诱导，提高外源肝细胞的定植率。使用Rosa26-alb-Tet-On3G-uPA小鼠进行肝脏重建，移植窗口不再受周龄限制，移植重建条件更加灵活。
另外还要注意的是，本发明实施例提供的Rosa26-alb-Tet-On3G-uPA小鼠的杂交后代的死亡率远远低于现有的自发性肝损伤小鼠模型，这为大规模使用肝损伤小鼠模型奠定了基础。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 江苏集萃药康生物科技有限公司
<120> 用于构建肝损伤小鼠模型的打靶载体、核酸组合物和构建方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2419
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
ggtggttctc ctgtcagttt cgagggggta cagcttgggc tgcaggtcga ctctagatcg 60
aattcctgca gcccggggga tcccggggtt gataggaaag gtgatctgtg tgcagaaaga 120
ctcgctctaa tatacttctt taaccaataa ctgtagatca ttaaccatac ttacctcgca 180
tttcattggt tcctacccca ttacaaaatc ataccatctt tgccaaaaag ttgtttgact 240
aaatcccttg cgtatgtttg ccatctggag ctgttcccct ctaaccccac ccccaccccc 300
atgcacaaga ctttgtccat tcattaaagt tatgtaaaac agcaaatttt acataagagc 360
ttaatctctt tgtctcccat ttgagcattt cagtgtgggc cttggcatgg aagcatgcct 420
gcaggtcgat cccaagctgg agaacgagtt caagccaagc tgcaccactg cttttcacac 480
actcttcact ctgcatcagc ttagtatttc ttaagaaatt aaaagatggc aaaacacatc 540
taaactgtat taataaagtg cttctttcat atttaatgtt tttccagata aagaaaacta 600
tgatgaatgc ctgcatgctt atctatgttt catagatcag caagtagaat gtataaaatg 660
gaagtgtcag taattctgct cataattatt gctgcagatt gaattcaccc ctaagcaaat 720
atacctctga acatctgctc acagtctgta tgttctccag acacaatcca aaagacttat 780
tatctgaaag attaatgtca caaagccaga gctttataat ctcttataaa acatagattg 840
tagccaggca gtggtggcac atgcttttaa tcctagcact tgcaaggcag aggcaagcag 900
atctctgagt tcaagaccaa cctggtctac agagcaaggt ccaggacagc caaagctaga 960
cagaaaaaac tgtatctcaa aagaaaatag acaacaaatt acattgttac agctaaaatt 1020
atcttatgtt gaaatttctg tagctcaact ttggaatatt ttcattagag ggtaatattt 1080
gattatgatc acttctaaaa ctttagaatt tattgtttta taatctcttg gtttcagtac 1140
ttacctaaaa ttttccaacc agtcacccag ctaaaactta aaatatttaa gtcctagaat 1200
tccagttagt tttgcaagta actataaatg gtattacagt gagaaatgga gcatctgatg 1260
tctactcaca tgtaaacttt acacatatca aatagatgat tgtctatggt ctttcttctt 1320
ttttagagta tatagagtat atagagatag attcatccat aataagctca ataaacaaat 1380
gtttaaaaat gattgttaga tattattggg tatataagta cctaattatt aaaattgact 1440
tttttataac attgagataa attaaaattc atttattaaa ataatatata tgaatttgaa 1500
ggggtttttt ttgcaaaaca atttcagcaa gcaataccat gacaaaagtg tgtattcaaa 1560
tggaatggga aacgaatgtc agtaacttat ggtccccgtg tactcattcc cagacatgcc 1620
tgattggtag ctgtgacagc tccagcgtac ttaacaccaa gactttaaat aagctgccaa 1680
aaatgtgtaa gactgccatt tcattagttt taatttttat atctataccc tttctacagc 1740
cacatactaa acgtagacaa gttggccttt tcctattgct ttaaaggcag aggactgtat 1800
tgatcagtcc aaacttcttt ctgcatgtac atggaaaact ggccaaggca aacacgtccg 1860
gaatgatggt atttaagaac aaacattccc tggtatcagc aagtacagtg ccctgctgac 1920
agagcaggag acacaaagta ccatctcgtc cctatgttaa gtagtgtcac ctcatgctca 1980
agggatactg agtggatgct gtaacgcagg ttattttcta ggctgtgagg atacaagaaa 2040
atgaaagtaa ttaaagtaga acattgctct gtgctatgct tgcagaatgt gtagtgtagt 2100
ctaggaacag agaggggaag gttctaaatc aaaaaaaatc aagctcatgc ctaaggatgt 2160
gtgggttgcc acctctttag ctacctatgc gatccaaaca actataaaac ttagaattta 2220
ttttctctgg atgaatttgt gcttgtggag caatgttggt agggggcagg gtcagctgga 2280
aaagtggaat gagcaagcag aaaactgaga gaagcagaag cttaggaaga tgggtaattt 2340
ccaaaagttt cacaaaagat caaatcaaag aagtaagctc caccttagaa aaaagtggaa 2400
cgtcatgcta aggaagcta 2419
<210> 2
<211> 747
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
ttacccgggg agcatgtcaa ggtcaaaatc gtcaagagcg tcagcaggca gcatatcaag 60
gtcaaagtcg tcaagggcat cggctgggag catgtctaag tcaaaatcgt caagggcgtc 120
ggtcggcccg ccgctttcgc actttagctg tttctccagg ccacatatga ttagttccag 180
gccgaaaagg aaggcaggtt cggctccctg ccggtcgaac agctcaattg cttgtttcag 240
aagtgggggc atagaatcgg tggtaggtgt ctctctttcc tcttttgcta cttgatgctc 300
ctgttcctcc aatacgcagc ccagtgtaaa gtggcccacg gcggacagag cgtacagtgc 360
gttctccagg gagaagcctt gctgacacag gaacgcgagc tgattttcca gggtttcgta 420
ctgtttctct gttgggcggg tgccgagatg cactttagcc ccgtcgcgat gtgagaggag 480
agcacagcgg tatgacttgg cgttgttccg cagaaagtct tgccatgact cgccttccag 540
ggggcaggag tgggtatgat gcctgtccag catctcgatt ggcagggcat cgagcagggc 600
ccgcttgttc ttcacgtgcc agtacagggt aggctgctca actcccagct tttgagcgag 660
tttccttgtc gtcaggcctt cgataccgac tccattgagt aattccagag cagagtttat 720
gactttgctc ttgtccagtc tagacat 747
<210> 3
<211> 635
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
ggctgcagga attcaacagg catctactga gtggacccaa cgcatgagag gacagtgcca 60
agcaagcaac tcaaatgtcc caccggttgg gccatggcag gtagcctatg ctgtgtctgg 120
acgtcctcct gctggtatag ttattttaaa atcagaagga cagggaaggg agcagtggtt 180
cacgcctgta atcccagcaa tttgggaggc caaggtgggt agatcacctg agattaggag 240
ttggagacca gcctggccaa tatggtgaaa ccccgtctct accaaaaaaa caaaaattag 300
ctgagcctgg tcatgcatgc ctggaatccc aacaactcgg gaggctgagg caggagaatc 360
gcttgaaccc aggaggcgga gattgcagtg agccaagatt gtgccactgc actccagctt 420
ggttcccaat agaccccgca ggccctacag gttgtcttcc caacttgccc cttgctccat 480
accacccccc tccaccccat aatattatag aaggacacct agtcagacaa aatgatgcaa 540
cttaatttta ttaggacaag gctggtgggc actggagtgg caacttccag ggccaggaga 600
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<211> 1352
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
ttggccggtg cgccgccaat cagcggaggc tgccggggcc gcctaaagaa gaggctgtgc 60
tttggggctc cggctcctca gagagcctcg gctaggtagg ggatcgggac tctggcggga 120
gggcggcttg gtgcgtttgc ggggatgggc ggccgcggca ggccctccga gcgtggtgga 180
gccgttctgt gagacagccg ggtacgagtc gtgacgctgg aaggggcaag cgggtggtgg 240
gcaggaatgc ggtccgccct gcagcaaccg gagggggagg gagaagggag cggaaaagtc 300
tccaccggac gcggccatgg ctcggggggg ggggggcagc ggaggagcgc ttccggccga 360
cgtctcgtcg ctgattggct tcttttcctc ccgccgtgtg tgaaaacaca aatggcgtgt 420
tttggttggc gtaaggcgcc tgtcagttaa cggcagccgg agtgcgcagc cgccggcagc 480
ctcgctctgc ccactgggtg gggcgggagg taggtggggt gaggcgagct ggacgtgcgg 540
gcgcggtcgg cctctggcgg ggcgggggag gggagggagg gtcagcgaaa gtagctcgcg 600
cgcgagcggc cgcccaccct ccccttcctc tgggggagtc gttttacccg ccgccggccg 660
ggcctcgtcg tctgattggc tctcggggcc cagaaaactg gcccttgcca ttggctcgtg 720
ttcgtgcaag ttgagtccat ccgccggcca gcgggggcgg cgaggaggcg ctcccaggtt 780
ccggccctcc cctcggcccc gcgccgcaga gtctggccgc gcgcccctgc gcaacgtggc 840
aggaagcgcg cgctgggggc ggggacgggc agtagggctg agcggctgcg gggcgggtgc 900
aagcacgttt ccgacttgag ttgcctcaag aggggcgtgc tgagccagac ctccatcgcg 960
cactccgggg agtggaggga aggagcgagg gctcagttgg gctgttttgg aggcaggaag 1020
cacttgctct cccaaagtcg ctctgagttg ttatcagtaa gggagctgca gtggagtagg 1080
cggggagaag gccgcaccct tctccggagg ggggagggga gtgttgcaat acctttctgg 1140
gagttctctg ctgcctcctg gcttctgagg accgccctgg gcctgggaga atcccttccc 1200
cctcttccct cgtgatctgc aactccagtc tttgcagtct ggtacttcca agctcattag 1260
atgccatcat gctctcactg cctcctcagc ttcaagagga atctggaaaa agcagtccca 1320
ctggtcagga aaggaacact agtgcactta tc 1352
<210> 5
<211> 1094
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
tgtgtgggcg ttgtcctgca ggggaattga acaggtgtaa aattggaggg acaagacttc 60
ccacagattt tcggttttgt cgggaagttt tttaataggg gcaaataagg aaaatgggag 120
gataggtagt catctggggt tttatgcagc aaaactacag gttattattg cttgtgatcc 180
gcctcggagt attttccatc gaggtagatt aaagacatgc tcacccgagt tttatactct 240
cctgcttgag atccttacta cagtatgaaa ttacagtgtc gcgagttaga ctatgtaagc 300
agaattttaa tcatttttaa agagcccagt acttcatatc catttctccc gctccttctg 360
cagccttatc aaaaggtatt ttagaacact cattttagcc ccattttcat ttattatact 420
ggcttatcca acccctagac agagcattgg cattttccct ttcctgatct tagaagtctg 480
atgactcatg aaaccagaca gattagttac atacaccaca aatcgaggct gtagctgggg 540
cctcaacact gcagttcttt tataactcct tagtacactt tttgttgatc ctttgccttg 600
atccttaatt ttcagtgtct atcacctctc ccgtcaggtg gtgttccaca tttgggccta 660
ttctcagtcc agggagtttt acaacaatag atgtattgag aatccaacct aaagcttaac 720
tttccactcc catgaatgcc tctctccttt ttctccattt ataaactgag ctattaacca 780
ttaatggttt ccaggtggat gtctcctccc ccaatattac ctgatgtatc ttacatattg 840
ccaggctgat attttaagac attaaaaggt atatttcatt attgagccac atggtattga 900
ttactgctta ctaaaatttt gtcattgtac acatctgtaa aaggtggttc cttttggaat 960
gcaaagttca ggtgtttgtt gtctttcctg acctaaggtc ttgtgagctt gtattttttc 1020
tatttaagca gtgctttctc ttggactggc ttgactcatg gcattctaca cgttattgct 1080
ggtctaaatg tgat 1094
<210> 6
<211> 1715
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
atgaaagtct ggctggcgag cctgttcctc tgcgccttgg tggtgaaaaa ctctgaaggt 60
ggcagtgtac ttggagctcc tgatgaatca aactgtggct gtcagaacgg aggtgtatgc 120
gtgtcctaca agtacttctc cagaattcgc cgatgcagct gcccaaggaa attccagggg 180
gagcactgtg agatagatgc atcaaaaacc tgctatcatg gaaatggtga ctcttaccga 240
ggaaaggcca acactgatac caaaggtcgg ccctgcctgg cctggaatgc gcctgctgtc 300
cttcagaaac cctacaatgc ccacagacct gatgctatta gcctaggcct ggggaaacac 360
aattactgca ggaaccctga caaccagaag cgaccctggt gctatgtgca gattggccta 420
aggcagtttg tccaagaatg catggtgcat gactgctctc ttagcaaaaa gccttcttcg 480
tctgtagacc aacaaggctt ccagtgtggc cagaaggctc taaggccccg ctttaagatt 540
gttgggggag aattcactga ggtggagaac cagccctggt tcgcagccat ctaccagaag 600
aacaagggag gaagtcctcc ctcctttaaa tgtggtggga gtctcatcag tccttgctgg 660
gtggccagtg ccgcacactg cttcattcaa ctcccaaaga aggaaaacta cgttgtctac 720
ctgggtcagt cgaaggagag ctcctataat cctggagaga tgaagtttga ggtggagcag 780
ctcatcttgc acgaatacta cagggaagac agcctggcct accataatga tattgccttg 840
ctgaagatac gtaccagcac gggccaatgt gcacagccat ccaggtccat acagaccatc 900
tgcctgcccc caaggtttac tgatgctccg tttggttcag actgtgagat cactggcttt 960
ggaaaagagt ctgaaagtga ctatctctat ccaaagaacc tgaaaatgtc cgtcgtaaag 1020
cttgtttctc atgaacagtg tatgcagccc cactactatg gctctgaaat taattataaa 1080
atgctgtgtg ctgcggaccc agagtggaaa acagattcct gcaagggcga ttctggagga 1140
ccgcttatct gtaacatcga aggccgccca actctgagtg ggattgtgag ctggggccga 1200
ggatgtgcag agaaaaacaa gcccggtgtc tacacgaggg tctcacactt cctggactgg 1260
attcaatccc acattggaga agagaaaggt ctggccttct gagatctttt tccctctgcc 1320
aaaaattatg gggacatcat gaagcccctt gagcatctga cttctggcta ataaaggaaa 1380
tttattttca ttgcaatagt gtgttggaat tttttgtgtc tctcactcgg aaggacatat 1440
gggagggcaa atcatttaaa acatcagaat gagtatttgg tttagagttt ggcaacatat 1500
gcccatatgc tggctgccat gaacaaaggt tggctataaa gaggtcatca gtatatgaaa 1560
cagccccctg ctgtccattc cttattccat agaaaagcct tgacttgagg ttagattttt 1620
tttatatttt gttttgtgtt atttttttct ttaacatccc taaaattttc cttacatgtt 1680
ttactagcca gatttttcct cctctcctga ctact 1715
<210> 7
<211> 433
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 7
Met Lys Val Trp Leu Ala Ser Leu Phe Leu Cys Ala Leu Val Val Lys
1 5 10 15
Asn Ser Glu Gly Gly Ser Val Leu Gly Ala Pro Asp Glu Ser Asn Cys
20 25 30
Gly Cys Gln Asn Gly Gly Val Cys Val Ser Tyr Lys Tyr Phe Ser Arg
35 40 45
Ile Arg Arg Cys Ser Cys Pro Arg Lys Phe Gln Gly Glu His Cys Glu
50 55 60
Ile Asp Ala Ser Lys Thr Cys Tyr His Gly Asn Gly Asp Ser Tyr Arg
65 70 75 80
Gly Lys Ala Asn Thr Asp Thr Lys Gly Arg Pro Cys Leu Ala Trp Asn
85 90 95
Ala Pro Ala Val Leu Gln Lys Pro Tyr Asn Ala His Arg Pro Asp Ala
100 105 110
Ile Ser Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn
115 120 125
Gln Lys Arg Pro Trp Cys Tyr Val Gln Ile Gly Leu Arg Gln Phe Val
130 135 140
Gln Glu Cys Met Val His Asp Cys Ser Leu Ser Lys Lys Pro Ser Ser
145 150 155 160
Ser Val Asp Gln Gln Gly Phe Gln Cys Gly Gln Lys Ala Leu Arg Pro
165 170 175
Arg Phe Lys Ile Val Gly Gly Glu Phe Thr Glu Val Glu Asn Gln Pro
180 185 190
Trp Phe Ala Ala Ile Tyr Gln Lys Asn Lys Gly Gly Ser Pro Pro Ser
195 200 205
Phe Lys Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ala Ser Ala
210 215 220
Ala His Cys Phe Ile Gln Leu Pro Lys Lys Glu Asn Tyr Val Val Tyr
225 230 235 240
Leu Gly Gln Ser Lys Glu Ser Ser Tyr Asn Pro Gly Glu Met Lys Phe
245 250 255
Glu Val Glu Gln Leu Ile Leu His Glu Tyr Tyr Arg Glu Asp Ser Leu
260 265 270
Ala Tyr His Asn Asp Ile Ala Leu Leu Lys Ile Arg Thr Ser Thr Gly
275 280 285
Gln Cys Ala Gln Pro Ser Arg Ser Ile Gln Thr Ile Cys Leu Pro Pro
290 295 300
Arg Phe Thr Asp Ala Pro Phe Gly Ser Asp Cys Glu Ile Thr Gly Phe
305 310 315 320
Gly Lys Glu Ser Glu Ser Asp Tyr Leu Tyr Pro Lys Asn Leu Lys Met
325 330 335
Ser Val Val Lys Leu Val Ser His Glu Gln Cys Met Gln Pro His Tyr
340 345 350
Tyr Gly Ser Glu Ile Asn Tyr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Glu
355 360 365
Trp Lys Thr Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile Cys
370 375 380
Asn Ile Glu Gly Arg Pro Thr Leu Ser Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg
385 390 395 400
Gly Cys Ala Glu Lys Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His
405 410 415
Phe Leu Asp Trp Ile Gln Ser His Ile Gly Glu Glu Lys Gly Leu Ala
420 425 430
Phe
<210> 8
<211> 379
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
gagtttactc cctatcagtg atagagaacg tatgaagagt ttactcccta tcagtgatag 60
agaacgtatg cagactttac tccctatcag tgatagagaa cgtataagga gtttactccc 120
tatcagtgat agagaacgta tgaccagttt actccctatc agtgatagag aacgtatcta 180
cagtttactc cctatcagtg atagagaacg tatatccagt ttactcccta tcagtgatag 240
agaacgtata agctttaggc gtgtacggtg ggcgcctata aaagcagagc tcgtttagtg 300
aaccgtcaga tcgcctggag caattccaca acacttttgt cttataccaa ctttccgtac 360
cacttcctac cctcgtaaa 379
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
agtcttctgg gcaggcttaa 20

Claims (28)

1.一种用于构建肝损伤小鼠模型的打靶载体，其特征在于，所述打靶载体上含有目标序列以及用于介导所述目标序列插入到小鼠基因组中目标位点的5’端同源臂序列和3’端同源臂序列；所述目标序列包括第一表达盒和位于所述第一表达盒下游的第二表达盒；
所述第一表达盒具有依次串联的如下元件：肝脏特异性启动子、四环素转录激活调控因子以及第一polyA；所述第二表达盒具有依次串联的如下元件：第二polyA、小鼠尿激酶原激活剂编码基因以及四环素诱导型启动子；
其中，所述肝脏特异性启动子从上游往下游方向驱动所述四环素转录激活调控因子表达，所述四环素诱导型启动子从下游往上游方向驱动所述小鼠尿激酶原激活剂编码基因表达。
2.根据权利要求1所述的打靶载体，其特征在于，所述第一表达盒还具有增强子序列；所述增强子序列位于所述肝脏特异性启动子的上游。
3.根据权利要求2所述的打靶载体，其特征在于，所述肝脏特异性启动子选自白蛋白启动子、载脂蛋白E启动子、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶启动子、α-I-抗胰蛋白酶启动子、甲状腺激素结合球蛋白启动子、α-甲胎蛋白启动子、醇脱氢酶启动子、IGF-II启动子、因子VIII启动子、HBV基础核心蛋白启动子、HBV前s2蛋白启动子、甲状腺素-结合球蛋白启动子、HCR-Ap0CII的杂合启动子、HCR-hAAT杂合启动子、与小鼠白蛋白基因的增强子元件结合的AAT启动子、低密度脂蛋白启动子、丙酮酸激酶启动子、卵磷脂-胆固醇酰基转移酶启动子、载脂蛋白H启动子、铁传递蛋白启动子、甲状腺素运载蛋白启动子、α-纤维蛋白原及β-纤维蛋白原的启动子、α-I-抗糜蛋白酶启动子、α-2-HS糖蛋白启动子、触珠蛋白启动子、血浆铜蓝蛋白启动子、血纤维蛋白溶酶原启动子、补体蛋白启动子、补体C3激活子的启动子、血液结合素启动子及α-I-酸性糖蛋白启动子中的任意一种。
4.根据权利要求2所述的打靶载体，其特征在于，所述肝脏特异性启动子为白蛋白启动子。
5.根据权利要求2所述的打靶载体，其特征在于，所述增强子序列为白蛋白增强子。
6.根据权利要求2所述的打靶载体，其特征在于，所述四环素转录激活调控因子选自tTA、rtTA和Tet-On 3G中的任意一种。
7.根据权利要求6所述的打靶载体，其特征在于，所述四环素转录激活调控因子为Tet-On 3G。
8.根据权利要求2所述的打靶载体，其特征在于，所述第一polyA选自HGH polyA、SV40polyA、BGH polyA、rbGlob polyA、SV40 late polyA和rbGlob polyA。
9.根据权利要求1-8任一项所述的打靶载体，其特征在于，在所述第二表达盒中，所述小鼠尿激酶原激活剂编码基因与所述四环素诱导型启动子之间还插入有Kozak序列。
10.根据权利要求9所述的打靶载体，其特征在于，所述四环素诱导型启动子选自TRE3G和TetO6中的任意一种。
11.根据权利要求10所述的打靶载体，其特征在于，所述四环素诱导型启动子为TRE3G。
12.根据权利要求9所述的打靶载体，其特征在于，所述小鼠尿激酶原激活剂编码基因所编码的小鼠尿激酶原激活剂的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
13.根据权利要求12所述的打靶载体，其特征在于，所述小鼠尿激酶原激活剂编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6中第1-1302位所示或为其互补序列。
14.根据权利要求9所述的打靶载体，其特征在于，所述第二polyA选自rabbit polyA、SV40 polyA、hGH polyA、BGH polyA、rbGlob polyA、SV40 late polyA 和rbGlob polyA。
15.根据权利要求1-8任一项所述的打靶载体，其特征在于，所述目标位点为Rosa26位点。
16.根据权利要求15所述的打靶载体，其特征在于，所述5’端同源臂序列如SEQ IDNO.4或其互补序列所示；所述3’端同源臂序列如SEQ ID NO.5或其互补序列所示。
17.一种用于构建肝损伤小鼠模型的核酸组合物，其特征在于，其包括权利要求1-16中任一项所述的打靶载体以及用于使小鼠基因组序列在所述目标位点发生双链断裂的CRISPR/Cas9组合物。
18.根据权利要求17所述的核酸组合物，其特征在于，所述CRISPR/Cas9组合物包括：Cas9蛋白和sgRNA。
19.根据权利要求18所述的核酸组合物，其特征在于，所述sgRNA的靶标序列如SEQ IDNO.9所示。
20.一种重组细胞，其特征在于，其含有权利要求1-16中任一项所述的打靶载体。
21.一种用于构建肝损伤小鼠模型的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1-16中任一项所述的打靶载体，或权利要求17-19中任一项所述的核酸组合物。
22.一种肝损伤小鼠模型的构建方法，其特征在于，使用权利要求1-16中任一项所述的打靶载体或权利要求17-19中任一项所述的核酸组合物在目标小鼠的基因组上的所述目标位点插入所述目标序列。
23.根据权利要求22所述的构建方法，其特征在于，所述目标小鼠为具有免疫缺陷的小鼠。
24.根据权利要求23所述的构建方法，其特征在于，所述方法包括：将所述核酸组合物注射至来自具有免疫缺陷的小鼠的受精卵中，再将所述受精卵移植至假孕雌鼠体内，从所述假孕雌鼠的后代中筛选出基因组中插入有所述目标序列的阳性小鼠，即为所述肝损伤小鼠模型。
25.一种肝损伤小鼠模型的繁育方法，其特征在于，其包括：将由权利要求22-24中任一项所述的构建方法得到的肝损伤小鼠模型与具有免疫缺陷的野生型小鼠进行交配。
26.由权利要求22-24中任一项所述的构建方法得到的肝损伤小鼠模型或由权利要求25所述的繁育方法得到的肝损伤小鼠模型在筛选用于治疗肝脏疾病的药物中的应用，所述应用以非疾病的诊断或治疗为目的。
27.根据权利要求26所述的应用，其特征在于，所述应用包括：对所述肝损伤小鼠模型植入人源肝脏细胞进行肝脏人源化，再将经肝脏人源化的所述肝损伤小鼠模型用于筛选药物。
28.根据权利要求26或27所述的应用，其特征在于，所述肝脏疾病选自病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬化、脂肪肝、药物性肝损伤和肝癌。
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