JP2007525226A

JP2007525226A - フラビウイルスワクチン

Info

Publication number: JP2007525226A
Application number: JP2007500981A
Authority: JP
Inventors: トマスピー．モナート; ファーシャドギラホー; ジュアンアロヨ; コンスタンチンプガチョーフ
Original assignee: アカンビスインコーポレーティッド
Priority date: 2004-02-27
Filing date: 2005-02-28
Publication date: 2007-09-06
Also published as: CN1950499A; EP1755539A2; AU2005216248A1; WO2005082020A3; US20050002968A1; NZ549749A; CA2557136A1; KR20060135844A; EP1755539A4; WO2005082020A8; SG150551A1; BRPI0508064A; WO2005082020A2; IL177667A0

Abstract

本発明は、弱毒化されたフラビウイルスワクチンならびにこれらのワクチンを作製および使用する方法を提供する。

Description

発明の背景
フラビウイルスは、主に感染した蚊またはダニにより伝染される、エンベロープを有する小型プラス鎖RNAウイルスである。黄熱病、デング熱、日本脳炎、ダニ媒介脳炎、および西ナイルウイルスのような、いくつかのフラビウイルスは、世界的な公衆衛生を、現在または潜在的に脅かしている。例えば、黄熱ウイルスはサハラ下アフリカの特定のジャングル地域と共に南アフリカのいくつかの地域での流行病の原因である。多くの黄熱病感染症は軽症であるが、疾患は重症な、生命を脅かす病気を引き起こすこともある。疾患状態の初期または急性期は通常、高熱、悪寒、頭痛、背部痛、筋肉痛、食欲喪失、悪心、および嘔吐を特徴とする。3〜4日後これらの症状は消失する。患者によっては、次いで疾患がいわゆる毒性期に入ると症状が再発する。この期の間に、高熱が再発して、ショック、出血（例えば、口、鼻、目、および/または胃からの出血）、腎不全、および肝不全がもたらされることがある。実際に、肝不全は皮膚および白眼の黄化である黄疸を引き起こし、従ってその名前に「黄熱」を授けている。毒性期に入った患者の約半数が10〜14日以内に死亡する。しかしながら、黄熱病から回復した人は、再感染に対して生涯免疫を有する。過去20年の間に黄熱病ウイルスに感染した人の数は増大しつつあり、現在では黄熱病は毎年約200,000症例あり、約30,000の死亡例がある。このように、黄熱病ウイルスの再出現は、重大な公衆衛生問題を提示する。

デング（DEN）ウイルスは、その有病率の劇的な増加故に、ますます大きくなっている、世界的な公衆衛生上の問題の原因である。この疾患は、現在、アメリカ、南ヨーロッパ、アジア、およびオーストラリアの100より多い国々において風土病となっている。25億人、世界人口の5分の2が、現在、感染のリスクを有する。デング熱に由来する5,000万例の感染および24,000の死亡例が毎年記録される。デング熱ウイルスは4つの、異なるが近縁の血清型、血清型1〜4を有する。一つの血清型による感染は通常その血清型に対する生涯免疫を誘導するが、他の3つに対しては一時的な防御を付与するだけである。一時的な防御だけを提供するより悪いことに、異なる血清型による連続的な感染は、疾患の潜在的に致死的な合併症である、デング出血熱（DHF）およびデングショック症候群（DSS）のリスクを増大させることが見いだされている。従って、1つまたは2つの血清型に対する防御は実際に他の血清型によるその後の感染のリスクを増強し、従って対象をDHF/DSSのリスクにさらす可能性があるため、4つ全ての血清型に対する防御が必要である。

黄熱病ウイルスおよびデング熱ウイルスを含むフラビウイルスは、ヒトおよび動物における疾患状態の誘導に関与する二つの主要な生物学的性質を有する。これらの二つの性質の第一のものは向神経性であり、これは宿主の神経組織に侵入して感染するウイルスの性向である。向神経性フラビウイルス感染症によって、脳および脊髄の炎症および損傷（すなわち、脳炎）、意識障害、麻痺、および痙攣が起こり得る。フラビウイルスの第二の生物学的性質は、内臓向性であり、これはウイルスが肝臓、腎臓、および心臓を含む生命にとって重要な内蔵に侵入して感染する性向である。内臓向性フラビウイルス感染症によって、肝臓（肝炎）、腎臓（腎炎）、および心筋（心筋炎）の炎症および損傷が起こり、これらの臓器の不全または機能障害がもたらされ得る。向神経性および内臓向性は、フラビウイルスの明確で異なる性質であるように思われる。

いくつかのフラビウイルスは、主に向神経性であるが（西ナイルウイルスのように）、主に内臓向性であるウイルスもあり（例えば、黄熱病ウイルスおよびデング熱ウイルス）、さらに双方の性質を示すものもある（キャサヌール森林病ウイルスのように）。しかし、向神経性と内臓向性はいずれも、全てのフラビウイルスにある程度存在する。宿主において、中枢神経系への侵入の前に臓器の感染症が起こることから、内臓向性と向神経性の相互作用が起こる可能性が高い。このように、向神経性は、神経外臓器（内蔵）におけるウイルスの複製能に依存する。この神経外複製は、ウイルス血症を引き起こし、次にこれが脳および脊髄への侵入の原因となる。

フラビウイルスに対するワクチンを開発する一つのアプローチは、ワクチンウイルスがヒトまたは動物に対するその向神経性および内臓向性を喪失するように、それらのビルレンス特性を改変することである。黄熱病ウイルスの場合、二つのワクチン（黄熱病17Dとフレンチ向神経性ワクチン）が開発されている（Monath、「Yellow Fever」、Plotkin and Orenstein、Vaccines、第3版、1999、Saunders、Philadelphia、pp. 815-879）（非特許文献1)。黄熱病17Dワクチンは、ニワトリ胚組織における連続継代によって作製され、それによって向神経性と内臓向性が有意に低下したウイルスがもたらされた。フレンチ向神経性ワクチンは、マウス脳組織におけるウイルスの連続継代によって作製され、それによって内臓向性の喪失がもたらされたが、向神経性は保持した。神経偶発症候（ワクチン接種後脳炎）の高発生率は、フレンチワクチンの使用に付随した。特に、デング、西ナイル、およびオムスク出血熱ウイルスのような向臓器的性質を有する多くの医学的に重要なフラビウイルスに対して、現在のところ承認されたワクチンは利用できない。

フラビウイルスの完全にプロセシングされた成熟ビリオンは、三つの構造タンパク質、カプシド（C）、膜（M）、およびエンベロープ（E）を含む。七つの非構造タンパク質（NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、およびNS5）が感染細胞中で産生される。ウイルス受容体および融合ドメインはEタンパク質内に存在する。さらに、Eタンパク質はフラビウイルスワクチンの望ましい構成要素でもある。それは、このタンパク質に対する抗体がウイルスの感染性を中和でき、かつ疾患に対して宿主に防御を付与できるからである。感染細胞において認められる未成熟なフラビウイルスは、Mタンパク質の前駆体であるプレ膜（prM）タンパク質を含む。フラビウイルスタンパク質は、単一の長いオープンリーディングフレームの翻訳してポリタンパク質を産生した後、ポリタンパク質の複雑な一連の翻訳後タンパク質分解切断が起こり、成熟ウイルスタンパク質を生成することによって産生される（Ambergら、J. Virol. 73：8083〜8094、1999（非特許文献2）；Rice、「Flaviviridae」、Virology、Fields（編）、Raven-Lippincott、New York、1995、第I巻、p. 937（非特許文献3））。ウイルスの構造タンパク質は、ポリタンパク質においてC-prM-Eの順に整列されている。

Monath、「Yellow Fever」、Plotkin and Orenstein、「Vaccines」、第3版、1999、Saunders、Philadelphia、pp. 815-879 Ambergら、J. Virol. 73：8083〜8094、1999 Rice、「Flaviviridae」、Virology、Fields（編）、Raven-Lippincott、New York、1995、第I巻、p. 937

発明の概要
本発明は、例えば、内臓向性を低下させることにより、ウイルスを弱毒化する一つまたは複数のヒンジ領域（例えば、疎水性ポケット領域）変異を含むフラビウイルスを提供する。これらのフラビウイルスは、例えば、黄熱病ウイルス（例えば、黄熱病ウイルスワクチン株）；デング熱ウイルス、西ナイルウイルス、ヴェッセルスブロンウイルス、キャサヌール森林病ウイルス、およびオムスク出血熱ウイルスからなる群より選択される内臓向性フラビウイルス；またはキメラフラビウイルスであり得る。キメラフラビウイルスの一つの例において、キメラには、第一のフラビウイルス（例えば、黄熱病ウイルス）のカプシドおよび非構造タンパク質、ならびにキメラフラビウイルスの内臓向性を低下させるエンベロープタンパク質変異を含む、第二のフラビウイルス（例えば、日本脳炎ウイルスまたはデング熱ウイルス（例えば、デング熱ウイルス1、2、3または4））のプレ膜およびエンベロープタンパク質が含まれる。デング熱ウイルスの場合、変異は、例えばデングエンベロープのアミノ酸202位（デング3）および/または204位（デング1、2、および4）のリジンにあり得る。このアミノ酸は、例えばアルギニンに置換できる。他の例では、変異はデングエンベロープのアミノ酸252、253、257、258、および261の任意の一つまたは複数に、任意で上記の202/204変異との組み合わせであり得る。これらの変異の詳細は以下に提供される。

本発明はまた、本明細書において記述される任意のウイルスおよび薬学的に許容される担体または希釈剤を含むワクチン組成物と共に、そのようなワクチン組成物を患者に投与することによって、患者におけるフラビウイルスに対する免疫応答を誘導する方法も提供する。これらの方法を用いて処置される患者は、フラビウイルス感染症を有さなくてもよいが発症するリスクを有するか、またはフラビウイルス感染症を有し得る。

内臓向性の低下をもたらす変異をフラビウイルス（例えば、キメラフラビウイルス）に導入する段階を含む、フラビウイルスワクチンを作製する方法もまた本発明に含まれる。さらに、本発明は、（i）フラビウイルスのヒンジ領域（例えば、疎水性ポケット領域）に変異を導入する段階、および（ii）変異を欠くフラビウイルスと比較して、変異を含むフラビウイルスが低下した内臓向性を有するか否かを決定する段階を含む、フラビウイルス（例えば、黄熱病ウイルスまたはキメラフラビウイルス）ワクチン候補物質を同定する方法を含む。

本発明のフラビウイルスは、低下した内臓向性を有する点において、患者に投与した場合に、非変異相等物と比較して、さらなる安全性レベルを提供することから有利である。これらのウイルスのさらなる長所は、（i）60年を超えてその安全性が確立され、そのあいだに3億5千万回もヒトに投与されてきた、（ii）単回投与後に長期間の免疫を誘導する、および（iii）迅速に、接種後数日以内に免疫を誘導する、黄熱病ウイルス株YF17Dの配列（例えば、カプシドと非構造タンパク質とをコードする配列）がそれらに含まれ得るという事実によって提供される。さらに、本発明のワクチンウイルスは、処置した患者において活動型感染症を引き起こす。免疫した個体のサイトカイン環境および先天性免疫応答は天然の感染症の場合と類似しているため、抗原性集団は宿主において増大して、適切に折り畳まれた立体構造エピトープが効率よくプロセシングされ、適応免疫応答は強く、記憶が確立される。その上、本発明の特定のキメラでは、標的ウイルスに由来するprMおよびEタンパク質は、保護的な液性および細胞性免疫にとって重要な抗原を含む。

本発明のその他の特徴および長所は、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明らかとなる。

詳細な説明
本発明は、エンベロープタンパク質のヒンジ領域（例えば、疎水性ポケット）内に一つまたは複数の変異を有するフラビウイルス（例えば、黄熱病ウイルスおよびキメラフラビウイルス）、そのようなフラビウイルスを作製するための方法、およびフラビウイルス感染症を予防または処置するためにこれらのフラビウイルスを用いるための方法を提供する。本発明は、部分的に、この領域内に特定の変異を有するウイルスは弱毒化されるという本発明者らの発見に基づく。例えば、本発明者らはヒンジ領域変異を有するウイルスが低下された内臓向性を有することを見いだした（以下を参照されたい）。本発明のウイルスおよび方法は、以下のようにさらに説明される。

本発明において用いることができるフラビウイルスの一例は黄熱病ウイルスである。野生型の感染性クローン、例えば、Asibi感染性クローンまたは別の野生型の感染性クローン、ビルレント黄熱病ウイルスのエンベロープのヒンジ領域に変異を作製することができ、次に変異体を動物モデル系（例えば、ハムスターおよび/またはサルモデル系）において試験して、内臓向性に影響する部位を同定することができる。内臓向性の低下は、例えば、モデル系において、ウイルス血症および/または肝損傷の低下を検出することによって判断される（さらなる詳細に関しては下記を参照されたい）。次に、野生型ウイルスの内臓向性を低下させることが判明した一つまたは複数の変異を、ワクチン株（例えば、YF17D）に導入して、これらの変異体を動物モデル系（例えば、ハムスターおよび/またはサルモデル系）において試験し、得られた変異体が低下した内臓向性を有するか否かを決定する。次いで、低下した内臓向性を有することが判明した変異体は、内臓向性レベルの低下により安全性が増大した新たなワクチン株として用いることができる。

本発明において用いることができるさらなるフラビウイルスには、日本脳炎、デング（血清型1〜4）、マリーバレー脳炎、セントルイス脳炎、西ナイル、クンジン、ロシオ（Rocio）脳炎、およびイルヘウスウイルスのような他の蚊媒介フラビウイルス；中欧脳炎、シベリア脳炎、ロシア春夏脳炎、キャサヌール森林病、オムスク出血熱、跳躍病、ポワッサン、ネギシ、アブセッタロフ（Absettarov）、ハンサロバ（Hansalova）、アポイ、およびHyprウイルスのようなダニ媒介フラビウイルス；ならびにヘパシウイルス属に含まれるウイルス（例えば、C型肝炎ウイルス）が含まれる。これらのウイルスは全て、内蔵に対する何らかの感染性向を有する。これらのウイルスの内臓向性は生命にとって重要な内蔵の機能障害を引き起こすとは限らず、これらの臓器におけるウイルスの複製がウイルス血症を引き起こして、中枢神経系への侵入に寄与する可能性がある。このように、変異誘発によってこれらのウイルスの内臓向性を低下させると、それらが脳に侵入して脳炎を引き起こす能力を低下させることができる。

他のフラビウイルスおよび上記のウイルスに加え、エンベロープタンパク質ヒンジ領域（例えば、疎水性ポケット）における一つまたは複数の変異を含むキメラフラビウイルスが本発明に含まれる。これらのキメラは、構造タンパク質が第二のウイルス（すなわち試験ウイルス、またはフラビウイルスのような所定のウイルス）の対応する構造タンパク質に置換されているフラビウイルス（すなわち、骨格フラビウイルス）からなってもよい。例えば、キメラは、フラビウイルスのprMおよびEタンパク質が第二の試験ウイルス（例えば、デング熱ウイルス（1〜4）、日本脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、または本明細書において言及した任意のもののような他のウイルス）のprMおよびEタンパク質に置換されている骨格フラビウイルス（例えば、黄熱病ウイルス）からなってもよく、そのEタンパク質は、本明細書において記述されるようにヒンジ領域変異を有する。キメラウイルスは、任意のウイルスの組み合わせから作製することができる。好ましくは、挿入された構造タンパク質の起源は、それに対する免疫が求められるウイルスである。

本発明のワクチンに含まれ得るキメラウイルスの特定の例は、prMタンパク質およびEタンパク質が、デング熱ウイルス（血清型1、2、3、または4）、日本脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マリーバレー脳炎ウイルスまたは先に記載したものの一つのような他の任意のフラビウイルスのような、別のフラビウイルスのprMタンパク質およびEタンパク質（本明細書において記述されるようなヒンジ変異を含む）に置換されている黄熱病ヒトワクチン株YF17Dである。例えば、本発明のウイルスを作製するために、ブダペスト条約の条項の下で米国バージニア州マナッサスのアメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection：ATCC）に寄託され、1998年1月6日という寄託日を与えられた以下のキメラフラビウイルスを用いることができる：キメラ黄熱病17D/デング2型ウイルス（YF/DEN-2；ATCCアクセッション番号ATCC VR-2593）、およびキメラ黄熱病17D/日本脳炎SA14-14-2ウイルス（YF/JE A 1.3；ATCCアクセッション番号ATCC VR-2594）。本発明において用いることができるキメラウイルス作製の詳細は、例えば、そのそれぞれの全文が参照により本明細書に組み入れられる、国際出願PCT/US98/03894号およびPCT/US00/32821号；ならびにChambersら、J. Virol. 73：3095〜3101、1999において提供される。

上記のように、本発明のウイルスに含まれる変異は、ウイルスを、例えばそれらの内臓向性を低下させることにより弱毒化する。これらの変異はフラビウイルスのエンベロープタンパク質のヒンジ領域に存在し得る。エンベロープタンパク質のポリペプチド鎖は3つの異なるドメインに折り畳まれる：中央ドメイン（ドメインI）、二量体化ドメイン（ドメインII）、および免疫グロビン様モジュールドメイン（ドメインIII）。ヒンジ領域はドメインIとIIの間に存在し、酸性のpHに曝露されると、受容体媒介エンドサイトーシスによるウイルスの取り込みの後に、ウイルスおよびエンドソーム膜の融合に関与するエンベロープタンパク質三量体の形成をもたらすコンホメーション変化を行う（従って「ヒンジ」と命名）。コンホメーション変化の前には、タンパク質は二量体の形で存在する。

例えば、黄熱病ウイルスのアミノ酸48〜61、127〜131、および196〜283を含む、多数のエンベロープアミノ酸がヒンジ領域に存在する（Rayら、Nature 375:291-298、1995）。これらのアミノ酸、またはごく周辺のアミノ酸（および他のフラビウイルスエンベロープタンパク質において相当するアミノ酸）の任意のものを、本発明に従って変異でき、かつ弱毒化について試験できる。ヒンジ領域の疎水性ポケット内のアミノ酸が特に関心対象である。具体的な例として、以下にさらに記述されるように、本発明者らは、黄熱病ウイルスベクターに挿入されたデング1配列を含むキメラフラビウイルスにおいて、ヒンジ領域の疎水性ポケット内にあるエンベロープタンパク質のアミノ酸204の置換（KからR）が弱毒化をもたらすことを見いだした。この置換が、野生型タンパク質におけるエンベロープ単量体間の分子間水素結合を破壊し、単量体内の新たな分子内相互作用と置き換えるような、エンベロープタンパク質の構造変化をもたらすという本発明者らの発見もまた以下に記述される。本発明者らは、この置換に由来する弱毒化は、最も高い可能性としてウイルス膜と宿主細胞の融合に必要なpH閾値を変化させることにより、融合前コンホメーションにあるタンパク質の構造を変化させる、これらの新たな相互作用に起因することを提案する。このように、この発見はさらなる弱毒化変異体の設計のための新たな基盤を提供する。特に、追加の置換を用いて疎水性ポケット内での分子内相互作用を増大させ、弱毒化をもたらすことができる。本発明に従って疎水性ポケット内に作成可能な、そのような変異/置換の例は、E202K、E204K、E252V、E253L、E257E、E258G、およぶE261Hの置換を含む。

部位特異的突然変異誘発法のような標準的な方法を用いて、ヒンジ領域に変異を作製できる。本発明のウイルスに存在する変異の型の一例は置換であるが、欠失および挿入のような他の変異の型も同様に用いることができる。さらに、上記のように、変異は単独で、または一つもしくは複数のさらなる変異と関連して存在してもよい。

本発明のウイルス（キメラを含む）は、当技術分野で標準的な方法を用いて作製することができる。例えば、ウイルスのゲノムに対応するRNA分子を、初代培養細胞、ニワトリ胚、または二倍体細胞系に導入して、次にそこから（またはその上清から）子孫ウイルスを精製することができる。ウイルスを作製するために用いることができるもう一つの方法は、Vero細胞のような異数体細胞を用いる（Yasumuraら、Nihon Rionsho 21：1201〜1215、1963）。この方法では、ウイルスのゲノムに対応する核酸分子（例えば、RNA分子）を異数体細胞に導入して、細胞が培養された培地からウイルスを回収して、回収したウイルスをヌクレアーゼ（例えば、Benzonase（商標）のようなDNAとRNAの双方を分解するエンドヌクレアーゼ；米国特許第5,173,418号）によって処置して、ヌクレアーゼ処置したウイルスを濃縮し（例えば、分子量カットオフが例えば500 kDaであるフィルターを用いた限外濾過を用いて）、濃縮したウイルスをワクチン接種の目的で製剤化する。この方法の詳細は、参照により本明細書に組み入れられる、2002年1月15日に出願された米国特許出願第60/348,565号に提供される（同様に、国際公開公報第03/060088 A2号も参照されたい）。

本発明のウイルスは、感染のリスクがある成人もしくは子供における一次予防物質として投与することができ、または感染した患者を処置するための二次物質として用いることができる。本発明のウイルスの製剤化は、当技術分野で標準的な方法を用いて行うことができる。ワクチン調製物において用いられる多数の薬学的に許容される溶液は周知であり、本発明において用いるために当業者によって容易に適合させることができる（例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、第18版、A. Gennaro編、1990、Mack Publishing Co.、Easton、PAを参照されたい）。二つの特定の例において、ウイルスは、7.5％乳糖および2.5％ヒト血清アルブミンを含む最小基本培地アール塩（MEME）において、または10％ソルビトールを含むMEMEにおいて製剤化される。しかし、ウイルスは、滅菌生理食塩液または滅菌緩衝生理食塩液のような生理的に許容される溶液において単に希釈することができる。もう一つの例において、ウイルスは、例えば感染したニワトリ胚組織の透明な懸濁液として、またはキメラ黄熱病ウイルスに感染した細胞培養から採取した液体として、黄熱病17Dワクチンの場合と同様に投与および製剤化することができる。

本発明のワクチンは、当技術分野で周知である方法を用いて投与することができ、投与されるワクチンの適当な量は、当業者によって容易に決定することができる。例えば、本発明のウイルスは、例えば筋肉内、皮下、または皮内経路によって投与される投与容量0.1〜1.0 mL中に10²〜10⁷感染単位（例えば、プラーク形成単位または組織培養感染用量）を含む滅菌水溶液として製剤化することができる。さらに、フラビウイルスは、粘膜経路を通してヒト宿主に感染することができる可能性があることから（Gresikovaら、「Tick-borne Encephalitis」、The Arboviruses、Ecology and Epidermiology、Monath編、CRC Press、Boca Raton、Florida、1988、第IV巻、177-203）、ウイルスはまた粘膜経路によっても投与することができる。さらに、本発明のワクチンは単回投与で投与することができ、または任意で、投与に、初回抗原投与量を用いた後に、当業者によって適当であると決定されるように、例えば2〜6ヶ月後に投与される、追加抗原投与量を含むことができる。

任意で、当業者に公知であるアジュバントを本発明のウイルスの投与において用いることができる。ウイルスの免疫原性を増強するために用いることができるアジュバントには、例えば、リポソーム製剤、（例えばQS21）、ムラミルジペプチド、モノホスホリルリピッドA、またはポリホスファジンのような合成アジュバントが含まれる。これらのアジュバントは典型的に、不活化ワクチンの免疫応答を増強するために用いられるが、それらは生ワクチンについても用いることができる。粘膜経路、例えば経口を介して送達されるウイルスの場合、大腸菌熱不安定毒素（LT）またはLTの変異体誘導体のような粘膜アジュバントをアジュバントとして用いることができる。さらに、アジュバント活性を有するサイトカインをコードする遺伝子をウイルスに挿入することができる。このように、GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-13、またはIL-5のようなサイトカインをコードする遺伝子を外来抗原遺伝子と共に挿入して、免疫応答が増強したワクチンを産生することができるか、または細胞性、液性、もしくは粘膜応答に対してより特異的に向けられるように免疫を調節することができる。

最適なワクチン接種がデング血清型4つ全てに対する免疫の誘導を含み得るデング熱ウイルスの場合、四価ワクチンの製剤に本発明のキメラウイルスを用いることができる。そのような四価製剤において用いられる任意のまたは全てのキメラは、本明細書において記述されるような、内臓向性を低下させる変異を含み得る。キメラは、製剤の際の任意の時点で、四価調製物を形成するように混合され得るか、または連続して投与され得る。四価ワクチンの場合、各キメラが等量用いられてもよい。または、投与されるワクチンに存在する、異なるキメラそれぞれの量は異なってもよい。簡単には、そのような製剤の一例において、他のキメラに比べ、少なくとも5倍少ない（例えば、10、50、100、200、または500倍少ない）デング-2キメラが用いられる。この例において、デング-1、デング-3、およびデング-4キメラの量は同等か、または異なってもよい。もう一つの例において、デング-4および/またはデング-1ウイルスの量も同様に減少させることができる。例えば、より少ないデング-2キメラを用いることに加え、デング-1およびデング-3キメラに比べ少なくとも5倍少ない（例えば、10、50、100、200、または500倍少ない）デング-4キメラを用いることができ；デング-3およびデング-4キメラに比べ少なくとも5倍少ない（例えば、10、50、100、200、または500倍少ない）デング-1キメラを用いることができ；またはデング-3キメラに比べ少なくとも5倍少ないデング-1およびデング-4キメラを用いることができる。例えば、本明細書において記載されるE204/E202変異がキメラに含まれない場合には、デング-3および/またはデング-4キメラの量に比べデング-1キメラの量を減少させることが特に望ましいことがある。

黄熱病/日本脳炎キメラのエンベロープタンパク質の279位で起こる、本発明に含まれる変異の一例の特徴付けの詳細が以下に提供される。同様に、デング熱ウイルスエンベロープタンパク質が内臓向性を低下させる一つまたは複数の変異を含む、黄熱病/デング熱ウイルスキメラに関する詳細も以下に提供される。そのような変異の一例において、デング-1、デング-2、もしくはデング-4のエンベロープタンパク質の204 位のリジン、または他のデング血清型のエンベロープタンパク質より2アミノ酸短いデング-3のエンベロープタンパク質の202位のリジンが置換または欠失される。このリジンは、例えばアルギニンに置換され得る。エンベロープアミノ酸204（デング-3では202）付近の他の残基もまた、内臓向性の低下を達成するために変異させ得る。例えば、アミノ酸200〜208のいずれか、またはこれらのアミノ酸の組み合わせを変異させ得る。具体的な例には、以下が含まれる：デング-1、デング-2、およびデング-4の202位（K）および204位（K）、ならびにデング-3の200位（K）および202位（K）。これらの残基は、例えばアルギニンに置換され得る。

実験結果
I．ヒンジ領域変異を含む黄熱病/日本脳炎キメラ
概要
キメラ黄熱病（YF）-日本脳炎（JE）ワクチン（ChimeriVax（商標）-JE）は、弱毒化JE SA14-14-2ワクチン株のprM-E遺伝子を、YF 17Dウイルスの完全長のcDNAクローンに挿入することによって構築した。アカゲザル胎仔肺（FRhL）細胞での継代により、E279で単一のMet→Lysアミノ酸変異を含む小さいプラークのウイルスの出現がもたらされ、SA14-14-2からのこの残基を野生型アミノ酸に復帰させた。部位特異的変異誘発によって類似のウイルスを構築した。E279変異は、Eタンパク質のヒンジ領域におけるβ-シートに位置し、これは、感染細胞の細胞質へのエンドソームからのウイルス侵入の際のpH依存的コンホメーション変化に関与する。FRhLまたはVero細胞における独立したトランスフェクション継代試験において、変異はヒンジ4（アミノ酸E266〜E284によって結合される）において最も頻繁に出現し、この機能的に重要な領域におけるゲノムの不安定性を反映していた。E279復帰変異は、哺乳期マウスのLD50および生存分布によって、ならびにアカゲザルにおける組織病理学によって決定すると、神経ビルレンスの有意な増加を引き起こしていた。サルでの結果の感度および同等性に基づくと、哺乳期のマウスは、向神経性のフラビウイルスワクチン候補の安全性試験の適当な宿主である。E279 Lysウイルスは、ウイルス血症と抗体レベル（内臓向性のマーカー）がE279 Metウイルスと比較して有意に減少したことから、サルにおいて神経外複製に関して限定されていた。

背景
キメラウイルスの研究は、ビルレンスの分子的基礎に新しい洞察を与え、ワクチン開発の新しい展望を与えた。例えば、プラス鎖アルファウイルス（Morris-Downesら、Vaccine 19：3877-3884、2001；Xiongら、Science 243：1188-1191、1991）およびフラビウイルス（Brayら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88：10342-10346、1991；Chambersら、J. Virol. 73：3095-3101、1999；Guirakhooら、J. Virol. 75：7290-7304、2001；Huangら、J. Virol. 74：3020-2038、2000）の分子クローンは、ウイルスエンベロープならびに中和、細胞接着、融合およびインターナリゼーションに関与する決定因子をコードする構造遺伝子の挿入によって改変されている。これらのキメラウイルスの複製は、親株によって発現される非構造タンパク質および非コード末端によって制御されるが、ドナー遺伝子からの構造タンパク質は特異的免疫を与える。キメラウイルスの生物学的特徴は、ドナーおよびレシピエントウイルス遺伝子の双方によって決定される。ドナー遺伝子の全域で、ヌクレオチド配列の差を有する構築物を比較することによって、ビルレンスおよび弱毒化における個々のアミノ酸残基の機能的役割を詳細に調べることが可能である。

日本脳炎（JE）の弱毒化株（SA14-14-2）からのprM-E遺伝子を組み入れたキメラ黄熱病（YF）ウイルスを用いて、弱毒化JEウイルスとビルレント野生型JE Nakayamaウイルスとを区別するアミノ酸10個の変異の役割について詳細に調べた（Arroyoら、J. Virol. 75：934-942、2001）。それぞれの変異を単一または集団で野生型配列に復帰させること、および脳内（IC）経路によって10⁴プラーク形成単位（PFU）を接種した若い成体マウスに対する神経ビルレンスに及ぼす作用を決定することによって、ビルレンス因子を定義した。単一部位復帰変異体ウイルスは全て、高度に弱毒化されたままであり、神経ビルレント表現型を回復するためには、3または4残基での復帰変異が必要であった。1種のみの単一部位復帰変異体（E279 Met→Lys）がビルレンスの変化の証拠を示し、動物8例中1例がIC接種後死亡した。

E279決定因子の機能的役割をさらに調べるために、本発明者らは、哺乳期マウスおよびサルにおける脳炎誘発能に関してこのアミノ酸残基で異なるキメラYF/JEウイルスを比較した。サルのIC接種は、フラビウイルスおよび他の生ワクチンの安全性の試験として日常的に用いられており、脳および脊髄組織の定量的病理的検査は、神経ビルレンスにおいて微妙な差を有する同じウイルスの株を区別するための高感度の方法を提供する（Levenbookら、J. Biol. Stand. 15：305-313、1987）。向神経性フラビウイルスに対する感受性は年齢依存的であるため、哺乳期マウスは、より高齢の動物より感度のよいモデルとなる（Monathら、J. Virol. 74：1742-1751、2000）。結果は、E279での単一のMet→Lysアミノ酸変異が神経ビルレンスの増加を付与したことを確認した。この変異は、Eタンパク質の「ヒンジ」領域に存在し、この領域は、エンドソームから感染細胞の細胞質にウイルスが侵入する際のpH依存的コンホメーション変化に関与する（Reedら、Am. J. Hyg. 27：493-497、1938）。重要なことに、哺乳期マウスは、アカゲザルにおけるビルレンスプロフィールを予測することが示された。点突然変異によって付与された神経ビルレンスの変化の検出に基づいて、本発明者らは、哺乳期マウスが向神経性のフラビウイルスワクチン候補の安全性試験のための適当な宿主であると提唱する。

神経ビルレンスを増強するにも関わらず、E279変異は、このウイルス形質の許容されたマーカーである、サルにおけるウイルス血症および抗体反応の減少によって測定すると、内臓向性に対して反対の作用を有するように思われた（Wangら、J. Gen. Virol. 76：2749-2755、1995）。

材料および方法
ウイルス
ChimeriVax（商標）-JEワクチンの開発は、YF 17Dウイルスの全11-キロベースゲノムのcDNAコピーをクローニングすることによって始まった（Chambersら、J. Virol. 73：3095-3101、1999）。これを行うため、ヌクレオチド（nt）1〜2276および8279〜10,861（プラスミドYF5'3'IV）、ならびにヌクレオチド1373〜8704（プラスミドYFM5.2）からのYF配列をそれぞれコードするYF 17Dゲノム配列を、二つのプラスミドにおいて増殖させた。これらのプラスミドに由来する適当な制限断片のライゲーションによって、完全長のcDNA鋳型を作製した。YF5'3'IVおよびYFM5.2プラスミド内のYF配列は、対応するJE（SA14-14-2）pr-ME配列によって置換され、TF5'3'IV/JE（prM-E'）およびYFM5.2/JE（E'-E）プラスミドが作製された。これらのプラスミドを、制限エンドヌクレアーゼNheIおよびBspEIによって連続的に消化した。適当な断片をT4 DNAリガーゼによってライゲーションして、cDNAをXhoI酵素によって消化して転写させ、Sp6プロモーターからRNAを産生した。完全長のRNAによる二倍体アカゲザル胎児肺（FRhL）細胞のトランスフェクションは、電気穿孔によって行った。細胞変性作用が認められた際に（通常、第3日）、ウイルスを含む上清を採取して、低速遠心によって透明にし、0.22 μmで濾過滅菌した。最終濃度50％v/vのウシ胎児血清（FBS）を安定化剤として加えた。ウイルスは、既に記述されているように（Monathら、Vaccine 17：1869-1882、1999）Vero細胞におけるプラークアッセイによって力価を測定した。キメラウイルスは感染多重度約0.001でFRhLまたはVero細胞（Vero-PM、Aventis Pasteur、Marcy 1' Etoile、France）において連続的に継代した。市販の黄熱病17Dワクチン（YF-VAX（登録商標））は、ペンシルバニア州スウィフトウォーターのAventis-Pasteur（前Pasteur-Merieux-Connaught）から入手した。

部位特異的変異誘発
残基E279での単一部位Met→Lys復帰変異を含むウイルスは、記述されたようにオリゴ特異的変異誘発によって作製した（Arroyoら、J. Virol. 75：934-942、2001）。簡単には、ヌクレオチド1108〜2472のJE SA14-14-2 E遺伝子領域を含むプラスミド（pBS/JE SA14-14-2）（Ceciliaら、Virology 181：70-77、1991）を部位特異的変異誘発の鋳型として用いた。変異誘発は、Transformer部位特異的変異誘発キット（Clontech、Palo Alto、CA）およびLife Technologies（Grand Island、NY）で合成したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行った。プラスミドは、唯一の変化が遺伝子操作された変異であることを確認するためにE領域全域についてシークエンシングした。E279変異を含む領域を、NheIおよびEheI（KasI）制限部位を用いてpBS/JEプラスミドからpYFM5.2/JE SA14-14-2（Ceciliaら、Virology 181：70-77、1991）にサブクローニングした。完全長のDNAの構築およびSP6転写は上記の通りに行った；しかし、Vero細胞のRNAトランスフェクションは、リポフェクチン（Gibco/BRL）を用いて行った。

シークエンシング
感染した単層からTrizol（登録商標）（Life Technologies）を用いてRNAを単離した。Superscript II逆転写酵素（RT）およびロングRTプロトコール（Life Technologies）によって逆転写を行った後、RNアーゼH処置（Promega）およびロングPCR（XL-PCR、Perkin-Elmer/ABI）を行った。RT、PCR、およびシークエンシングプライマーは、参照としてYF 17D株の配列（GenBankアクセッション番号K02749）およびJE-SA14-14-2株の配列（GenBankアクセッション番号D90195）を用いて設計した。PCR産物をゲル精製して（QiagenのQiaquickゲル抽出キット）、Dye-terminator dRhodamineシークエンシング反応ミックス（Perkin-Elmer/ABI）を用いてシークエンシングした。シークエンシング反応は、モデル310 Genetic Analyzer（Perkin-Elmer/ABI）において分析して、DNA配列をSequencher 3.0（GeneCodes）ソフトウェアを用いて評価した。

プラークアッセイおよび中和試験
プラークアッセイは、Vero細胞の単層培養の6ウェルプレートにおいて行った。37℃で1時間のインキュベートの間にウイルスを吸着させた後、細胞を栄養培地においてアガロースと共に重層した。第4日に、3％ニュートラルレッドを含む第二層を加えた。血清希釈、プラーク減少中和試験は、既に記述されたとおりに実施した（Monathら、Vaccine 17：1869-1882、1999）。

離乳マウスモデル
1群8〜10匹の雌性4週齢ICRマウス（Taconic Farms、Inc.、Germantown、N.Y.）に、E279変異を有する（用量4.0 log₁₀ PFU）、または有さない（3.1 log₁₀ PFU）キメラYF/JE SA14-14-2（ChimeriVax（商標）-JE）構築物30 μlをIC接種した。同数のマウスにYF-VAX（登録商標）または希釈剤を接種した。マウスを病気および死亡に関して21日間追跡した。

哺乳期マウスモデル
妊娠中の雌性ICRマウス（Taconic Farms）を、正確な年齢の哺乳マウスの同腹仔を得るために分娩の間観察した。48時間以内に生まれた複数の同腹仔から、哺乳期マウスをプールして、最大でマウス121匹の群の母親に無作為に再分配した。同腹仔にウイルスの連続10倍希釈液20 μlをIC接種して、病気および死亡の徴候に関して21日間追跡した。ウイルス接種物を逆滴定した。ReedおよびMuench（Morris-Downesら、Vaccine 19：3877-3884、2001）の方法によって50％致死量（LD₅₀）値を計算した。単分散生存分布をプロットして、ログランク検定（log rank test）によって比較した。

サルモデル
サル神経ビルレンス試験は、Levenbookら（Levenbookら、J. Biol. Stand. 15：305-313、1987）によって記述され、YF 17Dシードウイルスの安全性試験に関するWHO規則によって規制されている（Wangら、J. Gen. Virol. 76：2749-2755、1995）とおりに実施した。この試験はこれまで、ChimeriVax（商標）-JEワクチンの評価に適用されており、FRhL₃ウイルスに対する試験結果が記述された（Monathら、Curr. Drugs-Infect. Dis. 1：37-50、2001；Monathら、Vaccine 17：1869-1882、1999）。試験は、Sierra Biomedical Inc.（Sparks、NV）で、米国食品医薬品局の医薬品の安全性試験の実施に関する基準（GLP）規則（21 C.F.R.、58編）に従って実施した。第1日に、体重3.0〜6.5 kgのアカゲザル10匹（雄性5匹、雌性5匹）に、E279 Met→Lys変異を有するかもしくは有さない非希釈ChimeriVax（商標）-JEウイルス、またはYF-VAX（登録商標）0.25 mLを、脳の前頭葉に単回接種した。サルを臨床徴候に関して毎日調べて、0（徴候なし）、1（被毛の乱れ、摂食せず）、2（甲高い声、不活発、緩慢な動き）、3（不安的な動作、振戦、協調障害、肢弱）、および4（起立不能、肢の麻痺、死亡）として採点した。それぞれのサルの臨床スコアは、動物の毎日のスコアの平均値であり、処置群の臨床スコアは個々の臨床スコアの数学的平均値である。ウイルス血症レベルは、第2〜10日に採取した血清を用いたVero細胞におけるプラークアッセイによって測定した。第31日に、動物を安楽死させて、等張生理食塩液-5％酢酸を還流してから中性緩衝10％ホルマリンを還流して、剖検を行った。脳および脊髄を固定して、切片にしてガロシアニンによって染色した。神経ビルレンスは、中枢神経系の様々な解剖学的形成における病変の存在および重症度によって評価した。重症度はWHOによって明記された尺度を用いてそれぞれの組織片内で採点した（Wangら、J. Gen. Virol. 76：2749-2755、1995）：
段階1：最小：小さい巣状炎症浸潤物1〜3個。少数のニューロンが変化または失われることがある。
段階2：中等度：より広範囲の巣状炎症浸潤物。ニューロンの変化または喪失は、ニューロンの3分の1を超えて罹患していることはない。
段階3：重度：ニューロンの33〜90％に罹患するニューロンの変化または喪失；中等度の巣状または広範性の炎症変化。
段階4：圧倒的：90％を超えるニューロンが変化または失われ、多様ではあるが高頻度に重度の炎症性浸潤物を認める。

病理的プロセスに最も頻繁に、かつ最大の重症度で関係する構造は、「標的領域（target area）」と命名され、一方、野生型JEウイルスとChimeriVax（商標）-JEとを区別するような構造は、「識別子領域（discriminator area）」と命名された。YF 17Dに関して既に示されているように（Levenbookら、J. Biol. Stand. 15：305-313、1987）、黒質は「標的領域」を構成し、尾状核、淡蒼球、被殻、視床前核/視床外側核、視床内側核、および脊髄（頚膨大および腰膨大）は、「識別子領域」を構成した（Monathら、Curr. Drugs-Infect. Dis 1：37-50、2001）。神経病理学的評価は全て、処置コードを知らない経験のある試験者1人が行った。標的領域、識別子領域、および標的＋識別子領域について別個のスコアを、それぞれのサルについて決定し、平均スコアに関して試験群を比較した。他の脳幹領域（黒質の他の中脳の核；橋；髄質；および小脳）および軟髄膜も同様に調べた。神経病理スコア（標的領域、識別子領域、および標的＋識別子領域）の統計学的比較は、両側のスチューデントt検定によって実施した。神経病理学的検査の他に、肝臓、脾臓、副腎、心臓、および腎臓を光学顕微鏡により病理学的変化に関して調べた。

ゲノムの安定性
YF/JEキメラウイルスの遺伝的安定性を確認するため、およびワクチンゲノムにおいて変異に対して感受性である「ホットスポット」を検索するため、RNAを用いて細胞をトランスフェクトして、子孫ウイルスをインビトロで連続継代し、部分的または完全なゲノムシークエンシングを低いおよび高い継代レベルで行う、複数の実験を行った。継代シリーズは、FRhLまたはVero-PM細胞におけるトランスフェクション段階と共に開始して行った。ウイルスの連続継代はT25またはT75フラスコにおいて増殖させた細胞培養において低MOIで行った。選択された継代レベルで、ウイルスゲノムRNAの試料2個ずつを抽出して、逆転写し、PCRによって増幅して、prM-E領域または完全なゲノム配列を決定した。

結果
経験的継代による単一部位変異体ウイルスの作製
トランスフェクトしたFRhL細胞（FRhL₁）から回収したキメラYF/JE SA14-14-2（ChimeriVax（商標）-JE）ウイルスを、約0.001のMOIでこれらの細胞の液体培養において連続的に継代した。下記のように、4代目において、本発明者らはプラーク形態の変化を認め、これはその後、Eタンパク質の279位でのアミノ酸変化（Met→Lys）をもたらす、ヌクレオチド1818でのT→G転換に関連することが示された。

プラークを、それぞれの継代レベルで特徴を調べ、第6日に測定したそれらの大きさに基づいて三つに分類した（大型、L〜＞1.0 mm、中等度、M〜0.5〜1 mm、および小型、S〜＜0.5 mm）。プラークの大きさの分布は、プラーク100個を計数することによって決定した。FRhL₃（継代3代目）は、Lプラーク80〜94％およびSプラーク6〜20％を含んだ。FRhL₅（継代5代目）では、全体のプラーク集団の＞85％を含むSプラークの出現を伴う、プラークの大きさの変化を検出した。FRhL₄ウイルスは中間型であり、大型のプラークは40％および小型のプラークは60％であった。FRhL₅ウイルスの完全なゲノムシークエンシングにより、E279での単一変異が示された。FRhL₅キメラの完全なゲノムコンセンサス配列は、コドンの不均一性を注意深く調べ、これがウイルスに存在する唯一の検出可能な変異であったことが確認された。FRhL₃ウイルスの完全なゲノムコンセンサス配列は、親YF/JESA14-14-2キメラウイルスと比較して検出可能な変異がないことを明らかにした（Arroyoら、J. Virol. 75：934-942、2001）（表1）。

大型、中間型、および小型のプラーク10個をFRhL₃、FRhL₄、およびFRhL₅から採取して、FRhL細胞の液体培養での継代によって増幅した。増幅後、上清の液体にVero細胞上でプラークを形成させた。FRhL₃からSプラーク表現型を単離しようとする試みは失敗し、単離された全てのLまたはSサイズのプラークはFRhL細胞における増幅1ラウンド後に多数のLプラークを産生した。プラークの60％が小さいサイズである次の継代時（FRhL₄）には、FRhL細胞の増幅によってこれらのプラークを単離することができた。FRhL₅では、プラークの大多数（85〜99％）はサイズが小さく、LおよびSの個々のプラークの増幅は大多数がSサイズとなった。FRhL₃からのSおよびLプラーク表現型のprM-E遺伝子のシークエンシングから、ChimeriVax（商標）-JEの構築のために用いられる親SA14-14-2遺伝子と同一の配列が明らかになったが、FRhL₄またはFRhL₅ウイルスから単離したSプラークはE279での変異（Met→Lys）を示した。

動物のプロトコール
マウスおよびヒト以外の霊長類を含む試験は全て、Guide for Care and Use of Laboratory Animalsに記述されるUSDA動物福祉条例（9 C.F.R.、1〜3編）に従って実施した。

離乳マウスに対するビルレンス
4週齢の雌性ICRマウス10匹に、別個の実験において約3.0 log₁₀ PFUのFRhL₃、FRhL₄、およびFRhL₅ウイルスをIC接種した；それぞれの試験において、マウス10匹に、同等用量（約3.3 log₁₀ PFU）の市販の黄熱病ワクチン（YF-VAX（登録商標）、Aventis Pasteur、Swiftwater PA）を与えた。キメラウイルスを接種したマウスはいずれも病気の徴候または死亡を示さなかったのに対し、YF-VAX（登録商標）を接種した対照マウスの70〜100％が麻痺または死亡を示した。もう一つの実験において、マウス8匹にFRhL₅（3.1 log₁₀ PFU）またはYF/JE単一部位E279復帰変異体（4.0 log₁₀ PFU）をIC接種して、マウス9匹にYF-VAX（登録商標）（2.3 log₁₀ PFU）を与えた。キメラ構築物を接種したマウスはいずれも病気にならなかったが、YF-VAX（登録商標）を接種したマウス9匹中6匹（67％）が死亡した。

哺乳期マウスに対するビルレンス
E279変異を有するおよび有さないYF/JESA14-14-2キメラウイルスを哺乳期マウスに段階的な用量でIC接種する、という二つの別個の実験を行った（表2）。これらの実験においてYF-VAX（登録商標）を参照対照として用いた。LD₅₀および平均生存時間（AST）を、それぞれのウイルスに関して決定した。

8.6日齢のマウスを用いる第一の実験において、E279での単一部位復帰変異（Met→Lys）を含むFRhL₅ウイルスは、神経ビルレントであり、log₁₀ LD₅₀は、1.64であったが、この変異を欠損するFRhL₃ウイルスは、ほぼ無毒であり、最高用量群でもマウス10匹中1匹が死にかかっているに過ぎなかった（表2）。最高用量（約3 log₁₀ PFU）では、FRhL₅ウイルスのAST（10.3日）は、FRhL₃ウイルス（15日）より短かった。

次に、E遺伝子における単一部位変異が哺乳期マウスにおける神経ビルレンス試験によって検出可能であることを統計学的に確認するために、第二の実験を行った。この実験において、4日齢の非近交系マウスに、ChimeriVax（商標）-JE FRhL₃（変異なし）、ChimeriVax（商標）-JE FRhL₅（E279 Met→Lys）、または単一変異E279（Met→Lys）を部位特異的変異誘発（Arroyoら、J. Virol. 75：934-942、2001）によって導入したYF/JEキメラの段階的用量をIC接種した。E279変異を含む二つのウイルスのLD₅₀は、変異を有さないFRhL₃構築物より＞10倍低く（表2）、E279 Met→Lys変異が、キメラウイルスの神経ビルレンスを増加させたことを示している。ウイルス間の生存分布には統計学的に有意差を認めた（図1）。最低用量（〜0.7 log₁₀ PFU）では、YF/JEキメラウイルスは、YF-VAX（登録商標）より有意にビルレンスが低かった（ログランクp＜0.0001）。E279 Met→Lys変異を有するウイルスは、変異を有さないFRhL3とは異なる類似の生存曲線を示したが、差は、統計学的有意水準に達しなかった（ログランク、p＝0.1216）。しかし、より高用量（〜1.7および〜2.7 log₁₀ PFU）では、E279変異体ウイルスの生存分布は、FRhL₃ウイルスとは有意に異なった。

ウイルス用量による死亡率の分析は、類似の勾配の平行な回帰直線を示した（図2）。FRhL₅ウイルスは、FRhL₃より18.52倍強力（ビルレント）であった（95％信頼限界3.65および124.44、p＜0.0001）。

サルの神経ビルレンス試験
ChimeriVax（商標）-JE FRhL₃またはFRhL₅ウイルスを接種したサル20匹はいずれも脳炎の徴候を発症しなかったが、YF-VAX（登録商標）を接種したサル10匹中4匹は、第15〜29日のあいだに段階3の徴候（振戦）を示し、これは発症から6日以内に消失した。臨床スコアの平均値および最高平均値は、YF-VAX（登録商標）群では二つのChimeriVax（商標）-JE群より有意に高かった。E279変異を有するおよび有さないChimeriVax（商標）-JEウイルスを接種した群間の臨床スコアには差を認めなかった（表3）。

実験中、処置群間の体重変化に差を認めなかった。病理検査では、肝臓、脾臓、腎臓、心臓、または副腎にウイルスに帰因できる変化が見られず、処置群間に差を認めなかった。

脳および脊髄の組織病理試験は、YF-VAX（登録商標）を接種したサルでは、ChimeriVax（商標）-JEウイルスFRhL₃およびFRhL₅を接種したサルより有意に高い病変スコアを示した（表3）。YF-VAX（登録商標）に関して複合標的＋識別子スコア（±SD）は、1.17（±0.47）であった。ChimeriVax（商標）-JE FRhL₃（E279 Met）およびFRhL₅（E279 Lys）のスコアはそれぞれ、0.29（±0.20）（YF-VAX（登録商標）に対してp＝0.00014）および0.54（±0.28）（YF-VAX（登録商標）に対してp＝0.00248）であった。

E279でMet→Lys復帰変異を含むChimeriVax（商標）-JE FRhL₅に関する識別子領域スコアおよび複合標的＋識別子領域スコアは、ChimeriVax（商標）-JE FRhL₃の対応するスコアより有意に高かった（表3）。

YF-VAX（登録商標）を接種したサルの主症状は振戦であり、これは小脳、視床核、または淡蒼球の病変を反映する可能性がある。小脳皮質、小脳歯状核、または他の小脳核では明白な組織学的病変を認めなかったが、炎症病変は、陽性の全てのサルの視床核および淡蒼球に存在した。

興味深いことに、ウイルス血症によって反映されるように、E279復帰変異体の神経ビルレンスと内臓向性とのあいだには逆相関が存在した。WHOのサルの神経ビルレンス試験には、内臓向性の測定手段としてウイルス血症の定量が含まれる（世界保健機構、「Requirement for yellow fever Vaccine.」、Requirements for Biological Substances. 3号、1995年改訂、WHO Tech. Rep. Ser. 872、別冊2、Geneva：WHO、31〜68、1998）。これは、脳内接種によって、神経外組織の即時播種が起こるという知見に基づくと合理的である（Theiler、「The Virus」、Strode（編）、Yellow Fever、MacGraw Hill、New York、New York、46〜136、1951）。YF-VAX（登録商標）を接種したサル10匹中9匹（90％）およびChimeriVax（商標）-JE FRhL₃を接種したサル10匹中8匹（80％）がIC接種後ウイルス血症となった。ウイルス血症レベルは、YF-VAX（登録商標）群ではChimeriVax（商標）-JE FRhL₃群より高い傾向があり、第4日に有意に達した。対照的に、FRhL₅ウイルス（E279 Met→Lys）を与えた動物の2匹（20％）のみが、検出可能な低レベルウイルス血症を示し（表4）、平均ウイルス血症は、第3日および第4日にFRhL₃ウイルスより有意に（ならびに第5日でもほぼ有意に）低かった。このように、FRhL₅復帰変異体ウイルスは、神経ビルレンスの増加を示したが、FRhL₃ウイルスと比較すると内臓向性の低下を示した。ChimeriVax（商標）-JE FRhL₃およびFRhL₅を接種したサルからの血清を、プラークの大きさの変種の有無に関して調べた。FRhL₃を接種したサルの血清ではLプラークのみを認めたが、FRhL₅を接種したサルの血中のウイルスは、適当なSプラーク形態を示した。

免疫原性
三つ全ての群における全てのサルは、試料を失ったために試験できなかった動物1匹（FRhL₅、RAK22F）を除き、黄熱病（YF-VAX（登録商標）群）またはChimeriVax（商標）-JE（ChimeriVax（商標）群）の接種後第31日に同種中和抗体を産生した。しかし、幾何学的平均抗体力価（geometric mean antibody titer：GMT）は、FRhL₃を接種したサル（GMT 501）ではFRhL₅を接種したサル（GMT 169、p＝0.0386、t検定）より有意に高かった。

ゲノムの安定性
ChimeriVax（商標）-JE RNAの二つの別個のトランスフェクションを、二つの細胞株、FRhLおよびVeroのそれぞれにおいて実施し、子孫ウイルスを図3に示すように継代した。FRhL継代シリーズBでは、上記のようにFRhL₄でE279復帰変異体が出現した。興味深いことに、FRhL細胞における異なる継代シリーズ（A）によっても、隣接する残基であるE281で変異（Thr→Lys）が出現し、Vero細胞における継代シリーズの1つでは、E271でVal→Lysが生じた。Vero細胞において選択された他の変異は、ドメインIIIまたは膜貫通ドメイン内に存在した。図1に示した変異を含むウイルスを全て、成体マウスの神経ビルレンス試験において評価して、非ビルレントであることが判明した。

II．ヒンジ領域変異を含む黄熱病/デングキメラ
概要
キメラcDNAから転写されたRNAを用いたVero細胞のトランスフェクションにより、キメラ黄熱病-デング1ウイルス（ChimeriVax（商標）-DEN1）を作製した。変異を有さないワクチン候補を同定するために細胞培養上清をプラーク精製に供した。プラーク精製された10クローンより、いかなる変異も含まない唯一のもの（クローンJ）を、ワクチンウイルス産生のために選択した。しかしながら、ワクチン産生のためのこのクローンの細胞培養継代中に、単一のアミノ酸置換（KからR）がE204で起こった。同一の変異がもう一つのクローン（クローンE）でも観察された。この変異は、脳内経路により接種した4日齢の哺乳期のマウスに対してウイルスを弱毒化し、かつ皮下または脳内経路により接種したサルにおいてウイルス血症/内臓向性を低下させることが見いだされた。いずれかのウイルスを接種されたサル脳での病変の臨床スコアは、対照ウイルスYF-VAX（登録商標）のスコアに比べ統計学的に低かった。変異体および親（非変異体）ウイルスは共に、ヒト肝癌細胞系、HepG2において、YF-VAX（登録商標）より有意に低いレベルで増殖した。蚊の胸郭内に接種された場合は、両方のウイルス共にYF-VAX（登録商標）と類似のレベルまで増殖したが、これはそれらの野生型DEN1親ウイルスのレベルよりは有意に低かった。親ウイルスおよび変異体ウイルスのエンベロープタンパク質の構造の比較から、変異体ウイルスにおいては204R、261H、および257E間に新たな分子内結合が出現していることが明らかとなった。

材料および方法
細胞およびウイルス
ワクチン産生に用いたVero細胞は、認定された細胞バンク（Aventis Pasteur、France）より入手した。HepG2は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Manassas、VA）より購入した。3回プラーク精製されたChimeriVax（商標）-DEN1ウイルス（クローンE、Vero P6；およびクローンJ、Vero P7）は、インビトロRNA転写産物を用いたVero細胞のトランスフェクションおよびその結果生じたプラークにより調製された。ChimeriVax（商標）-DEN1ワクチンロット（VL）ウイルスを、P10で、プレマスターシード（PMS；クローンJ、Vero P7）ウイルスストックより、記載されたようにcGMP製造下で3回継代して産生した。野生型（WT）DEN1親（PUO359株、ChimeriVax（商標）-DEN1ウイルスのprME遺伝子のドナー）のストックウイルスをC6/36細胞にて調製した。YF-VAX（登録商標）（ワクチン株17D）はAventis Pasteur（France）より購入し、いかなる希釈もさらなる継代もなしに用いた。さまざまなクローン化されなかった、およびクローン化されたChimeriVax（商標）-DEN1ウイルスの特徴付けに関するさらなる詳細は、表5に提供される。

動物実験
全ての実験は、Guide for Care and Use of Laboratory Animalsに記述されるUSDA動物福祉条例（9 CFR、1〜3編）に従って、IACUC認可プロトコル下で実施した。

マウス
哺乳期のマウスにおいて、DEN1キメラの異なるクローンの神経ビルレンス表現型を評価した。妊娠中のICRマウスをTaconic Farm（Germantown、NY）より購入した。哺乳期のマウスを2〜3日齢でプールし母親に無作為に分配した（9〜12マウス/母親）。さまざまな希釈度のウイルス0.02mLを用いて、3〜4日齢のマウスにIC経路より接種した。マウスを21日間観察し、死亡率を記録した。各群の動物に投与したウイルス濃度を、Vero細胞に対するプラークアッセイにおける接種の逆滴定により決定した。

サル
E204変異を有するかまたは有さないChimeriVax（商標）-DEN1ウイルスの内臓向性（実験1）および神経ビルレンス（実験2）を評価するため、マカクザル（Sierra Division、Charles River Laboratories, Inc.、Sparks、Nevada）にて2つの実験を行った。第一の実験において、アカゲザル（Macaca mulatta）にSC経路よりキメラDEN1ウイルスを接種し、一方第二の実験においては、カニクイザル（Macaca fascicularis）にIC経路より接種した。2種は系統発生学的に関連しており、かつアカゲザルは入手不可能であることから、第二の実験にカニクイザルを選択した。アカゲザルの代わりとしてのカニクイザルの適合性を保証するため、ChimeriVax（商標）-DEN1〜4ウイルスおよびYF-VAX（登録商標）を用いたパイロット実験をあらかじめ行った。

実験1
雄性は2.7〜4.3年齢および雌性は2.6〜5.2年齢、投与前日に雄性は重さ3.6〜4.3kgおよび雌性は3.4〜4.6kgであった、全部で12匹（雄性6匹および雌性6匹）の、実験的に未処置の、フラビウイルス血清反応陰性のアカゲザルを、3つの処置群に割り当てた（n=4）。各動物はSC注射を介して3つのウイルスそれぞれの単回投与（50%ウシ胎仔血清（FBS）を含む最小必須培地（MEM）中の〜5 log₁₀ PFU/0.5mL ウイルス）を受けた：群1：ChimeriVax（商標）-DEN1（未クローン化ウイルス、Vero P4）；群2：ChimeriVax（商標）-DEN1（クローンE、Vero P6）；および群3：ChimeriVax（商標）-DEN1 PMS（クローンJ）。投与日を第1日とした。血液試料をウイルス血症分析のために第1日の投与前、および第2〜11日に、ならびに中和抗体分析のために第31日に回収した。実験に割り当てられる前に、動物は、血液生化学検査および血液学パラメーターの標準的なパネルの評価に加えて、腹部触診、ならびに皮膚、呼吸器系、および循環系の状態の観察を含む完全な身体検査を受けた。実験全体にわたり、動物を一般的な外見および行動（少なくとも毎日2回）、体重（毎週）、ならびに摂餌量（毎日）における変化について観察した。第31日の最終試料回収の後、全ての動物をSBi動物コロニーに戻した。

実験2
ChimeriVax（商標）-DEN1 PMS（クローンJ、P7）およびChimeriVax（商標）-DEN1 VL（P10）（それぞれ5 log₁₀ PFU）、ならびにYF-VAX（登録商標）対照ワクチン（4.7 log₁₀ PFU）を、フラビウイルス血清反応陰性であるとプレスクリーニングされた、実験的に未処置の、フラビウイルス血清反応陰性の18匹のカニクイザル（n=6/群）の左前頭葉への注射により投与（0.25mL）した。接種後、サルを30日間観察下に置き、次いで安楽死させ剖検した。選択された組織を全動物から切除し、病理組織学的評価の前にスライドに加工した。

観察期間中、サルを臨床徴候（毎日2回）、体重（毎週）、および摂餌量（毎日）における変化について評価した。臨床徴候は、世界保健機構（WHO）の黄熱病ウイルスワクチン要件（世界保健機構、「Requirement for yellow fever vaccine.」、Requirements for Biological Substances 3号、1995年改訂、WHO Tech. Rep. Ser. 872、別冊2、Geneve：WHO、31-68、1998）に基づく、臨床スコア系に従って割り当てられたスコアである。血液試料を臨床病理学分析（血液生化学検査および血液学パラメーター）のために第1日の実験前および接種前、ならびに第3日、5日、7日、15日、および31日に回収した。さらなる血液試料をウイルス血症分析のために第1日の接種前、および第2〜11日に、ならびに中和抗体反応測定のために第1日（投与前）および第31日に回収した。

剖検において、肉眼的病理所見を記録し、完全な組織一覧を回収し保存した。選択された一部の組織からスライドを調製し、研究病理学者が組織病理学的所見について検査した（肝臓、脾臓、心臓、腎臓、および副腎）。脳および脊髄の組織病理学を、WHOのYFワクチン要件に従って、神経病理学者が行った。組織病理学的評価は盲検様式にて実施した。髄膜および脳/脊髄物質における病変を、以下の観察に従って0〜2の尺度を用いて採点した：段階0：可視病変なし；段階1：（最小）、大部分は血管周囲の1〜3個の小さいおよび/または1個の大きな浸潤物、血管に接続していない少数のより拡散した浸潤の小さな病巣；および段階2：（軽症）、3個より多い小さい血管周囲浸潤物および/または2個もしくはそれ以上の大きな血管周囲浸潤物、血管に接続してない数個の細胞浸潤病巣（これらの炎症病巣中にいくつかのニューロンが含まれ得る）。神経ビルレンスの程度を標的領域および識別子領域について評価した。カニクイザルにおいて、黒質ならびに脊髄の頚膨大および腰膨大が標的構成体を代表するが、一方基底核および視床核は識別子領域と見なされる。標的領域および識別子領域についての個々のおよび群の平均病変スコアは、別個におよび複合スコアとして計算する。

プラークアッセイ
Vero細胞を用いる標準的なプラークアッセイを感染後第2〜11日から得た血清（非希釈、または1:2および1:10希釈物）に対して行った。ウイルス血症力価をPFU/mLとして表した。Vero細胞を用いるプラーク減少法を、相同ウイルス（キメラまたはYF-VAX）に対する中和抗体反応の測定に用いた。この試験において、一定のウイルス投入（〜50〜100PFU）をさまざまな血清希釈物（加熱不活性化された）により中和し、力価を50%のプラークを阻害した血清の最も高い希釈度として表した（PRNT₅₀）。

HepG2細胞における増殖速度論
HepG2細胞を、8% FBS（Hyclone）および抗生物質/抗真菌（Sigma）を補ったEagles MEM（Vitacell）中で、コンフルエントまでT25フラスコ中で37℃、5% CO₂にて増殖させ、ChimeriVax（商標）-DEN1 PMS、ChimeriVax（商標）-DEN1 VL、または親ウイルス（YF-VAX（登録商標）およびWT DEN1、PUO359株）を用い、0.001のMOIにて1時間感染させた。接種原を除き、結合していないウイルスを除くためにPBSで細胞を三回洗浄し、培養物に成長培地を添加した。毎日試料を除き（10日間）、ウイルスの感染性を保つためFBSを最終濃度50%となるよう添加して、試料を-70度で保存した。ウイルス力価を、寒天二重層およびニュートラルレッドを用いた、Vero細胞に対するプラークアッセイにより決定した。

蚊伝染
プエルトリコ由来のネッタイシマカ（Aedes aegypti）の実験室で確立されたコロニーのF4世代に、ChimeriVax（商標）-DEN1 PMS（P7）、ChimeriVax（商標）-DEN1 VL（P10）、または対照の親（YF 17DおよびWT DEN1、PUO359株）ウイルスを接種した。蚊を冷凍麻酔し、Narishige（Tokyo）ニードルプーラー（needle puller）によりある程度牽引したミクロキャピラリー針を用いて、経口摂取に関連した中腸における潜在的な感染障壁を除外するために胸腔内（IT）接種した。6.0 log₁₀ PFU/mLに標準化した約0.34μlのウイルスをそれぞれの蚊に注射した（2.5 log₁₀ PFU/蚊）。接種した蚊をカートン中で、27℃、湿度80%にて、5%砂糖水を用いて維持した。10日間、48時間間隔で感染毎に3匹の蚊を除き；残りの蚊を接種後14日で回収し、アッセイするまで-70℃で凍結した。感染性ウイルス力価をリアルタイムRT-PCR（TaqMan）により決定した。プライマーおよびプローブをPrimerExpressソフトウェアパッケージ（PE Applied Biosystems、Foster City、CA）を用いて設計した。TaqManプローブは、5'末端をFAMレポーター色素で、3'末端をdark quencher色素で標識した。ChimeriVax（商標）-DENプライマーはそれぞれ血清型特異的で、一方YF 17DプライマーはChimeriVax（商標）-DENおよびYF 17Dウイルスの両方を検出した。

統計分析
DEN1クローンまたはYF-VAX（登録商標）を接種された哺乳期マウスの群間の平均生存時間（AST）の差を、積極限生存適合（Product-Limit Survival Fit）を用いて、有意性について分析した。動物の2つの群間または3つ以上の群間の有意水準についての、他の確率分析は全て、一元配置分散分析（oneway ANOVA）検定を用いて行った。0.050またはそれ未満の観察された有意確率を、分散分析モデルがデータに適合している証拠であると見なすことが多い。全ての分析はJMPソフトウェアバージョン 5.1を用いて行った。

結果
哺乳期マウスにおけるDEN1キメラのさまざまなクローンの神経ビルレンス特性
DEN1キメラのPMS産生過程におけるプラーク精製の間に、10個の異なるクローン（A〜J）をシークエンシングして、いかなるアミノ酸置換をも有さないクローンを同定した。1つのクローン（J）を除いて全てのクローンがエンベロープタンパク質E内に1つまたは2つの置換を含んでいた。代表的なクローンを、それらの神経ビルレンスに関して、IC経路より接種した4日齢の哺乳期マウスを用いて評価した（表6）。クローンEを除く全てのクローンが、8.5〜11.3日のASTで、類似の神経ビルレンスを示し、これはYF-VAX（登録商標）（8.3日）より有意に高かった。2つの変異（1590でのAからGへの1ヌクレオチド変化はKからRへの置換をもたらし、3952でのAからTへの1ヌクレオチド変化は無変化であった）を含むクローンEは、ASTが13〜15日である他の全てのDEN1クローンより、ビルレンスが有意に低い。興味深いことに、元の、クローン化されていないDEN1キメラのEタンパク質上に同定された唯一のアミノ酸変化はもまたE204のKからRへの置換であった。このウイルスは、SC経路によりサルに接種された場合、低レベルのウイルス血症を1.3日間誘導することが示された（平均最高力価0.7 log₁₀ PFU/mL)（Guirakhooら、J. Virol. 75（16）：7290-7304、2001）。あらゆる変異を含まず、4日齢のマウスにおいてYF-VAX（登録商標）よりビルレンスが有意に低いことが示された（表6の統計を参照されたい）クローンJを、cGMPワクチンウイルスの産生のために選択した。クローンEの乳仔マウスに対する弱毒化が、サルにおける低度の内臓向性/ウイルス血症、および/または免疫原性に相関しているか決定するため、このクローンおよびクローンJ（PMS）をSC経路によりサルに接種した（下記を参照されたい）。

実験1．SC経路により接種したサルにおけるE204変異を有するかまたは有さないChimeriVax（商標）-DEN1ウイルスのウイルス血症/内臓向性および免疫原性
12匹のフラビウイルス血清陰性アカゲザルを3群に分けた（n=4）。各群に含まれる動物に、表7に示すように皮下（SC）注射を介して3種のウイルスそれぞれの単回投与（〜5 log₁₀ PFUウイルス/0.5mL）を与えた。1か月の観察期間中に、臨床徴候、摂餌量、または体重についての試験項目に関連した変化は見いだされなかった。

ウイルス血症および中和抗体反応
表7に示すように、DEN1 PMSウイルス（クローンJ、第3群）を接種した4匹のサル全てがウイルス血症となったが、クローンEまたはクローン化されていないDEN1ウイルスを接種したサルのそれぞれ4匹中3匹および4匹中2匹がウイルス血症となった。第3群の動物4匹全てで試料回収の最終日（第11日）までにウイルス血症を検出したが、第5日を過ぎた第1群および第2群の動物にウイルス血症は見られなかった（検出レベル1 log₁₀PFU/mL）。平均最高ウイルス力価は、第1〜3群でそれぞれ0.75（ウイルス血症の動物では1.5）、1.3（ウイルス血症の動物では1.7）、および2.5 log₁₀PFU/mLであった。ウイルス血症の平均持続時間は、第1〜3群でそれぞれ1（ウイルス血症の動物では2）、1.5（ウイルス血症の動物では2）、および8.5日間であった。第3群のサルでのウイルス血症の強度および持続時間は第1群および第2群の動物のそれらより有意に高度であった（表8の統計を参照されたい）。何匹かのサルはウイルス血症を有さないにもかかわらず、全ての動物が相同ウイルスに対する中和抗体力価を生じた（表7）。中和抗体幾何平均（GMT PRNT₅₀）は、第1〜3群でそれぞれ538、3620、および8611であった。ウイルス血症のレベルに一致して、PMSウイルス（第3群、変異なし）で免疫化されたサルでの中和力価が、他の2群（第1群および第2群、変異あり）よりも有意に高かった（表7の統計を参照されたい）。第1群のサルの血清（エンベロープタンパク質上に2つのアミノ酸置換、M39 H>RおよびE204 K>Rを有するDEN1キメラを用いて免疫化された）が最も低い中和力価を示した。

実験2．IC経路により接種したサルにおけるE204変異を有するかまたは有さないChimeriVax（商標）-DEN1ウイルスの安全性/神経ビルレンス
エンベロープタンパク質E上にKからRへの単一アミノ酸置換を含むクローンEによる哺乳マウスの接種から、この部位が、乳仔マウスに対するDEN1キメラの神経ビルレンスに関与していることが示された。その後、このクローンがSC経路によりサルに接種された場合には、それは非変異体ウイルス（クローンJ PMS、P7）に比べ、強度および持続時間において有意に低度のウイルス血症を誘導した。興味深いことに、クローンJがVero細胞中で継代されP10でcGMP VLを産生した場合に、クローンEで観察されたのと同じヌクレオチド変化（KからRへの置換をもたらす、ヌクレオチド1590のAからGへ）を獲得した。乳仔マウスで試験した場合には、同様にワクチンウイルス（P10）はPMS（P7）より低ビルレントであった。DEN1ワクチン（P10）の弱毒化はEタンパク質上の単一アミノ酸置換（E204R）に依存しており、それは理論的にはワクチン接種された個体内でWT配列（E204K）に戻り得ることから、脳組織に直接注射された場合の非変異体ウイルス（WTエンベロープ）の安全性プロフィールを決定する必要があった。

3群のサル（n=6）にChimeriVax（商標）-DEN1 PMS（P7、E204K）、ChimeriVax（商標）-DEN1 VL（P10、E204R）、またはYF-VAX（登録商標）（対照として）をIC経路により接種した。動物を31日間臨床徴候についてモニターし、次いで病理学的評価のために屠殺した。

ウイルス血症
ChimeriVax（商標）-DEN1、PMSウイルスを接種したサル6匹（第1群）全てがウイルス血症になった。ウイルス血症の持続時間は通常4〜5日間で、最高力価は1〜3.3 log₁₀ PFU/mLの範囲であった（表9）。平均最高ウイルス血症は2.5 log₁₀ PFU/mLで、平均持続時間は4.2日間であった（表10）。ChimeriVax（商標）-DEN1 VLウイルスを接種したサル6匹（第2群）中5匹がウイルス血症になった。ウイルス血症の持続時間は通常1〜4日間で、最高力価は1〜2.1 log₁₀ PFU/mLの範囲であった（表9）。平均最高ウイルス血症は1.4（ウイルス血症の動物では1.6） log₁₀ PFU/mLで、平均持続時間は2.5日間（ウイルス血症の動物では3日間）であった（表10）。

YF-VAX（登録商標）を接種したサル6匹（第3群）全てがウイルス血症になった。ウイルス血症の持続時間は通常2〜4日間で（1匹例外があり、1 log₁₀ PFU/mlのウイルス力価が4日間の検出不能な力価の後で接種後9日目に観察された）、最高力価は1〜3 log₁₀ PFU/mLの範囲であった（表9）。平均最高ウイルス血症は2.2 log₁₀ PFU/mLで、平均ウイルス血症日数は2.8日間であった（表10）。第1群のウイルス血症の最高力価および持続時間は第2群より有意に高かった。第1群（P7）を第3群（YF-VAX（登録商標））と比較した場合には、2群間で、持続時間のみが有意であり、ウイルス血症の強度は有意でなかった。P10ワクチンウイルス（第2群）のウイルス血症および持続時間はYF-VAXに類似していた（統計については表10を参照されたい）。

WHOの黄熱病ウイルス17Dワクチン要件の下で確立された通り、全群において、サルウイルス血症力価は、それぞれ個々のサルおよび群（すなわち、サルの10%以下に存在する）力価について許容される最大力価である、500および100のマウスIC LD₅₀値を下回る（YF-VAX（登録商標）についてそれぞれ〜20,000および〜4,000 Vero細胞PFU/0.03mL（Guirakhooら、Virology 257:363-372、1999）に等しいと推定される）。

免疫原性
全てのサルはYF-VAX（登録商標）による処置後に抗体陽転した。第31日にYFウイルスに対するPRNT₅₀は640〜2560の範囲であった。YF-VAX（登録商標）処置されたサルの1匹は、第31日のPRNT₅₀アッセイにおいて、異種DEN1への交差反応性を有した。そのような抗体交差反応性はフラビウイルス間で予想外ではない。しかしながら、このサルの、試験前の抗体スクリーニングで検出されなかった異種フラビウイルスへの、遠隔性の曝露を除外することはできない。

ChimeriVax（商標）-DEN1 PMSまたはChimeriVax-DENワクチンウイルスによる処置後、全てのサルは抗体陽転した（表9）。ChimeriVax（商標）-DEN1 PMSおよびChimeriVax（商標）-DENワクチン処置された群において、PRNT50はそれぞれ1280〜5120および2560〜10240の範囲であり、YF 17Dウイルスに交差反応性の抗体を有するサルはなかった。ChimeriVax（商標）-DEN1処置群の両方共について抗体レベルはウイルス血症レベルとは逆に変化した（表9の統計を参照されたい）。

組織病理学
微小病変は、ChimeriVax（商標）-DEN1 PMSウイルスを接種したサルの6匹中1匹で、ChimeriVax（商標）-DEN1 VLを接種したサルの6匹中3匹で見いだされた（表11）。YF-VAX（登録商標）を接種したサルの6匹中5匹に病変が存在した。これらの病変は全て炎症性で、最小および軽度の重症度を有し、組織球およびリンパ球からなっていた。髄膜浸潤が主に接種部位の周辺に見られた。わずかな、主に血管周囲の浸潤物が陽性のサルの脳および/または脊髄に認められた。いずれの動物でもニューロンの関与はなかった。ChimeriVax（商標）-DEN1処置群における病変は一般的に最小（段階1）で、段階2の病変はChimeriVax（商標）-DEN1 VLを与えたサルF22205Mの1つの脳切片のみに見いだされた。YF-VAX（登録商標）処置群においては、4匹のサルの多数の脳切片中に段階2の病変が存在した。標的領域および識別子領域についての個々のおよび群の平均病変スコアおよび複合スコアを表11に示す。

非中枢神経系（CNS）組織では、ワクチンに関連した唯一の組織病理学的所見は、ChimeriVax（商標）-DEN1（P7）、ChimeriVax（商標）-DEN1（P10）、またはYF-VAX（登録商標）により処置した動物の、それぞれ6匹中4匹、6匹中3匹、および6匹中6匹における、最小から軽度の脾性リンパ組織過形成であった。リンパ組織過形成は本研究における免疫刺激のための二次的なものと考えられた。

CNS病変はChimeriVax（商標）-DEN1（P7）、ChimeriVax（商標）-DEN1（P10）、またはYF-VAX（登録商標）を接種したサルの、それぞれ6匹中1匹、6匹中5匹、および6匹中5匹において観察された。これらの病変は全て炎症性で、最小および軽度の重症度（段階1または段階2）を有した。わずかな、主に血管周囲の浸潤物が、病変を有するそれらのサルの脳および/または脊髄に認められた。いずれの動物でもニューロンの関与はなかった。ChimeriVax（商標）-DEN1 VL（P10）を与えた1匹のサルの1つの脳切片は軽度（段階2）の病変を有したが、ChimeriVax（商標）-DEN1処置群における病変は一般的に最小（段階1）であった。YF-VAX（登録商標）処置群においては、4匹のサルの多くの脳切片中に段階2の病変が存在していた。ChimeriVax（商標）-DEN1 PMSウイルスおよびChimeriVax（商標）-DEN1 VL処置群についての、標的領域、識別子領域、および複合病変スコアは、基準のYF-VAX（登録商標）処置群についてのスコアよりずっと低かった（表11の統計を参照されたい）。2つのChimeriVax（商標）-DEN1処置群についての標的領域と識別子領域の病変スコアの差は統計学的に有意ではなかった（表11）。

E204変異を有するかまたは有さないChimeriVax（商標）-DEN1ウイルスのHepG2肝癌細胞における増殖速度論
ChimeriVax（商標）-DEN1および親WT DEN1ウイルスは両方ともYF 17Dウイルスより遅くかつ著しく低い力価にまで増殖した。WT DEN1、ChimeriVax（商標）-DEN1 PMS（E204K）、ChimeriVax（商標）-DEN1 VL（E204R）、およびYF17Dウイルスについて、最高力価はそれぞれ第9日、8日、7日、および5日に見られた。最高レベルでのウイルス濃度は、WT DEN1、ChimeriVax（商標）-DEN1 PMS、ChimeriVax（商標）-DEN1 VL、およびYF17Dウイルスについて、それぞれ〜3.2、3.6、4.1、および7.8 log₁₀ PFU/mlであった（図5）。

E204変異を有するかまたは有さないChimeriVax（商標）-DEN1ウイルスの蚊における増殖
この実験の根拠は、ChimeriVax（商標）-DEN1変異体ワクチンが、それがワクチン接種された個体内WT配列に復帰してしまったとしても、ヒト宿主内で安全性を保ち、かつ蚊の中で複製しないことを保証することである。ChimeriVax（商標）-DEN1ウイルスの自己複製および播種を蚊において評価した。ネッタイシマカに、IT経路により、ChimeriVax（商標）-DEN1 PMS（E204K P7）、ChimeriVax（商標）-DEN1 VL（E204R、P10）、WT DEN1（PUO359株）、またはYF 17Dウイルスを接種し、複製速度を比較した。2つのキメラウイルスとYF 17Dの間に有意な差はなかった。WT DEN1の力価は、両方のChimeriVax（商標）-DEN1ウイルスより、約0.5〜2.5 log高かった（図6）。

DEN1 Eタンパク質の結晶構造上の変異204の位置
DEN1 Eタンパク質エクトドメインの394残基の構造（POU359株、ChimeriVax（商標）-DEN1（PMS、E204K、wt、p7）のEタンパク質に相当する）を、Accelrysのホモロジーモデル化ソフトウェアを用いて、DEN2ウイルスの公知の構造（Modisら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100（12）：6986-6991、2003）に基づきモデル化した（図7Aおよび図7B）。204位のK残基をRに変異し、ChimeriVax（商標）-DEN1（E204R、変異体、VL、P10）ウイルスのEタンパク質構造を示すために、変異体ウイルスについてモデル化を繰り返した（図7C）。残基204はドメインIIの2つのβストランド、fおよびgを繋ぐ短いループ内に位置し（図7A）、2つのαへリックス、α-Aおよびα-Bに近接している。ドメインIIはその先端に保存された融合ペプチドもまた有する。この短いループは、神経ビルレンスまたはウイルス融合に対するpH閾値に影響を与える残基により裏打ちされる疎水性ポケット内に位置する（Modisら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100（12）：6986-6991、2003）。図7Bは棒表示により示される、図7Aのアミノ酸204Kを有する相当領域の拡大図である。204Kおよび261H側鎖の窒素（N）原子は、それぞれ252V（2.7Å隔たった）および253L（2.65Å隔たっている）側鎖の酸素（O）原子と水素結合を作る（図7B）。対照的に、204でのKからRへの変異は、コンホメーションの変化をもたらし、204Rおよび261Hの252Vおよび253Lへの距離はそれぞれ5.10Åおよび8.11Åに増大する。この移動により、これらの残基の間の分子間（2つのE単量体間の）水素結合が失われる。これら2つの水素結合の喪失を補償するため、変異体ウイルス204R側鎖のN原子が3つの新たな分子内（同一のE単量体内で）結合を作る；204RのNと261Hおよび257EのNおよびO原子との間（それぞれ、3.01Å、3.07Å、および2.78Å隔たっている）（図7C）。RとEのアミノ酸の間の相互作用は、それら両方が中性pHにおいて荷電していることから、恐らく水素結合ではなく塩橋である。もう一つの興味深い観察は、変異体ウイルス中の261Hの側鎖が、WT構造におけるその位置と比べ、裏返っていることである（図7Bおよび図7Cにおいて261Hの位置を比較されたい）。

（表１）ChimeriVax（商標）-JE FRhL₃およびChimeriVax（商標）-JE FRhL₅ウイルスのEタンパク質の、JE SA14-14-2ワクチン、野生型JE株、親SA14、およびNakayamaウイルスの公表された配列とのアミノ酸差異の比較。ChimeriVax（商標）-JE FRhL₃およびFRhL₅ウイルスをそれらのゲノム全域にわたりシークエンシングしたところ、E279での変異が唯一見いだされた差異であった。

¹Nitayaphanら、Virology 177：541-552、1990
²Niら、J. Gen. Virol. 75：1505-1510、1994；PDK=初代イヌ腎臓
³Aiharaら、Virus Genes 5：95-109、1991；PHK= 初代ハムスター腎臓
⁴McAdaら、Virology 158：348-360、1987

（表２）E279に変異を有するおよび有さないChimeriVax（商標）-JEウイルス、ならびにYF 17Dワクチンの、哺乳期マウスに対する神経ビルレンス

（表３）ChimeriVax（商標）-JE FRhL₃、FRhL₅、または黄熱病17D（YF-VAX（登録商標））を用いてIC接種され、接種後第30日に剖検されたサルの神経病理学的評価

¹逆滴定
²臨床スコア：0=徴候なし；1=被毛の乱れ、摂食せず；2=甲高い声、不活発、緩慢な動き；3=振戦、共調運動不能、不安定な動作、肢弱；4=起立不能、麻痺、瀕死、または死亡。任意の日の最大スコアおよび30日の観察期間中にわたる平均スコアが示される。
³黒質
⁴線条体および視床、右側および左側（尾状核、淡蒼球、被殻、視床前/外側核、視床外側核；脊髄の頚膨大および腰膨大（6レベル））
⁵異分散の両側のスチューデントt検定、YF-VAX（登録商標）とChimeriVax（商標）-JEウイルスの比較。
⁶実施せず

（表４）ウイルス血症、YF-VAX（登録商標）またはChimeriVax（商標）-JE FRHL₃およびFRHL₅ウイルスを用いてIC接種したアカゲザル（接種した用量については、表3を参照されたい）

¹- =検出可能なウイルス血症はなく；多くの試験では希釈していない血清が試験され、カットオフは1.0 log₁₀ PFU/mLであった）；いくつかの場合では、希釈していない血清が細胞に対し毒性であり、1:2または1:5に希釈した血清を用いた（カットオフは1.3または1.7 log₁₀ PFU/mL）。
²平均力価および標準偏差の計算のため、<1.0の所には0.7を、<1.3の所には1.0を、および<1.7の所には1.4を用いた。
³両側t検定によるYF-VAX（登録商標）との比較
⁴両側t検定によるChimeriVax（商標）JE FRhL₃との比較

（表５）ChimeriVax-DEN1ウイルスの未クローン化の、およびさまざまなクローンのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列、ならびにそれらのインビトロ（Vero継代）の遺伝的安定性

^a：ゲノムの最初から。^b：示したタンパク質のN末端から；番号付けはRiceら、Science 229：726-733、1985に従った。204変異を有するクローンを太字で示す。

（表６）IC経路により接種した4日齢マウスにおける、ChimeriVax（商標）-DEN1ウイルスのさまざまなクローンの神経ビルレンス

^a：太数字で示すP値は統計学的に有意であると考えられる。
^b：逆滴定
^c：平均生存時間

（表７）5 log₁₀ PFU/0.5mlの各ChimeriVax（商標）-DEN1ウイルスを用いてSC接種したサルにおける、ウイルス血症および中和抗体反応

^a：太数字で示すP値は統計学的に有意であると考えられる。
^b：サルは第1日に免疫化した。
^c：<1.0 log₁₀ PFU/mL。

（表８）表7に示されたウイルス血症の概要

^a：太数字で示すP値は統計学的に有意であると考えられる。
^b：ウイルス血症の動物のみ。

（表９）ChimeriVax（商標）-DEN1 PMSもしくはChimeriVax（商標）-DEN1 VLウイルス（それぞれ、5 log₁₀ PFU/0.25ml）、またはYF-VAX（登録商標）（4.7 log₁₀ PFU/0.25ml）を用いてIC接種した後のサルにおける、ウイルス血症および中和抗体反応

（表１０）表9に示されたウイルス血症の概要

（表１１）ChimeriVax（商標）-DEN1 PMSもしくはChimeriVax（商標）-DEN1 VLウイルス（それぞれ、5 log₁₀ PFU/0.25ml）、またはYF-VAX（登録商標）（4.7 log₁₀ PFU/0.25ml）を用いてIC接種した後のサルにおける、脳および脊髄の組織学的評価（病変スコア）

^a：太数字で示すP値は統計学的に有意であると考えられる。

YF-VAX（登録商標）、およびE279（M→K）に変異を有する、および有さないChimeriVax（商標）-JE構築物の生存分布を示す一連のグラフである。約0.7 log₁₀ PFU（図1A）、約1.7 log₁₀ PFU（図1B）、および〜2.7 log₁₀ PFU（図1C）を用いて脳内経路より接種された4日齢の哺乳期マウスを示す。 MetからLysへの復帰を有する（FRhL₅）ウイルスおよび有さない（FRhL₃）ウイルスについて類似した勾配および平行な直線を示す、ウイルス用量に対する死亡率の回帰分析のグラフであり、統計的な比較を可能としている。FRhL₅ウイルスはFRhL₃より18.52倍強力（ビルレント）であった（p<0.0001）。 FRhLおよびVero細胞におけるChimeriVax（商標）-JEウイルスの、独立したRNAトランスフェクションおよび一連の継代の結果を示す。継代レベルによるprME遺伝子における変異の出現が示されている。 FRhLまたはVero細胞における適応により生じたヒンジ領域における変異の位置を示す、フラビウイルスエンベロープ糖タンパク質エクトドメインの三次元モデルである。JEエンベロープ糖タンパク質（JaOArS982株；Sumiyoshiら、Virology 161：497-510、1987）の配列を、LOOKソフトウェア（Molecular Application Group、Palo Alto、CA）を用いるSegMod（Segment Match Modeling）法による、自動化されたホモロジーモデル化構築のための入力として、TBEの構造テンプレート（Reyら、Nature 375：291-298、1995）の一つに対し整列させた。 HepG2細胞における、ChimeriVax（商標）-DEN1 PMS（wt prME、P7）、ChimeriVax（商標）-DEN1（エンベロープタンパク質E中にKからRのアミノ酸置換を含む（E204KからR）、P10)ワクチン、WT DEN1 PUO359、およびYF-VAX（登録商標）の増殖速度論を示すグラフである。■：WT DEN1（親PUO359）、◆：ChimeriVax（商標）-DEN1 P7、▲：ChimeriVax（商標）-DEN1 P10、および●：YF-VAX。 IT接種されたネッタイシマカ中でのウイルスの増殖を示すグラフである。IT接種されたネッタイシマカ中での、ChimeriVax（商標）-DEN1 PMS（（wt prME、P7）、ワクチン（エンベロープタンパク質E中にKからRのアミノ酸置換を含む（E204KからR）、P10)、YF-VAX（登録商標）、およびWT DEN1（PUO359株、ChimeriVax（商標）-DEN1ウイルスのprME遺伝子のドナー）ウイルスの増殖を示す。■：WT DEN1（親PUO359）、◆：ChimeriVax（商標）-DEN1 P7、▲：ChimeriVax（商標）-DEN1 P10、および●：YF-VAX。 ChimeriVax（商標）-DEN1ウイルスのDEN1 Eタンパク質二量体（アミノ酸1〜394）の構造を示す3次元モデルである。A：P7（PMS、204K）ウイルスの残基204の正に荷電したリジン（K）アミノ酸の位置をCPK（ファンデルワールス（VDW）半径のサイズの球を示す）表示により示す。3つの構造上のドメインを赤色（ドメインI）、黄色（ドメインII）、および青色（ドメインIII）により規定した。構造は、Accelrys Inc. （San Diego、CA）からのホモロジーモデル化ソフトウェア（DS modeling 1.1）を用いて、Modisら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100（12）：6986-6991、2003により寄託されたタンパク質データバンクから得たDEN2ウイルスの原子配位（1OKE.pdb）に基づき構築された。B：棒表示で示されるKアミノ酸を含む、Aで印を付けた領域の拡大図である。C：変異体DEN1ウイルス（P10、204Rを赤で示す）のEタンパク質モデルからの、Aと同じ領域である。204Kまたは204Rの窒素（N）と261HのNまたは252V（反対側の鎖）の酸素（O）間の距離がオングストローム単位で示されている。BおよびCで、選択されたアミノ酸が棒表示で示されている。灰色、炭素（C）；青色、窒素（N）；赤色、酸素（O）、および黄色、硫黄（S）。

Claims

フラビウイルスを弱毒化するヒンジ領域変異を含む、フラビウイルス。
変異がフラビウイスルの内臓向性を低下させる、請求項1記載のフラビウイルス。
フラビウイルスが黄熱病ウイルスワクチン株を含むか；デング熱ウイルス、西ナイルウイルス、ヴェセルスブロンウイルス、キャサヌール森林病ウイルス、およびオムスク出血熱ウイルスからなる群より選択される内臓向性フラビウイルスであるか；またはキメラフラビウイルスである、請求項1記載のフラビウイルス。
キメラフラビウイルスが、第一のフラビウイルスのカプシドおよび非構造タンパク質、ならびにキメラフラビウイルスを弱毒化するエンベロープタンパク質の変異を含む第二のフラビウイルスのプレ膜およびエンベロープタンパク質を含む、請求項3記載のフラビウイルス。
第二のフラビウイルスが日本脳炎ウイルス、またはデング-1、デング-2、デング-3、およびデング-4ウイルスからなる群より選択されるデング熱ウイルスである、請求項4記載のフラビウイルス。
変異がエンベロープタンパク質のヒンジ領域の疎水性ポケット内にある、請求項1記載のフラビウイルス。
第二のフラビウイルスがデング熱ウイルスであり、変異がデングエンベロープのアミノ酸202位もしくは204位のリジン、ならびにデングエンベロープのアミノ酸252、253、257、258、および261の任意の一つまたは複数にある、請求項6記載のフラビウイルス。
変異がリジンの置換である、請求項7記載のフラビウイルス。
リジンがアルギニンに置換されている、請求項8記載のフラビウイルス。
請求項1記載のフラビウイルスおよび薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、ワクチン組成物。
患者においてフラビウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、請求項10記載のワクチン組成物を患者に投与する段階を含む、方法。
患者がフラビウイルスによる感染を有さないがそれを生じるリスクを有するか、またはフラビウイルスにより感染している、請求項11記載の方法。
フラビウイルスを含むワクチンを作製する方法であって、内臓向性の低下をもたらす変異をフラビウイルスに導入する段階を含む、方法。
変異がフラビウイルスのエンベロープタンパク質のヒンジ領域にある、請求項13記載の方法。
変異がフラビウイルスのエンベロープタンパク質の疎水性ポケット内にある、請求項14記載の方法。
以下の段階を含む、フラビウイルスワクチン候補物質を同定する方法：
フラビウイルスのヒンジ領域に変異を導入する段階；および
ヒンジ領域変異を含むフラビウイルスが、変異を欠くフラビウイルスと比較して、低下された内臓向性を有するか否か決定する段階。
変異がフラビウイルスのエンベロープタンパク質のヒンジ領域内にある、請求項16記載の方法。
フラビウイルスが黄熱病ウイルスまたはキメラフラビウイルスである、請求項16記載の方法。