CN113005144A - 蜱传脑炎病毒报告病毒TBEV Nluc 2A的构建方法及其应用 - Google Patents

蜱传脑炎病毒报告病毒TBEV Nluc 2A的构建方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了蜱传脑炎病毒报告病毒TBEV Nluc 2A的构建方法及其应用。本发明构建出了含有Nluc 2A报告基因的报告病毒，使可以通过检测Nluc荧光素酶信号来监测TBEV、研究病毒毒力，并且可作为抗病毒药物筛选的有力工具。

Description

蜱传脑炎病毒报告病毒TBEV Nluc 2A的构建方法及其应用
技术领域
本发明涉及蜱传脑炎病毒(TBEV)报告病毒的构建，特别涉及稳定表达含有Nluc荧光素酶的报告病毒的构建及其活性检测。
背景技术
在中国，第一例人类蜱传脑炎(TBE)病例于1943年被发现。TBE在中国的分布与其蜱媒的分布密切相关。我国TBE病例均为远东亚型，由全沟硬蜱传播。内蒙古大兴安岭、黑海龙江小兴安岭、吉林省长白山林区是东北地区典型的TBE疫区。西北地区的新疆天山北坡林区和阿尔泰南坡林区也有间歇性的TBE报告。此外，TBE在云南(中国西南部)和西藏(中国西部)也有报道。由于TBE在中国不是强制报告的传染病，缺乏对该病的监测，其发病率很可能被低估。并且该病有区域性、季节性、职业性等特征，因此增强我国对该病的检测和对TBEV的相关研究以达到对该病的控制是必要且可行的。
蜱传脑炎病毒(TBEV)是黄病毒蜱传类群中最重要的一种。TBEV有一个约11千碱基长的正链RNA基因组，基因组包括5'UTR和3'UTR以及一个开放阅读框(Open readingframe，ORF)，基因组总共编码3414个氨基酸，并翻译成单个多蛋白，该多蛋白经共转录和转录后加工成三种结构蛋白(Structural protein，SP)和七种非结构蛋白(Non-structuralprotein，nSP)[21]。其中，结构蛋白有C、PrM和E蛋白，非结构蛋白有NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。相比于其他黄病毒尤其是蚊媒病毒，蜱传病毒研究相对较少，很多功能是基于其他黄病毒的研究推理出的。
Nluc是荧光素酶系统家族的最新成员，可用于生物发光应用，这种小荧光素酶是从深海虾中提取的，并经过人工优化的一种荧光素酶，它的底物是呋喃嗪。Nluc分子量较小，且该系统显示出比FLuc和RLuc高150倍以上的活性，发光输出保持稳定，持续时间比其他的荧光素酶长。因此，在几种荧光素酶中，Nluc基因在生物发光和报告基因的应用上都比其他荧光素酶更稳定、更灵敏。
发明内容
本发明的目的是构建出含有Nluc荧光素酶的蜱传脑炎病毒的报告病毒，使其可以在细胞中稳定表达，并且可以通过检测Nluc荧光素酶信号来研究病毒毒力，可作为抗病毒药物筛选的有力工具。
本发明采用的技术方案是：蜱传脑炎病毒报告病毒TBEV Nluc 2A的构建方法，包括如下步骤：
1)SnaBI-C38片段的克隆：以TBEV感染性克隆为模板，引物1和引物2为特异性引物，PCR扩增蜱传脑炎病毒SnaBI-C38片段；所述引物1和引物2的序列为：
引物1：5’-TACGTATTAGTCATCGCTATTAC-3’；
引物2：5’-GTGTGAAGACCATCACGAGTCCATTTGGC-3’；
Figure BDA0002960239710000021
PCR反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，58℃30s，68℃1min为一个循环，进行35个循环，最后68℃延伸7min。
2)P2A序列和Nluc基因的连接：将P2A序列设计在引物上，并分两轮PCR将P2A序列连接到Nluc基因上。
第一轮PCR：以Nluc-pGEMT为模板，Nluc-F和P2A Nluc R1为引物进行PCR，扩增好目的片段后，回收目的条带。
引物Nluc-F：
5’-ATGGTCTTCACACTCGAAG-3’；
引物P2A Nluc R1：
5’-CAGCAGGCTGAAGTTAGTAGCTCCGCTTCCCGCCAGAATGCGTTCGCAC-3’；
Figure BDA0002960239710000022
PCR反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，58℃30s，68℃1min为一个循环，进行35个循环；最后68℃延伸7min。
第二轮PCR：以第一轮PCR回收的目的条带为模板，Nluc-F和P2A Nluc R2为引物进行PCR，扩增好目的片段后，回收目的条带。
引物Nluc-F：
5’-ATGGTCTTCACACTCGAAG-3’；
引物P2A Nluc R2：
5’-AGGTCCAGGGTTCTCCTCCACGTCTCCAGCCTGCTTCAGCAGGCTGAAGTTAG-3’；
Figure BDA0002960239710000031
PCR反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，58℃30s，68℃1min为一个循环，进行35个循环；最后68℃延伸7min。
将第二轮PCR回收的目的条带连接到pGEM T载体上，命名为Nluc 2A pGEM T。
3)Nluc-P2A片段的克隆：以Nluc 2A pGEM T为模板，引物3和引物4为特异性引物，扩增出片段Nluc-P2A，此时该片段与前后两部分有重叠序列；所述引物3和引物4的序列为：
引物3：5’-CAAATGGACTCGTGATGGTCTTCACACTCGAAG-3’；
引物4：5’-CTTCCCGGCCATAGGTCCAGGGTTCTCCTC-3’；
Figure BDA0002960239710000032
PCR反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，58℃30s，68℃1min为一个循环，进行35个循环，最后68℃延伸7min。
4)C1-AflⅡ片段的克隆：以TBEV FL为模板，引物5和引物6为特异性引物，扩增出片段C1-AflⅡ；所述引物5和引物6的序列为：
引物5：5’-GAACCCTGGACCTATGGCCGGGAAGGCCATTC-3’；
引物6：5’-CTTAAGCAACACTCCAGTCTGG-3’；
Figure BDA0002960239710000041
PCR反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，56℃30s，68℃2min30s为一个循环，进行35个循环；最后68℃延伸7min。
5)构建SnaBI-C38-Nluc-P2A-C1-AflⅡ片段：以引物1和引物6为特异性引物，步骤1)获得的SnaBI-C38片段、步骤3)获得的Nluc-P2A片段和步骤4)获得的C1-AflⅡ片段为模板，通过重叠延伸PCR，将此三个片段连接在一起，得到SnaBI-C38-Nluc-P2A-C1-AflⅡ片段；
Figure BDA0002960239710000042
PCR反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，56℃30s，68℃3min为一个循环，进行35个循环；最后68℃延伸7min。
6)含有Nluc荧光素酶的TBEV报告病毒的构建：将步骤5)获得的SnaB I-C38-Nluc-P2A-C1-AflⅡ片段和TBEV的感染性克隆用SnaBI和AflⅡ双酶切，将酶切片段跑胶回收，再用T4连接酶进行连接。构建含有Nluc荧光素酶的TBEV报告病毒TBEV Nluc 2A。
本发明的有益效果是：
1、本发明通过将构建的含有Nluc荧光素酶的TBEV Nluc 2A质粒转染至BHK 21细胞，进行荧光素酶活性检测，验证了本发明TBEV Nluc 2A的可用性。
2、本发明获得的TBEV Nluc 2A质粒转染后可以用于检测蜱传脑炎病毒的复制情况。
3、本发明构建了含有Nluc荧光素酶的TBEV报告病毒，为进一步研究TBEV的抗病毒药物的筛选奠定了基础。
附图说明
图1是本发明TBEV Nluc 2A的构建图。
图2是检测TBEV Nluc 2A质粒的荧光素酶情况；
具体实施方式
实施例1
(一)稳定表达含有Nluc荧光素酶的蜱传脑炎病毒的报告病毒的构建方法
构建方法如图1所示。
蜱传脑炎病毒TBEV感染性克隆，采用本实验室保存的TBEV FL。
1、SnaBI-C38片段的克隆
以TBEV感染性克隆为模板，引物1和引物2为特异性引物，PCR扩增蜱传脑炎病毒SnaBI-C38片段。
引物1：5’-TACGTATTAGTCATCGCTATTAC-3’；
引物2：5’-GTGTGAAGACCATCACGAGTCCATTTGGC-3’；
Figure BDA0002960239710000051
PCR反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，58℃30s，68℃1min为一个循环，进行35个循环，最后68℃延伸7min。
2、P2A序列和Nluc基因的连接
通过两轮PCR扩增，将P2A序列和Nluc基因进行连接，具体为：
将P2A序列设计在引物上，并分两轮PCR将P2A序列连接到Nluc基因上。
第一轮PCR：以Nluc-pGEMT为模板，Nluc-F和P2A Nluc R1为引物进行PCR，扩增好目的片段后，回收目的条带。
引物Nluc-F：
5’-ATGGTCTTCACACTCGAAG-3’；
引物P2A Nluc R1：
5’-CAGCAGGCTGAAGTTAGTAGCTCCGCTTCCCGCCAGAATGCGTTCGCAC-3’；
Figure BDA0002960239710000061
第一轮PCR反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，58℃30s，68℃1min为一个循环，进行35个循环；最后68℃延伸7min。
第二轮PCR：以第一轮PCR回收的目的条带为模板，Nluc-F和P2A Nluc R2为引物进行PCR，扩增好目的片段后，回收目的条带。
引物Nluc-F：
5’-ATGGTCTTCACACTCGAAG-3’；
引物P2A Nluc R2：
5’-AGGTCCAGGGTTCTCCTCCACGTCTCCAGCCTGCTTCAGCAGGCTGAAGTTAG-3’；
Figure BDA0002960239710000062
Figure BDA0002960239710000071
第二轮PCR反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，58℃30s，68℃1min为一个循环，进行35个循环；最后68℃延伸7min。
将第二轮PCR回收的目的条带连接到pGEM T载体上，命名为Nluc 2A pGEM T。
3、构建Nluc-P2A片段
以Nluc 2A pGEM T为模板，引物3和引物4为特异性引物，扩增出片段Nluc-P2A，此时该片段与前后两部分有重叠序列。
引物3：5’-CAAATGGACTCGTGATGGTCTTCACACTCGAAG-3’；
引物4：5’-CTTCCCGGCCATAGGTCCAGGGTTCTCCTC-3’；
Figure BDA0002960239710000072
PCR反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，58℃30s，68℃1min为一个循环，进行35个循环，最后68℃延伸7min。
4、C1-AflⅡ片段的克隆
以TBEV FL为模板，引物5和引物6为特异性引物，扩增出片段C1-AflⅡ。
引物5：5’-GAACCCTGGACCTATGGCCGGGAAGGCCATTC-3’；
引物6：5’-CTTAAGCAACACTCCAGTCTGG-3’；
Figure BDA0002960239710000073
Figure BDA0002960239710000081
PCR反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，56℃30s，68℃2min30s为一个循环，进行35个循环；最后68℃延伸7min。
5、构建SnaBI-C38-Nluc-P2A-C1-AflⅡ片段
以引物1和引物6为特异性引物，步骤1)获得的SnaBI-C38片段、步骤3)获得的Nluc-P2A片段和步骤4)获得的C1-AflⅡ片段为模板，通过重叠延伸PCR，将此三个片段连接在一起，得到SnaBI-C38-Nluc-P2A-C1-AflⅡ片段；
Figure BDA0002960239710000082
PCR反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，56℃30s，68℃3min为一个循环，进行35个循环；最后68℃延伸7min。
6、含有Nluc荧光素酶的TBEV报告病毒的构建
将步骤5)获得的SnaB I-C38-Nluc-P2A-C1-AflⅡ和TBEV的感染性克隆用SnaBI和AflⅡ双酶切3h，将酶切片段跑胶回收，再用T4连接酶进行连接。构建含有Nluc荧光素酶的TBEV报告病毒TBEV Nluc 2A。
(二)验证
以TBEV感染性克隆为模板，成功构建出TBEV Nluc 2A报告病毒。在C蛋白的第38个氨基酸后面插入Nluc报告基因，TBEV Nluc 2A报告病毒在Nluc报告基因后面插入了2A序列。2A序列是为了方便Nluc基因和其后的C蛋白的切割。构建好的报告病毒测序，测得的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，整个基因组均无突变。
(三)含有Nluc荧光素酶的蜱传脑炎病毒TBEV Nluc 2A的应用
1、转染细胞获得病毒
将BHK 21细胞接种至细胞培养小皿，放入37℃培养箱培养过夜。待细胞密度达到80％，利用Lip3000进行感染性克隆的转染操作。转染前将细胞培养基换成含有2％FBS的DMEM(含双抗)。取2个1.5ml EP管，分别加入125μl Opti-MEM培养基，标记管A和管B。管A加入7.5μl Lip3000，轻轻混匀；管B依次加入TBEV Nluc 2A质粒2.5μg和Lip3000 5μl，轻轻混匀。将管B中混合物逐滴加入管A，边加边混匀，室温孵育5min。将混合液逐滴滴入BHK-21细胞。转染后每天观察细胞的病变效应，第3-4天收取上清病毒悬液。
2、感染细胞扩增病毒
接种BHK21细胞至细胞培养小皿，放入37℃培养箱培养过夜。待细胞密度达到50％，进行感染实验。感染前配制好病毒稀释液。感染时首先吸出培养基并用D-Hanks洗两次细胞。每个小皿加500ul病毒稀释液，并用封口膜包好，孵育1.5h，期间每隔30min震荡一次细胞。1.5h后补加1mlD+2％FBS培养基。放置37℃，5％CO2培养箱，扩增病毒3、Nluc荧光素酶活性检测
接种BHK细胞至24孔板，培养过夜，接种TBEV Nluc 2A报告病毒，放回37℃培养箱继续培养，在相应的时间点，利用
Figure BDA0002960239710000091
报告基因检测系统检测各孔的Nluc荧光素酶活性。配制新鲜细胞裂解液，弃去细胞上清，PBS洗1次，弃去PBS，每孔加入裂解液200μl，震荡裂解20min，按照1：50的比例将
Figure BDA0002960239710000092
Luciferase AssayReagent稀释于
Figure BDA0002960239710000093
Luciferase Assay Buffer中，取10μl待测裂解样品加入50μl稀释的
Figure BDA0002960239710000094
Figure BDA0002960239710000095
Luciferase Assay Reagent，混匀，利用荧光素酶检测系统读取样品中Nluc萤光素酶信号。每个样品在实验中均设置3个平行重复，结果如图2所示。
如图2所示，与阴性对照组相比，TBEV Nluc 2A报告病毒的荧光素酶活性均有极显著差异。说明在报告病毒中Nluc报告基因已经成功表达。
<110> 辽宁大学
<120>蜱传脑炎病毒报告病毒 TBEV Nluc 2A的构建方法及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 14831
<212> DNA
<213> TBEV Nluc 2A
<400> 1
AGATTTTCTT GCACGTGTGT GCGTTTGCTC CGGATAGCAA CAGCAGCGAC AGGTTTGAGA 60
GAGATAATTT TTCGCTTGAC CAGTCGTGAA CGTGTTGAGA AAAAGACAGC TTAGGAGAAC 120
AAGAGCTGGG GATGGCCGGG AAGGCCATTC TGAAAGGAAA GGGGGGCGGT CCCCCTCGAC 180
GAGTGTCGAA AGAGACCGCG AGGAAGACGC GTCAATCTAG GGTCCAAATG CCAAATGGAC 240
TCGTGATGGT CTTCACACTC GAAGATTTCG TTGGGGACTG GCGACAGACA GCCGGCTACA 300
ACCTGGACCA AGTCCTTGAA CAGGGAGGTG TGTCCAGTTT GTTTCAGAAT CTCGGGGTGT 360
CCGTAACTCC GATCCAAAGG ATTGTCCTGA GCGGTGAAAA TGGGCTGAAG ATCGACATCC 420
ATGTCATCAT CCCGTATGAA GGTCTGAGCG GCGACCAAAT GGGCCAGATC GAAAAAATTT 480
TTAAGGTGGT GTACCCTGTG GATGATCATC ACTTTAAGGT GATCCTGCAC TATGGCACAC 540
TGGTAATCGA CGGGGTTACG CCGAACATGA TCGACTATTT CGGACGGCCG TATGAAGGCA 600
TCGCCGTGTT CGACGGCAAA AAGATCACTG TAACAGGGAC CCTGTGGAAC GGCAACAAAA 660
TTATCGACGA GCGCCTGATC AACCCCGACG GCTCCCTGCT GTTCCGAGTA ACCATCAACG 720
GAGTGACCGG CTGGCGGCTG TGCGAACGCA TTCTGGCGGG AAGCGGAGCT ACTAACTTCA 780
GCCTGCTGAA GCAGGCTGGA GACGTGGAGG AGAACCCTGG ACCTATGGCC GGGAAGGCCA 840
TTCTGAAAGG AAAGGGGGGC GGTCCCCCTC GACGAGTGTC GAAAGAGACC GCGAGGAAGA 900
CGCGTCAATC TAGGGTCCAA ATGCCAAATG GACTCGTGTT GATGCGCATG TTGGGGATTT 960
TATGGCATGC CGTGGCCGGC ACCGCTAGGA GTCCCGTGTT GAAGTCTTTC TGGAATTCAG 1020
TCCCACTGAA ACAGGCCATG GCAGCACTCC GGAAAATTAA AAAGGCAGTG AGCACCCTGA 1080
TGGTAGGTCT GCAAAGACGT GGCAAAAGAA GGTCAGCAGC AGACTGGACA AGTTGGTTGC 1140
TGGTTCTGGT TTTGGTGGGG GTGACACTTG CAGCCACAGT GCGGAAAGAA AGGGATGGCA 1200
CTACCGTGAT CAGAGCTGAA GGAAAAGATG CGGCAACCCA GGTGCGTGTG GAAAATGGCA 1260
CCTGTGTGAT CCTGGCCACG GACATGGGAT CATGGTGTGA TGACTCACTA ACCTATGAGT 1320
GTGTGACCAT AGACCAGGGG GAGGAACCAG TTGACGTGGA TTGCTTCTGC AGGAATGTTG 1380
ATGGAGTTTA CCTGGAGTAT GGACGGTGTG GAAAACAAGA AGGATCAAGA ACAAGGCGCT 1440
CAGTGCTGAT CCCGTCCCAT GCCCAGGGAG ACCTCACAGG AAGGGGACAC AAATGGTTAG 1500
AAGGGGATTC ACTGCGGACG CATCTCACTA GGGTTGAAGG ATGGGTCTGG AAGAACAAAG 1560
TGCTCACCCT GGCGGTGATC GCCATTGTGT GGCTGACCGT GGAAAGCGTG GTGACCAGGG 1620
TCGCCGTAGT GGTGGTGCTC TTGTGCCTGG CTCCGGTTTA TGCCTCACGA TGCACACATT 1680
TGGAAAACAG AGATTTTGTT ACTGGCACTC AGGGAACCAC TCGTGTGACT CTGGTGCTGG 1740
AACTGGGAGG ATGCGTCACC ATAACAGCCG AGGGGAAGCC ATCGATGGAC GTGTGGCTTG 1800
ACTCCATTTA TCAGGAGAAT CCTGCCAAAA CACGTGAGTA CTGCCTGCAC GCAAAGCTGT 1860
CGGACACCAA GGTCGCGGCC AGATGCCCCA CAATGGGACC TGCCACTTTG GCTGAAGAGC 1920
ACCAGAGTGG CACAGTGTGC AAGAGAGACC AGAGTGATCG AGGCTGGGGT AATCATTGTG 1980
GATTATTTGG AAAAGGCAGC ATTGTGACCT GCGTCAAGGC GTCCTGTGGG GCAAAAAAGA 2040
AGGCCACAGG ACACGTGTAT GATGCCAACA AAATTGTGTA CACGGTTAAA GTAGAGCCGC 2100
ATACGGGGGA TTACGTCGCC GCTAATGAGA CCCATAGTGG AAGAAAAACA GCATCCTTCA 2160
CGGTTTCCTC GGAAAAAACC ATCTTGACCA TGGGAGACTA CGGAGATGTG TCCTTGTTGT 2220
GTCGAGTAGC TAGCGGTGTT GACCTTGCTC AGACTGTCAT TCTGGAACTT GACAAGACTT 2280
CAGAACACCT ACCGACGGCC TGGCAGGTTC ACCGGGACTG GTTCAATGAT CTGGCCCTGC 2340
CGTGGAAACA TGAAGGGGCA CAGAACTGGA ACAATGCTGA ACGGCTAGTT GAGTTTGGAG 2400
CCCCACATGC TGTGAAAATG GATGTGTATA ACCTTGGAGA CCAGACTGGA GTGTTGCTTA 2460
AGTCACTTGC TGGTGTTCCA GTGGCGCACA TTGATGGAAC CAAGTACCAC CTGAAAAGTG 2520
GCCACGTGAC ATGCGAGGTA GGACTAGAAA AACTCAAGAT GAAAGGTCTC ACATACACAA 2580
TGTGCGACAA GACGAAATTC ACGTGGAAGA GAATCCCAAC TGACAGTGGA CATGATACAG 2640
TGGTCATGGA AGTTGCATTC TCTGGAACCA AACCCTGTAG GATCCCGGTG AGGGCCGTGG 2700
CACACGGCTC TCCAGATGTG AATGTGGCTA TGTTGATAAC ACCCAACCCC ACAATCGAAA 2760
CCAATGGTGG TGGTTTCATA GAAATGCAGT TACCGCCAGG AGACAACATC ATCTATGTCG 2820
GGGAACTGAG TCACCAATGG TTCCAAAAAG GGAGTAGCAT TGGAAGGGTC TTTCAAAAAA 2880
CCAGGAAAGG TATAGAACGA CTGACAGTGA TCGGAGAACA CGCCTGGGAT TTTGGCTCAA 2940
CTGGTGGATT CCTGACCTCG GTTGGCAAGG CGCTACACAC AGTTCTTGGT GGTGCCTTCA 3000
ACAGCCTGTT TGGAGGAGTA GGGTTCTTGC CTAAGATCCT AGTGGGAGTG GTCCTGGCCT 3060
GGTTGGGCCT GAACATGAGG AATCCGACCA TGTCCATGAG CTTCCTCCTG GCCGGAGGAC 3120
TGGTTCTGGC CATGACACTC GGAGTCGGAG CTGATGTTGG CTGTGCTGTG GACACCGAAC 3180
GGATGGAGCT CCGTTGTGGT GAGGGTCTGG TTGTATGGAG GGAGGTTTCC GAGTGGTATG 3240
ACAATTATGC ATACTACCCT GAGACACCAG GAGCTCTTGC TTCGGCCATA AAAGAGACCT 3300
TCGAGGAGGG AACTTGTGGT ATAGTGCCCC AAAACAGACT TGAAATGGCC ATGTGGAGAA 3360
GCTCGGCGAC AGAACTGAAT CTGGCCTTGG CGGAGGGAGA CGCAAATCTC ACAGTGGTGG 3420
TGGACAAACT TGATCCCACA GACTATCGAG GTGGCATTCC TGGGCTGCTA AAGAAGGGGA 3480
AAGACATAAA GGTTTCTTGG AAGAGCTGGG GCCACTCAAT GATCTGGAGT GTCCCCGAGG 3540
CCCCCCGTCG GTTTATGGTG GGAACAGAGG GAAGCAGTGA GTGTCCACTA GAGAGAAGGA 3600
AAACAGGTGT CTTCACGGTG GCAGAGTTTG GGGTTGGCCT GAGAACAAAA GTATTCTTGG 3660
ACTTCAGACA GGAATCAACA CATGAGTGTG ACACAGGAGT GATGGGAGCC GCTGTCAAGA 3720
ATGGCATGGC AGTCCACACA GACCAGAGCC TCTGGATGAA ATCCGTGAGA AATGACACAG 3780
GGACCTACAT AGTAAGTATC AAGGTTACAA GACAGGTTTA AGGAGACCAA TAGAAACTGG 3840
GCTTGTCGAG ACAGAGAAGA CTCTTGCGTT TCTGATAGGC ACCTATTGGT CTTACTGACA 3900
TCCACTTTGC CTTTCTCTCC ACAGGTGGAA CTTCTGGTTA CTGACCTGAG AAATTGCTCA 3960
TGGCCGGCTA GCCACACCAT TGACAATGCT GAGGTGGTGG ACTCAGAACT CTTCCTTCCA 4020
GCCAGTCTGG CAGGGCCTAG ATCCTGGTAT AACAGGATAC CCGGGTACTC AGAACAAGTG 4080
AAAGGACCAT GGAAGTACTC GCCCATCCGA GTGACAAGAG AAGAGTGCCC TGGCACGAGG 4140
GTCACCATAA ATGCCGACTG TGACAAAAGG GGGGCTTCTG TGAGGAGTAC CACAGAGAGT 4200
GGCAAGGTGA TTCCAGAGTG GTGCTGCCGA ACGTGCACAT TACCTCCAGT GACGTTCCGT 4260
ACGGGGACAG ACTGTTGGTA TGCCATGGAA ATACGACCAG TTCATGACCA GGGAGGGCTT 4320
GTTCGCTCAA TGGTGGTGGC AGACAATGGA GAGCTGCTTA GTGAGGGGGG CATTCCCGGG 4380
ATAGTGGCTT TGTTTGTGGT CCTTGAGTAC GTCATCCGGA GGAGGCCAGC CACTGGAACA 4440
ACGGCCATGT GGGGAGGCAT TGTTGTCCTT GCATTGCTCG TCACTGGTCT GGTGAGAATC 4500
GAAAGCCTGG TGCGTTATGT CGTGGCAGTT GGGATCACAT TTCATCTTGA GCTAGGGCCA 4560
GAGATTGTGG CTCTGACACT GTTACAGGCT GTGTTTGAGT TGAGGGTTGG CCTGCTCAGC 4620
GCTTTTGCAC TACGCAGCAA CCTCACTGTC AGAGAGATGG TAACCATCTA CTTCCTTCTG 4680
CTGGTTTTGG AGTTGGGATT GCCAGGTGAG GGTCTTGGGG CCCTATGGAA ATGGGGAGAT 4740
GCATTGGCCA TGGGGGCATT GATTTTCAGA GCCTGCACGG CAGAGGAAAA GACTGGTGTT 4800
GGACTCCTGC TCATGGCTCT CATGACACAG CAAGACCTGG CGATTGCACA CTATGGACTC 4860
ATGCTCTTCC TGGGCACGGC CTCATGTTGT TCAATCTGGA AACTGATTCG AGGACACAGA 4920
GAACAGAAGG GATTGACCTG GGTTGTCCCC CTGGCCGGGC TACTCGGAGG AGAGGGCTCT 4980
GGAGTCAGAC TGCTGGCTTT TTGGGAACTG GCCATCCATG GAAGGAGACG GTCATTCAGT 5040
GAACCACTGA CTGTTGTGGG AGTCATGCTA ACCCTGGCCA GCGGCATGAT GCGGCACACC 5100
TCTCAGGAGG CCCTTTGCGC GCTCGCCGTG GCCTCGTTCC TTCTGCTCAT GCTGGTCCTA 5160
GGGACAAGGA AGATGCAGCT AGTGGCTGAA TGGAGTGGCT GTGTGGAGTG GCACCCAGAA 5220
CTGATGAATG AAGGTGGAGA GGTGAGCCTG CGGGTCCGGC AGGACTCAAT GGGAAACTTC 5280
CACCTGACAG AGCTTGAGAA AGAGGAGAGA GTGATGGCTT TCTGGCTGCT GGCAGGACTG 5340
GCGGCTTCGG CCTTCCACTG GTCTGGCATT CTTGGTGTGA TGGGATTGTG GACGCTGTCG 5400
GAAATGCTGA GGACGGCTCG AAGATCAGAT TTGGTCTTCT CTGGACAGGG GGGACGTGAG 5460
CGTGGTGACA GGCCCTTTGA GGTCAAGGAT GGCGTCTATA GAATCTTCAG CCCAGGACTG 5520
CTCTGGGGGC AGCGCCAGGT GGGAGTTGGC TATGGCTCCA AAGGTGTCCT ACACACGATG 5580
TGGCATGTGA CGAGAGGGGC GGCGCTGTCC ATTGATGACG CCGTCGCAGG GCCCTATTGG 5640
GCTGACGTCA AAGAGGACGT TGTATGCTAT GGTGGAGCCT GGAGTCTTGA GGAGAAGTGG 5700
AAAGGTGAGA CAGTGCAGGT TCATGCCTTC CCACCGGGGA GAGCCCATGA GGTGCATCAA 5760
TGTCAGCCCG GGGAACTGCT CCTGGACACA GGTAGGAGGA TAGGGGCAGT GCCAATTGAT 5820
CTGGCAAAAG GGACATCTGG CAGCCCCATC CTCAACTCCC AAGGAGTGGT TGTGGGACTG 5880
TATGGGAATG GACTGAAGAC CAATGAAACC TACGTCAGCA GCATTGCTCA AGGTGAGGCT 5940
GAAAAAAGTC GACCCAATCT CCTGCCGGCC GTCATTGGCA CAGGCTGGAC AGCAAAAGGG 6000
CAGATCACAG TGCTGGACAT GCACCCAGGC TCTGGGAAGA CCCACAGAGT CCTCCCGGAG 6060
CTCATTCGCC AATGCATTGA CAGACGCCTA AGGACATTGG TGTTGGCCCC AACCCGTGTG 6120
GTGCTCAAGG AAATGGAGCG TGCCTTGAAT GGGAAGAGAG TCATGTTCCA TTCTCCGGCA 6180
GTTGGAGATC AGCAGGTGGG AGGGGCCATC GTCGACGTGA TGTGCCATGC AACCTATGTC 6240
AATAGACGCC TGCTCCCGCA GGGGAGACAG AATTGGGAAG TGGCAATCAT GGATGAAGCC 6300
CATTGGACGG ATCCACACAG CATAGCCGCT CGGGGTCACC TGTACACCTT GGCTAAGGAA 6360
AACAAATGTG CCCTGGTTCT TATGACAGCA ACGCCACCCG GGAAGAGCGA ACCCTTCCCA 6420
GAGTCCAACG GGGCAATCAC CAGTGAAGAG AAGCAGATCC CTGATGGGGA GTGGCGTGAT 6480
GGGTTCGACT GGATCACCGA GTATGAGGGG CGTACCGCAT GGTTCGTTCC CTCGATTGCA 6540
AAAGGTGGTA CTATAGCCCG CACCCTGAGA CAAAAAGGAA AAAGCGTGAT CTGTCTGAAC 6600
AGCAAGACAT TTGAAAAGGA CTACTCCAGA GTGAGAGATG AGAAACCCGA CTTCGTGGTC 6660
ACAACCGACA TATCTGAAAT GGGGGCCAAC CTCGATGTGA GCCGTGTCAT AGACGGGCGA 6720
ACAAACATCA AACCGGAAGA GGTTGATGGG AGAGTTGAGC TCACAGGGAC CAGACGTGTG 6780
ACCACGGCCT CTGCGGCCCA ACGCCGTGGG AGAGTCGGAA GACAGGAGGA AAGAACAGAT 6840
GAATACATAT ACTCTGGACA GTGTGATGAT GATGATAGTG GACTTGTGCA GTGGAAGGAA 6900
GCGCAGATAC TTCTTGACAA CATAACAACA CTGCGGGGGC CTGTGGCCAC CTTTTATGGA 6960
CCAGAGCAGG ACAAGATGCC AGAGGTGGCA GGTCATTTCC GCCTCACAGA AGAGAAAAGA 7020
AAGCACTTTC GACATCTTCT CACCCATTGT GACTTCACGC CATGGTTGGC ATGGCACGTC 7080
GCAGCAAACG TGTCTAGTGT GACAAGCCGG AACTGGACTT GGGAAGGCCC TGAGGAGAAC 7140
ACTGTGGATG AGGCCAATGG AGATCTGGTC ACCTTCAGGA GCCCGAATGG GGCTGAAAGA 7200
ACACTGAGGC CAGTATGGAG GGATGCGCGC ATGTTCAGAG AAGGACGTGA CATCAGAGAG 7260
TTCATCGCGT ATGCCTCAGG GAGACGCAGC TTTGGAGATG TGTTGAGCGG AATGTCCGGT 7320
GTTCCTGAGC TTCTGCGCCA TAGATGTGTT AGCGCCATGG ATGTCTTCTA CACACTGATG 7380
CATGAGGAGC CTGGCAGCAG GGCAATGAAG ATGGCCGAGA GAGATGCTCC AGAGGCTTTT 7440
TTGACGGTGG TAGAGATGAT GGTGCTCGGC CTGGCCACTC TTGGGGTCGT CTGGTGCTTT 7500
GTTGTTCGCA CCTCAATCAG TCGCATGATG CTTGGCACGC TGGTACTGCT GGCCTCACTG 7560
GCGCTCCTGT GGGCCGGTGG TGTAAGCTAC GGGATTATGG CAGGAGTGGC CCTCATTTTC 7620
TACACGTTGT TGACGGTGCT GCAGCCTGAA GCGGGGAAAC AGAGGAGCAG TGATGACAAC 7680
AAGTTGGCCT ACTTCCTGTT GACGCTCTGC AGTCTAGCTG GACTGGTAGC CGCCAATGAA 7740
ATGGGATTTC TGGAGAAGAC TAAGGCGGAC CTGTCCACGG TGTTGTGGAG TGAACATGAA 7800
GAGTTGCGGT CGTGGGAAGA GTGGACCAAC ATCGACATCC AGCCTGCACG TTCCTGGGGA 7860
ACTTACGTGC TGGTGGTCTC TTTGTTCACA CCATACATAA TTCACCAACT TCAGACCAAG 7920
ATCCAACAAC TCGTCAACAG CGCTGTTGCA ACTGGGGCTC AGGCCATGCG AGACCTCGGA 7980
GGAGGGGCTC CATTCTTTGG GGTAGCAGGG CATGTAATGG CTTTGGGAGT GGTATCGCTA 8040
GTTGGTGCAA CGCCAACATC CTTGGTGGTT GGTGTTGGTC TGGCGGCGTT CCACCTGGCC 8100
ATTGTGGTGT CCGGACTAGA GGCTGAGTTG ACACAAAGAG CCCACAAAGT CTTCTTCTCG 8160
GCAATGGTGC GCAATCCCAT GGTGGATGGA GACGTCATCA ATCCATTTGG AGAGGGAGAG 8220
GCAAAACCTG CTCTGTATGA GAGGAAAATG AGCCTGGTCT TGGCGATAGT GCTTTGCTTG 8280
ATGTCGGTGG TCATGAACAG AACGGTGCCT TCTATCACTG AGGCTTCTGC TGTGGGACTG 8340
GCGGCAGCGG GACAACTGCT CAGACCAGAG GCGGATACCC TGTGGACGAT GCCAGTGGCC 8400
TGTGGCCTGA GCGGCGTGGT CAGGGGTAGC CTCTGGGGAT TCTTGCCCCT CGGGCATAGA 8460
CTCTGGCTAA GGGCCTCTGG GAGTAGGCGT GGTGGCTCTG AGGGGGACAC TCTCGGTGAC 8520
TTGTGGAAAC GGAAACTCAA TGGCTGTACC AAAGAAGAGT TCTTCGCCTA TAGACGCACT 8580
GGCATCCTGG AGACGGAAAG GGACAAGGCA CGGGAACTCC TCAGGAGAGG GGAGACCAAC 8640
ATGGGGCTGG CTGTGTCACG GGGCACGGCT AAACTTGCCT GGCTTGAGGA ACGAGGTTAC 8700
GCAACTCTCA AGGGTGAGGT CGTGGACCTT GGATGTGGAA GAGGCGGCTG GTCCTACTAT 8760
GCGGCCTCTA GACCGGCTGT CATGAGTGTC AAAGCCTACA CAATTGGTGG AAAGGGACAC 8820
GAGACCCCAA AGATGGTGAC AAGCTTGGGT TGGAACCTGA TCAAGTTCAG AGCGGGAATG 8880
GATGTGTTCA GCATGCAGCC ACACCGAGCT GATACCATTA TGTGTGACAT CGGAGAAAGC 8940
AACCCAGATG CCGTGGTGGA GGGTGAGAGG ACACGGAAAG TGATACTACT CATGGAACAG 9000
TGGAAAAACC GCAATCCCAC GGCTACCTGT GTGTTCAAGG TGTTGGCCCC ATACCGCCCA 9060
GAGGTCATAG AAGCACTACA CAGATTCCAA CTGCAGTGGG GCGGAGGACT GGTGAGGACC 9120
CCTTTCTCAA GGAATTCAAC CCATGAAATG TATTACTCGA CTGCTGTCAC TGGAAACATT 9180
GTGAATTCAG TTAACATCCA ATCAAGAAAA CTCTTGGCCC GGTTCGGGGA CCAGAGGGGA 9240
CCCACCAGGG TGCCTGAGCT GGACCTCGGA GTTGGGACTC GATGCGTTGT CTTGGCTGAG 9300
GACAAGGTGA AGGAAAAAGA TGTGCAGGAG AGGATCAGTG CGCTGCGAGA GCAGTATGGT 9360
GAGACCTGGC ATATGGACAG AGAGCATCCG TACAGGACCT GGCAGTACTG GGGCAGCTAC 9420
CGCACCGCGC CAACCGGGTC AGCGGCGTCA CTGATCAATG GAGTCGTGAA GCTTCTCAGC 9480
TGGCCATGGA ACGCGCGGGA GGATGTCGTG CGAATGGCCA TGACTGACAC CACAGCCTTT 9540
GGACAGCAGC GAGTGTTCAA AGAGAAGGTT GACACCAAGG CTCAGGAACC TCAGCCTGGC 9600
ACAAAGGTCA TCATGAGAGC AGTGAATGAC TGGATTCTGG AACGATTGGC ACGGAAAAGC 9660
AAACCACGAA TGTGCAGCAG AGAGGAGTTC ATAGCGAAAG TGAAATCCAA TGCGGCTCTG 9720
GGGGCTTGGT CTGATGAGCA GAACAGGTGG TCAAGTGCAA AAGAGGCTGT AGAGGATCCC 9780
GCATTCTGGC AGCTCGTGGA TGAAGAGAGA GAGAGACACC TTGCTGGGAG ATGCGCCCAC 9840
TGTGTGTACA ACATGATGGG CAAAAGAGAA AAGAAGCTTG GAGAGTTTGG AGTGGCCAAA 9900
GGAAGCCGGG CCATATGGTA CATGTGGCTG GGGAGCCGCT TTCTGGAGTT CGAAGCTCTT 9960
GGCTTTTTGA ATGAGGACCA CTGGGCCTCT AGGGGGTCCA GTGGATCTGG AGTGGAGGGA 10020
ATAAGCTTGA ATTACCTGGG CTGGTATCTC AAAGGGTTGT CAACACTGGA AGGAGGCCTT 10080
TTCTACGCGG ATGACACAGC CGGCTGGGAC ACCAAGGTCA CCAACGCAGA CCTAGAGGAT 10140
GAAGAACAGC TCCTACGCTA CATGGAGGGT GAACACAAGC AACTGGCGGC TACAATAATG 10200
CAGAAGGCAT ACCACGCCAA GGTGGTAAAA GTAGCCCGGC CCTCCCGAGA TGGGGGCTGT 10260
GTCATGGATG TCATCACAAG AAGAGACCAA AGAGGCTCAG GGCAGGTTGT GACTTATGCC 10320
CTCAACACTC TAACCAACAT AAAGGTTCAG CTGATCCGTA TGATGGAGGG GGAGGGAGTC 10380
ATTGAGGCCT CGGACGCACA TAATCCAAGA TTACTCCGAG TGGAACGATG GCTGAGGGAT 10440
CATGGAGAAG AACGTCTCGG AAGAATGCTC GTGAGCGGTG ATGACTGTGT GGTGAGACCG 10500
GTGGATGACA GGTTCAGTAG GGCACTCTAT TTTCTGAATG ACATGGCCAA AACCAGGAAA 10560
GACATTGGAG AGTGGGAGCA TTCGGTTGGC TTCTCGAACT GGGAGGAGGT TCCCTTTTGC 10620
TCACACCACT TCCACGAGTT GGTGATGAAG GATGGGCGTG CTCTCATAGT GCCATGCCGA 10680
GACCAAGATG AACTGGTTGG AAGAGCCCGC GTCTCACCAG GGTGCGGCTG GAGTGTCCGT 10740
GAAACCGCCT GCCTTTCAAA AGCTTATGGG CAGATGTGGC TGCTGAGTTA CTTCCACCGG 10800
CGCGACTTGC GGACGCTTGG ACTTGCCATC TGTTCGGCGG TGCCCATTGA CTGGGTCCCC 10860
ACTGGCCGCA CGACCTGGAG CATCCATGCT AGCGGAGCCT GGATGACCAC AGAGGACATG 10920
TTGGATGTCT GGAACAGGGT GTGGATCCTG GACAACCCCT TCATGCACAG TAAAGAAAAG 10980
ATTGTGGAAT GGAGGGATGT CCCGTATCTC CCCAAATCCC ATGATATGCT GTGTTCCTCT 11040
CTTGTTGGGA GAAAAGAGAG GGCAGAGTGG GCCAAGAACA TCTGGGGAGC AGTAGAGAAA 11100
GTCAGGAAGA TGATCGGACA AGAGAAGTTT AAGGACTACC TTTCCTGCAT GGACCGGCAC 11160
GACTTGCACT GGGAGCTCAA ACTGGAGAGC TCAATAATTT AAAACCAGAC TGTGACTGAG 11220
CACAACCTGG AGTGCTCGTT AAACATTGTC CAGAACCAAA AACCACAGCA AACAATTTAA 11280
AAAACACCCC CAGAGTGCCC CACGGCAACA CGTCAGTGAG AGTGGCGACG GGAAAATGGT 11340
CGATCCCGAC GTAGGGCACT CTGTAAAACT TTGTGAGACC CCCGGCACCA TGATAAGGCC 11400
GAACATGGTG CAAGAACGGG AGGCCCCCGG AAGCATGCTT CCGGGAGGAG GGAAGAGAGA 11460
AATTGGCAAC TCTCTTCGGG ATTTTTCCTC CTCCTATACC AAATTCCCCC TCAACAGAGG 11520
GGGGGCGGTT CTTGTTCTCC CTGAGCCACC ATCACCCAGA CACAGATAGT CTGACAAGGA 11580
GGTGACGTGT GACTCGGAAA AACACCCGCT GGGTCGGCAT GGCATCTCCA CCTCCTCGCG 11640
GTCCGACCTG GGCTACTTCG GTAGGCTAAG GGAGAAGAAC TTGTTTATTG CAGCTTATAA 11700
TGGTTACAAA TAAAGCAATA GCATCACAAA TTTCACAAAT AAAGCATTTT TTTCACTGCA 11760
TTCTAGTTGT GGTTTGTCCA AACTCATCAA TGTATCTTAT CATGTCTCTC GAGCAAGACG 11820
TTTCCCGTTG AATATGGCTC ATAACACCCC TTGTATTACT GTTTATGTAA GCAGACAGTT 11880
TTATTGTTCA TGATGATATA TTTTTATCTT GTGCAATGTA ACATCAGAGA TTTTGAGACA 11940
CAACGTGGCT TTGTTGAATA AATCGAACTT TTGCTGAGTT GAAGGATCAG ATCACGCATC 12000
TTCCCGACAA CGCAGACCGT TCCGTGGCAA AGCAAAAGTT CAAAATCACC AACTGGTCCA 12060
CCTACAACAA AGCTCTCATC AACCGTGGCT CCCTCACTTT CTGGCTGGAT GATGGGGCGA 12120
TTCAGGCCTG GTATGAGTCA GCAACACCTT CTTCACGAGG CAGACCTCAG CGCTAGCGGA 12180
GTGTATACTG GCTTACTATG TTGGCACTGA TGAGGGTGTC AGTGAAGTGC TTCATGTGGC 12240
AGGAGAAAAA AGGCTGCACC GGTGCGTCAG CAGAATATGT GATACAGGAT ATATTCCGCT 12300
TCCTCGCTCA CTGACTCGCT ACGCTCGGTC GTTCGACTGC GGCGAGCGGA AATGGCTTAC 12360
GAACGGGGCG GAGATTTCCT GGAAGATGCC AGGAAGATAC TTAACAGGGA AGTGAGAGGG 12420
CCGCGGCAAA GCCGTTTTTC CATAGGCTCC GCCCCCCTGA CAAGCATCAC GAAATCTGAC 12480
GCTCAAATCA GTGGTGGCGA AACCCGACAG GACTATAAAG ATACCAGGCG TTTCCCCCTG 12540
GCGGCTCCCT CGTGCGCTCT CCTGTTCCTG CCTTTCGGTT TACCGGTGTC ATTCCGCTGT 12600
TATGGCCGCG TTTGTCTCAT TCCACGCCTG ACACTCAGTT CCGGGTAGGC AGTTCGCTCC 12660
AAGCTGGACT GTATGCACGA ACCCCCCGTT CAGTCCGACC GCTGCGCCTT ATCCGGTAAC 12720
TATCGTCTTG AGTCCAACCC GGAAAGACAT GCAAAAGCAC CACTGGCAGC AGCCACTGGT 12780
AATTGATTTA GAGGAGTTAG TCTTGAAGTC ATGCGCCGGT TAAGGCTAAA CTGAAAGGAC 12840
AAGTTTTGGT GACTGCGCTC CTCCAAGCCA GTTACCTCGG TTCAAAGAGT TGGTAGCTCA 12900
GAGAACCTTC GAAAAACCGC CCTGCAAGGC GGTTTTTTCG TTTTCAGAGC AAGAGATTAC 12960
GCGCAGACCA AAACGATCTC AAGAAGATCA TCTTATTAAG GGGTCTGACG CTCAGTGGAA 13020
CGAAAACTCA CGTTAAGGGA TTTTGGTCAT GAGATTATCA AAAAGGATCT TCACCTAGAT 13080
CCTTTTAAAT TAAAAATGAA GTTTTAAATC AATCTAAAGT ATATATGAGT AAACTTGGTC 13140
TGACAGTTAC CAATGCTTAA TCAGTGAGGC ACCTATCTCA GCGATCTGTC TATTTCGTTC 13200
ATCCATAGTT GCCTGACTCC CCGTCGTGTA GATAACTACG ATACGGGAGG GCTTACCATC 13260
TGGCCCCAGT GCTGCAATGA TACCGCGAGA CCCACGCTCA CCGGCTCCAG ATTTATCAGC 13320
AATAAACCAG CCAGCCGGAA GGGCCGAGCG CAGAAGTGGT CCTGCAACTT TATCCGCCTC 13380
CATCCAGTCT ATTAATTGTT GCCGGGAAGC TAGAGTAAGT AGTTCGCCAG TTAATAGTTT 13440
GCGCAACGTT GTTGCCATTG CTGCAGGCAT CGTGGTGTCA CGCTCGTCGT TTGGTATGGC 13500
TTCATTCAGC TCCGGTTCCC AACGATCAAG GCGAGTTACA TGATCCCCCA TGTTGTGCAA 13560
AAAAGCGGTT AGCTCCTTCG GTCCTCCGAT CGTTGTCAGA AGTAAGTTGG CCGCAGTGTT 13620
ATCACTCATG GTTATGGCAG CACTGCATAA TTCTCTTACT GTCATGCCAT CCGTAAGATG 13680
CTTTTCTGTG ACTGGTGAGT ACTCAACCAA GTCATTCTGA GAATAGTGTA TGCGGCGACC 13740
GAGTTGCTCT TGCCCGGCGT CAACACGGGA TAATACCGCG CCACATAGCA GAACTTTAAA 13800
AGTGCTCATC ATTGGAAAAC GTTCTTCGGG GCGAAAACTC TCAAGGATCT TACCGCTGTT 13860
GAGATCCAGT TCGATGTAAC CCACTCGTGC ACCCAACTGA TCTTCAGCAT CTTTTACTTT 13920
CACCAGCGTT TCTGGGTGAG CAAAAACAGG AAGGCAAAAT GCCGCAAAAA AGGGAATAAG 13980
GGCGACACGG AAATGTTGAA TACTCATACT CTTCCTTTTT CAATATTATT GAAGCATTTA 14040
TCAGGGTTAT TGTCTCATGA GCGGATACAT ATTTGAATGT ATTTAGAAAA ATAAACAAAT 14100
AGGGGTTCCG CGCACATTTC CCCGAAAAGT GCCACCTGAC GTCTAAGAAA CCATTATTAT 14160
CATGACATTA ACCTATAAAA ATAGGCGTAT GCACGAGGCC CTTTCGTCTT CAAGAATTTT 14220
ATAAGGTACC GAATTCTTGA TTATTGACTA GTTATTAATA GTAATCAATT ACGGGGTCAT 14280
TAGTTCATAG CCCATATATG GAGTTCCGCG TTACATAACT TACGGTAAAT GGCCCGCCTG 14340
GCTGACCGCC CAACGACCCC CGCCCATTGA CGTCAATAAT GACGTATGTT CCCATAGTAA 14400
CGCCAATAGG GACTTTCCAT TGACGTCAAT GGGTGGAGTA TTTACGGTAA ACTGCCCACT 14460
TGGCAGTACA TCAAGTGTAT CATATGCCAA GTACGCCCCC TATTGACGTC AATGACGGTA 14520
AATGGCCCGC CTGGCATTAT GCCCAGTACA TGACCTTATG GGACTTTCCT ACTTGGCAGT 14580
ACATCTACGT ATTAGTCATC GCTATTACCA TGGTGATGCG GTTTTGGCAG TACATCAATG 14640
GGCGTGGATA GCGGTTTGAC TCACGGGGAT TTCCAAGTCT CCACCCCATT GACGTCAATG 14700
GGAGTTTGTT TTGGCACCAA AATCAACGGG ACTTTCCAAA ATGTCGTAAC AACTCCGCCC 14760
CATTGACGCA AATGGGCGGT AGGCGTGTAC GGTGGGAGGT CTATATAAGC AGAGCTGGTT 14820
TAGTGAACCG T 14831

Claims (9)

1.蜱传脑炎病毒报告病毒TBEV Nluc 2A的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)SnaBI-C38片段的克隆：以TBEV FL为模板，引物1和引物2为特异性引物，PCR扩增蜱传脑炎病毒SnaBI-C38片段；所述引物1和引物2的序列为：
引物1：
5’-TACGTATTAGTCATCGCTATTAC-3’；
引物2：
5’-GTGTGAAGACCATCACGAGTCCATTTGGC-3’；
2)P2A序列和Nluc基因的连接：将P2A序列设计在引物上，并分两轮PCR将P2A序列连接到Nluc基因上；第一轮PCR：Nluc-pGEMT为模板，Nluc-F和P2A Nluc R1为引物进行PCR，扩增好目的片段后，回收目的条带；进行第二轮PCR：第一轮PCR回收的目的条带为模板，Nluc-F和P2A Nluc R2为引物进行PCR，扩增好目的片段后，回收目的条带；将第二轮PCR回收的目的条带连接到pGEM T载体上，命名为Nluc 2A pGEM T；所述引物Nluc-F、引物P2A Nluc R1和引物P2A Nluc R2的序列为：
引物Nluc-F：
5’-ATGGTCTTCACACTCGAAG-3’；
引物P2A Nluc R1：
5’-CAGCAGGCTGAAGTTAGTAGCTCCGCTTCCCGCCAGAATGCGTTCGCAC-3’；
引物P2A Nluc R2：
5’-AGGTCCAGGGTTCTCCTCCACGTCTCCAGCCTGCTTCAGCAGGCTGAAGTTAG-3’；
3)Nluc-P2A片段的克隆：以Nluc 2A pGEM T为模板，引物3和引物4为特异性引物，扩增出Nluc-P2A片段；所述引物3和引物4的序列为：
引物3：
5’-CAAATGGACTCGTGATGGTCTTCACACTCGAAG-3’；
引物4：
5’-CTTCCCGGCCATAGGTCCAGGGTTCTCCTC-3’；
4)C1-AflⅡ片段的克隆：以TBEV FL为模板，引物5和引物6为特异性引物，扩增出C1-AflⅡ片段；所述引物5和引物6的序列为：
引物5：
5’-GAACCCTGGACCTATGGCCGGGAAGGCCATTC-3’；
引物6：
5’-CTTAAGCAACACTCCAGTCTGG-3’；
5)构建SnaBI-C38-Nluc-P2A-C1-AflⅡ片段：以引物1和引物6为特异性引物，以步骤1)获得的SnaBI-C38片段、步骤3)获得的Nluc-P2A片段和步骤4)获得的C1-AflⅡ片段为模板，通过重叠延伸PCR，将三个片段连接在一起，得到SnaBI-C38-Nluc-P2A-C1-AflⅡ片段；
6)将SnaB I-C38-Nluc-P2A-C1-AflⅡ片段和TBEV的感染性克隆用SnaBI和AflⅡ双酶切，将酶切片段跑胶回收，再用T4连接酶进行连接，获得蜱传脑炎病毒报告病毒TBEV Nluc2A。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述蜱传脑炎病毒报告病毒TBEVNluc 2A的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤1)SnaBI-C38片段的克隆中，PCR反应体系为：TBEV FL 1ul，引物1和引物2各1ul，KOD buffer 5ul，dNTP 5ul，MgSO43ul，KOD1ul，ddH2O 33ul，总体系50ul；PCR反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，58℃30s，68℃1min为一个循环，进行35个循环，最后68℃延伸7min。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2)Nluc 2A pGEM T的克隆中，
第一轮PCR反应体系为：Nluc-pGEM T 1ul，引物Nluc-F和P2A Nluc R1各1ul，KODbuffer 5ul，dNTP 5ul，MgSO4 3ul，KOD 1ul，ddH2O 33ul，总体系50ul；PCR反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，58℃30s，68℃1min为一个循环，进行35个循环；最后68℃延伸7min；
第二轮PCR反应体系为：第一轮PCR回收的目的条带1ul，引物Nluc-F和P2A Nluc R2各1ul，KOD buffer 5ul，dNTP 5ul，MgSO4 3ul，KOD 1ul，ddH2O 33ul，总体系50ul；PCR反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，58℃30s，68℃1min为一个循环，进行35个循环；最后68℃延伸7min。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤3)构建Nluc-P2A片段中，PCR反应体系为：Nluc 2A pGEM T片段1ul，引物3和引物4各1ul，KOD buffer 5ul，dNTP 5ul，MgSO43ul，KOD 1ul，ddH2O 33ul，总体系50ul；PCR反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，58℃30s，68℃1min30s为一个循环，进行35个循环；最后68℃延伸7min。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤4)C1-AflⅡ片段的克隆中，PCR反应体系为：TBEV FL 1ul，引物5和引物6各1ul，KOD buffer 5ul，dNTP 5ul，MgSO43ul，KOD1ul，ddH2O 33ul，总体系50ul；PCR反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，56℃30s，68℃2min30s为一个循环，进行35个循环；最后68℃延伸7min。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤5)构建SnaBI-C38-Nluc-P2A-C1-AflⅡ片段中，PCR反应体系为：SnaBI-C38片段2ul，Nluc-P2A片段2ul，C1-AflⅡ片段2ul，引物1和引物6各1ul，KOD buffer 5ul，dNTP 5ul，MgSO4 3ul，KOD 1ul，ddH2O 28ul，总体系50ul；PCR反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，56℃30s，68℃3min为一个循环，进行35个循环；最后68℃延伸7min。
8.按照权利要求1-7任意一项所述的方法构建的蜱传脑炎病毒报告病毒TBEV Nluc 2A在抗病毒药物筛选中的应用。
9.按照权利要求1-7任意一项所述的方法构建的蜱传脑炎病毒报告病毒TBEV Nluc 2A在检测蜱传脑炎病毒的复制情况中的应用。
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