MXPA04003692A - Metodos para prevenir y tratar la infeccion por flavivirus en animales. - Google Patents

Abstract

La invencion provee metodos de prevenir y tratar infeccion por flavivirus en animales.

Description

MÉTODOS PARA PREVENIR Y TRATAR LA INFECCIÓN POR FLAVIVIRUS EN ANIMALES Campo de la Invención Esta invención se refiere a métodos de prevenir y tratar la infección por flavivirus en animales. Antecedentes de la Invención Los flavivirus son pequeños virus de ARN de filamento positivo, envueltos, que son de preocupación en muchos ambientes médicos y veterinarios alrededor del mundo. El virus del Nilo Occidental (WN) , por ejemplo, el cual es un miembro de la familia de los flavivirus, es el agente causante de la encefalitis WN, una' enfermedad viral portada por artrópodos, no contagiosa, infecciosa (Monath y colaboradores, "Flaviviruses", en Virology, Fields (editor), Raven-Lippincott, New York, 1996, pp . 961-1034). El virus ha sido encontrado en África, Asia Occidental, el Medio Oriente, la región mediterránea de Europa y, recientemente, en los Estados Unidos. Les mosquitos se infectan con el virus después de comer de pájaros silvestres infectados, y luego transmiten el virus mediante sus picaduras a seres humanos, pájaros y animales, tales como caballos, ovejas, ganado y cerdos.

En 1999, se encontró que 25 caballos en New York con síntomas neurológicos tenían infección por el virus WN. Estos caballos presentaron signos de ataxia, dificultad para caminar, se arrodillaban, se inclinaba su cabeza, sufrían de temblores musculares y la incapacidad para levantarse. De estos 25 caballos, nueve murieron o fueron sacrificados, y el virus, así como anti-cuerpos específicos al virus, fueron encontrados en muestras de tejidos de estos caballos. Los 16 caballos supervivientes se recuperaron todos, y también desarrollaron títulos de anti-cuerpos del virus WN. Desde entonces, se han confirmado números cada vez mayores de caballos infectados con el virus del Nilo Occidental. Las proteínas de flavivirus son producidas por traducción de un solo marco de lectura abierto, largo, para generar una poliproteina, que sufre una serie compleja de cortes proteolíticos post-traduccionales mediante una combinación de proteasas hospederas y virales para generar proteínas virales maduras (Amberg y colaboradores, J. Virol. 73:8083-8094; Rice, "Flaviviridae", en Virology, Fields (editor) , Raven-Lippincott, New York, 1995, vol . I, p. 937) . Las proteínas estructurales del virus están dispuestas en la poliproteina en orden C-prM-E, donde "C" es el casquillo proteico (cápsida), "prM" es un precursor de la proteína M (membrana) ligada a envolvente viral, y "E" es la proteína de envolvente. Estas proteínas están presentes en la región N-terminal de la poliproteina, mientras que las proteínas no estructurales (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, y NS5) están ubicadas en la región C-terminal de la poliproteina. Compendio de la Invención La invención provee métodos de prevenir o tratar infección por flavivirus (v.gr., infección por el virus del Nilo Occidental) en mamíferos no humanos (v.gr., caballos), que implican administrar a los mamíferos no humanos flavivirus quiméricos. La invención también provee el uso de flavivirus quiméricos en la preparación de medicamentos para uso en tales métodos. Los flavivirus quiméricos pueden incluir, por ejemplo, la cápsida y proteínas no estructurales de un primer flavivirus (v.gr., un virus de la fiebre amarilla, tal como un virus de la fiebre amarilla derivado de la cepa 17D) y el prM y las proteínas de envolvente de un segundo flavivirus (v.gr., virus del Nilo Occidental) . La invención provee diversas ventajas. Por ejemplo, como se discute mas adelante, los caballos tratados usando los métodos de la invención no presentan efectos secundarios adversos debido a la vacunación y sin embargo están protegidos contra pruebas de inmunidad al virus sustanciales. De esta manera, los métodos de la invención son altamente efectivos para proteger caballos contra infección por flavivirus, v.gr., virus del Nilo Occidental. En adición, haciendo referencia específicamente a la quimera del virus de la fiebre amarilla/virus del Nilo Occidental descrita en la presente, el rango de hospederos del virus de la fiebre amarilla es muy específico, estando limitado a primates. De esta manera, la eficacia de la quimera del virus de la fiebre amarilla/virus del Nilo Occidental para proteger caballos contra pruebas de inmunidad por el virus del Nilo Occidental fue sorprendente, pues los caballos solamente están relacionados con los primates de manera distante, asi como están fuera del rango de hospederos naturales del virus de la fiebre amarilla. Además, debido a que los virus de vacuna usados en la invención son quiméricos, consistentes en material de mas de un virus diferente, se eliminan las posibilidades de reversión al virus tipo silvestre . Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y las reivindicaciones . Descripción Detallada La invención provee métodos de prevenir y tratar infección por flavivirus (v.gr., virus del Nilo Occidental (WN) ) en animales, tales como caballos. Los métodos de la invención implican vacunación de animales que están en riesgo de desarrollar o tienen infección por flavivirus con un flavivirus quimérico vivo, atenuado. Estos virus consisten en un flavivirus (es decir, un flavivirus de columna vertebral) en el cual una proteína estructural (o proteínas) han sido reemplazadas con una proteína estructural (o proteínas) correspondientes de un segundo flavivirus, al cual se busca inmunidad. De preferencia, las quimeras consisten en una flavivirus de columna vertebral en el cual las proteínas prM y M han sido reemplazadas con las proteínas prM y E del segundo flavivirus.

Los virus quiméricos que son usados en la invención pueden consistir en cualquier combinación de virus, con la condición de que, como se mencionó antes, el virus al cual se desea inmunidad sea la fuente de la(s) proteína (s) estructu-ral (es) insertada (s) . Por ejemplo, para vacunar a un animal, tal como un caballo, contra infección por el virus del Nilo Occidental, puede usarse un flavivirus quimérico que consiste en una columna vertebral de flavivirus, tal como del virus de la fiebre amarilla (YF) , en la cual se insertan proteínas estructurales del virus del Nilo Occidental (v.gr., proteínas prM y E) . En esta quimera, las proteínas YF prM y E son reemplazadas por las de WN. De manera similar, si se desea inmunidad contra el virus de la encefalitis japonesa (JE), entonces pueden insertarse las proteínas prM y E del virus JE en un flavivirus de columna vertebral, tal como el virus de la fiebre amarilla, en lugar de las proteínas de columna vertebral correspondientes. Otros flavivirus que pueden ocasionar enfermedades en caballos, y para las cuales pueden usarse virus quiméricos para inducir protección, incluyen los virus de Kunjin, encefalitis de Murray Valley, y la enfermedad de Louping. En adición a caballos, los animales que pueden ser tratados usando los métodos de la invención incluyen, por ejemplo, cerdos, ovejas, ganado, animales domésticos, tales como gatos y perros, y pájaros domésticos. Como ejemplos específicos de vacunaciones no de caballo, las ovejas pueden ser tratadas usando un virus quimérico que incluye las proteínas estructurales insertadas del virus de la encefalitis japonesa. De esta manera, ejemplos de los flavivirus que pueden ser usados en la invención, como fuentes de virus de columna vertebral o insertos de proteínas estructurales, incluyen flavivirus portados por mosquitos, tales como los virus de la encefalitis japonesa, del dengue (serotipos 1-4), de la fiebre amarilla, de la encefalitis de Murray Valley, de la encefalitis de St. Louis, del Nilo Occidental, Kunjin, de la encefalitis de Rocío, Wesselsbron e Ilheus; flavivirus portados por garrapatas, tales como los virus de la encefalitis europea central, la encefalitis siberiana, la encefalitis rusa de primavera-verano, de la enfermedad de los bosques de Kyasanur, la fiebre hemorrági-ca de' Omsk, la enfermedad de Louping, Powassan, Negishi, Absettarov, Hansalova, Apoi e Hypr; así como virus del género Hepacivirus (v.gr., virus de la hepatitis C) . Virus adicionales que pueden ser usados como fuente de las proteínas estructurales insertadas incluyen virus del género Pestivirus (v.gr., virus de la diarrea de bovinos) , y otros virus, tales como los virus Lassa, Ébola y Marburg. Como se señaló antes, de preferencia, el virus consiste en una columna vertebral del virus de la fiebre amarilla conteniendo un inserto del virus del Nilo Occidental.

Detalles para hacer virus quiméricos que pueden usarse en la invención son provistos, por ejemplo, en las solicitudes de patente US 09/007,664; 09/121,587; y 09/452,638; las solicitudes internacionales PCT/US98/03894 y PCT/USOO/32821 ; y Chambers y colaboradores, J. Virol. 73:3095-3101, 1999, todas las cuales son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad. Las vacunas de la invención pueden ser administradas en cantidades, y usando métodos, que pueden ser fácilmente determinados por técnicos en esta materia. Las vacunas pueden ser administradas y formuladas, por ejemplo, como un fluido cosechado de cultivos celulares infectados con el virus quimérico apropiado. El virus quimérico vivo, atenuado, es formulado como una solución acuosa estéril conteniendo entre 102 y 106, v.gr., entre 106 y 101, unidades infecciosas (v.gr., unidades formadoras de placa (pfu) o dosis infecciosas de cultivo de tejidos) en un volumen de dosis de 0.1 a 1.0 mi, para administrarse, por ejemplo, por las rutas sub-cutánea, intramuscular, o intradérmi-ca. En adición, puede seleccionarse una ruta mucosal, tal como una ruta oral. La sección de una cantidad apropiada de quimera por administrarse puede ser determinada por los técnicos en la materia, y esta cantidad puede variar debido a numerosos factores, v.gr., el tamaño, el tipo y la salud general del animal al cual va a administrarse la quimera. Como se señaló antes, las vacunas pueden ser administradas como agentes profilácticos primarios a un animal que está en riesgo de infección por flavivirus. Las vacunas también pueden ser usadas como agentes secundarios para tratar a animales infectados por flavivirus estimulando una respuesta inmune contra el flavivirus que infecta. Aunque no se requiere, también pueden usarse coadyuvantes para acrecentar la inmunogenicidad de las vacunas quiméricas. La selección de coadyuvantes apropiados puede ser llevada a cabo fácilmente por los técnicos en la materia . Resultados Experimentales La seguridad y la eficacia de ChimeriVax-WN fue evaluada en caballos. La eficacia fue definida en términos de respuestas inmunes humorales y protección contra pruebas de inmunidad . Animales Se usaron 11 caballos en este estudio, como se resume mas adelante en la Tabla 1. Los caballos fueron alojados en un edificio de contención ABSL3 por la duración del estudio, y se alimentaron con paja de alfalfa y granos mixtos.

Tabla 1. Sumario de Características de Animales y Tratamientos Inmunización Cuatro caballos (EQ1, EQ2, EQ3 y EQ4) fueron inmuniza-dos mediante dos inyecciones, con tres semanas de separación, del virus ChimeriVax-WN . En cada inmunización, se inoculó por vía subcutánea una dosis de lO7 unidades formadoras de placa (pfu) del virus en 1 mi, sobre el hombro izquierdo. Se analizó la viremia en los caballos vacunados usando un ensaye estándar de placa de WN. Las muestras fueron probadas por duplicado, limpias y en una dilución 1:5. Se encontró que aunque los niveles de viremia eran sumamente bajos del dia 0 hasta el 7, un pico de viremia era detectable los días 3 y 4. Los niveles de anti-cuerpos fueron medidos en muestras tomadas de cada caballo después de la vacunación, como se indica en la Tabla 2, usando una prueba de neutralización de reducción de placas (PRNT) . En suma, dos de los caballos desarrollaron un titulo de reducción al 80% de 10 dentro de dos semanas a partir de la inmunización primaria, y los cuatro caballos tenían un título de entre 10 y 20 a las cuatro semanas (una semana después de la segunda inmunización) . Validación de un Modelo de Prueba de Inmunidad Equina La prueba de inmunidad por mosquitos de caballos con el virus WN habitualmente da como resultado viremia, pero la enfermedad clínica es rara. De esta manera, para permitir la determinación de la inmunidad protectora al virus WN, se desarrolló un modelo apropiado de prueba de inmunidad. El virus de prueba de inmunidad usado en estos estudios fue el WNV NY99 (4132), el cual fue aislado originalmente de un cuervo y había sido pasado una vez en células Vero y una vez en células C636.

Debido a las reacciones de hiper-sensibilidad observadas después de inyecciones de vacunación de refuerzo, se pasó el virus un tiempo adicional en células BHK-21, se lavó con inoculo conteniendo FBS después de adsorción, y se prepararon materiales usando suero de caballo WNV/SLE sero-negativo al 20%. Esta preparación libre de FBS fue diluida en PBS y usada para las pruebas de inmunidad de los caballos EQ1, EQ2, EQ4, EQ8, EQ9, EQ10 y EQ11. La mayoría de los caballos fue sometida a prueba de inmunidad mediante inoculación intratecal. Para este procedimiento, se anestesiaron con una combinación de xilazina y cetamina y se llevó a cabo una incisión cisternal bajo condiciones asépticas. Dos mi de CSF fueron retirados, y se inyectó 1.0 mi de virus. En todos los casos, la recuperación de este procedimiento fue sin incidencias. Los resultados de los estudios de desarrollo de prueba de inmunidad son resumidos como sigue. Caballo EQ5 Este caballo fue inoculado con 104 pfu de NV por la ruta intratecal. El caballo pareció estar normal ese día y el siguiente, pero se encontró renuente y de pobre respuesta la mañana del día 2. Se sacrificó y sometió a necropsia, y el virus no fue recuperado de diversas áreas del cerebro. Este animal puede haber caído durante la noche anterior y haberse lesionado seriamente la columna vertebral, lo cual no se examinó durante la necropsia. Parece que su muerte no estuvo relacionada con infección por WNV. Caballo EQ6 Este caballo fue inoculado con 104 pfu de WNV por la ruta sub-cutánea; cuatro días después, se llevó a cabo una incisión cisternal con la idea de facilitar el paso del virus a través de la barrera sanguínea del cerebro. En la mañana del día 10, estaba notoriamente ansioso y no normal, pero hacia la noche de ese día regresó a la normalidad. No se observaron otros signos clínicos durante las seis semanas siguientes a la prueba de inmunidad. Muestras de suero recolectadas dos veces diariamente por los primeros 13 días después de la inoculación fueron sometidas a ensayes de virus en células Vero; no se recuperó virus de ninguna muestra. Se llevaron a cabo ensayes PKNT usando suero recolectado el día de la inoculación y tres semanas después. Los títulos de neutralización al 80% (y 90%) en estas muestras fueron de 10 (<10) y 40 (40), respectivamente. Se habían realizado previamente pruebas que dieron resultados serológicamente negativos, antes de usarse, de modo que el título 1:10 al 80% el día de la inoculación fue sorprendente. Este animal puede haber tenido un caso tenue de WN. Caballo EQ7 Este caballo fue inoculado con 104 pfu de WNV por la ruta intratecal; retro-titulación del inoculo reveló que la dosis fue de 6 x 103 pfu. Estuvieron ausentes los signos clínicos de la enfermedad hasta el día 20, cuando se observó que el animal estaba ansioso y nervioso. Durante los dos días siguientes, su condición empeoró con una ansiedad incrementada, temblores en cabeza y labios, fasciculación y parecía de las patas traseras. Sin embargo, hacia la noche del día 23, parecía estarse recuperando y los signos clínicos se redujeron en severidad de manera considerable. Se sacrificó el día 24 para permitir confirmar que la enfermedad de hecho se debía al virus WN. El examen histo-patológico del cerebro reveló una encefalitis difusa, esparcida. Las muestras de suero recolectadas dos veces al día de los días 1 a 9 fueron ensayadas respecto del virus por formación de placas sobre células Vero; el virus no fue aislado de ninguna de las muestras. Tampoco se pudo aislar virus de CSF ni de homogenados del cerebro, cerebelo y el tallo cerebral recolectados durante la necropsia (tejidos ensayados como suspensiones al 10% y disoluciones -1 y -2) . Los títulos PRNT (80 o 90%) de sueros recolectados los días 0, 7, 14 y 23 fueron de <10, <10, 160 y 160. Caballos EQ8 y EQ9 Estos caballos fueron sometidos a prueba de inmunidad mediante inoculación intratecal de 105 pfu de WNV; la retro-titulación reveló que la dosis administrada era de 2 x 105 pfu. Ambos animales permanecieron clínicamente normales por 7 a 7.5 días, luego desarrollaron una enfermedad progresivamente severa (descripciones clínicas en registros de animales individuales) . El curso de la enfermedad en los dos caballos fue casi idéntico y ambos fueron sacrificados y sometidos a necropsia el día 9. El examen histo-patológico reveló encefalitis severa en ambos caballos. Los sueros recolectados dos veces diariamente después de la inoculación fueron ensayados respecto de producción de placas en células Vero. Los títulos de viremia (log10 pfu/ml) determinados fueron: Las muestras de CSF, cerebro, cerebelo, tallo cerebral y cordón cervical craneal recolectadas en la necropsia fueron ensayadas respecto del virus en células Vero-. EQ8 tenía una traza (1.5 log10 pfu/g) de virus en el tallo cerebral, y EQ8 tenía una pequeña cantidad de virus (1.3 log13 pfu/g) en el cerebelo; todas las demás muestras fueron negativas. Ambos animales tenían títulos PRNT de <10 en el momento de la prueba de inmunidad. En el momento de la eutanasia, EQ8 y EQ9 tuvieron títulos PRNT (90%) de 160 y <10, respectivamente. Prueba de Inmunidad de Caballos Vacunados y Controles Los caballos vacunados EQl, EQ2 y EQ4 fueron sometidos a prueba de inmunidad exactamente 24 semanas después de la inmunización primaria. Dos caballos de control adicionales fueron sometidos a prueba de inmunidad de manera simultánea. Todas estas pruebas de inmunidad consistieron en inoculación intratecal de 1.0 mi conteniendo 105 pfu de WVN (preparación libre de FBS diluida en PBS) . La retro-titulación del inoculo indicó que los caballos recibieron aproximadamente 125,000 pfu de virus . Los dos caballos de control (EQ10 y EQ11) desarrollaron una severa enfermedad clínica, comenzando a los 7 a 8 días después de la inoculación del virus y fueron sacrificados 8.5 y 10 días después de la prueba de inmunidad, respectivamente. En el momento de la eutanasia, sus títulos de anti-cuerpos PRNT fueron de 1:40 y <10, respectivamente. El suero recolectado a intervalos de medio día entre el tiempo de la prueba de inmunidad y la eutanasia fue ensayado por producción de placas en células Vero; los títulos de viremia (loglc pfu/ml de suero) son mostrados en las siguientes tablas (muestras negativas de EQ11 tomadas después del día 8 no son mostradas) .

Muestras de CSF, cerebro, cerebelo y tallo cerebral recolectadas en la necropsia también fueron ensayadas por producción de placas en células Vero. El virus no fue aislado de ninguna muestra de CSF. Se aislaron trazas de virus (1-2 placas por pozo inoculado con 0.1 mi de suspensión al 10%) de las tres áreas del cerebro el caballo EQ10, y del tallo cerebral solamente del caballo EQ11. El examen histo-patológico de los cerebros de EQ10 y EQ11 reveló una encefalitis difundida. En marcado contraste con los dos caballos de control, los caballos vacunados EQl, EQ2, y EQ4 no mostraron evidencia alguna de enfermedad clínica en las cuatro semanas posteriores a la prueba de inmunidad. Además, el virus no fue aislado de ninguna de las muestras de suero recolectadas dos veces diariamente de estos animales durante los primeros 10 días después de la prueba de inmunidad, ni de muestras de cerebro, cerebelo, tallo cerebral o CSF recolectadas en la necropsia el día 28. El examen histo-patológico de sus cerebros no reveló lesiones, salvo unos cuantos hallazgos incidentales no asociados con infección por el virus WN. Los anti-cuerpos al virus WN fueron ensayados en CSF recolectado en el momento de la inoculación del virus y el momento de la eutanasia (día 28 para EQl, EQ2 y EQ4; día 8.5 para EQ10, y día 10 para EQ11) . Las muestras fueron ensayadas a disoluciones de 1:5, 10 y 20. Las muestras recolectadas en la necropsia del caballo EQl mostraron una reducción del 87% en el conteo de placas a 1:5, y la muestra post-mortem de EQ4 mostró una reducción del 98% a 1:5. Todas las demás muestras tuvieron títulos de <5 a una reducción del 80%. Respuestas Serológicas a la Vacunación Las muestras de suero fueron recolectadas de los cuatro caballos inmovilizados semanalmente por la duración de su ejercicio y almacenadas por duplicado. Los títulos de anticuerpos de neutralización fueron determinados en un sub-conjunto de estas muestras, usando una prueba estándar de neutralización de reducción de placas en células Vero. Solamente algunos de los ensayes fueron conducidos usando suero humano al 8% en el inoculo del virus, como se indica en la Tabla 2.

Tabla 2. Resultados PRNT para Caballos Inmunizados con ChimeriVax-WN Fecha de Se ana EQ1 EQ1 EQ2 EQ2 EQ3 EQ3 EQ4 EQ Mue. t ra 2n.s gye* 80% 90% 80% 90% 80% 90% 80% 90% 3/9 0 Varias <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 3/16 1 11/13- 10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 3/23 2 10/27- 10 10 10 10 <10 <10 <10 <10 3/30 3 10/27- 10 <10 10 <10 <10 <10 <10 <10 4/6 4 11/02- 20 10 40 40 10 10 <10 <10 4/6 4 10/27- 20 10 20 10 10 10 10 <10 4/6 4 11/13 20 20 20 10 10 10 10 <10 4/13 5 10/27- 20 20 20 20 20 <10 <10 <10 /4 8 10/27- 20 10 10 <10 <10 <10 <10 <10 /4 8 11/13- 20 20 10 <10 <10 <10 <10 <10 /18 10 10/27- 10 10 10 <10 <10 <10 <10 <10 6/1 12 10/27- 10 10 20 10 <10 <10 <10 <10 6/1 12 11/13- 20 <10 10 <10 <10 <10 <10 <10 6/29 16 10/27- 10 <10 10 <10 — — <10 <10 6/29 16 11/13- 10 <10 <10 <10 — — <10 <10 7/27 20 11/13- 10 <10 10 <10 — — <10 <10 8/24 24 10/4 + 20 20 10 10 — — <10 <10 8/24 24 11/02- 10 <10 <10 <10 — — <10 <10 8/24 24 11/13- 10 10 <10 <10 — — <10 <10 8/31 25 10/4 + 40 40 20 20 — — 20 20 8/31 25 11/02- 20 10 10 10 — — 20 10 9/7 26 10/4 + >32C =320 =320 =320 — =320 >320 9/7 26 11/02- 320 160 320 160 -- 640 640 9/7 26 11/13- 320 320 640 320 — — 1280 640 9/14 27 10/4- =320 =320 ¿320 =320 -- — =320 =320 9/14 27 11/02- 160 160 320 320 — — 640 320 9/21 28 10/4 + 2320 =320 =320 2320 — — k320 >320 9/21 28 11/02- 160 160 320 320 — — 320 160 9/21 28 11/13- 320 160 320 160 — — 640 320 *indica con (+) o sin (+) el uso de factor de suero lábil

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES 1. El uso de un flavivirus quimérico en la preparación de un medicamento para prevenir o tratar la infección por flavivirus en un mamífero no humano.
2. 2. El uso de la reivindicación 1, donde dicho mamífero no humano es un caballo.
3. 3. El uso de la reivindicación 1, donde dicha infección por flavivirus es infección por el virus del Nilo Occidental .
4. 4. El uso de la reivindicación 1, donde dicho flavivirus quimérico comprende la cápsida y las proteínas no estructurales de un primer flavivirus y las proteínas prM y de envolvente de un segundo flavivirus.
5. 5. El uso de la reivindicación 4, donde dicho primer flavivirus es un virus de la fiebre amarilla.
6. 6. El uso de la reivindicación 5, donde dicho virus de la fiebre amarilla es derivado de la cepa 17D.
7. 7. El uso de la reivindicación 4, donde dicho segundo flavivirus es un virus del Nilo Occidental.
8. 8. El uso de un flavivirus quimérico que comprende la cápsida y las proteínas no estructurales de un virus de la fiebre amarilla y las proteínas prM y de envolvente de un virus del Nilo Occidental en la preparación de un medicamento para prevenir la infección por el virus del Nilo Occidental en un caballo.