WO2006068307A1 - 弱毒日本脳炎ウイルスの遺伝子をバックボーンとして有する弱毒キメラフラビウイルス - Google Patents

弱毒日本脳炎ウイルスの遺伝子をバックボーンとして有する弱毒キメラフラビウイルス Download PDF

Info

Publication number
WO2006068307A1
WO2006068307A1 PCT/JP2005/024161 JP2005024161W WO2006068307A1 WO 2006068307 A1 WO2006068307 A1 WO 2006068307A1 JP 2005024161 W JP2005024161 W JP 2005024161W WO 2006068307 A1 WO2006068307 A1 WO 2006068307A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
virus
protein
encephalitis virus
nucleic acid
acid molecule
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/024161
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kouichi Morita
Takeshi Nabeshima
Shinichi Miyake
Toshiyuki Onishi
Isao Fukuya
Toyokazu Ishikawa
Hideo Goda
Masahide Ishibashi
Michiaki Takahashi
Original Assignee
The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University filed Critical The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University
Priority to US11/793,277 priority Critical patent/US7749734B2/en
Priority to AU2005320001A priority patent/AU2005320001B2/en
Priority to EP05822652A priority patent/EP1840214A4/en
Priority to CN2005800442400A priority patent/CN101090966B/zh
Priority to CA002592005A priority patent/CA2592005A1/en
Priority to JP2006549091A priority patent/JP4871738B2/ja
Publication of WO2006068307A1 publication Critical patent/WO2006068307A1/ja
Priority to HK08104980.6A priority patent/HK1115157A1/xx
Priority to US12/292,518 priority patent/US8492532B2/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24161—Methods of inactivation or attenuation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to an attenuated chimeric flapivirus having a attenuated Japanese encephalitis virus gene as a backbone, which is useful as a live attenuated vaccine for preventing flavivirus infection.
  • flaviviruses belonging to the Flaviviridae family (hereinafter abbreviated as flaviviruses) are: ⁇ 3 ⁇ 43 ⁇ 4 ⁇ ⁇ 0 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ Rus (Japanese encephal itis virus), Ninorequinores (West Ni le virus), Denk '(types 1 to 4) ) Winoles (Dengue— 1 to 4 virus), Yellow fever virus, Sent Norreis Moon i3 ⁇ 4 Flame Winoles (St.
  • flaviviruses have a single-stranded (+) RNA genome, and their gene structures are similar to each other.
  • the open reading frame (ORF) of the flavivirus genome consists of three structural proteins (capsid (C) protein, premembrane (pr M) protein that is a precursor of membrane (M) protein), and envelope from its 5 'end. (E) protein, followed by seven non-structures (N S) Encodes proteins (NS 1, NS 2A, NS 2 B, NS 3, NS 4A, NS 4 B, and NS 5).
  • flavivirus structural and nonstructural proteins are translated as a single polyprotein, which is then translated into NS 3 proteins with protease and protease activity of host cells and viruses. Processed by quality, it forms a mature virion composed of the above three structural proteins.
  • Vaccine prevention is effective in preventing the spread of virus infection.
  • vaccines against flavivirus infection include live attenuated vaccine against yellow fever virus and Japanese encephalitis virus infection, and Japanese encephalitis. Only inactivated vaccines against viral and tick-borne encephalitis virus infections are in practical use.
  • live attenuated vaccines are inexpensive and useful as vaccines that induce long-term immunity, but there are no other live vaccines approved.
  • C himeri V ax TM-JE is a gene that encodes two structural proteins (prM—E) of yellow fever virus vaccine 17 D strain.
  • Vaccine SA 14-14 Chimeric flavivirus produced by recombination with the corresponding gene of the strain (see, eg, WO 98/37911 pamphlet and WO 01/39802 pamphlet) .
  • This Chime ri Vax TM — JE is caused by an amino acid mutation from the wild type that is present in multiple viral polyproteins corresponding to the E protein of the Japanese encephalitis virus vaccine SA 14-14-2 strain. Has been attenuated enough to be used as a vaccine (see, eg, Arroyo et al., J. Virol. 75: 934-942, 2001).
  • the chimeric flavivirus (Ch i) with Dengue (types 1 to 4) virus which has the gene of yellow fever virus vaccine 1 7D strain as the backbone me ri V ax TM -DEN (1-4)) (see, eg, WO 98/37911 pamphlet and WO 01/39802 pamphlet) and chimera flaviviruses with West Nile virus (Ch imeri Vax TM -West Nile) (see, for example, International Publication No. 2004/045529).
  • chimeric flaviviruses are also attenuated to the extent that they can be used as vaccines, mainly due to amino acid substitutions from the wild type present in the viral polyprotein corresponding to the prM_E protein. ing.
  • Chimeri Vax TM -DEN 1 attenuated mainly due to amino acid mutations in the E protein that occur during the passage of this chimeric flavivirus in cells for vaccine production. (See, eg, Guirakhoo et al., J. Virol. 78: 9998-10008, 2004). Furthermore, since one of the causes of dengue hemorrhagic fever is expected to be reinfected with dengue virus of different serotypes, this vaccine has not been put into practical use.
  • C himeri V ax TM -West N i 1 e promotes attenuation by artificially introducing an amino acid mutation into E protein derived from wild-type highly virulent West Ninorevirus NY-99.
  • a chimeric flavivirus using a gene backbone other than yellow fever virus (YF-17D) the gene encoding the prM-E protein of dengue type 4 virus is supported by West Nile virus NY 9 9 Chimeric flaviviruses produced by recombination with genes (WN / DEN 4 chimeric viruses) have been reported (see, eg, Pletnev et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 3036-3041, 2002). See).
  • the WN / DEN 4 chimeric virus is attenuated compared to its parent strains West Nile virus and Dengue type 4 virus, but the mechanism of the attenuation has not been fully elucidated, and as a vaccine. Has not yet been put to practical use.
  • DISCLOSURE OF THE INVENTION When developing a live attenuated chimeric flavivirus vaccine against various flavivirus infections by the conventional methods as described above, the safety of the constructed chimeric virus for each flavivirus species to be combined, that is, cranial neurotoxicity, peripheral It is necessary to examine the infectivity (brain invasiveness) to the central nervous system, the prevention of infection, and the production of neutralizing antibodies. This greatly prolongs the period until the live attenuated vaccine is put to practical use. It can be a cause.
  • an object of the present invention is to provide an attenuated chimeric flavivirus having an attenuation mutation in a portion other than the E protein.
  • the present inventors have found that the Japanese encephalitis virus vaccine ML-1-17 for swine has pr M and NS other than E protein.
  • the protein was found to have multiple amino acid mutations unique to the ML-17 strain, suggesting that these amino acid mutations are responsible for the weak toxicity of the ML-17 strain.
  • structural and nonstructural proteins other than E protein ie, C protein, prM protein, etc.
  • the inventors have conceived of constructing a chimera flavivirus having an NS protein and an NS protein, and as a result of further studies, the present invention has been completed.
  • the present invention is as follows.
  • a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding a capsid protein, a premembrane protein, and a nonstructural protein of Japanese encephalitis virus, and a nucleotide sequence encoding a second flavivirus envelope protein,
  • the nucleotide sequence encoding the premembrane protein and / or non-structural protein of the Japanese encephalitis virus comprises a nucleotide mutation that produces one or more amino acid mutations that attenuate the virus.
  • the second flavivirus is West Nile virus, Dengue (1-4) virus, Yellow fever virus, St. Louis encephalitis virus, Tick-borne encephalitis virus, Kunjin virus, Central European encephalitis virus, Chiasanua fores [1] or [2], selected from the group consisting of Towinoles, Marie Valley Encephalitis virus, Omsk hemorrhagic fever Winores, Posan Suninoles, Mouth Shea summer encephalitis virus, Yokosei virus, Apovirus, and Alloa virus Nucleic acid molecule.
  • a live attenuated vaccine comprising the attenuated chimeric flavivirus according to [4].
  • Enbero in nucleic acid molecules containing nucleotide sequences encoding Japanese encephalitis virus Recombining the nucleotide sequence encoding the protein with a nucleotide sequence encoding the second flavivirus envelope protein; and encoding the Japanese encephalitis virus premembrane protein and Z or non-structural protein. Introducing a nucleotide mutation into the nucleotide sequence that results in one or more amino acid mutations that attenuate the virus.
  • a nucleotide sequence encoding an envelope protein in a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding a Japanese encephalitis virus containing at least one amino acid mutation that attenuates the virus in a premembrane protein or a Z or nonstructural protein; Recombination with the nucleotide sequence encoding the flavivirus envelope protein of.
  • a method for producing an attenuated chimeric flavivirus comprising the step of expressing a chimeric plaque protein from the nucleic acid molecule according to any one of [1] to [3].
  • a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding a Japanese encephalitis virus comprising a premembrane protein and one or more amino acid mutations that attenuate viruses in Z or nonstructural proteins.
  • nucleotide mutations that produce one or more amino acid mutations that attenuate the virus in a nucleotide sequence that encodes a pre-membrane protein and / or a nonstructural protein in a nucleic acid molecule that includes a nucleotide sequence encoding the Japanese encephalitis virus
  • [1 3] A method for producing an attenuated Japanese encephalitis virus comprising a step of expressing a Japanese encephalitis virus protein from the nucleic acid molecule according to [9].
  • an attenuated chimeric flavivirus having an attenuation mutation in a portion other than the E protein is provided.
  • the attenuated toxicity of the chimeric flavivirus of the present invention is Since it can be achieved without modifying the protein, live attenuated vaccines against various flavivirus infections can be put into practical use in a short period of time without reducing the ability to induce immunity. It shows the differences in the nucleotide sequence of genomic cDNA and the amino acid sequence of polyprotein between virus ML—17 and J a OHO 566.
  • N t represents a nucleotide
  • AA represents an amino acid.
  • the amino acid position is represented by a number counted from the amino acid next to the polymethic initiation methionine.
  • Fig. 2 shows the amino acid mutated from the parent strain (J a O HO 566 strain) in the polyprotein of Japanese encephalitis virus ML-1 17 strain (shown in bold), J a OHO 566 strain, J a OA r
  • the results are shown in comparison with the corresponding amino acids in the polyproteins of S982 strain, JaGarlOl strain, Nakayama strain, Beijing strain, SA14 strain, and SA14-14-2 strain.
  • the amino acid position is represented by a number counted from the amino acid next to the starting methionine of the polyprotein. * Indicates that the amino acid at that position is identical to the M L-17 strain
  • FIG. 3 shows an outline of a method for preparing full-length cDNAs of recombinant Japanese encephalitis virus MS-14 and MS-15 strains by the Long-PCR method.
  • Fig. 4 shows an outline of a method for preparing the cDNA of ML-17 / WN (E gene) chimeric flavivirus by the Long-PCR method.
  • BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The present invention comprises a nucleotide sequence encoding C protein, pr M protein, and NS protein of Japanese encephalitis virus (first flavivirus), and E protein of second flavivirus.
  • Nucleic acid molecules comprising a nucleotide sequence that encodes are provided.
  • the present invention provides a nuclease of the 5 ′ untranslated region of Japanese encephalitis virus.
  • a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding a leotide sequence, a C protein, a pr M protein, and an NS protein; and 3, a nucleotide sequence of an untranslated region and a nucleotide sequence encoding a second flavivirus E protein.
  • the nucleic acid molecule contains one or more nucleotide mutations in the nucleotide sequence encoding prM protein and Z or NS protein of Japanese encephalitis virus that can attenuate the virus as described below. Contains mutations.
  • the present invention also provides a chimeric flavivirus encoded by such a nucleic acid molecule.
  • nucleic acid molecule refers to a single-stranded or double-stranded DNA or R A
  • nucleotide sequence refers to a sequence of deoxyribonucleotides (represented by A, G, C, and T) or ribonucleotides (A, G, C, and U unless otherwise specified). Represent).
  • a single-stranded nucleotide sequence represents the 5 ′ end on the left end, the 3 ′ end on the right end, and the amino acid sequence represents the N end (amino end) on the left end and C on the right end. Represents the terminal (carboxyl terminal).
  • amino acid notation uses a single letter abbreviation or a three letter abbreviation which is a standard notation for amino acids.
  • “attenuated” refers to the animal to be vaccinated ⁇ eg, human and non-human mammals (eg, monkeys, horses, tusks, hidges, pigs, inu, cats, Usagi, rat, mouse, etc.), as well as birds, etc. ⁇ means low pathogenicity (low toxicity) that can be safely used as a vaccine.
  • human and non-human mammals eg, monkeys, horses, tusks, hidges, pigs, inu, cats, Usagi, rat, mouse, etc.
  • “to the extent that it can be (safely) used as a vaccine” means that virus growth is observed in the vaccinated region, but the growth is terminated without showing any serious symptoms. In a subsequent attack test with highly virulent virus against the vaccinated individuals, it protects against the development of diseases caused by the vaccinated virus. Means to confer specific immunity.
  • Japanese encephalitis virus which is the first flavivirus used for the production of the chimeric flavivirus of the present invention, has the prM protein and / or NS protein of the chimeric flavivirus of the present invention finally described below. There is no particular limitation as long as it contains one or more amino acid mutations that attenuate such viruses.
  • Information on the genome sequences of various Japanese encephalitis viruses can also be obtained from publicly available gene databases such as Gen B ank.
  • Gen B ank For example, for JaOA r S 982 strain, G en Bank registration number: M 1 83 70; for Ja GA r 01 strain, G en Bank registration number: AF 069076; Beijing g-1 strain For Gen B ank registration number: L4896 1; For SA 14 strain, G en Ban registration number: M55506; For SA 14-14-2 strain, G en Ban registration number: AF 3 1 5 See 1 1 9
  • nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding the chimeric virus of the present invention
  • a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding the Japanese encephalitis virus can be prepared and used as the gene backbone of the chimeric flavivirus.
  • Day Examples of the nucleic acid molecule containing a nucleotide sequence encoding the encephalitis virus include genomic RNA, cDNA, synthetic RNA, and synthetic DNA.
  • any fragment of a nucleic acid molecule containing a nucleotide sequence encoding Japanese encephalitis virus (for example, an amplified DNA fragment by PCR, etc.) Can be used.
  • Japanese encephalitis virus genomic RNA can be obtained by using known methods to infect cells infected with Japanese encephalitis virus (for example, MMC-LK 2 cells, HeLa cells, N2a cells, PS cells, BSC-1 cells). HL-CZ cells, LLC-MK2 cells, V ero cells, BHK cells, mosquito-derived C 6/36 cells, mouse or hamster-derived brain cells), and developing chicken eggs.
  • the Japanese encephalitis virus strain used for preparing genomic RNA is not particularly limited, and for example, strains as listed above can be used.
  • the cDNA of Japanese encephalitis virus can be constructed from genomic RNA according to a known method (for example, the method described in Sum i yo oshi et al., Vi ro lo g y 1 6 1:49 7—510, 1987).
  • Japanese encephalitis virus genomic RNA, cDNA, or any fragment thereof can be chemically synthesized by a known method based on the genome sequence information of Japanese encephalitis virus.
  • Japanese encephalitis virus genomic RNA, cDNA, or any fragment thereof is a type of genomic RNA or cDNA, abbreviated as Polymerase Reacti ⁇ ⁇ (abbreviated as ⁇ PCR method), Reverse Transcriptase-Pol yme rase and Hain R eaction (abbreviated as “R i ′-PCR method J”), Long Pol y rase C hain R eaction (abbreviated as TL on g-PCR method j), And / or LongReverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (abbreviated as “Long-R TP CR method”).
  • Japanese encephalitis virus genomic RNA, cDNA, or any fragment thereof can be inserted into a vector and cloned.
  • Examples of the vector to be used include pBR322, pBR325, pBR327, pBR328, pUC7, pUC8, pUC9, pCU18, pUCl9, pHSG298, pHSG299. , P SC 1 0 1, p GBM5, p CRII and other plasmids.
  • butterophage, cosmid, phagemid and the like can also be used as a cloning vector.
  • Such cloning vectors are commercially available from, for example, NIPPON GENE CO., LTD.
  • flaviviruses different from Japanese encephalitis virus such as West Nile virus, Dengue (1-4 type) virus, yellow fever virus, St. Louis encephalitis virus, tick-borne encephalitis virus , Kunjin virus, Central European encephalitis virus, Kyasanua Forest virus, Mari Ichigaya encephalitis virus, Omsk hemorrhagic fever virus, Posunsan virus, Russian spring and summer encephalitis virus, Yokosei virus, acea virus, Aroa virus.
  • Japanese encephalitis virus such as West Nile virus, Dengue (1-4 type) virus, yellow fever virus, St. Louis encephalitis virus, tick-borne encephalitis virus , Kunjin virus, Central European encephalitis virus, Kyasanua Forest virus, Mari Ichigaya encephalitis virus, Omsk hemorrhagic fever virus, Posunsan virus, Russian spring and summer encephalitis virus, Yokosei virus, acea virus, Aroa virus.
  • Nucleotide and amino acid sequences encoding various flavivirus E proteins, as described above, are known, and many of these flavivirus species have been reported for the entire nucleotide sequence of the genome. For example, see: West Nile Winores (eg, Wengler et al., Virology 147: 264-274, 1985); Dengue type 1 virus (eg, Mason. Et al., Virology 161: 262-267, 1987); Dengue 2 Type viruses (eg, Deubel et al., Virology 155: 365-377, 1986; Gruenberg et al., J. Gen. Virol.
  • Louis encephalitis virus eg Trent et al., Virology 156: 293-30 4, 1987
  • tick-borne encephalitis virus eg Mandl et al., Virology 166: 197-205, 19 88
  • Chiasanuafores Towinores eg, Venugopal et al., Journal of Gene ral Virology 75: 227-232, 1994
  • Marie Valley Encephalitis virus eg, Dalgarno et al., J. Mol. Biol.
  • Omsk hemorrhagic fever quinores eg, Lin et al., Virology 313: 81-90, 2003; Li et al., Journal of General Virology 85: 1619-1624, 2004; Gritsun et al., Journ al of General Virology 74: 287-291, 1993); J. Trop. Med. Hyg. 65: 671-676, 2001; Mandl et al., Virology 194: 173 -184, 1993); , Kuno, et al., Journal of Virology
  • Dengue type 1 virus eg GenBank accession number: M23 027
  • Yellow fever virus eg GenBank accession number: X03700; NC_002031
  • St GenBank accession number: X03700; NC_002031
  • nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding a chimeric virus of the present invention
  • a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding a second flavivirus is prepared and the region encoding the E protein can be used.
  • nucleic acid molecule containing a nucleotide sequence encoding the second flavivirus include genomic RNA, cDNA, synthetic RNA, and synthetic DNA.
  • any fragment of a nucleic acid molecule containing a nucleotide sequence encoding a second flavivirus eg, an amplified DNA fragment by PCR) Etc.
  • a second flavivirus eg, an amplified DNA fragment by PCR
  • the second flavivirus genome RNA can be prepared by the same method as Japanese encephalitis virus.
  • the second flavivirus cDNA can also be constructed from genomic RNA in the same manner as the Japanese encephalitis virus.
  • the genomic RNA, cDNA, or any fragment thereof of the second flavivirus can be chemically synthesized by a known method based on the known genomic sequence information regarding the virus used as the second flavivirus. it can.
  • the second flavivirus genomic RNA, cDNA, or any fragment thereof is the same as for Japanese encephalitis virus: PCR, RT-PCR, Long-PCR, and Long or RT-PCR. According to the method, genomic RNA or cDNA can be amplified as a cage.
  • genomic RNA, cDNA, or any fragment thereof of the second flavivirus can be inserted into an appropriate vector as listed above and cloned in the same manner as Japanese encephalitis virus.
  • a nucleic acid molecule (DNA or RNA) comprising a nucleotide sequence encoding the chimeric flavivirus of the present invention comprises a nucleotide sequence encoding E protein in a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding Japanese encephalitis virus, and a second flavivirus. It is produced by recombination with a nucleotide sequence encoding the envelope protein.
  • Recombination of the region encoding the E protein in the nucleic acid molecule containing the nucleotide sequence encoding the Japanese encephalitis virus can be performed by known recombination techniques (for example, Morita et al., Virology 28 7: 4 1 7-426, 200, a method using a long-PCR method described in 2001).
  • the nucleic acid molecule (DNA or RNA) containing a nucleotide sequence encoding the chimeric flavivirus of the present invention is based on the genomic sequence information on S-encephalitis virus and the second flavivirus. The entire nucleotide sequence that codes for the virus can be designed and generated by chemical synthesis.
  • a nucleic acid molecule containing a nucleotide sequence encoding the chimeric flavivirus of the present invention is prepared as DNA, a promoter sequence for in vitro transcription is introduced at the 5 ′ end of DNA.
  • the DNA encoding the chimeric flavivirus of the present invention is transcribed to RNA by the RNA polymerase corresponding to the introduced promoter at any stage prior to the expression of the chimeric flavivirus protein.
  • RNA polymerase corresponding to the introduced promoter at any stage prior to the expression of the chimeric flavivirus protein.
  • examples of the sequence include T 7 RNA polymerase promoter and SP 6 RNA polymerase promoter.
  • RNA encoding the chimeric flavivirus of the present invention can be obtained by using a gene introduction technique known in the art such as transfection, electroporation, microphone mouth induction, etc.
  • C 6 -36 cells, V ero cells, BHK cells, MMC—LK2 cells, He La cells, N 2 a cells, PS cells, etc. C 6 -36 cells, V ero cells, BHK cells, MMC—LK2 cells, He La cells, N 2 a cells, PS cells, etc.
  • chimeric flavivirus proteins are expressed in these cells .
  • the chimeric flavivirus of the present invention can be used in a cell disruption solution or an extract, By adding enzymes, etc., a genetic information translation system for organisms is prepared in a test tube, and a protein production method that does not use a cell system (also called cell-free expression; for example, US Pat. No. 5,478,730; 1 ⁇ & ⁇ 1 1 11 et al. 1: 0 ... atl. A cad. S ci. USA 9 7: 559-564, 2000; S a wa saki et al., Proc. Na tl. Ac a d. Sci. USA 99: 14652—146 57, 2002) can also be used to obtain chimeric flavivirus proteins.
  • the nucleic acid molecule comprising the nucleotide sequence encoding the chimeric flavivirus of the present invention attenuates the virus in the nucleotide sequence encoding the prM protein or NS protein derived from Japanese encephalitis virus in the nucleic acid molecule. Includes nucleotide variations that result in one or more amino acid variations.
  • the amino acid mutation that attenuates the virus is the amino acid sequence of each structural protein and nonstructural protein of the Japanese encephalitis virus J OA r S 98 2 strain (H. S um iyoshi et al., Virology 1 6 1 : 49 7- 5 1 0, 1 98 7), the following amino acid substitutions: substitution of the first methionine of p rM protein by isoloicin; Replacement of the asparagine of th (56th of protein) with threonine; replacement of NS 2 ⁇ protein with serine of fourth alanine; replacement of NS 4 B protein with lysine of 5th first asparagine; of NS 4 B protein 52nd valine substitution with isoloicin; NS4B protein 68th threonine substitution with serine; NS5 protein 1 26th leucine methionine Substituted; and Z or, substitution with ⁇ scan aspartic 854 th serine NS 5 proteins.
  • amino acid substitutions can also be made using conservative amino acids relative to the amino acid introduced at each amino acid position.
  • “conservative amino acid” means an amino acid similar in physicochemical properties, for example, an aromatic amino acid (P he, T rp, T yr), fat Family amino acids (1 3, 6 1_1, 1 1 6, ⁇ 3 1), polar amino acids (G 1 n, A sn), basic amino acids (L ys, A rg, H is), acidic amino acids (G Examples include amino acids classified into the same group, such as lu, A sp), amino acids having a hydroxyl group (Ser, Thr), and amino acids having small side chains (G1y, Ala, Ser).
  • the chimeric flavivirus of the present invention has at least one of the above-mentioned amino acid substitutions, substitution of the first methionine of the PrM protein with isoleucine, and Z or pr148 of the M protein (56 of the M protein).
  • substitution of asparagine with threonine is at least one of the above-mentioned amino acid substitutions, substitution of the first methionine of the PrM protein with isoleucine, and Z or pr148 of the M protein (56 of the M protein).
  • the above amino acid mutations can be introduced in any step for producing a nucleic acid molecule containing a nucleotide sequence encoding the chimeric flavivirus of the present invention.
  • the introduction of the above amino acid mutation is, for example, a site-directed mutagenesis method using the Long—PCR method described in Morita et al., Virology 28 7: 4 1 7-426, 2001, or For cDNA cloned into plasmid, known methods such as Kunkel method and Gappeddulex method, or kits for mutagenesis using these methods (for example, available from Takara Bio Inc.) ) Etc.
  • a nucleic acid molecule containing a nucleotide sequence encoding a Japanese encephalitis virus containing at least one amino acid mutation that attenuates the virus in the prM and / or NS protein is encoded with the chimeric flavivirus of the present invention.
  • These mutations can be introduced into the chimeric flavivirus of the present invention by using it for the production of a nucleic acid molecule containing a nucleotide sequence.
  • Nucleic acid molecules containing nucleotide sequences encoding Japanese encephalitis virus that contain one or more amino acid mutations that attenuate the virus in the prM and / or NS proteins can be obtained using these known site-directed mutagenesis methods described above.
  • Japanese encephalitis virus strains that do not contain mutations for example, J a OH0566 strain, J a OA r S 982 strain, J a GA r O l strain, Naka ma strain, Beijing strain, SA 14 strain, SA 14 — 14 — Artificially introduce these mutations into genomic RNA or cDNA It can produce by introducing.
  • a recombinant Japanese encephalitis virus can be produced by expressing a viral protein.
  • genomic RNA can be prepared from the cultured cells by infecting the recombinant Japanese encephalitis virus with appropriate cells as described above and culturing the cells. Furthermore, this recombinant Japanese encephalitis virus is itself an attenuated Japanese encephalitis virus and can be a promising live attenuated vaccine candidate for Japanese encephalitis.
  • a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding a Japanese encephalitis virus that contains one or more amino acid mutations that attenuate the virus in the prM and / or NS protein is also a Japanese encephalitis virus that naturally contains one or more of such amino acid mutations. It can also be prepared by obtaining genomic RNA or cDNA from the mutant strain. Examples of Japanese encephalitis virus mutant strains that naturally contain one or more amino acid mutations that attenuate the virus in prM and Z or NS proteins include Japanese encephalitis virus ML-17 strain.
  • the ML-17 strain is a Japanese encephalitis virus vaccine strain for swine (see, for example, Yo shida et al., BI KEN J OURNAL 24: 47-6 7, 1 98 1). It is available from the study group (Osaka Prefecture Suita, Yamadaoka 3-1, Osaka University).
  • a strain containing one or more amino acid mutations that attenuate the virus in prM and wild-type or NS protein can be obtained by a known method.
  • the genomic RNA or cDNA can also be used for the production of the chimeric flavivirus of the present invention.
  • a nucleic acid molecule containing a nucleotide sequence encoding genomic encephalitis virus containing at least one amino acid mutation that attenuates virus in prM and Z or NS proteins (genomic RNA or c) DNA) as needed It may be fragmented and inserted into a cloning vector as described above. For example, by using such a recombinant vector, the chimeric flavivirus of the present invention can be produced safely and easily.
  • a gene is obtained from the produced chimeric virus, and all or a part of the base sequence or the corresponding amino acid sequence (for example, a portion into which a mutation has been introduced, (Such as the junction of two viruses) and make sure that the sequence matches the intended sequence.
  • the present invention also provides a live attenuated vaccine comprising the chimeric flavivirus of the present invention (hereinafter also referred to as the vaccine of the present invention). Since the viral E protein contains antigenic determinants that induce neutralizing antibodies, inoculation with the chimeric flavivirus of the present invention as a vaccine produces an antibody against the second flavivirus species used as the E protein. .
  • the vaccine of the present invention can be used to prevent various flavivirus infections, for example, human and non-human mammals (eg, monkeys, horses, tusks, hidges, pigs, dogs, cats, rabbits, rats). , Mice, etc.), and animals such as birds.
  • the vaccine of the present invention can be manufactured in the form of a suspension or lyophilization agent.
  • a pharmaceutically acceptable stabilizer usually used in vaccine preparations for example, sucrose, lactose, bud sugar, gelatin, gelatin
  • soothing agent eg, glucose, etc.
  • the vaccines of the invention can usually be dissolved or suspended in a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier examples include liquid carriers such as water, saline (including physiological saline), and buffer solution (for example, phosphate buffer).
  • Vaccines of the present invention is typically 0.1 to 1.
  • Formulated as a sterile aqueous solution containing the chimeric flavivirus of O m 1 per dose 0 2 ⁇ 1 0 6 PFU of the present invention for example, subcutaneously Can be inoculated intradermally, intramuscularly, etc.
  • some flaviviruses are known to infect through the mucosa, so the vaccine of the present invention can be administered orally or nasally, depending on the second flavivirus species selected. Also good.
  • RNA or DNA itself containing a nucleotide sequence encoding the chimeric flavivirus of the present invention can also be used as a nucleic acid vaccine preparation.
  • Confirmation of the effect and safety of the constructed chimeric virus can be performed by, for example, cerebral neurotoxicity in animals (eg, mice, monkeys, etc.), infectivity from the periphery to the central nervous system (brain nerves). Invasiveness), infection prevention effect, presence of viremia, and production of neutralizing antibodies.
  • Nucleotide sequence of the full-length genomic c DN A of ML- 17 strain obtained from the Osaka University Microbial Disease Research Group (SEQ ID NO: 1) and nucleotide sequence of the full-length genomic cDNA of J a OHO 566 strain (sequence) The number 3) was determined according to the method disclosed in Sumiiyoshi et al., Virology 1 6 1: 497-5 10, 1 987. In all strains, the PCR primers shown in Table 1A were used for cDNA construction, and the nucleotide sequence of the constructed cDNA was shown in Table 1B. Sequencing primers were used.
  • amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of the polyprotein of ML-17 strain and the amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) of the polyprotein of Ja OHO 566 strain were compared with each of the full-length genomic cDNAs. Deduced from the nucleotide sequence.
  • JEV 8257-8223R 8257-8223-R TTTTCTATAACCTT66GCATGTAAGGGCAGAGAAC (SEQ ID NO: 10)
  • F represents a forward primer
  • R represents a reverse primer.
  • F represents a forward primer
  • R represents a reverse primer.
  • ML-7 strain has 25 nucleotide substitutions, of which 10 nucleosides are shown. 1 27th, 2 74th, 1 209th, 246 2nd, 2463th, 2 479th, 265 2nd, 275 1st, counted from the next amino acid of the polymethicine starting methionine due to tide substitution It was revealed that 10 amino acid substitutions occurred at the 2896th and 3380th amino acids. Furthermore, the amino acid mutation in the polyprotein of ML-17 strain described above was replaced with ⁇ !
  • Amino acid sequence of polyprotein of S A 14 strain (GenBank accession number: M55506); Amino acid sequence of polyprotein of SA14-14 strain 2 (GenBank accession number: AF315119).
  • amino acid sequence of the polyprotein of Nakaya ma strain is GenBank accession number: AF112297; McAda et al., Virology. 158 (2): 348-60, 1987 etc. and partial sequence information of Z or amino acid
  • GenBank accession number: AF112297; McAda et al., Virology. 158 (2): 348-60, 1987 etc. partial sequence information of Z or amino acid
  • each structural protein and nonstructural protein in the polyprotein of Japanese encephalitis virus Ja OA r S 982 strain described in S um iyoshi et al., V irology 1 6 1: 497-5 10, 1 98 7
  • the positions of these 8 amino acid substitutions in the polyprotein are the 1st and 148th positions of the prM protein (56th position of the M protein), the 4th position of the NS2A protein, and NS4B, respectively.
  • Recombinant Japanese encephalitis virus MS-14 which introduced the resulting nucleotide mutation (G substitution at position 479 G with A), and substitution of 148 th of the asparagine of pr M protein (56th of M protein) with threonine MS-1 15, a recombinant Japanese encephalitis virus, in which a nucleotide mutation that results in a substitution (substitution of A at position 9 19 of the genome with C) was introduced.
  • the gene RNA of Japanese encephalitis virus (Ja OA r S 982 strain) is used as a saddle, primer 1 and primer 2 set, primer 3 and primer 4 set, and primer 5 and primer 6 set Using this method, the Japanese encephalitis virus gene fragments (fragments 1, 2, and 3) corresponding to each primer set were prepared by the Long-RT-PCR method.
  • fragment 1 and 2 were used as a saddle, and gene fragment 4 was prepared again using the Long-PCR method using a set of primers 1 and 4 did.
  • This gene fragment was purified in the same manner, and then the Long-PCR method was performed using gene fragments 3 and 4 in a saddle shape, using a set of primers 1 and 6, and two T7 promoter sequences at the ends.
  • a full-length Japanese encephalitis virus cDNA (fragment 5) was prepared.
  • the recombinant virus was recovered according to the above method except that the recombinant virus was prepared by changing primer 2 to primer 1 and primer 3 to primer 8.
  • a virus containing no mutation was obtained by changing primer 2 to primer 9 and primer 3 to primer 10.
  • Table 2 shows the primers used in this example. (Table 2) rLima-name Corresponding nucleotide sequence
  • FLIMA-1 T7 promoter-l-45-S AAAmAATACGACTCACTATAAGAAGTTTATCTGTGTGAACnCTTGGCnAGTATCGnG (K column No. 48)
  • FLAIMA-9 972-927-R AAGCCGGAGCGAGCAACAGCAGGAGGATGGTAAATACCACGGGTTG (IB column No.
  • S represents a sense sequence
  • R represents a complementary sequence
  • Underlined represents the ⁇ 7 promoter sequence
  • double underlined represents a nucleotide mutation.
  • the proliferation ability of the recombinant Japanese encephalitis virus MS-14 strain and MS-15 strain prepared in Example 2 in BHK cells was evaluated.
  • As a control wild-type toxic Japanese encephalitis virus JOAOA S982 strain was used.
  • MS-1 4 strain, MS-1 5 strain, and JaOA r S 98 2 strain were infected with B HK cells, respectively, and cell culture supernatants were collected 24, 48, and 72 hours after infection. , Confirmed the appearance of the virus. The amount of virus in the culture supernatant at each time was measured by the plaque method. All strains were confirmed to grow in BHK cells.
  • mice groups (4 week old male and female ICR mice, each group 5 mice each) to, 1 0 1 ⁇ 10 MS- 14 strains of 6 plaque forming units, MS- 1 5 share, ML- 1 7 strain, J the a OA r S 98 2 strain was inoculated in the brain, and observed each over three weeks, teeth 0 50! 3 ⁇ 4 6 3 (Calculated by 1-Mench method. Table 3 shows the results of this test. (Table 3)
  • MS-14rev represents a revertant of MS-14 made from MS-14 using Long-PCR-based site-directed mutagenesis.
  • the MS-14 and MS-15 strains were significantly attenuated compared to the toxic J aOA r S 982 strain.
  • the MS-14 strain had a weak toxicity similar to that of the ML-17 strain, a Japanese encephalitis virus vaccine strain.
  • Japanese encephalitis virus vaccine ML— 17 To create ML — 1 7 / WN (E gene), a chimeric flavivirus in which E protein of 7 strain is replaced by West Nile virus E protein, Morita et al., V iro 1 ogy 287: 4 1 Long-recombination date described in 7-426, 200 1 using PCR method According to this encephalitis virus production method, ML-1 7ZWN (E gene) cDNA was constructed.
  • the gene RNA of the Japanese encephalitis virus live vaccine strain (ML-17 strain) is used as a saddle type, primer 1 A and primer 2 A set, and primer 5 A and primer 6 A set.
  • ML-17 strain Japanese encephalitis virus live vaccine strain
  • primer 1 A and primer 2 A set primer 1 A and primer 2 A set
  • primer 5 A and primer 6 A set primer 5 A and primer 6 A set.
  • West Nile virus (NY 99-3 526 2-ll strain) gene RN A was used as a saddle type, using a set of primer 3 A and primer 4 A, and the West Nile by the Long-RT-PCR method.
  • Viral gene fragment 2A was generated. After purifying each fragment by agarose electrophoresis, first use fragments 1A and 2A as a saddle and a set of primers 1A and 4A. 4A was produced.
  • This gene fragment was purified in the same manner, and then a Long — PCR method was performed using the set of primers 1 A and 6 A with the gene fragments 3 A and 4 A in a saddle shape, and T 7 at the 5 ′ end.
  • Table 4 shows the primers used in this example.
  • J E represents the Japanese encephalitis virus JOAOA 982 strain
  • ML 17 represents the sequence of the Japanese encephalitis virus ML-17 strain
  • WN represents the sequence of West Nile virus.
  • S or N represents a sense sequence
  • R represents a complementary sequence.
  • Underlined represents the T7 promoter sequence.
  • An artificial full-length chimera was prepared by conducting an in vitro RNA synthesis reaction using the S-encephalitis virus and West Nile virus chimera flavivirus cDNA (fragment 5A in Fig. 4) constructed in Example 5 as a saddle type. Viral gene RNA was prepared. This RNA was introduced into mosquito cells (C 636 cells) by electroporation and cultured for 5 days, and then the chimeric virus that appeared in the culture supernatant was recovered. (Example 7)
  • ML-1 17 WN (E gene) obtained in Example 6 was used as the chimeric virus.
  • ML—17 / WN (E gene) and ML—17 strains were grown on C 6/36 cells and BHK cells, and the infected culture was dispensed and stored at —70 ° C.
  • Fetal calf serum was added to each cell at a concentration (2 to 10%) as required using a culture solution in which nonessential amino acids were added to Eagle MEM culture solution.
  • Table 5 shows the infectious titer of the culture solution in the proliferation experiment.
  • ML-1 / 7 / WN (E gene) had the same proliferation ability as ML-1-7.
  • Table 5 Proliferation of ML-17ZWN (E gene) chimeric pravivirus and ML-17 in C 6/36 cells and BHK cells
  • mice Four-week-old C5 7 B LZB 6 mice were inoculated with 101 1 to 10 7 viruses in the brain and observed for 28 days.
  • LD 5 was calculated by the Read-Mench method.
  • Table 6 shows the LD 5 of ML-1 17 WN (E gene) obtained from the experiment. Indicates.
  • ML- 1 7 / WN (E gene) was significantly attenuated compared to the highly virulent J a OHO 566 strain.
  • ML-17ZWN (E gene) had an attenuated toxicity comparable to ML-17 strain, which is a Japanese encephalitis virus vaccine strain.
  • Infection rates were calculated by assessing the incidence of PFU (Pl aq ue—F o rm ng unit) and milk-only mice.
  • Mosquitoes sucked with the chimeric virus by the transmembrane method were bred for 10 days or 21 days, and this was used as an emulsion. The presence of the virus was verified by inoculating milk only into the brain and evaluating PFU. ML-1 7 / WN (E gene) did not prove any virus at all even when sucking more than 10 2 PFU of virus per mosquito.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

日本脳炎ウイルスのキャプシドタンパク質、プレメンブランタンパク質、および非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、第２のフラビウイルスのエンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子であって、ここで、該日本脳炎ウイルスのプレメンブランタンパク質および／または非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ウイルスを弱毒化するアミノ酸変異を１つ以上生じるヌクレオチド変異を含む、核酸分子。

Description

明铀書
弱毒日本脳炎ウィルスの遺伝子をバックボーンとして有する弱毒キメラフラビゥ イノレス 技術分野
本発明は、フラビウィルス感染を予防するための弱毒生ワクチンとして有用な、 弱毒日本脳炎ウィルスの遺伝子をバックボーンとして有する弱毒キメラフラピウ ィルスに関する。 背景技術
フラビウィルス科に属するウィルス （以下、 フラビウィルスと略称する） は、 ί¾¾Εχ 0 ^ ί^ ^ ルス (Japanese encephal itis virus)、 ナイノレクイノレス (West Ni le virus)、 デンク' （ 1〜 4型） ウイノレス （Dengue— 1〜4 virus)、 黄熱ウイノレス (Yellow fever virus) セン トノレイス月 i¾炎ウイノレス (St. Louis encephal itis virus)、 ダニ媒介脳炎ウイノレス（Tick-borne encephalitis virus)、 クンジンウイ ノレス (Kunjin virus) ^ 中央 3一口ッノ 月 炎クイノレス (Central European encephal itis virus;、キイアサヌフ フォレス トヮイノレス (Kyasanur Forest virus) マリー谷脳炎ウイノレス (Murray Valley encephal itis virus) Λ オムスク.出血熱ゥ イノレス (Omsk Hemorrhagic fever virus) x a、： サンクイノレス (Powassan virus) ^ ロシフ春夏脳炎ウイノレス (Russian Spring-Summer encephal itis virus) ^ ョ コセ ウイノレス（Yokose virus)、 アポィゥイノレス（Apoi virus)、 ァロアウイノレス （Aroa virus)など、 約 6 0種類以上が知られている。
これらのフラビウィルスは、 一本鎖 （+ ) R N Aのゲノムを有し、 遺伝子構造 は互いに類似している。 フラビウィルスゲノムのオープンリーディングフレーム ( O R F ) は、 その 5 ' 末端から 3つの構造タンパク質 （キヤプシド （C ) タン パク質、 メンブラン （M) タンパク質の前駆体であるプレメンブラン （p r M) タンパク質、 およびエンベロープ （E ) タンパク質）、 続いて、 7つの非構造 （N S) タンパク質 （NS 1、 NS 2A、 NS 2 B、 NS 3、 NS 4A、 NS 4 B、 および NS 5) をコードしている。
これらのフラビウィルスの構造タンパク質および非構造タンパク質は、 単一の ポリタンパク質として翻訳され、 次いで、 翻訳されたポリタンパク質は、 宿主細 胞およびウィルスの、 プロテアーゼおよびプロテア一ゼ活性を有する NS 3タン パク質によってプロセシングされて、 上記の 3種類の構造タンパク質から構成さ れる成熟ビリオンを形成する。
上記のフラビウィルスの多くは、 蚊やダニなどの昆虫を媒介して、 ヒ トを含む 哺乳動物や鳥類に感染し、 脳炎およびノまたは発熱症状を引き起こすことが知ら れている。 本来、 これらのフラビウィルス種の各々は、 特定の地域に生息してお り、 それ故、 感染の流行地域は限られていた。 しかし、 近年、 交通 流通の発達 や気候の変化などにより、 種々のフラビウィルス感染が、 原因となるフラビウイ ルスの本来の生息地域外にも拡大しており、 公衆衛生上の重大な問題となってい る。
ウィルス感染の拡大を防ぐには、 ワクチンによる予防が効果的である。 しかし ながら、 上記のように多数のフラビウィルス科に属するウィルスが認識されてい るにもかかわらず、 フラビウィルス感染に対するワクチンとしては、 黄熱ウィル スおよび日本脳炎ウィルス感染に対する弱毒生ワクチン、 ならびに日本脳炎ウイ ルスおよびダニ媒介脳炎ウィルス感染に対する不活化ワクチンのみが実用化され ているにすぎない。 特に、 弱毒生ワクチンは、 安価でありかつ長期間の免疫を誘 導するワクチンとして有用であるが、 上記の他に認可されている生ワクチンはな い。
このような状況において、 近年、 種々のフラビウィルス感染に対する新規の弱 毒生ワクチンを迅速に開発する手段として、 遺伝子工学的手法で作製されたキメ ラフラビウィルスを利用するストラテジーが注目されている。
例えば、 C h i m e r i V a x™- J Eは、 黄熱ウィルスワクチン 1 7 D株の 2つの構造タンパク質 （p rM— E) をコードする遺伝子を、 B本脳炎ウィルス ワクチン SA 14— 14— 2株の対応する遺伝子と組換えることにより作製され たキメラフラビウィルスである （例えば、国際公開第 98/37911号パンフレツトぉ よび国際公開第 01/39802号パンフレツ トを参照）。 この C h i me r i V a xTM — J Eは、 日本脳炎ウィルスワクチン S A 14- 14— 2株の Eタンパク質に対 応するウィルスポリタンパク質中に複数存在する野生型からのァミノ酸変異に起 因して、ワクチンとして使用できる程度に弱毒化されている（例えば、 Arroyoら、 J. Virol. 75:934-942, 2001を参照）。
さらに、 この C h i me r i V a x™- J Eの手法を基にして、 黄熱ウィルス ワクチン 1 7D株の遺伝子をバックボーンとして有する、 デング （1〜4型） ゥ ィルスとのキメラフラビウィルス （Ch i me r i V a x™-DEN (1〜4)) (例えば、 国際公開第 98/37911号パンフレツトおよび国際公開第 01/39802号パ ンフレッ トを参照） や、 西ナイルウィルスとのキメラフラビウィルス （Ch i m e r i V a x™-W e s t N i l e) (例えば、 国際公開第 2004/045529号パ ンフレッ トを参照) も開発されている。
これらのキメラフラビウィルスもまた、 ワクチンとして使用できる程度に弱毒 化されており、 その弱毒性は、 主に、 p rM_Eタンパク質に対応するウィルス ポリタンパク質中に存在する野生型からのアミノ酸置換に起因している。
しかし、 C h i me r i V a x™-DEN 1の弱毒性は、 主に、 ワクチン製造 のためにこのキメラフラビウィルスを細胞中で継代する過程で生じる Eタンパク 質のァミノ酸変異に起因していることが報告されている（例えば、 Guirakhooら、 J.Virol. 78:9998-10008， 2004を参照）。 さらに、 デング出血熱の発生原因の 1 つとして、 異なった血清型のデングウィルスによる再感染が想定されるため、 こ のワクチンは実用化には至っていない。
また、 C h i m e r i V a x™-We s t N i 1 eは、 野生型の強毒西ナイ ノレウィルス NY— 99株に由来する Eタンパク質中に人為的にアミノ酸変異を導 入して弱毒化を促進している （例えば、 国際公開第 2004/045529号パンフレッ ト を参照）。 黄熱ウィルス （Y F - 1 7 D )以外の遺伝子バックボーンを用いたキメラフラビ ウィルスとしては、 デング 4型ウィルスの p r M—Eタンパク質をコードする遺 伝子を、 西ナイルウィルス N Y 9 9株の対応する遺伝子と組換えることにより作 製されたキメラフラビウィルス （WN/D E N 4キメラウィルス）が報告されてい る （例えば、 Pletnevら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 : 3036-3041, 2002を参 照)。
WN/D E N 4キメラウィルスは、その親株である西ナイルウィルスおよびデン グ 4型ウィルスと比較して弱毒化されているが、 その弱毒化のメカニズムは完全 には解明されておらず、 またワクチンとしての実用化にも至っていない。 発明の開示 上記のような従来の方法によって、 種々のフラビウィルス感染に対する弱毒生 キメラフラビウィルスワクチンを開発する場合、 組み合わせるフラビウィルス種 毎に、 構築したキメラウィルスの安全性、 即ち、 脳神経毒性、 末梢からの中枢神 経系への感染性 （脳神経侵襲性） や感染予防効果、 中和抗体の産生などについて 検討する必要があり、 このことは、 弱毒生ワクチンの実用化までの期間を長引か せる大きな原因となり得る。
さらに、 生ワクチンは、 安全性のために弱毒化すると抗体産生能が反比例して 低下するという問題が残されている。 なぜならば、 中和抗体を誘導するための抗 原決定基は、 Eタンパク質中に存在するため、 上記のような Eタンパク質の改変 によるウィルスの弱毒化は、 ワクチンとしての免疫誘導能 （抗体産生能） を低下 させる可能性があるためである。
従って、 本発明は、 Eタンパク質以外の部分に弱毒化変異を有する弱毒キメラ フラビウィルスを提供することを目的とする。
本発明者らは、 上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 ブタ用日 本脳炎ウィルスワクチン M L— 1 7株が、 Eタンパク質以外の p r Mおよび N S タンパク質中に、 ML— 1 7株に固有の複数のアミノ酸変異を有することを見出 し、 これらのアミノ酸変異が ML— 1 7株の弱毒性に関与しているという示唆を 得た。 この知見に基づいて、 ML— 1 7株に固有のアミノ酸変異の 1つ以上を含 む日本脳炎ウィルスの、 Eタンパク質以外の構造および非構造タンパク質 （すな わち、 Cタンパク質、 p rMタンパク質、 および NSタンパク質） を有するキメ ラフラビウィルスを構築することを着想し、 さらに検討を重ねた結果、 本発明を 完成するに至った。
すなわち、 本発明は、 以下の通りである。
[1] 日本脳炎ウィルスのキヤプシドタンパク質、プレメンブランタンパク質、 および非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、 第 2のフラビウィル スのエンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、 核酸分子で あって、
ここで、 該日本脳炎ウィルスのプレメンブランタンパク質および または非構 造タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、 ウィルスを弱毒化するアミノ酸 変異を 1つ以上生じるヌクレオチド変異を含む、 核酸分子。
[2] 前記日本脳炎ウィルスが、 ML- 1 7株である、 [ 1] 記載の核酸分子。
[3] 前記第 2のフラビウィルスが、 西ナイルウィルス、 デング （1〜4型） ウィルス、 黄熱ウィルス、 セントルイス脳炎ウィルス、 ダニ媒介脳炎ウィルス、 クンジンウィルス、 中央ヨーロッパ脳炎ウィルス、 キイアサヌァフォレス トウイ ノレス、 マリー谷脳炎ウィルス、 オムスク出血熱ゥイノレス、 ポヮサンウイノレス、 口 シァ春夏脳炎ウィルス、 ョコセウィルス、 アポィウィルス、 およびァロアウィル スからなる群より選択される、 [1] .または [2] 記載の核酸分子。
[4] [1] 〜 [3] のいずれか 1項記載の核酸分子によりコードされる、 弱 毒キメラフラビウィルス。
[5] [4] 記載の弱毒キメラフラビウィルスを含む、 弱毒生ワクチン。
[6] 以下の工程を包含する、 [1] 記載の核酸分子の作製方法：
日本脳炎ウィルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子中のェンベロ —プタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、 第 2のフラビウィルスのェン ベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列と組換える工程；および 該日本脳炎ウィルスのプレメンブランタンパク質および Zまたは非構造タンパ ク質をコードするヌクレオチド配列中に、 ウィルスを弱毒化するアミノ酸変異を 1つ以上生じるヌクレオチド変異を導入する工程。
[7] 以下の工程を包含する、 [1] 記載の核酸分子の作製方法：
プレメンブランタンパク質および Zまたは非構造タンパク質中にウィルスを弱 毒化するアミノ酸変異を 1つ以上含む日本脳炎ウィルスをコードするヌクレオチ ド配列を含む核酸分子中の、 エンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド 配列を、 第 2のフラビウィルスのエンベロープタンパク質をコードするヌクレオ チド配列と組換える工程。
[8] [1] 〜 [3] のいずれか 1項記載の核酸分子から、 キメラプラビウイ ルスタンパク質を発現させる工程を包含する、 弱毒キメラフラビウィルスの作製 方法。
[9] プレメンブランタンパク質および Zまたは非構造タンパク質中にウィル スを弱毒化するアミノ酸変異を 1つ以上含む日本脳炎ウィルスをコードするヌク レオチド配列を含む、 核酸分子。
[10] [9] 記載の核酸分子を含む、 ベクター。
[1 1] [9] 記載の核酸分子によりコードされる、 弱毒日本脳炎ウィルス。
[1 2] 日本脳炎ウィルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子中の プレメンブランタンパク質および または非構造タンパク質をコードするヌクレ ォチド配列中に、 ウィルスを弱毒化するアミノ酸変異を 1つ以上生じるヌクレオ チド変異を導入する工程を包含する、 [9] 記載の核酸分子の作製方法。
[1 3] [9] 記載の核酸分子から、 日本脳炎ウィルスタンパク質を発現させ る工程を包含する、 弱毒日本脳炎ウィルスの作製方法。
本発明によって、 Eタンパク質以外の部分に弱毒化変異を有する弱毒キメラフ ラビウィルスが提供される。 本発明のキメラフラビウィルスの弱毒性は、 Eタン パク質を改変せずに達成できるため、 免疫誘導能を低下させることなく、 種々の フラビウィルス感染に対する弱毒生ワクチンを短期間で実用化することができる 図面の簡単な説明 図 1は、 日本脳炎ウィルス ML— 1 7株と J a OHO 566株との間のゲノム c DNAのヌクレオチド配列およびポリタンパク質のアミノ酸配列中の差異を示 す。 N tはヌクレオチドを表し、 A Aはアミノ酸を表す。 アミノ酸位置を、 ポリ タンパク質の開始メチォニンの次のァミノ酸から数えた番号で表す。
図 2は、 日本脳炎ウィルス ML— 1 7株のポリタンパク質中の、 親株 （ J a O HO 566株） から変異しているアミノ酸 （太字で表す） を、 J a OHO 566 株、 J a OA r S 982株、 J a GA r O l株、 N a k a y a ma株、 B e i j i n g株、 SA 14株、 および S A 14— 14— 2株のポリタンパク質中の対応 するアミノ酸と比較した結果を示す。 アミノ酸位置を、 ポリタンパク質の開始メ チォニンの次のアミノ酸から数えた番号で表す。 *は、 その位置のアミノ酸が M L— 1 7株と同一であることを表す
図 3は、 組換え日本脳炎ウィルス MS— 14株および MS— 1 5株の完全長 c DNAの L o n g— P C R法による作製方法の概略を示す。
図 4は、 ML— 1 7/WN (E g e n e) キメラフラビウィルスの c DNA の L o n g— PCR法による作製方法の概略を示す。 発明を実施するための最良の形態 本発明は、 日本脳炎ウィルス （第 1のフラビウィルス） の Cタンパク質、 p r Mタンパク質、 および NSタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、 第 2の フラビウィルスの Eタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、 核酸分子 を提供する。 好ましくは、 本発明は、 日本脳炎ウィルスの 5' 非翻訳領域のヌク レオチド配列、 Cタンパク質、 p r Mタンパク質、 および N Sタンパク質をコー ドするヌクレオチド配列、 ならびに 3， 非翻訳領域のヌクレオチド配列と、 第 2 のフラビウィルスの Eタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む、 核酸 分子を提供する。 さらに、 この核酸分子は、 日本脳炎ウィルスの p r Mタンパク 質および Zまたは N Sタンパク質をコードするヌクレオチド配列中に、 以下に記 載するような、 ウィルスを弱毒化し得るアミノ酸変異を 1つ以上生じるヌクレオ チド変異を含む。
本発明はまた、 このような核酸分子によりコードされる、 キメラフラビウィル スを提供する。
本明細書中において、 「核酸分子」 とは、一本鎖または二本鎖の D N Aまたは R
N Aのことを意味する。
本明細書中において、 「ヌクレオチド配列」 とは、 特に言及しない限り、 デォキ シリボヌクレオチド（A、 G、 C、 および Tで表す）の配列、 またはリボヌクレオ チド（A、 G、 C、 および Uで表す）の配列を意味する。
本明細書中において、 特に言及しない限り、 一本鎖ヌクレオチド配列は、 左端 が 5 ' 末端、 右端が 3 ' 末端を表し、 そしてアミノ酸配列は、 左端が N末端 （ァ ミノ末端）、 右端が C末端 （カルボキシル末端） を表す。 .
本明細書中において、 特に言及しない限り、 アミノ酸の表記は、 アミノ酸に関 する標準的な表記である 1文字略号または 3文字略号を使用する。
本明細書中において、 「弱毒」 とは、 ワクチン接種の対象となる動物 {例えば、 ヒ トおよび非ヒ ト哺乳動物 （例えば、 サル、 ゥマ、 ゥシ、 ヒッジ、 ブタ、 ィヌ、 ネコ、 ゥサギ、 ラッ ト、 マウスなど）、 ならびに鳥類など }に対して、 ワクチンと して安全に使用できる程度の低病原性 （低毒性） のことを意味する。
本明細書中において、 「ワクチンとして （安全に） 使用できる程度」 とは、 ワク チンを接種した局所において、 ウィルスの増殖は認められるが、 重篤な症状を示 すことなく増殖が終了し、 その後の、 ワクチンを接種した個体に対する強毒ウイ ルスによる攻撃試験において、 接種したウィルスに起因する疾患の発症を防御す ることができる特異的免疫を付与することを意味する。
本発明のキメラフラビウィルスの作製に使用される第 1のフラビウィルスであ る日本脳炎ウィルスは、 本発明のキメラフラビウィルスの p rMタンパク質およ び または NSタンパク質が、 最終的に、 以下に記載するようなウィルスを弱毒 化するアミノ酸変異の 1つ以上を含む限り、 特に限定はされない。
従って、 日本脳炎ウィルスには、 種々の株 （例えば、 ML— 1 7株、 J a OH 0566株、 J a OA r S 982株、 J a GA r O l株、 N a k a y a ma株、 B e i j i n g株、 SA 14株、 SA 14— 14— 2株など） が存在するが、 い ずれの株を用いてもよい。
種々の日本脳炎ウィルス株のゲノムがクローン化され、 その完全または部分ヌ クレオチド配列が決定されている。 例えば、 J a OA r S 98 2株については、 S um i y o s h i ら、 V i r o l o g y 1 6 1 :497-5 1 0, 1 98 7 ； N a k a y a ma株については、 Mc Ad a ら、 V i r o 1 o g y 1 58 ： 348 -360, 1 9 87 ; B e i j i n g株については、 Ha s h i mo t oら、 V i r u s G e n e s 1 : 305-3 1 7, 1 988 ; S A 14株および S A 1 4- 14- 2株については、 N i t a y a p h a nら、 V i r o l o g y 1 7 7 ： 54 1 - 5 52, 1 990を参照のこと。
また、 種々の日本脳炎ウィルスのゲノム配列に関する情報は、 G e n B a n k などの公に利用可能な遺伝子データベースからも入手することができる。例えば、 J a OA r S 982株については、 G e n B a n k登録番号： M 1 83 70 ； J a G A r 0 1株については、 G e n B a n k登録番号： AF 069076 ; B e i j i n g- 1株については、 G e n.B a n k登録番号： L4896 1 ; SA 1 4株については、 G e n B a n k登録番号： M55506 ； SA 14— 14— 2 株については、 G e n B a n k登録番号： AF 3 1 5 1 1 9を参照のこと。
本発明のキメラウィルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を作製 するために、 日本脳炎ウィルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が 調製され、 キメラフラビウィルスの遺伝子バックボーンとして用いられ得る。 日 本脳炎ウィルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子としては、例えば、 ゲノム RNA、 c DNA、 合成 RNA、 合成 DN Aなどが挙げられる。
あるいは、 本発明のキメラフラビウィルスをコードするヌクレオチド配列を含 む核酸分子を作製するために、 日本脳炎ウィルスをコードするヌクレオチド配列 を含む核酸分子の任意の断片 （例えば、 PCRによる増幅 DNA断片など） が用 いられ得る。
日本脳炎ウィルスのゲノム RNAは、 公知の方法によって、 日本脳炎ウィルス を感染させた、細胞 （例えば、 MMC— LK 2細胞、 H e L a細胞、 N 2 a細胞、 P S細胞、 B SC— 1細胞、 HL— CZ細胞、 L LC— MK2細胞、 V e r o細 胞、 BHK細胞、 蚊由来の C 6/36細胞、 マウスまたはハムスター由来の脳内 細胞）、発育鶏卵などから調製することができる。 ゲノム RNAを調製するために 用いられる日本脳炎ウィルス株は、 特に限定されず、 例えば、 上記に列挙したよ うな株が用いられ得る。
日本脳炎ウィルスの c DNAは、公知の方法（例えば、 S um i y o s h i ら， V i r o l o g y 1 6 1 : 49 7— 5 10, 1 98 7に記載される方法） に従 つて、 ゲノム RNAから構築できる。
あるいは、 日本脳炎ウィルスのゲノム RNA、 c DNA, またはそれらの任意 の断片は、 日本脳炎ウィルスのゲノム配列情報に基づいて、 公知の方法により化 学合成することもできる。
日本脳炎ウィルスのゲノム RNA、 c DNA, またはそれらの任意の断片は、 ゲノム RNAまたは c DNAを铸型として、 P o l yme r a s e Ch a i n R e a c t i ο η (Γ P C R法」 と略称する）、 R e v e r s e T r a n s c r i p t a s e - P o l yme r a s.e し h a i n R e a c t i o n(「R i' - PCR 法 J と略称する）、 L o n g P o l yme r a s e C h a i n R e a c t i o n (TL o n g- P CR法 j と略称する）、 および または L o n g-R e v e r s e T r a n s c r i p t a s e - P o l yme r a s e Ch a i n R e a c t i o n (「L o n g -R T-P C R法」と略称する）によって増幅することができる。 あるいは、 日本脳炎ウィルスのゲノム RNA、 c DNA、 またはそれらの任意 の断片を、 ベクターに挿入してクローニングすることもできる。
用いられるベクターとしては、 例えば、 p BR 322、 p BR 325、 p B R 327、 p BR 328、 pUC 7、 pUC 8、 pUC 9、 p CU 1 8、 pUC l 9、 p HSG 2 98、 pHSG 2 99、 p SC 1 0 1、 p GBM5、 p C R I I などのプラスミ ドが挙げられる。 また、 クローニングベクターとして、 バタテリ オファージ、 コスミ ド、 ファージミ ドなどを用いることもできる。 このようなク ローニングベクターは、 例えば、 N I P PON GENE CO., LTD. など から市販されている。
本発明に用いられる第 2のフラビウィルスとしては、 日本脳炎ウィルスとは異 なるフラビウィルス、 例えば、西ナイルウィルス、 デング （ 1〜4型） ウィルス、 黄熱ウィルス、 セントルイス脳炎ウィルス、 ダニ媒介脳炎ウィルス、 クンジンゥ ィルス、 中央ヨーロッパ脳炎ウィルス、 キイアサヌァフォレストウィルス、 マリ 一谷脳炎ウィルス、 オムスク出血熱ウィルス、 ポヮサンウィルス、 ロシア春夏脳 炎ウィルス、 ョコセウィルス、 アポィウィルス、 ァロアウィルスなどが挙げられ る。 これらのフラビウィルス種もまた、 その各々の種について、 様々な変異株が 存在するが、 いずれの株を用いてもよい。
上記のような、 種々のフラビウィルスの Eタンパク質をコードするヌクレオチ ド配列およびアミノ酸配列は公知であり、 さらに、 これらのフラビウィルス種の 多くは、 ゲノムの全ヌクレオチド配列が報告されている。 例えば、 以下を参照の こと ：西ナイルウイノレス （例えば、 Wenglerら、 Virology 147:264-274， 1985) ； デング 1型ウィルス （例えば、 Mason.ら， Virology 161:262-267， 1987) ；デング 2型ウィルス （例えば、 Deubel ら， Virology 155:365-377， 1986; Gruenbergら、 J. Gen. Virol.69： 1391-1398, 1988； Hahnら、 Virology 162:167-180, 1988) ；デ ング 3型ウィルス （例えば、 Osatomi ら、 Virus Genes 2:99 - 108, 1988) ；デング 4型ウィルス （例えば、 Mackowら、 Virology 159:217-228, 1987; Zhaoら、 Vir ology 155:77-88， 1986) ；黄熱病ウィルス（例えば、 Riceら、 Science 229:726-7 33， 1985) ；セントルイス脳炎ウィルス（例えば、 Trent ら、 Virology 156:293-30 4, 1987) ；ダニ媒介脳炎ウィルス（例えば、 Mandl ら、 Virology 166:197-205， 19 88) ； クンジンウイノレス （例えば、 Coiaら、 J. Gen. Virol. 69 (Pt 1):1— 21, 198 8) ；キイアサヌァフォレス トウイノレス （例えば、 Venugopal ら、 Journal of Gene ral Virology 75:227-232， 1994； Kunoら、 Journal of Virology 72:73-83， 199 8) ；マリー谷脳炎ウィルス （例えば、 Dalgarnoら、 J. Mol. Biol. 187:309-323, 1986) ；オムスク出血熱ゥイノレス （例えば、 Linら、 Virology 313:81-90, 2003； Li ら、 Journal of General Virology 85: 1619 - 1624, 2004； Gritsunら、 Journ al of General Virology 74： 287-291, 1993) ； ポヮサンウィルス （例えば、 Kun oら、 Am. J. Trop. Med. Hyg. 65:671 - 676, 2001； Mandl ら、 Virology 194:173 -184, 1993) ； ロシア春夏脳炎ウィルス （例えば、 Kunoら、 Journal of Virology
72 :73 - 83, 1998) ；アポィウイノレス （例えば、 Billoirら、 Journal of General Virology 81:781-790, 2000) ； ァロアウイノレス （例えば、 Gaunt ら、 Journal of General Virology 82:1867-1976, 2001)。
また、 種々のプラビウィルスのゲノムのヌクレオチド配列に関する情報は、 G e n B a n kなどの公に利用可能な遺伝子データベースからも入手することがで きる。 例えば、 以下を参照のこと ：西ナイルウィルス （例えば、 GenBank登録番 号： M12294; NC_001563) ；デング 1型ウィルス （例えば、 GenBank登録番号： M23 027) ；デング 2型ウィルス （例えば、 GenBank登録番号： M19197; NC_001474) ； デング 3型ウィルス （例えば、 GenBank登録番号： M93130) ；デング 4型ウィルス (例えば、 GenBank登録番号： M14931)；黄熱ウィルス（例えば、 GenBank登録番号： X03700; NC_002031) ；セントルイス脳炎ウィルス（例えば、 GenBank登録番号： Ml 6614)；ダニ媒介脳炎ウィルス（例えば、 GenBank登録番号： U27495; N 001672) ； クンジンウィルス （例えば、 GenBank登録番号： AY274504; AY274505) ； キイァ サヌァフォレス トウィルス （例えば、 GenBank登録番号： X74111) ；マリー谷脳炎 ウィルス （例えば、 GenBank登録番号： AF161266; NC_000943) ； オムスク出血熱 ウイノレス （例えば、 GenBank登録番号： AY193805; AY438626; X66694; NC_00506 2) ；ポヮサンウィルス （例えば、 GenBank登録番号： AF310922; AF310920； AF310 912; L06436; NC— 003687) ； ョコセウィルス （例えば、 GenBank登録番号： AB1148 58； NC— 005039) ；アポィウィルス （例えば、 GenBank登録番号： AF160193; NC_00 3676) ；ァロアウィルス （例えば、 GenBank登録番号： AF372413)。
本発明のキメラウィルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を作製 するために、 第 2のフラビウィルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分 子が調製され、 その Eタンパク質をコードする領域が用いられ得る。 第 2のフラ ビウィルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子としては、 例えば、 ゲ ノム RNA、 c DNA、 合成 RNA、 合成 D N Aなどが挙げられる。
あるいは、 本発明のキメラフラビウィルスをコードするヌクレオチド配列を含 む核酸分子を作製するために、 第 2のフラビウィルスをコードするヌクレオチド 配列を含む核酸分子の任意の断片 （例えば、 PCRによる増幅 DNA断片など） が用いられ得る。
第 2のフラビウィルスのゲノム RN Aは、 日本脳炎ウィルスと同様の方法によ つて、 調製することができる。
第 2のフラビウィルスの c DNAもまた、 日本脳炎ウィルスと同様の手法によ つて、 ゲノム RNAから構築できる。
あるいは、 第 2のフラビウィルスのゲノム RNA、 c DNA、 またはそれらの 任意の断片は、 第 2のフラビウィルスとして用いるウィルスに関する公知のゲノ ム配列情報に基づいて、 公知の方法により化学合成することもできる。
第 2のフラビウィルスのゲノム RNA、 c DNA、 またはそれらの任意の断片 は、 日本脳炎ウィルスと同様に、 PCR法、 RT— PCR法、 L o n g— PCR 法およびノまたは L o n g— RT— P CR法によって、 ゲノム RNAまたは c D NAを铸型として増幅することができる。
あるいは、 第 2のフラビウィルスのゲノム RNA、 c DNA, またはそれらの 任意の断片を、 日本脳炎ウィルスと同様に、 上記に列挙したような適切なベクタ 一に挿入してクローニングすることもできる。 本発明のキメラフラビウィルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子 (DNAまたは RNA) は、 日本脳炎ウィルスをコードするヌクレオチド配列を 含む核酸分子中の Eタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、 第 2のフラビ ウィルスのエンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列と組換えるこ とによって作製される。
日本脳炎ウィルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子中の Eタンパ ク質をコードする領域の組換えは、公知の組換え技術（例えば、 Mo r i t aら、 V i r o l o g y 28 7 : 4 1 7-426, 200 1に記載される L o n g— PCR法を利用する方法など） によって行うことができる。
あるいは、 本発明のキメラフラビウィルスをコードするヌクレオチド配列を含 む核酸分子 （DNAまたは RNA) は、 S本脳炎ウィルスおよぴ第 2のフラビゥ ィルスに関するゲノム配列情報に基づいて、 本発明のキメラフラビウィルスをコ 一ドする全ヌクレオチド配列を設計し、 化学合成により作製することもできる。 本発明のキメラフラビウィルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子 を、 DN Aとして作製する場合、 インビトロ転写のためのプロモーター配列が D NAの 5' 末端に導入される。 本発明のキメラフラビウィルスをコードする DN Aは、 キメラフラビウィルスタンパク質を発現させる前の任意の段階で、 導入さ れたプロモーターに対応する RN Aポリメラーゼによって RN Aへと転写される 用いられるプロモータ一配列としては、 例えば、 T 7 RNAポリメラーゼプロモ —ター、 S P 6 RNAポリメラーゼプロモーターなどが挙げられる。
本発明のキメラフラビウィルスをコードする RNAは、 トランスフエクシヨン、 エレク トロポレーション、 マイク口インジエタションなどの当該分野で公知の遺 伝子導入技術により、タンパク質の発現に適切な細胞（例えば、 C 6ノ36細胞、 V e r o細胞、 BHK細胞、 MMC— LK2細胞、 He L a細胞、 N 2 a細胞、 P S細胞など） に導入され、 そしてこの細胞においてキメラフラビウィルスタン パク質が発現される。
あるいは、 本発明のキメラフラビウィルスは、 細胞破砕液や抽出液に、 基質や 酵素などを加えることによって、生物の遺伝情報翻訳系を試験管内に取り揃えた、 細胞系を使用しないタンパク質の生産方法 （無細胞系発現ともいう ；例えば、 米 国特許第 5， 478， 730号； 1^& {1 1 11ら、 ？ 1： 0。. a t l . A c a d . S c i . USA 9 7 : 559- 564, 2000 ; S a wa s a k i ら、 P r o c. Na t l . Ac a d. S c i . USA 99 : 14652— 146 57, 2002を参照のこと） を利用して、 キメラフラビウィルスタンパク質を 取得することもできる。
本発明のキメラフラビウィルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子 は、 この核酸分子中の日本脳炎ウィルスに由来する p rMタンパク質および ま たは N Sタンパク質をコードするヌクレオチド配列中に、 ウィルスを弱毒化する アミノ酸変異を 1つ以上生じるヌクレオチド変異を含む。
詳細には、 ウィルスを弱毒化するアミノ酸変異とは、 日本脳炎ウィルス J a O A r S 98 2株の各構造タンパク質および非構造タンパク質のァミノ酸配列（H. S um i y o s h i ら、 V i r o l o g y 1 6 1 : 49 7- 5 1 0, 1 98 7 を参照のこと） を基準として表した場合、 以下のアミノ酸置換である ： p rMタ ンパク質の 1番目のメチォニンのィソロイシンによる置換； p rMタンパク質の 148番目 （Μタンパク質の 56番目）のァスパラギンのトレオニンによる置換； N S 2 Αタンパク質の 4番目のァラニンのセリンによる置換； NS 4 Bタンパク 質の 5 1番目のァスパラギンのリジンによる置換； NS 4 Bタンパク質の 52番 目のバリンのィソロイシンによる置換； N S 4 Bタンパク質の 68番目のトレオ ニンのセリンによる置換； NS 5タンパク質の 1 26番目のロイシンのメチォ二 ンによる置換；および Zまたは、 NS 5タンパク質の 854番目のセリンのァス パラギンによる置換。
あるいは、 上記のアミノ酸置換はまた、 それぞれのアミノ酸位置で導入された アミノ酸に対する保存的アミノ酸を用いて行われ得る。
本明細書中において、 「保存的アミノ酸」 とは、物理化学的性質において類似し たアミノ酸を意味し、 例えば、 芳香族アミノ酸 （P h e、 T r p、 T y r )、 脂肪 族アミノ酸（ 1 3、 し 6 1_1、 1 1 6、 ¥ 3 1 )、極性アミノ酸（G 1 n、 A s n)、 塩基性ァミノ酸 （L y s、 A r g、 H i s)、 酸性ァミノ酸 （G l u、 A s p), 水酸基を有するアミノ酸 （S e r、 Th r)、 側鎖の小さいァミノ酸 （G 1 y、 A l a、 S e r ) などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。
好ましくは、 本発明のキメラフラビウィルスは、 上記のアミノ酸置換の内、 少 なくとも、 P rMタンパク質の 1番目のメチォニンのイソロイシンによる置換、 および Zまたは、 p r Mタンパク質の 148番目 （Mタンパク質の 56番目） の ァスパラギンのトレオニンによる置換を含む。
上記のアミノ酸変異は、 本発明のキメラフラビウィルスをコードするヌクレオ チド配列を含む核酸分子を作製する任意の工程において導入することができる。 上記のァミノ酸変異の導入は、 例えば、 Mo r i t aら、 V i r o l o g y 28 7 : 4 1 7-426, 200 1に記載される L o n g— P CR法を利用する 部位特異的変異誘発方法、 あるいは、 プラスミ ドへクローユングした c DNAに 対して、 Ku n k e l法、 G a p p e d d u l e x法などの公知の方法また はこれらの方法を利用した変異導入用キッ ト （例えば、 T a k a r a B i o I n c.より入手可能） などを用いて行うことができる。
あるいは、 p rMおよび または NSタンパク質中にウィルスを弱毒化するァ ミノ酸変異を 1つ以上含む日本脳炎ウィルスをコードするヌクレオチド配列を含 む核酸分子を、 本発明のキメラフラビウィルスをコ一ドするヌクレオチド配列を 含む核酸分子の作製に用いることによって、 本発明のキメラフラビウィルスにこ れらの変異を導入できる。
p rMおよび または NSタンパク質中にウィルスを弱毒化するアミノ酸変異 を 1つ以上含む日本脳炎ウィルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子 は、 前述の公知の部位特異的変異誘発方法を用いて、 これらの変異を含まない日 本脳炎ウィルス株 （例えば、 J a OH0566株、 J a OA r S 982株、 J a GA r O l株、 Na k a y a ma株、 B e i j i n g株、 SA 14株、 SA 14 — 14— 2株など） のゲノム RNAまたは c DNAに、 これらの変異を人為的に 導入することによって作製することができる。
このようにして人為的に作製した、 p rMおよび または NSタンパク質中に ウィルスを弱毒化するアミノ酸変異を 1つ以上含む日本脳炎ウィルスをコードす るヌクレオチド配列を含む核酸分子から、 前述したような公知の方法によって、 ウィルスタンパク質を発現させて、 組換え日本脳炎ウィルスを作製することがで さる。
この組換え日本脳炎ウィルスを、 前述したような適切な細胞に感染させ、 細胞 を培養することにより、 培養した細胞から大量のゲノム RNAが調製できる。 さらに、 この組換え日本脳炎ウィルスは、 それ自体が、 弱毒日本脳炎ウィルス であり、 日本脳炎に対する有望な弱毒生ワクチン候補であり得る。
p rMおよび または NSタンパク質中にウィルスを弱毒化するアミノ酸変異 を 1つ以上含む日本脳炎ウィルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子 はまた、 このようなアミノ酸変異の 1つ以上を生来含む日本脳炎ウィルス変異株 からゲノム RN Aまたは c DN Aを取得することにより調製することもできる。 p rMおよび Zまたは NSタンパク質中にウィルスを弱毒化するアミノ酸変異 の 1つ以上を生来含む日本脳炎ウィルス変異株としては、 例えば、 日本脳炎ウイ ルス ML— 1 7株が挙げられる。 ML— 1 7株は、 ブタ用日本脳炎ウィルスワク チン株であり （例えば、 Yo s h i d aら、 B I KEN J OURNAL 24 : 47-6 7, 1 98 1を参照のこと）、財団法人 阪大微生物病研究会 （大阪府吹 田巿山田丘 3番 1号 大阪大学内） から入手可能である。
あるいは、 細胞での継代などにより生じた日本脳炎ゥィルスの突然変異株の中 から、 p rMおよびノまたは NSタンパク質中にウィルスを弱毒化するアミノ酸 変異の 1つ以上を含む株を、 公知の方法により選抜して、 そのゲノム RNAまた は c DNAを、 本発明のキメラフラビウィルスの作製に用いることもできる。 このようにして調製された、 p rMおよび Zまたは NSタンパク質中にウィル スを弱毒化するアミノ酸変異を 1つ以上含む日本脳炎ウィルスをコ一ドするヌク レオチド配列を含む核酸分子 （ゲノム RNAまたは c DNA) は、 必要に応じて 断片化して、 前述したようなクローニングべクタ一に挿入してもよい。 例えば、 このような組換えベクターを利用すれば、 安全かつ簡便に本発明のキメラフラビ ウィルスを作製することができる。
本発明のキメラフラビウィルスの構築を確認するには、 例えば、 作製したキメ ラウィルスから遺伝子を取得して、 その塩基配列または対応するアミノ酸配列の 全てもしくは一部 （例えば、 変異を導入した部分、 2つのウィルスの連結部分な ど） を決定し、 その配列が、 意図された配列と一致していることを確かめればよ レ、。
本発明はまた、 本発明のキメラフラビウィルスを含む弱毒生ワクチン （以下、 本発明のワクチンともいう） を提供する。 ウィルスの Eタンパク質は、 中和抗体 を誘導する抗原決定基を含むため、 ワクチンとして本発明のキメラフラビウィル スを接種すると、 Eタンパク質として用いた第 2のフラビウィルス種に対する抗 体が産生される。
本発明のワクチンは、 種々のフラビウィルス感染を予防するために、 例えば、 ヒ トおよび非ヒ ト哺乳動物 （例えば、 サル、 ゥマ、 ゥシ、 ヒッジ、 ブタ、 ィヌ、 ネコ、 ゥサギ、 ラット、 マウスなど）、 ならびに鳥類などの動物に接種され得る。 本発明のワクチンは、 懸濁液または凍結乾燥剤の形態で製造可能である。 本発 明のワクチンには、 本発明のキメラフラビウィルスに加えて、 ワクチン製剤にお いて通常用いられる、 薬学的に受容可能な、 安定剤 （例えば、 白糖、 乳糖、 ブド ゥ糖、 ゼラチン、 ゼラチン加水分解物、 L—グルタミン酸ナトリウム、 血清アル ブミンなど）、 無痛化剤 （例えば、 ブドウ糖など） などが配合され得る。
ワクチン接種の際、 本発明のワクチンは、 通常、 薬学的に受容可能な担体に溶 解または懸濁され得る。担体とレては、例えば、水、食塩水（生理食塩水を含む）、 緩衝液 （例えば、 リン酸緩衝液） などの液体の担体が挙げられる。
本発明のワクチンは、 代表的には、 0 . 1〜1 . O m 1の用量あたり 1 0 2〜 1 0 6 P F Uの本発明のキメラフラビウィルスを含有する無菌水溶液として処方 され、 例えば、 皮下、 皮内、 筋肉内などに接種され得る。 あるいは、 フラビウィルスの中には、 粘膜を介して感染することが知られてい る種もあるため、 選択した第 2のフラビウィルス種に応じて、 本発明のワクチン を経口または経鼻投与してもよい。
さらに、 本発明のキメラフラビウィルスをコードするヌクレオチド配列を含む 核酸分子 （RNAまたは DNA) 自体を、 核酸ワクチン製剤として使用すること もできる。
構築したキメラウィルスの効果および安全性の確認は、 当該分野で公知の評価 方法により、 例えば、 動物 （例えば、 マウス、 サルなど） における、脳神経毒性、 末梢からの中枢神経系への感染性 （脳神経侵襲性）、 感染予防効果、 ウィルス血症 の有無、 中和抗体の産生などを評価することによって行うことができる。
以下の実施例によって、 本発明をより具体的に説明するが、 実施例は、 本発明 の単なる例示を示すものにすぎず、 本発明の範囲を何ら限定するものではない。 実施例
(実施例 1 )
(日本脳炎ウィルスワクチン ML— 1 7株の弱毒化変異部位の決定） 日本脳炎ウィルスワクチン ML— 1 7株の弱毒化変異部位を決定するために、 初めに、 ML— 1 7株と、 その親株である野生型の毒性日本脳炎ウィルス J a O HO 566株との間で、 完全長ゲノム c DNAのヌクレオチド配列おょぴポリタ ンパク質のァミノ酸配列を比較した。
ML- 1 7株 （財団法人 阪大微生物病研究会から入手した） の完全長ゲノム c DN Aのヌクレオチド配列 （配列番号 1) および J a OHO 566株の完全長 ゲノム c DNAのヌクレオチド配列 （配列番号 3) を、 S um i y o s h i ら， V i r o l o g y 1 6 1 : 497-5 10, 1 987に開示される方法に従って 決定した。 いずれの株も、 c DNAの構築には、 表 1 Aに示す PCRプライマ一 を用い、 そして、.構築した c DN Aのヌクレオチド配列の決定には、 表 1 Bに示 す配列決定用プライマーを用いた。 さらに、 M L— 1 7株のポリタンパク質のァ ミノ酸配列 （配列番号 2 ) および J a O H O 5 6 6株のポリタンパク質のァミノ 酸配列 （配列番号 4 ) を、 それぞれの完全長ゲノム c D N Aのヌクレオチド配列 から推定した。
(表 1 A ) 日本 K炎ウィルス （J E V ) P C Rプライマー
フ'ラ ίマ-名 対応するゲノムの ヌクレオチド S列
Ϊクレオチド位置 *
JE 1-34F 1-34-F A6AA6TTTATCT6TGTGAACTTCTTQ6CTTAGTA (配列番号 5)
JEV 2851-2817R 2851-2817-R GCAAA6AGAAT6CTTTTTCCCCAT6CTTTCCAGCC (配列番号 6)
JEV 2707-2741 F 2707-2741-F TCCTGCTCAAA6A6AATGCAQTQGACCTCAQTQTG (配列番号 7)
JEV 5554-5520R 5554-5520-R GTCATGAA6ATGGCT6CT6CCTCCCCTAATTCCAC (SB列番母 8)
JEV 5414-5449F 5414-5449-F ACTGATGTCACCGAACAGAGT6CCCAACTACAACCT (S列番号 9)
JEV 8257-8223R 8257-8223-R TTTTCTATAACCTT66GCATGTAAGGGCAGAGAAC (配列番号 10)
JEV 8119-B153F 8119-8153-F 6GGAATCCTCTCCAAGTCCAGAAGTAGAAGAAGAA (配列番号 Π)
JEV 10976-10943R 10976-10943- AQATCCTGTGTTCTTCCTCACCACCAGCTACATA (配列番 S 12)
(表 1 B) 日本 B炎ウィルス （JEV) 配列決定用プライマー
Figure imgf000022_0001
* ： Fはフォワードプライマーを表し、 Rはリバースプライマーを表す。 ゲノム c DN Aのヌクレオチド配列の比較の結果、 図 1に示すように、 ML— 7株は、 25個のヌクレオチド置換を有しており、 その内の 10個のヌクレオ チド置換に起因して、 ポリタンパク質の開始メチォニンの次のアミノ酸から数え て、 1 27番目、 2 74番目、 1 209番目、 246 2番目、 2463番目、 2 479番目、 265 2番目、 275 1番目、 2896番目、 および 3380番目 のアミノ酸において 10個のアミノ酸置換を生じていることが明らかとなった。 さらに、 上記の ML— 1 7株のポリタンパク質中のアミノ酸変異を、 ^!の野生 型の毒性日本脳炎ウィルスである、 J a OA r S 98 2株、 J a GA r O l株、 Na k a y ama株、 B e i j i n g株、 および SA 14株、 ならびに他の日本 脳炎ウィルスワクチンである、 SA 1 4— 14— 2株のポリタンパク質の対応す る部位のァミノ酸配列と比較した。
以下の株のポリタンパク質の推定アミノ酸配列を、 G e n B a n kから入手し て本実施例に用いた ：
J a OA r S 982株のポリタンパク質のァミノ酸配列 （GenBank登録番号： M18370) ；
J a G A r 0 1株のポリタンパク質のアミノ酸配列 （GenBank登録番号： AF069076) ；
B e i j i n g - 1株のポリタンパク質のアミノ酸配列 （GenBank登録番号： L48961) ；
S A 14株のポリタンパク質のアミノ酸配列 （GenBank登録番号： M55506) ； SA 14— 14一 2株のポリタンパク質のアミノ酸配列 （GenBank登録番号： AF315119)。
Na k a y a ma株のポリタンパク質のァミノ酸配列は、 GenBank登録番号： AF112297； McAdaら、 Virology. 158 (2)： 348- 60, 1987などに記載される遺伝子お よび Zまたはァミノ酸の部分配列情報から、 比較のために必要な領域のアミノ酸 配列を入手して本実施例に用いた。
図 2に示すように、 ポリタンパク質のアミノ酸配列の比較の結果、 ML— 1 7 株と J a OHO 566株との間の上記の 1 0個のアミノ酸置換の内、 ポリタンパ ク質の開始メチォニンの次のアミノ酸から数えて、 1 27番目、 274番目、 1 209番目、 246 2番目、 2463番目、 2479番目、 2652番目、 およ び 3380番目のアミノ酸位置における合計 8個のァミノ酸置換は、 ML— 1 7 株に固有のアミノ酸変異であった。
S um i y o s h i ら， V i r o l o g y 1 6 1 : 497 - 5 10, 1 98 7 に記載される日本脳炎ウィルス （J a OA r S 982株） のポリタンパク質中の 各構造タンパク質および非構造タンパク質の位置との比較から、 ポリタンパク質 中のこれらの 8個のアミノ酸置換の位置は、 それぞれ、 p rMタンパク質の 1番 目および 148番目 （Mタンパク質の 56番目） ； NS 2 Aタンパク質の 4番目 ； NS 4 Bタンパク質の 5 1番目、 52番目、 および 68番目 ； NS 5タンパク質 の 1 26番目および 854番目のアミノ酸に相当した。
(実施例 2)
(組換え日本脳炎ウィルス MS— 14株および MS _ 1 5株の作製）
ウィルスの弱毒化に対する、 ML— 1 7株に固有のアミノ酸変異の影響を確認 するために、 ： Mo r i t a ら、 V i r o l o g y 287 : 4 1 7-426, 20 0 1に記載される L o n g— PC R法を利用する部位特異的変異誘発法に従って、 野生型の毒性日本脳炎ウィルス J a OAr S 98 2株の遺伝子をバックボーンと して用いて、 p rMタンパク質の 1番目のメチォニンのイソロイシンによる置換 を生じるヌクレオチド変異 （ゲノムの 479位の Gの Aによる置換） を導入した 組換え日本脳炎ウィルスである MS— 14株、 および p r Mタンパク質の 148 番目 （Mタンパク質の 56番目） のァスパラギンのトレオニンによる置換を生じ るヌクレオチド変異 （ゲノムの 9 1 9位の Aの Cによる置換） を導入した組換え 日本脳炎ウィルスである MS— 1 5株を作製した。
(MS - 14株の作製）
図 3に示すように、 日本脳炎ウィルス （J a OA r S 982株） の遺伝子 RN Aを铸型として、 プライマー 1およびプライマー 2のセッ ト、 プライマー 3およ びプライマー 4のセッ ト、 ならびにプライマー 5およびプライマー 6のセッ トを 用いて、 L o n g— RT— P CR法により、 それぞれのプライマーセッ トに対応 する日本脳炎ウィルス遺伝子フラグメント （フラグメント 1、 2、 および 3) を 作製した。
さらに、それぞれのフラグメントをァガロース電気泳動法により精製したのち、 初めに、 フラグメント 1および 2を铸型として、 プライマ一 1および 4のセット を用いて再び L o n g— PC R法により遺伝子フラグメント 4を作製した。 この 遺伝子断片を同様に精製し、次に、遺伝子フラグメント 3および 4を铸型として、 プライマー 1および 6のセッ トを用いて L o n g— PCR法を実施し、 5， 末端 に T 7プロモータ二配列を有する完全長日本脳炎ウィルス c DNA (フラグメン ト 5) を作製した。
この完全長日本脳炎ウィルス c DNA (フラグメント 5) を铸型として、 試験 管内 RN A合成反応を実施し、 人工の完全長日本脳炎ウィルス遺伝子 RN Aを作 製した。 この RNAをエレク トロポレーション法により蚊細胞（C 6Z36細胞） に導入し、 5日間培養した後、 培養上清中に出現した組換えウィルス （MS— 1 4株） を回収した。
(MS— 1 5株の作製）
MS— 1 5株については、 プライマー 2をプライマ一 7に、 プライマー 3をプ ライマー 8に変更することで組換えウィルスを作製した以外、 上記の方法に従つ て、 組換えウィルスを回収した。
さらに、 コントロールとして、 変異を含まないウィルスを、 プライマー 2をプ ライマー 9に、 プライマー 3をプライマー 10に変更することで取得した。
本実施例に用いたプライマーを表 2に示す。 (表 2) rライマ-名 対応するケ' /ムの ヌクレオチド配列 *
ヌクレオチト'位置 *
フ ·ライマ- 1 T7 promoter-l-45-S AAAmAATACGACTCACTATAAGAAGTTTATCTGTGTGAACnCTTGGCnAGTATCGnG (K列番号 48) フ'ライマ- 9 972-927-R AAGCCGGAGCGAGCAACAGCAGGAGGATGGTAAATACCACGGGTTG (IB列番号 56) フ'ライマ- 10 927-972-S CAACGCGTGGTAnTACCATCCTCCTGCTGnGGTCGCTCCGGCn (E列 57) フ'ライマ- 4 2670-2626- GCTCCAATCTAGTGACAGATCT6ACTCC6CACACGCCTTCCTTGT (K列番号 51) フ'ライマ- 5 2501-2547-S CACAAGAAAAGAGATGAGATGTGGAAGTGGCATCnTGTGGACAACG 列番号 52) フ'ライマ- 6 10976-10937-R AGATCCTGTGnCTTCCTCACCACCAGCTACATACTTCGG (¾列番号 53) フ'ライマ- 3 439-484/5-S (479G-A) CGCAAGCTTGGCAGTTGTCATAGGTTACGCAGGAGCAATAAAGTT6 (£列番号 50) フ'ライマ- 2 471-515-R (479G-A) CGTCATCAAAAGCnCCCCTGGAAAnCGACAACHTAnGCTCC (Κ列番号 49) フ'ライマ- 8 882-926-S (919A-C) HCCTGGCGGCGACACnGGCTGGATGGTTGGCAGTAGCAACGGT (Ε列番号 55) フ'ライマ- 7 900-944 Ϊ (919A-*C) GGTAAATAGGAGGG6nGACGGHGGTACTGCCAAC(^TCCAGGC 列番号 54)
上記表において、 Sはセンス配列を表し、 Rは相補配列を表す。 下線ば、 τ 7 プロモーター配列を表し、 二重下線は、 ヌクレオチド変異を表す。
(実施例 3 )
(組換え日本脳炎ウィルス MS— 14株および MS— 1 5株の BHK細胞にお ける増殖能の評価）
実施例 2で作製した組換え日本脳炎ウィルス MS— 14株および MS— 1 5株 の、 BHK細胞における増殖能を評価した。 コントロールとして、 野生型の毒性 日本脳炎ウィルス J a OA r S 982株を用いた。
MS— 1 4株、 MS— 1 5株、 および J a OA r S 98 2株を、 それぞれ、 B HK細胞に感染させ、 感染から 24、 48、 および 72時間後の細胞培養上清を 採取し、 ウィルスの出現を確認した。 各々の時間における培養上清中のウィルス 量をプラーク法により測定した。 全ての株について、 BHK細胞における増殖が 確認された。
(実施例 4)
(組換え日本脳炎ウィルス MS— 1 4株および MS— 1 5株の、 正常成熟マウ スにおける神経毒性の評価）
実施例 2で作製した組換え日本脳炎ウィルス MS— 14株および MS— 1 5株 を用いて、 それぞれの株の正常成熟マウスの腹腔内接種法によって神経毒性を評 価した。 毒性コントロールとして野生型の毒性日本脳炎ウィルス J a OA r S 9 82株、 弱毒性コントローノレとして日本脳炎ウィルスワクチン ML— 1 7株を用 いた。
10匹のマウス群 （4週齢の雌雄 I C Rマウス、 各群 5匹ずつ） に、 1 01〜 106プラーク形成単位の MS— 14株、 MS— 1 5株、 ML— 1 7株、 J a O A r S 98 2株を脳内接種し、 3週間にわたり毎 観察し、 し050を！¾ 6 3 (1— Mu e n c h法で算出した。 本試験の結果を表 3に示す。 (表 3)
Figure imgf000028_0001
* ： MS - 1 4 r e vは、 L o n g— P C Rベースの部位特異的変異誘発を 用いて MS— 14から作製した MS— 14の復帰突然変異体を表す。
表 3に示すように、 MS— 14株および MS— 1 5株は、 毒性の J a OA r S 982株と比較して、 有意に弱毒化されていた。 特に、 MS— 14株は、 日本脳 炎ウィルスワクチン株である ML— 1 7株に近い弱毒性を有していた。
このことは、 p rMタンパク質中のアミノ酸置換により、 マウスの神経毒性を 低下させることが可能であることを示した。
上記の結果から、 組換え日本脳炎ウィルスである MS— 14株および MS— 1 5株に導入したアミノ酸変異は、 日本脳炎生ワクチン作製上、 有用であることが 示唆された。 さらに、 MS— 14は高濃度接種で低度の病原性が見られることか ら、 N S上の変異もまた弱毒化に必要であることが示唆された。 (実施例 5)
(日本脳炎ウィルスと西ナイルウィルスとのキメラフラビウイ/レス （ML— 1 7/WN (E g e n e)) の c.DNAの構築）
日本脳炎ウィルスワクチン ML— 1 7株の Eタンパク質が西ナイルウィルスの Eタンパク質により置換されたキメラフラビウィルスである、 ML— 1 7/WN (E g e n e )を作製するために、 M o r i t a ら、 V i r o 1 o g y 287 : 4 1 7-426, 200 1に記載される L o n g— P C R法を利用する組換え日 本脳炎ウィルス作製法に従って、 ML— 1 7ZWN (E g e n e) の c DNA を構築した。
図 4に示すように、 日本脳炎ウィルス生ワクチン株 （ML— 1 7株） の遺伝子 RN Aを铸型として、 プライマー 1 Aおよびプライマー 2 Aのセッ ト、 ならびに プライマー 5 Aおよびプライマー 6 Aのセットを用いて、 L o n g— RT— PC R法により、 それぞれのプライマーセットに対応する日本脳炎ウィルス遺伝子断 片 （フラグメント 1 Aおよび 3 A) を作製した。
また、 西ナイルウィルス （NY 99— 3 526 2— l l株） の遺伝子 RN Aを 铸型として、 プライマー 3 Aおよぴプライマー 4 Aのセットを用いて、 L o n g — RT— PCR法により西ナイルウィルス遺伝子フラグメント 2 Aを作製した。 それぞれのフラグメントを、 ァガロース電気泳動法により精製したのち、 初め に、 フラグメント 1 Aおよび 2 Aを铸型として、 プライマー 1 Aおよび 4 Aのセ ットを用いて、 再び L o n g _PCR法により遺伝子フラグメント 4Aを作製し た。
この遺伝子フラグメントを同様に精製して、 次いで、 遺伝子フラグメント 3 A および 4 Aを铸型として、 プライマー 1 Aおよび 6 Aのセットを用いて L o n g — PCR法を実施し、 5 ' 末端に T 7プロモーター配列を有し、 かつ西ナイルゥ ィルス Eタンパク質遺伝子を有する、 ML— 1 7/WN (E g e n e) のキメ ラウィルス c DNA (フラグメント 5 A) を作製した。
本実施例に用いたプライマーを表 4に示す。
(表 4) フ 'ライマ-名 対応するケ ムの ヌクレオチド配列 *
ヌクレオチド位置 *
rライマ- 5A JE2478-2513 WN2431-N GGAGGAGTTCTGCTCTTCCTCTCCGTGAAC6TGCACGCTGACACT6GATGTGCCATTGACATCACAAGAAAAGAG
(K列番号 62)
7'ライマ- 4A JE2478-2513 WN2433-R CTCTTTTCTTGT6ATGTCAATGGCACATCCAGTGTCAGC6TGCACGTTCAC6GA6A6GAA6AGCAGAACTCCT
(SB列番号 61)
7'ライマ- 6A JE-NR AGATCCTGTGTTCTTCCTCACCACCAQCTACATACTTCGG (配列番 ¾ 63) フ'ライマ- 3A Λί17 941 WN 967 S CACCATCCTCCTGCTGCTGGTCGCTCCGGCTTACAGTTTCAACT6CCTTGGAATGAGCAACAGAGACTTC
(K列番号 60)
1'ライマ- 2A ML17 945 WN 967 R CCAAGAAGTCTCTGTTGCTCATTCCAAGGCAGTTGAAACTGTAAGCGGGA6CGAGCAGCAGCAGGAGGAT
(配列番号 59) フ 'ライマ- 1A T7 promoter JE1-40 N AAATTTAATACGACTCACTATAAGAAGTTTATCTGTGT6AACTTCTTGGCTTAGTATCGTTG
(配列番号 58)
* ： J Eは日本脳炎ウィルス J a OA r 982株を表し、 ML 1 7は日本脳炎 ウィルス ML— 1 7株の配列を表し、 WNは西ナイルウィルスの配列を表す。 S または Nはセンス配列を表し、 Rは相補配列を表す。 下線は、 T 7プロモーター 配列を表す。
(実施例 6 )
(ML - 1 7/WN (E g e n e) の c D N Aからのキメラフラビウィルス の産生）
実施例 5で構築した S本脳炎ウィルスと西ナイルウィルスとのキメラフラビゥ ィルスの c DNA (図 4中のフラグメント 5 A) を铸型として、 試験管内 RNA 合成反応を実施して、 人工の完全長キメラウィルス遺伝子 RNAを作製した。 こ の RNAをエレク トロポレーション法により蚊細胞 （C 6 36細胞） に導入し て、 5日間培養した後、 培養上清中に出現したキメラウィルスを回収した。 (実施例 7)
(ML— 1 7ZWN (E g e n e) キメラフラビウィルスの増殖能の評価） キメラウィルスは、 実施例 6で得られた ML— 1 7 WN (E g e n e) を 用いた。 ML— 1 7/WN (E g e n e) と ML— 1 7株を、 C 6/36細胞 および BHK細胞において増殖させ、 その感染培養液を分注して、 — 70°Cで保 存した。 何れの細胞にもイーグル MEM培養液に非必須アミノ酸を添加した培養 液を用い、 必要に応じた濃度 （2〜1 0%) で牛胎児血清を添加した。 増殖実験 の培養液の感染価を表 5に示す。 M L— 1 7 /WN (E g e n e) は、 ML— 1 7と同等の増殖能を有していた。 (表 5) ML— 17ZWN (E g e n e) キメラプラビウィルス及び M L— 17 の C 6/36細胞および BHK細胞における増殖
Figure imgf000032_0001
(実施例 8 )
(ML - 1 7/WN (E g e n e) キメラウィルスの神経毒性の評価） 実施例 6で作製した組換えキメラウィルス、 ML— 1 7ノ WN (E g e n e) を用いて、 正常成熟マウス脳内接種法で神経毒性を評価した。 また、 腹腔内投与 で末梢から中枢神経系への感染（脳神経侵襲性）を調べた。コントロールとして、 野生型の強毒株 0本脳炎ウィルスである J a OHO 566株、 西ナイルウィルス NY9 9— 3562— 1 1株、 弱毒株日本脳炎ウィルスワクチン M L— 1 7株を 用いた。
生後 4週齢の C 5 7 B LZB 6マウスに 101〜 107の各ウィルスを脳内に 接種し、 28日間観察した。 LD5。を R e a d— Mu e n c h法で算出した。 表 6に、実験から得られた ML— 1 7ノ WN (E g e n e)の LD5。を示す。
ML- 1 7/WN (E g e n e ) は、 強毒の J a OHO 566株と比較して、 有意に弱毒化されていた。 特に、 ML— 1 7ZWN (E g e n e ) は、 日本脳 炎ウィルスワクチン株である ML— 1 7株に匹敵する弱毒性を有していた。 C 57 B L/B 6 マウスにおける ML— 1 7/WN (E gene) の LDS0
Figure imgf000033_0001
(実施例 9)
(ML - 1 7/WN (E g e n e) キメラウィルスの性状）
ML- 1 7/WN (E g e n e ) キメラウィルスの蚊に対する感染性を検討 した。 コガタァカイエ力 OK 7 (C u 1 e X t r i t a e n i o r h y n c h u s) に、 ゥサギ血液（抗体陰性） に混合したウィルスを経膜法により吸わせた。
PFU (P l a q u e— F o rm i n g Un i t)、および乳のみマウスの発症 率を評価することにより感染率を計算した。
経膜法によりキメラウィルスを吸わせた蚊を 10日、 2 1日間飼育後、 これを 乳剤とし、 乳のみマウス脳内接種および P FUの評価によりウィルスの存在の証 明を行った。 ML— 1 7/WN (E g e n e) は、 蚊 1匹あたり 102PFU 以上のウィルスを吸わせても、 全くウィルスの存在は証明されなかった。
ML - 1 7/WN (E g e n e) キメラウィルスはコガタァカイエ力 （Cu l e x t r i t a e n i o r h y n c h u s )に対して感受性を示さなかった。
(実施例 10)
(ML - 1 7/WN (E g e n e) キメラウィルスを含む生ワクチンの防御 効力の評価）
免疫実験には 2週齢の C 5 7 B L/B 6および C 3 H/H eマウスを用いた。 二つの近交系マウスを用いて検討した。免疫をしなかったコントロール群では、 西ナイルウィルス （NY 99— 3526 2— 1 1株） の脳内チヤレンジによって 致死的な感染を示したのに対して、 M L— 1 7ノ WN ( E g e n e ) を腹腔内 に接種した群では有意な感染防御が認められた。 産業上の利用可能性 本発明によって、 Eタンパク質以外の部分に弱毒化変異を有する弱毒キメラフ ラビウィルスが提供される。 本発明のキメラフラビウィルスの弱毒性は、 Eタン パク質を改変せずに達成できるため、 免疫誘導能を低下させることなく、 種々の フラビウィルス感染に対する弱毒生ワクチンを短期間で実用化することができる。 本出願は、 日本特許出願、 特願 2 0 0 4— 3 7 4 6 3 0を基礎としており、 そ の内容は全て本明細書に包含される。

Claims

請求の範囲
1 . 日本脳炎ウィルスのキヤプシドタンパク質、 プレメンブランタンパク質、 お よび非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、 第 2のフラビウィルス のエンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、 核酸分子であ つて、
ここで、 該日本脳炎ウィルスのプレメンブランタンパク質および または非構 造タンパク質をコ一ドするヌクレオチド配列は、 ウィルスを弱毒化するアミノ酸 変異を 1つ以上生じるヌクレオチド変異を含む、 核酸分子。
2 . 前記 S本脳炎ウィルスが、 M L - 1 7株である、 請求項 1記載の核酸分子。
3 . 前記第 2のフラビウィルスが、 西ナイルウィルス、 デング （1〜4型） ウイ ルス、 黄熱ウィルス、 セントルイス脳炎ウィルス、 ダニ媒介脳炎ウィルス、 クン ジンウィルス、中央ョ一口ッパ脳炎ウィルス、キイアサヌァフォレス トウイノレス、 マリー谷脳炎ウィルス、 オムスク出血熱ウィルス、 ポヮサンウィルス、 ロシア春 夏脳炎ウィルス、 ョコセウィルス、 アポィウィルス、 およびァロアウィルスから なる群より選択される、 請求項 1または 2記載の核酸分子。
4 . 請求項 1〜 3のいずれか 1項記載の核酸分子によりコードされる、 弱毒キメ ラフラビウィルス。
5 . 請求項 4記載の弱毒キメラフラビウィルスを含む、 弱毒生ワクチン。
6 . 以下の工程を包含する、 請求項 1記載の核酸分子の作製方法：
日本脳炎ウィルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子中のェンベロ ープタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、 第 2のフラビウィルスのェン ベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列と組換える工程；および 該日本脳炎ウィルスのプレメンブランタンパク質および /または非構造タンパ ク質をコ一ドするヌクレオチド配列中に、 ウィルスを弱毒化するアミノ酸変異を 1つ以上生じるヌクレオチド変異を導入する工程。
7 . 以下の工程を包含する、 請求項 1記載の核酸分子の作製方法：
プレメンブランタンパク質および/または非構造タンパク質中にウィルスを弱 毒化するアミノ酸変異を 1つ以上含む日本脳炎ウィルスをコードするヌクレオチ ド配列を含む核酸分子中の、 エンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド 配列を、 第 2のフラビウィルスのエンベロープタンパク質をコードするヌクレオ チド配列と組換える工程。
8 . 請求項 1〜 3のいずれか 1項記載の核酸分子から、 キメラフラビウィルスタ ンパク質を発現させる工程を包含する、 弱毒キメラフラビウィルスの作製方法。
9 . プレメンブランタンパク質およびノまたは非構造タンパク質中にウィルスを 弱毒化するアミノ酸変異を 1つ以上含む日本脳炎ウィルスをコードするヌクレオ チド配列を含む、 核酸分子。
1 0 . 請求項 9記載の核酸分子を含む、 ベクター。
1 1 . 請求項 9記載の核酸分子によりコードされる、 弱毒日本脳炎ウィルス。
1 2 . 日本脳炎ウィルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子中のプレ メンブランタンパク質および または非構造タンパク質をコードするヌクレオチ ド配列中に、 ウィルスを弱毒化するアミノ酸変異を 1つ以上生じるヌクレオチド 変異を導入する工程を包含する、 請求項 9記載の核酸分子の作製方法。
13. 請求項 9記載の核酸分子から、 日本脳炎ウィルスタンパク質を発現させる 工程を包含する、 弱毒日本脳炎ウィルスの作製方法。
PCT/JP2005/024161 2004-12-24 2005-12-22 弱毒日本脳炎ウイルスの遺伝子をバックボーンとして有する弱毒キメラフラビウイルス WO2006068307A1 (ja)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11/793,277 US7749734B2 (en) 2004-12-24 2005-12-22 Attenuated chimeric flavivirus bearing attenuated Japanese encephalitis virus gene as backbone
AU2005320001A AU2005320001B2 (en) 2004-12-24 2005-12-22 Attenuated chimeric flavivirus bearing attenuated Japanese encephalitis virus gene as backbone
EP05822652A EP1840214A4 (en) 2004-12-24 2005-12-22 DEFICIENT CHIMERIC FLAVIVIRUS WITH WEAKENED JAPANESE ENZEPHALITIS VIRUS GENE AS BASIC EQUIPMENT
CN2005800442400A CN101090966B (zh) 2004-12-24 2005-12-22 具有减毒日本脑炎病毒基因作为主链的减毒嵌合黄病毒
CA002592005A CA2592005A1 (en) 2004-12-24 2005-12-22 Attenuated chimeric flavivirus bearing attenuated japanese encephalitis virus gene as backbone
JP2006549091A JP4871738B2 (ja) 2004-12-24 2005-12-22 弱毒日本脳炎ウイルスの遺伝子をバックボーンとして有する弱毒キメラフラビウイルス
HK08104980.6A HK1115157A1 (en) 2004-12-24 2008-05-05 Attenuated chimeric flavivirus bearing attenuated japanese encephalitis virus gene as backbone
US12/292,518 US8492532B2 (en) 2004-12-24 2008-11-20 Attenuated chimeric flavivirus bearing attenuated japanese encephalitis virus gene as backbone

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004374630 2004-12-24
JP2004-374630 2004-12-24

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US11/793,277 A-371-Of-International US7749734B2 (en) 2004-12-24 2005-12-22 Attenuated chimeric flavivirus bearing attenuated Japanese encephalitis virus gene as backbone
US12/292,518 Division US8492532B2 (en) 2004-12-24 2008-11-20 Attenuated chimeric flavivirus bearing attenuated japanese encephalitis virus gene as backbone

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006068307A1 true WO2006068307A1 (ja) 2006-06-29

Family

ID=36601887

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2005/024161 WO2006068307A1 (ja) 2004-12-24 2005-12-22 弱毒日本脳炎ウイルスの遺伝子をバックボーンとして有する弱毒キメラフラビウイルス

Country Status (8)

Country Link
US (2) US7749734B2 (ja)
EP (2) EP1840214A4 (ja)
JP (1) JP4871738B2 (ja)
CN (1) CN101090966B (ja)
AU (1) AU2005320001B2 (ja)
CA (1) CA2592005A1 (ja)
HK (1) HK1115157A1 (ja)
WO (1) WO2006068307A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010509226A (ja) * 2006-11-07 2010-03-25 サノフィ パスツール バイオロジクス カンパニー 凍結乾燥によるワクチンの安定化

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0921359A2 (pt) * 2008-11-17 2015-08-25 Inovio Pharmaceuticals Inc Antígenos que induzem a resposta imunológica contra flavivírus e métodos de uso dos mesmos
JP6057460B2 (ja) * 2009-08-31 2017-01-11 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド デングウイルスアッセイ
CN102796749B (zh) * 2011-05-27 2017-05-24 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 以乙脑病毒减毒株为基因骨架的乙脑/登革嵌合病毒及其应用
CN102337248B (zh) * 2011-10-09 2013-04-17 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 表达乙型脑炎病毒PrM/M-E蛋白的重组BHK细胞系及其应用
CN103352029A (zh) * 2013-07-29 2013-10-16 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 一种乙脑/森林脑炎嵌合病毒及其应用
EP3031923A1 (en) * 2014-12-11 2016-06-15 Institut Pasteur Lentiviral vector-based japanese encephalitis immunogenic composition
CN105400799B (zh) * 2015-12-22 2018-12-28 成都生物制品研究所有限责任公司 一种乙脑/黄热嵌合病毒及其制备方法和应用
GB201716307D0 (en) * 2017-10-05 2017-11-22 Univ Leuven Kath Chimeric yellow fever zika virus strain

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06511150A (ja) * 1991-09-19 1994-12-15 アメリカ合衆国 キメラおよび／または増殖制限されたフラビウイルス
JP2003523189A (ja) * 2000-02-16 2003-08-05 ザ ガバメント オブ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ，センターズ フォー 無毒性の免疫原性フラビウイルスキメラ

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07101802B2 (ja) 1987-08-05 1995-11-01 株式会社村田製作所 高周波回路
US5478730A (en) 1988-12-21 1995-12-26 Institute Of Protein Research Method of preparing polypeptides in cell-free translation system
FR2748298B1 (fr) 1996-05-03 1998-07-31 Caillau Ets Dispositif de verin pneumatique
HU228705B1 (en) 1997-02-28 2013-05-28 Univ St Louis Chimeric flavivirus vaccines
WO2001039802A1 (en) 1999-12-01 2001-06-07 Oravax, Inc. Chimeric flavivirus vaccines
US20040120964A1 (en) * 2001-10-29 2004-06-24 Mikszta John A. Needleless vaccination using chimeric yellow fever vaccine-vectored vaccines against heterologous flaviviruses
JP2004045529A (ja) 2002-07-09 2004-02-12 Fuji Mark Kk 照光表示体
EP1575979B1 (en) 2002-11-15 2009-12-23 Sanofi Pasteur Biologics Co. West nile virus vaccine

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06511150A (ja) * 1991-09-19 1994-12-15 アメリカ合衆国 キメラおよび／または増殖制限されたフラビウイルス
JP2003523189A (ja) * 2000-02-16 2003-08-05 ザ ガバメント オブ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ，センターズ フォー 無毒性の免疫原性フラビウイルスキメラ

Non-Patent Citations (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AIHARA S. ET AL.: "Identification of mutations that occured on the genome of Japanese encephalitis virus during the attenuation process", VIRUS GENES, vol. 5, no. 2, 1991, pages 95 - 109, XP002999440 *
COIA ET AL., J. GEN. VIROL., vol. 69, 1988, pages 1 - 21
DALGARNO ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 187, 1986, pages 309 - 323
DEUBEL ET AL., VIROLOGY, vol. 155, 1986, pages 365 - 377
GRITSUN ET AL., JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY, vol. 74, 1993, pages 287 - 291
GRUENBERG ET AL., J. GEN. VIROL., vol. 69, 1988, pages 1391 - 1398
HAHN ET AL., VIROLOGY, vol. 162, 1988, pages 167 - 180
KUNO ET AL., AM. J. TROP. MED. HYG., vol. 65, pages 671 - 676
KUNO ET AL., JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 72, 1998, pages 73 - 83
LI ET AL., JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY, vol. 85, 2004, pages 1619 - 1624
LIN ET AL., VIROLOGY, vol. 313, 2003, pages 81 - 90
MACKOW ET AL., VIROLOGY, vol. 159, 1987, pages 217 - 228
MANDL ET AL., VIROLOGY, vol. 166, 1988, pages 197 - 205
MASON ET AL., VIROLOGY, vol. 161, 1987, pages 262 - 267
MORITA ET AL., VIROLOGY, vol. 287, 2001, pages 417 - 426
NI H. ET AL.: "Molecular basis of attenuation of neurovirulence of wild-type Japanese encephalitis virus strain SA14", J. GEN. VIROL., vol. 76, no. 2, 1995, pages 409 - 413, XP000885551 *
OSATOMI ET AL., VIRUS GENES, vol. 2, 1988, pages 99 - 108
RICE ET AL., SCIENCE, vol. 229, 1985, pages 726 - 733
See also references of EP1840214A4 *
SUMIYOSHI ET AL., VIROLOGY, vol. 161, 1987, pages 497 - 510
TRENT ET AL., VIROLOGY, vol. 156, 1987, pages 293 - 304
VENUGOPAL ET AL., JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY, vol. 75, 1994, pages 227 - 232
WENGLER ET AL., VIROLOGY, vol. 147, 1985, pages 264 - 274
YOSHIDA I. ET AL.: "Establishment of an attenuated ML-17 strain of Japanese encephalitis virus", BIKEN J., vol. 24, no. 1-2, 1981, pages 47 - 67, XP002999439 *
ZHAO ET AL., VIROLOGY, vol. 155, 1986, pages 77 - 88

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010509226A (ja) * 2006-11-07 2010-03-25 サノフィ パスツール バイオロジクス カンパニー 凍結乾燥によるワクチンの安定化
US9132184B2 (en) 2006-11-07 2015-09-15 Sanofi Pasteur Biologics, Llc Stabilization of vaccines by lyophilization

Also Published As

Publication number Publication date
EP1840214A4 (en) 2009-03-04
AU2005320001B2 (en) 2011-05-19
US8492532B2 (en) 2013-07-23
US20080138363A1 (en) 2008-06-12
CA2592005A1 (en) 2006-06-29
US7749734B2 (en) 2010-07-06
JPWO2006068307A1 (ja) 2008-06-12
EP1840214A1 (en) 2007-10-03
HK1115157A1 (en) 2008-11-21
EP1840214A8 (en) 2008-01-02
JP4871738B2 (ja) 2012-02-08
AU2005320001A1 (en) 2006-06-29
EP2458003A1 (en) 2012-05-30
CN101090966B (zh) 2012-07-04
US20090104702A1 (en) 2009-04-23
CN101090966A (zh) 2007-12-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3681369B2 (ja) キメラおよび／または増殖制限されたフラビウイルス
JP5538729B2 (ja) 偽感染性フラビウイルスおよびそれらの使用
JP5295956B2 (ja) ４種のデング熱血清型に対する免疫付与の方法
WO2006068307A1 (ja) 弱毒日本脳炎ウイルスの遺伝子をバックボーンとして有する弱毒キメラフラビウイルス
US8716013B2 (en) Recombinant lentiviral vector for expression of a flaviviridae protein and applications thereof as a vaccine
AU2002229390B2 (en) Attenuated live vaccine
JP4683926B2 (ja) ウエストナイルウイルス・ワクチン
US6589522B1 (en) Vaccines against infections caused by YF virus; YF infectious cDNA, method for producing a recombinant YF virus from the YF infectious cDNA and plasmids to assemble the YF infectious cDNA
JP2005532044A (ja) デング熱１、２、３および４型又は抗原性キメラデング熱ウイルス１、２、３および４の３’−ｕｔｒにおいて３０ヌクレオチド欠失を共通に含有するデング熱四価ワクチン
JP2019511221A (ja) 弱毒化された生ジカウイルスワクチン
US20230241201A1 (en) Coronavirus vaccines
WO2018129160A1 (en) Live attenuated flavivirus vaccines and methods of using and making same
JP2022023198A (ja) プラス鎖ｒｎａウイルスによって引き起こされる感染疾患に対するワクチン
AU2009211379B2 (en) Flaviviridae mutants comprising a deletion in the capsid protein for use as vaccines
BR102013011247A2 (pt) Processo para a construção de rnas infecciosos a partir de cdnas de clones do vírus da dengue tipo 3, processo para a construção de rnas infecciosos a partir de cdnas de clones quiméricos do vírus da dengue tipo 3 e do vírus rocio e referidos cdnas

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KM KN KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV LY MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NG NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006549091

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005320001

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2592005

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200580044240.0

Country of ref document: CN

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1200701288

Country of ref document: VN

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2005320001

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20051222

Kind code of ref document: A

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2005320001

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005822652

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 3239/CHENP/2007

Country of ref document: IN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11793277

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2005822652

Country of ref document: EP