PT1441761E - Métodos para prevenir e tratar a infecção por flavivírus em animais. - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Métodos para prevenir e tratar a infecção por flavivírus em animais"

Campo da invenção A presente invenção refere-se a métodos para prevenir e tratar a infecção por flavivírus em animais.

Antecedentes da invenção

Os flavivírus são vírus de ARN de cadeia positiva pequenos, com envelope, que são uma preocupação em muitas instalações médicas e veterinárias em todo o mundo. 0 vírus do Nilo ocidental (WN), por exemplo, que é um membro da família dos flavivírus, é o agente causal da encefalite WN uma doença virai infecciosa, não contagiosa, transmitida por artrópodes (Monath et al. "Flaviviruses," In virology, Fields (ed.), Raven-Lippincott, Nova Iorque, 1996, pp. 961-1034). O vírus foi encontrado em África, Ásia ocidental e Médio Oriente, região mediterrânica da Europa e, recentemente, nos Estados Unidos. Os mosquitos ficam infectados com o vírus após se alimentarem em pássaros selvagens infectados e em seguida transmitem o vírus através de picadas, para seres humanos, pássaros e animais, tais como cavalos, ovelhas, gado e porcos.

Em 1999, verificou-se em vinte e cinco cavalos em Nova Iorque com sintomas neurológicos que tinham infecção pelo vírus WN. Estes cavalos apresentavam sinais de ataxia, dificuldade em andar, dobra das articulações para a frente, inclinação da cabeça, tremores musculares e incapacidade de se levantar. Destes vinte e cinco cavalos, nove morreram ou foram eutanizados e encontrou-se vírus, bem como anticorpos específicos para o vírus, em amostras de tecido destes cavalos. Os dezasseis cavalos que sobreviveram recuperaram todos e também desenvolveram títulos de anticorpos contra o vírus WN. Desde essa altura, foram confirmados números crescentes de cavalos infectados com o vírus do Nilo ocidental. 2 ΕΡ 1 441 761/ΡΤ

As proteínas de flavivírus são produzidas por tradução de uma única fase de leitura aberta, longa, para produzir uma poliproteína que sofre uma série complexa de clivagens proteolíticas pós-tradução por uma combinação de proteases do hospedeiro e virais, para produzir proteínas virais maduras (Amberg et al., J. Virol. 73: 8083-8094,1999; Rice, "Flaviviridae, "In Virology, Fields (ed.), Raven-Lippincott, Nova Iorque, 1995, Volume I, p. 937). As proteínas estruturais do vírus estão arranjadas na poliproteína pela ordem C-prM-E, em que "C" é cápside, "prM" é um precursor das proteínas M (membrana) ligadas ao envelope virai e "E" é a proteína de envelope. Estas proteínas estão presentes na região de terminal-N da poliproteína, enquanto que as proteínas não estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5) estão localizadas na região de terminal-C da poliproteína.

Monath et al. (Current Drug Targets- Infectious Diseases (2001) 1:37-50) fazem uma revisão dos efeitos da encefalite do Nilo ocidental e discutem vacinas quiméricas vivas, atenuadas, de febre amarela-vírus do Nilo ocidental. Arroyo et al. (Trends in Molecular Medicine (2001) 7:350-354) referem a manipulação de febre amarela 17D para induzir uma resposta imunitária protectora contra vírus da mesma família. Em WO 98/37911 descrevem-se vírus quiméricos vivos, atenuados compreendendo vírus de febre amarela e sequências de envelope virai de um flavivírus diferente.

Sumário da invenção A invenção proporciona métodos para prevenir ou tratar a infecção por flavivírus (e.g., infecção pelo vírus do Nilo ocidental) em cavalos, que envolve a administração a cavalos de flavivírus quiméricos. A invenção também proporciona a utilização de flavivírus quiméricos na preparação de medicamentos para utilização nestes métodos. Os flavivírus quiméricos podem incluir, por exemplo, as proteínas da cápside e proteínas não estruturais de um primeiro flavivírus (e.g., um vírus de febre amarela, tal como um vírus de febre amarela derivado da estirpe 17D) e as proteínas prM e de envelope de um segundo flavivírus (e.g., vírus do Nilo ocidental). 3 ΕΡ 1 441 761/ΡΤ A invenção proporciona várias vantagens. Por exemplo, como discutido a seguir, os cavalos tratados utilizando os métodos da invenção não apresentam os efeitos secundários adversos devidos à vacinação e estão no entanto protegidos contra um provocação substancial com virus. Assim, os métodos da invenção são altamente eficazes em proteger os cavalos contra os flavivirus, e.g. infecção pelo virus do Nilo ocidental. Além disso, referindo especificamente à quimera de virus de febre amarela/Nilo ocidental aqui descrita, a gama de hospedeiros do virus de febre amarela é muito específica, limitando-se aos primatas. Assim, a eficácia da quimera de virus de febre amarela/Nilo ocidental em proteger os cavalos contra uma provocação com virus de Nilo ocidental foi surpreendente, uma vez que os cavalos que estão apenas distantemente relacionados com os primatas, estão bem fora da gama de hospedeiros naturais para o virus de febre amarela. Além disso, uma vez que os virus de vacina utilizados na invenção são quiméricos, consistindo de material de mais do que um virus diferente, as hipóteses de reversão para o vírus do tipo selvagem são eliminadas.

Outras características e vantagens da invenção serão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada e das reivindicações.

Descrição detalhada A invenção proporciona métodos para prevenir e tratar infecção por flavivirus (e.g. pelo vírus do Nilo Ocidental (WN) ) em cavalos. Os métodos da invenção envolvem vacinação dos cavalos que estão em risco de desenvolver ou ter infecção por flavivirus com um flavivirus quimérico vivo, atenuado. Estes vírus consistem num flavivirus (i.e., um esqueleto de flavivirus) em que uma proteína estrutural (ou proteínas) foi substituída por uma proteína estrutural correspondente (ou proteínas) de um segundo flavivirus, para o qual se pretende obter imunidade. De preferência, as quimeras consistem num esqueleto de flavivirus em que as proteínas prM e E foram substituídas pelas proteínas prM e E do segundo flavivirus. 4 ΕΡ 1 441 761/ΡΤ

Os vírus quiméricos que são utilizados na invenção podem consistir em qualquer combinação de vírus, desde que, como referido acima, o vírus para o qual se pretende obter imunidade seja a fonte da(s) proteína(s) estrutural(ais) inserida(s). Por exemplo, para vacinar um cavalo contra a infecção pelo vírus do Nilo ocidental, pode-se utilizar um flavivírus quimérico consistindo num esqueleto de flavivírus, tal como o vírus da febre amarela (YF), no qual são inseridas proteínas estruturais do vírus do Nilo ocidental (e.g., proteínas prM e E). Nesta quimera, as proteínas prM e E de YF são substituídas pelas de WN. De igual modo, quando se pretende obter imunidade contra o vírus de encefalite japonesa (JE), as proteínas prM e E do vírus JE podem ser inseridas no esqueleto de flavivírus, tal como um vírus de febre amarela, no lugar das proteínas correspondentes do esqueleto. Outros flavivírus que provocam doença em cavalos e para os quais se podem utilizar vírus quiméricos para induzir protecção, incluem vírus de Kunjin, de encefalite de Murray Valley e vírus de Louping ill.

Assim, exemplos de flavivírus que podem ser utilizados na invenção como fontes de vírus esqueleto ou inserções de proteínas estruturais incluem flavivírus transmitidos por mosquitos, tais como vírus de encefalite japonesa, Dengue (serotipos 1-4), febre amarela, encefalite de Murray Valley, encefalite de St. Louis, Nilo ocidental, Kunjin, encefalite de Rocio, Wesselsbron e Ilhéus; flavivírus transmitidos por carraças, tais como vírus de encefalite da Europa central, encefalite siberiana, encefalite de Primavera-Verão russa, doença da floresta de Kyasanur, febre hemorrágica de Omsk, Louping ill, Powassan, Negishi, Absettarov, Hansalova, Apoi e Hypr; bem como vírus do género Hepacivírus (e.g., vírus de hepatite C) . Outros vírus que podem ser utilizados como fonte das proteínas estruturais inseridas incluem vírus do género Pestivírus (e.g., vírus de diarreia bovina) e outros vírus, tais como vírus de Lassa, Ebola e Marburg. Como referido acima, de preferência o vírus consiste num esqueleto do virus de febre amarela contendo uma inserção do vírus do Nilo ocidental.

Os detalhes para produzir vírus quiméricos que podem ser utilizados na invenção são proporcionados, por exemplo, nos 5 ΕΡ 1 441 761/ΡΤ pedidos de patente U.S. com os números de série 09/007664, 09/121587 e 09/452638; pedidos internacionais PCT/US98/03894 e PCT/US00/32821; e Chambers et al., J. Virol. 73: 3095-3101, 1999 .

As vacinas da invenção podem ser administradas em quantidades, e utilizando métodos, que podem ser facilmente determinados pelas pessoas competentes na matéria. As vacinas podem ser administradas e formuladas, por exemplo, como um fluido recolhido a partir de culturas de células infectadas com os virus quiméricos adequados. O vírus quimérico vivo, atenuado, é formulado como uma solução aquosa estéril contendo entre 102 e 108, e.g., entre 106 e 107 unidades infecciosas (e.g., unidades formadoras de placas (pfu) ou doses infecciosas de cultura de tecidos) num volume de dose de 0,1 a 1,0 ml, para ser administrado, por exemplo, pelas vias subcutânea, intramuscular ou intradérmica. Adicionalmente, pode-se seleccionar uma via mucosa, tal como uma via oral. A selecção de uma quantidade adequada de quimera para administrar pode ser determinada pelos peritos na arte e esta quantidade pode variar devido a vários factores, e.g., o tamanho, tipo e saúde geral do animal a quem a quimera será administrada.

Como referido acima, as vacinas podem ser administradas como agentes profiláticos primários a um cavalo que está em risco de infecção por flavivírus. As vacinas também podem ser utilizadas como agentes secundários para tratar cavalos infectados com flavivírus, estimulando uma resposta imunitária contra o flavivírus infectante. Além disso, embora não seja necessário, podem-se utilizar adjuvantes para aumentar a imunogenicidade das vacinas quiméricas. A selecção de adjuvantes adequados pode ser facilmente realizada pelos peritos na arte.

Resultados experimentais A segurança e eficácia do Chimerivax-WN foi avaliada em cavalos. A eficácia foi definida em termos de respostas imunitárias humorais e protecção contra uma provocação. 6 ΕΡ 1 441 761/ΡΤ

Animais

Utilizaram-se onze cavalos neste estudo, como resumido a seguir na Tabela 1. Os cavalos foram alojados num edifício de confinamento ABSL3 pela duração do estudo e foram alimentados com feno de alfalfa e mistura de grãos.

Tabela 1. Resumo das características e tratamentos dos animais

Cavalo Sexo Idade (anos) Tratamento Comentários EQ1 F 8 Vacinado duas vezes Totalmente protegido contra uma provocação EQ2 F 14 Vacinado duas vezes Totalmente protegido contra uma provocação EQ3 F 9 Vacinado duas vezes Eutanizado antes duma provocação devido a laminite EQ4 CM 16 Vacinado duas vezes Totalmente protegido contra uma provocação EQ5 F 8 Modelo de provocação desenvolvimento de 104 pfu IT Eutanizado dois dias após uma provocação; não desenvolveu doença relacionada com WN EQ6 F 9 Modelo de provocação desenvolvimento de 104 pfu SC; punção de CSF no dia 4 Doença relacionada com WN leve com recuperação possível EQ7 F 10 Modelo de provocação desenvolvimento de 104 pfu IT Doença clínica 20-22 dias após inoculação; eutanizado no dia 24; encefalite confirmada EQ8 F 8 Modelo de provocação desenvolvimento de 105 pfu IT Doença clínica grave começando no dia 7; encefalite confirmada EQ9 CM 6 Modelo de provocação desenvolvimento de 105 pfu IT Doença clínica grave começando no dia 8; encefalite confirmada EQ10 CM 8 Controlo de provocação 105 pfu IT Doença clínica grave começando no dia 8; encefalite confirmada EQ11 CM 11 Controlo de provocação 105 pfu IT Doença clínica grave começando no dia 8; encefalite confirmada

Imunização

Imunizaram-se quatro cavalos (EQ1, EQ2, EQ3 e EQ4) com duas injecções, separadas de três semanas, de virus ChimeriVax-WN. Em cada imunização, inoculou-se 7 ΕΡ 1 441 761/ΡΤ subcutaneamente no ombro esquerdo uma dose de 107 unidades formadoras de placas (pfu) de vírus em 1 ml. A viremia nos cavalos vacinados foi analisada utilizando um teste convencional de placas de WN. As amostras foram testadas em duplicado, sem diluição e com diluição 1:5. Verificámos que embora os níveis de viremia fossem muito baixos do dia 0 ao dia 7, era detectável um pico de viremia nos dias 3 e 4.

Os níveis de anticorpo foram medidos em amostras recolhidas de cada cavalo após vacinação, tal como é indicado na Tabela 2, utilizando um teste de neutralização de redução de placas (PRNT). Em resumo, dois dos cavalos desenvolveram um título de redução de 80% de 10 no espaço de duas semanas após a imunização primária e todos os quatro cavalos tinham um título entre 10 e 20 às quatro semanas (uma semana após a segunda imunização).

Validação de um modelo de provocação de equino

Uma provocação de cavalos com WN transmitida por mosquitos normalmente resulta em viremia, mas a doença clínica é rara. Assim, para permitir a determinação da imunidade protectora contra WNV, desenvolveu-se um modelo adequado de provocação. O vírus de provocação utilizado nestes estudos era WNV NY99 (4132), que foi originalmente isolado de um corvo e tinha sido passado uma vez em células Vero e uma vez em células C636. Devido às reacções de hipersensibilidade observadas após injecções de vacina de reforço, passámos o vírus mais uma vez em células BHK-21, removemos por lavagem o inoculo contendo FBS após adsorção e preparámos soluções mãe utilizando soro de cavalo seronegativo WNV/SLE a 20%. Esta preparação isenta de FBS foi diluída em PBS e utilizada para as provocações dos cavalos EQ1, EQ2, EQ4, EQ8, EQ9, EQ10 e EQ11. A maioria dos cavalos foi confrontada por inoculação intratecal. Para este procedimento, eles foram anestesiados com uma combinação de xilazina e cetamina e fez-se uma punção da cisterna sob condições assépticas. Retiraram-se 2 ml de 8 ΕΡ 1 441 761/ΡΤ CSF e injectou-se 1,0 ml de vírus. Em todos o caso, a recuperação do procedimento era tranquila.

Os resultados de estudos de desenvolvimento de provocação são resumidos como se segue.

Cavalo EQ5

Este cavalo foi inoculado com 104 pfu de WNV pela via intratecal. O cavalo parecia normal nesse dia e nos seguintes, mas foi encontrado recumbente e com pouca capacidade de resposta na manhã do dia 2. Foi eutanizado e necropsiado e não se recuperou vírus de várias áreas do cérebro. Este animal poderá ter caído na noite anterior e ter magoado gravemente a sua medula espinal, que não foi examinada na necropsia. Parece óbvio que a sua morte não estava relacionada com a infecção por WNV.

Cavalo EQ6

Este cavalo foi inoculado com 104 pfu de WNV subcutaneamente; quatro dias mais tarde, fez-se uma punção da cisterna com a ideia de facilitar a passagem de vírus através da barreira sangue-cérebro. Na manhã do dia 10, ela estava notoriamente ansiosa e não normal, mas nessa noite já tinha voltado à normalidade. Não foram observados nenhuns outros sinais clínicos durante as 6 semanas após uma provocação. As amostras de soro recolhidas duas vezes por dia durante os primeiros 13 dias após a inoculação foram testadas para vírus em células Vero - não se recuperou nenhum vírus de nenhum espécime. Os testes de PRNT foram realizados utilizando soro recolhido no dia de inoculação e 3 semanas mais tarde. Os títulos de neutralização de 80% (e 90%) nestas amostras eram de 10 (<10) e 40 (40), respectivamente. Ela tinha sido testada como serologicamente negativa antes da utilização, pelo que 1:10 a um título de 80% no dia da inoculação era surpreendente. Este animal poderá ter tido um caso leve de WN. 9 ΕΡ 1 441 761/ΡΤ

Cavalo EQ7

Este cavalo foi inoculado com 104 pfu de WNV intratecalmente; a titulação de retorno do inoculo revelou que a dose era de 6 xlO3 pfu. Os sinais clínicos da doença eram inexistentes até ao dia 20, altura em que se notou que o animal estava ansioso e nervoso. Ao longo dos 2 dias seguintes, a sua condição piorou com um aumento de ansiedade, tremores da cabeça e lábios, fasciculação muscular e paralisia dos membros traseiros. No entanto, na tarde do dia 23 ela parecia estar a recuperar e os sinais clínicos eram de gravidade consideravelmente menor. Ela foi eutanizada no dia 24 para permitir a confirmação de que a doença era de facto devida a WNV. A análise histopatológica do cérebro revelou uma encefalite difusa, espalhada. Testaram-se amostras de soro quanto a vírus duas vezes por dia, do dia 1 ao dia 9, plaqueando em células Vero; não se isolaram vírus em nenhuma das amostras. Também não conseguimos isolar vírus a partir do CSF e de homogenatos de cérebro, cerebelo e tronco cerebral recolhidos na necropsia (tecidos testados como suspensões a 10% e diluições -1 e -2) . Os títulos de PRNT (80 ou 90%) de soros recolhidos nos dias 0, 7, 14, e 23 eram <10, <10, 160 e 160.

Cavalos EQ8 e EQ9

Estes cavalos foram confrontados por inoculação intratecal de 105 pfu de WNV; A titulação de retorno revelou que a dose administrada era de 2 x 105 pfu. Ambos os animais permaneceram clinicamente normais durante 7 a 7,5 dias, em seguida desenvolveram progressivamente doença grave (descrições clínicas nos registos animais individuais). O curso da doença nos dois cavalos era quase idêntico e ambos foram eutanizados e necropsiados no dia 9. A análise histopatológica revelou encefalite grave em ambos os cavalos. Os soros recolhidos duas vezes por dia após inoculação foram testados quanto à produção de placas em células Vero. Os títulos de viremia (logio pfu/ml) determinados eram: 10 ΕΡ 1 441 761/ΡΤ

Dia após provocação 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 EQ8 <1 <1 <1 1,0 1,0 1,5 <1 1,4 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 EQ9 <1 <1 1,7 2,5 2,0 2,3 2,3 2,3 1,6 <1 <1 <1 <1 <1 <1

Testaram-se amostras de CSF, cérebro, cerebelo, tronco cerebral e junção craniocervical recolhidas na necropsia, quanto a vírus em células Vero. O EQ8 tinha um vestígio de vírus (1,5 logiopfu/grama) no tronco cerebral e o EQ8 tinha uma pequena quantidade de vírus (1,3 logiopfu/grama) no cerebelo; todas as outras amostras eram negativas. Ambos os animais tinham títulos de PRNT < 10 na altura da provocação. Na altura da eutanásia o EQ8 e EQ9 tinham títulos de PRNT (90%) de 160 e < 10, respectivamente.

Provocação de cavalos vacinados e controlos

Os cavalos vacinados EQ1, EQ2, e EQ4 foram confrontados exactamente 24 semanas após a imunização primária. Dois cavalos de controlo adicionais foram confrontados simultaneamente. Todas as provocações consistiam em inoculação intratecal de 1,0 ml contendo 105 pfu de WVN (preparação isenta de FBS diluída em PBS). A titulação de retorno do inoculo indicou que os cavalos receberam aproximadamente 125 000 pfu de vírus.

Os dois cavalos de controlo (EQ10 e EQ11) desenvolveram doença clínica grave começando 7 a 8 dias após a inoculação de vírus e eutanizados 8,5 e 10 dias após a provocação, respectivamente. Na altura da eutanásia os seus títulos de anticorpos no PRNT eram 1:40 e <10, respectivamente. Os soros recolhidos a intervalos de meio dia entre a altura da provocação e a eutanásia foram testados quanto à produção de placas em células Vero; os títulos de viremia (logiopfu/ml de soro) são apresentados nas tabelas seguintes (as amostras negativas de EQ11 recolhidas após o dia 8,0 não são apresentadas). 11 ΕΡ 1 441 761/ΡΤ

Dia após provocação 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 EQ10 1,0 1,3 1,9 1,9 2,3 2,4 2,4 1,8 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 EQll <1 1,0 2,8 2,9 2,5 2,4 2,4 2,3 1,3 <1 <1 <1 <1 <1 <1

Também se analisaram amostras de CSF, cérebro, cerebelo e tronco cerebral na necropsia quanto à produção de placas, em células Vero. Não se isolaram vírus de nenhuma amostra de CSF. Isolaram-se quantidades vestigiárias de vírus (1-2 placas por poço inoculado com 0,1 ml de suspensão a 10%) de todas as três áreas do cérebro do cavalo EQ10 e do tronco cerebral apenas do cavalo EQll. A análise histopatológica dos cérebros de EQ10 e EQll revelou encefalite espalhada.

Em contraste acentuado com os dois cavalos de controlo, os cavalos vacinados EQ1, EQ2 e EQ4 não mostraram evidências de doença clinica nas 4 semanas a seguir aa provocação. Além disso, o virus não foi isolado de nenhuma amostra de soro recolhida duas vezes por dia a partir destes animais, durante os primeiros 10 dias após provocação, nem de amostras de cérebro, cerebelo, tronco cerebral ou CSF recolhidos na necropsia, no dia 28. A análise histopatológica dos seus cérebros não revelou lesões, para além de algumas observações casuais não associadas com infecção por WNV.

Testaram-se anticorpos contra WNV no CSF recolhido na altura da inoculação do vírus e na altura da eutanásia (dia 28 para EQl, EQ2 e EQ4; dia 8,5 para EQIO, e dia 10 para EQll). As amostras foram testadas foram testadas nas diluições 1:5, 10 e 20. as amostras recolhidas na necropsia do cavalo EQl apresentavam uma redução de 87% na contagem de placas a 1:5, e a amostra post mortem de EQ4 apresentava uma redução de 98% a 1:5. Todas as outras amostras tinham títulos < 5 a uma redução de 80%.

Respostas serológicas à vacinação

Recolheram-se amostras de soro dos quarto cavalos imunizados, semanalmente durante a sua tenência e foram armazenadas em duplicado. Os títulos de anticorpo 12 ΕΡ 1 441 761/ΡΤ neutralizantes foram determinados num subconjunto destas amostras, utilizando um teste convencional de neutralização de redução de placas em células Vero. Apenas alguns dos testes foram realizados utilizando soro humano a 8% no inoculo do virus, como indicado na Tabela 2.

Tabela 2. Resultados de PRNT para cavalos imunizados com ChimeriVax-WN

Data da amostra Sem. Data do ensaio* EQ1 EQ1 EQ2 EQ2 EQ3 EQ3 EQ4 EQ4 80% 90% 80% 90% 80% 90% 80% 90% 3/9 0 várias <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 3/16 1 11/13- 10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 3/23 2 10/27- 10 10 10 10 <10 <10 <10 <10 3/30 3 10/27- 10 <10 10 <10 <10 <10 <10 <10 4/6 4 11/02- 20 10 40 40 10 10 <10 <10 4/6 4 10/27- 20 10 20 10 10 10 10 <10 4/6 4 11/13- 20 20 20 10 10 10 10 <10 4/13 5 10/27- 20 20 20 20 10 <10 <10 <10 5/4 8 10/27- 20 10 10 <10 <10 <10 <10 <10 5/4 8 11/13- 20 20 10 <10 <10 <10 <10 <10 5/18 10 10/27- 10 10 10 <10 <10 <10 <10 <10 6/1 12 10/27- 10 10 20 10 <10 <10 <10 <10 6/1 12 11/13- 20 <10 10 <10 <10 <10 <10 <10 6/29 16 10/27- 10 <10 10 <10 — — <10 <10 6/29 16 11/13- 10 <10 <10 <10 — — <10 <10 7/27 20 11/13- 10 <10 10 <10 — — <10 <10 8/24 24 10/4+ 20 20 10 10 — — <10 <10 8/24 24 11/02- 10 <10 <10 <10 - - <10 <10 8/24 24 11/13- 10 10 <10 <10 — - <10 <10 8/31 25 10/4+ 40 40 20 20 — — 20 20 8/31 25 11/02- 20 10 10 10 — — 20 10 9/7 26 10/4+ >320 >320 >320 >320 — — >320 >320 9/7 26 11/02- 320 160 320 160 — — 640 640 9/7 26 11/13- 320 320 640 320 — — 1280 640 9/14 27 10/4- >320 >320 >320 >320 — — >320 >320 9/14 27 11/02- 160 160 320 320 — — 640 320 9/21 28 10/4+ >320 >320 >320 >320 — — >320 >320 9/21 28 11/02- 160 160 320 320 — — 320 160 9/21 28 11/13- 320 160 320 160 — — 640 320 * indica com (+) ou sem (-) utilização de factor sérico lábil

Lisboa,

Claims (6)

1. ΕΡ 1 441 761/ΡΤ 1/1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um flavivirus quimérico na preparação de um medicamento para prevenir ou tratar a infecção por flavivirus num cavalo, em que o flavivirus quimérico é um virus da febre amarela em que pelo menos uma proteína estrutural do vírus da febre amarela é substituído por uma proteína estrutural correspondente de um segundo flavivirus diferente, para o qual se pretende obter imunidade.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a referida infecção por flavivirus é a infecção pelo vírus do Nilo ocidental.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2 em que o referido flavivirus quimérico compreende as proteínas da cápside e não estruturais de um vírus da febre amarela e proteínas de envelope de um segundo flavivirus diferente.
4. 4. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que o referido vírus da febre amarela é derivado da estirpe 17D.
5. 5. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido segundo flavivirus é um vírus do Nilo ocidental.
6. 6. Utilização de um flavivirus quimérico compreendendo as proteínas da cápside e não estruturais de um vírus da febre amarela e as proteínas prM e de envelope de um vírus do Nilo ocidental, na preparação de um medicamento para prevenir a infecção pelo vírus do Nilo ocidental num cavalo. Lisboa,