CN115196618B - 一种吉拉尔特试剂t碳点及其制备方法和抗菌应用 - Google Patents

一种吉拉尔特试剂t碳点及其制备方法和抗菌应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种吉拉尔特试剂T碳点及其制备方法和抗菌应用，该吉拉尔特试剂T碳点由吉拉尔特试剂T溶解在双蒸水中，在180℃下反应12h，然后冷却至室温后离心，保留上层液体过滤后获得。本发明制备的吉拉尔特试剂T碳点对细胞毒性低，细胞相容性好，甚至在低浓度下还能促进细胞增殖，由于其优秀的抗菌性能、良好的细胞相容性、对耐药菌的抑制作用以及其抗生物膜的特性使该吉拉尔特试剂T碳点具有良好的抗菌应用前景，特别是对伤口的细菌感染具有良好的应用前景。

Description

一种吉拉尔特试剂T碳点及其制备方法和抗菌应用
技术领域
本发明属于碳点技术领域，具体涉及一种吉拉尔特试剂T碳点及其制备方法和抗菌应用。
背景技术
细菌感染严重威胁着人类健康，抗生素仍然是人类对抗细菌感染最有力的武器。然而长期使用和滥用抗生素导致了耐抗生素细菌(ARB)的出现，并在世界各地蔓延。一项研究表明，全世界每年约有70万人死于ARB感染，如果不开发新的抗菌剂或不抑制耐药菌，到2050年死亡人数可能上升到1000万。由ARB感染引起的疾病不仅治疗费用而且治愈率低下，因此，开发新的抗菌剂势在必行。虽然研究人员经过不懈的努力，并已经发现了诸如植物多酚、抗菌肽和益生菌活性物质等传统抗菌剂，但它们仍然有各种局限。
细菌通常以多菌种聚合体的形式存在，由胞外聚合物(EPS)和嵌入其中的细菌组成。EPS被认为是细菌对抗生素产生抗药性的主要原因。如何使抗菌剂穿透EPS并有效作用于细菌是一个挑战。纳米颗粒具有极小的颗粒尺寸，这使它们能够穿透EPS。由于不需要额外的抗生素，与载药纳米颗粒相比，自身具有抗菌特性的纳米颗粒更受研究者青睐。
作为零维碳基纳米粒子的碳点，由于其光致发光、高稳定性、生物相容性、小尺寸、水分散性、低成本和易于合成而备受关注。它们已经在许多领域被广泛研究，包括药物输送、生物成像和荧光探针。最近，一些碳点已经显示出良好的抗菌性能。与其他抗菌剂相比，碳点最大的优势在于其制备简单；然而，制备具有抗菌特性的碳点具有挑战性。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种吉拉尔特试剂T碳点及其制备方法和抗菌应用，具体采用以下的技术方案：
一种吉拉尔特试剂T碳点，由吉拉尔特试剂T溶解在双蒸水中，在180℃下反应12h，然后冷却至室温后离心，保留上层液体过滤后获得。
优选地，所述吉拉尔特试剂T和双蒸水的比例是10mg：1mL。
该吉拉尔特试剂T碳点可以粘附在细菌表面，破坏细菌生理结构，导致细菌丧失正常生理功能致死，并且随着吉拉尔特试剂T碳点浓度的增加，细菌生物膜的生物量逐渐减少，即该吉拉尔特试剂T碳点具有抗菌活性和抗生物膜活性。
因此本发明还提供一种吉拉尔特试剂T碳点在抗菌领域的应用，特别是对伤口的细菌感染具有应用前景。
本发明还提供一种吉拉尔特试剂T碳点的制备方法，包括以下步骤：将吉拉尔特试剂T溶解在双蒸水中，转移至反应釜内，在温度为180℃下反应12h，冷却到室温后，离心，保留上层液体并用滤膜过滤，最后将过滤后的上层液体冷冻干燥，获得吉拉尔特试剂T碳点，其中，所述吉拉尔特试剂T和双蒸水的比例是5～10mg：1mL。
优选地，所述反应釜为PTFE内衬反应釜。
离心条件为：10000rpm离心10min。
所述滤膜的规格为0.22μm。
本发明的有益效果为：本发明通过吉拉尔特试剂T溶解在双蒸水中，一锅式水热法合成吉拉尔特试剂T碳点，合成方法具有低成本和方便的优点，而且合成的吉拉尔特试剂T碳点的抗菌活性不需要光催化或其他外部激活方式。本发明制备的吉拉尔特试剂T碳点对细胞毒性低，细胞相容性好，甚至在低浓度下还能促进细胞增殖，由于其优秀的抗菌性能、良好的细胞相容性、对耐药菌的抑制作用以及其抗生物膜的特性使该吉拉尔特试剂T碳点具有良好的抗菌应用前景，特别是对伤口的细菌感染具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明吉拉尔特试剂T碳点的合成和抗菌过程；
图2(a)为本发明吉拉尔特试剂T碳点的TEM图像；图2(b)为本发明基于TEM的吉拉尔特试剂T碳点的直径统计图；图2(c)为本发明吉拉尔特试剂T碳点的紫外全扫描光谱；图2(d)为本发明吉拉尔特试剂T碳点的XRD谱图；
图3为本发明吉拉尔特试剂T和吉拉尔特试剂T碳点的FT-IR光谱；
图4(a)为本发明吉拉尔特试剂T碳点的XPS全扫描谱图；图4(b)为C1s的高分辨光谱；图4(c)为N1s的高分辨光谱图；图4(d)为O1s的高分辨光谱图；
图5(a)的左侧标1处为10mg/mL吉拉尔特试剂T对大肠杆菌的抑制区和左侧标2处为10mg/mL吉拉尔特试剂T碳点对大肠杆菌的抑制区；图5(b)的左侧标3处为10mg/mL吉拉尔特试剂T对金黄色葡萄菌的抑制区和左侧标4处为10mg/mL吉拉尔特试剂T碳点对金黄色葡萄菌的抑制区；
图6(a)为不同浓度的吉拉尔特试剂T碳点和吉拉尔特试剂T对大肠杆菌的抑制作用；图6(b)为不同浓度的吉拉尔特试剂T碳点和吉拉尔特试剂T对金黄色葡萄菌的抑制作用；
图7(a)为不同浓度的吉拉尔特试剂T碳点下大肠杆菌的生长曲线；图7(b)为不同浓度的吉拉尔特试剂T碳点下金黄色葡萄菌的生长曲线；
图8(a)为正常大肠杆菌的荧光显微镜图像；图8(b)为与10mg/mL吉拉尔特试剂T碳点共同培养的大肠杆菌的荧光显微镜图像；图8(c)为正常金黄色葡萄球菌的荧光显微镜图像；图8(d)为与10mg/mL吉拉尔特试剂T碳点共同培养的金黄色葡萄球菌的荧光显微镜图像；
图9(a)为正常大肠杆菌的SEM图像；图9(b)为与5mg/mL吉拉尔特试剂T碳点共同处理4h的大肠杆菌的SEM图像；图9(c)为正常金黄色葡萄球菌的SEM图像；图9(d)为与5mg/mL吉拉尔特试剂T碳点共同处理4h的金黄色葡萄球菌的SEM图像；
图10(a)为吉拉尔特试剂T碳点、正常大肠杆菌、和与5mg/mL吉拉尔特试剂T碳点共同处理4h的大肠杆菌的Zeta电位；图10(b)为吉拉尔特试剂T碳点、金黄色葡萄球菌、和与5mg/mL吉拉尔特试剂T碳点共同处理4h的金黄色葡萄球菌的Zeta电位；
图11(a)为不同浓度的吉拉尔特试剂T碳点对大肠杆菌生物膜的去除和形成抑制的效果；图11(b)为不同浓度的吉拉尔特试剂T碳点对金黄色葡萄球菌生物膜的去除和形成抑制的效果；
图12为不同浓度的吉拉尔特试剂T碳点的细胞存活率。
具体实施方式
以下将结合实施例和附图对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地理解本发明的目的、方案和效果。
本发明使用的材料：
吉拉德试剂T和琼脂粉由上海麦克林生化科技有限公司提供；
大肠杆菌(ATCC25922)和金黄色葡萄球菌(ATCC6538)由上海鲁微科技有限公司提供；
MRSA(ATCC43300)由上海北诺生物技术有限公司提供；
成人皮肤成纤维细胞(HDFa)由上海通派生物技术有限公司提供；
万古霉素由Sigma-Aldrich(上海)贸易有限公司提供；
胰蛋白酶大豆肉汤由杭州百思生物技术有限公司提供；
麦康凯营养琼脂是由上海博微生物科技有限公司提供；
Calcein AM/PI双重染色试剂盒由上海懋康生物科技有限公司提供。
实施例1
制备吉拉尔特试剂T碳点(GRT-CDs)：
将100mg吉拉尔特试剂T溶解在10mL的双蒸水中，再将溶液转移至一个25mL的PTFE内衬反应釜中，180℃下反应12h，冷却到室温后，将10000rpm下离心10min，保留上层液体并用0.22μm的滤膜过滤，将过滤后的上层液体冷冻干燥，获得产品。
实施例2
制备吉拉尔特试剂T碳点(GRT-CDs)：
将50mg吉拉尔特试剂T溶解在10mL的双蒸水中，再将溶液转移至一个25mL的PTFE内衬反应釜中，180℃下反应12h，冷却到室温后，将10000rpm下离心10min，保留上层液体并用0.22μm的滤膜过滤，将过滤后的上层液体冷冻干燥，获得产品。
实施例3
吉拉尔特试剂T碳点(GRT-CDs)的形貌特征、紫外吸收光谱以及XRD分析：
(1)紫外全波段吸收光谱的测定：准备两个洁净的比色皿，均加入3mL dd H2O。打开UV-1800紫外-可见分光光度计(Shimadzu公司，日本)并与电脑连接，将两个装有dd H2O的比色皿分别放置空白池及样品池中，波段参数选定200～600nm进行基线校准。校准结束后，取出样品池中的比色皿，弃去dd H2O并加入吉拉尔特试剂T碳点水溶液，全波段扫描得到吉拉尔特试剂T碳点在200～600nm范围的吸收值。
如图2(c)所示，在紫外-可见吸收光谱中可以观察到204nm处的峰值，这归因于C＝O键的n-π*跃迁，以及吉拉尔特试剂T碳点结构中sp2的π-π*跃迁。
(2)傅立叶红外光谱的测定：将冷冻干燥后得到的固体吉拉尔特试剂T碳点用玛瑙研钵顺时针研磨分散。称取约2mg吉拉尔特试剂T碳点并加入300mg溴化钾后继续研磨，过程中需注意将待测样与溴化钾混合均匀，将研磨后的粉末用烤灯烘烤30min左右。称取约150mg上述混合物放入压片装置中压成薄片，将薄片转移至Spectrum Two FT-IR光谱仪(PerkinElmer，美国)中进行扫描。
吉拉尔特试剂T的傅里叶变换红外光谱(FT-IR)如图3所示，已知吉拉尔特试剂T的化学结构式，即1693cm-1、1609cm-1、1545cm-1和1481cm-1的尖锐峰值分别归因于C＝O、-NH2、-NH-、-CH2-的伸缩振动；1441cm-1和1404cm-1的双吸收峰归结为-CH3的拉伸振动；在1322cm-1和1293cm-1的双峰吸收是由C-N引起的。
吉拉尔特试剂T碳点的傅里叶变换红外光谱(FT-IR)如图3所示，结合上述分析对吉拉尔特试剂T碳点的未知基团进行猜测：1622cm-1处的吸收峰对应缔合状态的C＝O与-NH2、-NH-；在1449cm-1和1404cm-1的双峰吸收是-CH3；在1488cm-1和1334cm-1的尖锐峰值分别对应-CH2-和C-N的伸缩振动。
吉拉尔特试剂T碳点和吉拉尔特试剂T的FT-IR谱图部分相似，例如：-CH2-、-CH3、C-N和其他一些基团的振动，这表明它们具有部分相同的官能团。值得注意的是与吉拉尔特试剂T相比，在1622cm-1处吉拉尔特试剂T碳点的吸收峰变宽，这是由于碳点中的C＝O与GRT-CDs表面的-NH2、-NH-处于缔合状态。
(3)透射电子显微镜(TEM)下形貌观察：将吉拉尔特试剂T碳点至超薄碳膜上，自然风干，调节Tecnai G2 20透射电子显微镜(FEI，美国)的参数，选定视野观察并拍摄吉拉尔特试剂T碳点的微观形态。
如图2(a)所示，GRT-CDs具有高分散性和均匀的类球状形态图，高分辨TEM视野下观察到晶格结构，晶格间距约为0.21nm；
如图2(b)所示，随机选取TEM图像中的50个颗粒进行统计，得出GRT-CDs的粒径分布图，其平均粒径为2.41nm。
(4)X射线光电子能谱测试(XPS)：将吉拉尔特试剂T碳点水溶液滴至载玻片上风干制样，通过Thermo ESCALAB 250XI多功能成像电子能谱仪(Thermo Fisher Scientific，美国)对GRT-CDs所含的元素及化合态进行分析。
吉拉尔特试剂T碳点的全扫描X射线光电子能谱(XPS)如图4(a)所示，可以看出在286.17eV、402.27eV和531.9eV处分别存在C1s(碳)、N 1s(氮)和O1s(氧)特征峰；C：N：O的原子比为29：5：10(C/N/O)。
C 1s的高分辨光谱如图4(b)所示，可以看出存在三个峰，结合能分别为284.8eV、286.2eV和288.45eV；284.8eV的峰对应于脂肪族sp2 C(C-C)，这与碳原子在晶格中的共轭排列有关；286.2eV的峰值对应N-sp2c(C-N)。；C 1s谱图的最后一个峰288.45eV对应O＝sp2c(C＝O)。
N 1s的高分辨光谱如图4(c)所示，可以看出存在两个峰，结合能分别为400.18eV和402.48eV，400.18eV的峰归属于N-N，402.48eV的峰归属于C-N+。
O 1s的高分辨光谱如图4(d)所示，可以看出有一个结合能为531.39eV的峰归属于C-O；532.56eV的峰归属于C＝O。
综上所述，XPS分析得到的吉拉尔特试剂T碳点化合态基团构成基本与其红外图谱相吻合。
(5)X射线衍射测试(XRD)：通过D8 ADVANCE X射线衍射仪(Bruker，德国)进行测试，射线源为Cu靶X-射线光管。在5～90°测试角度范围内对吉拉尔特试剂T碳点进行扫描，如图2(d)所示，吉拉尔特试剂T碳点在28.54°和41.27°处具有宽衍射峰，表明GRT-CDs中的C是以无序的无定形形式存在。
实施例4
吉拉尔特试剂T碳点(GRT-CDs)的各项抗菌性能：
(1)培养基的配制以及细菌活化验纯：
①麦康凯平板的配制：称取3g麦康凯琼脂培养基分散于1L双蒸水中，灭菌处理，于无菌平皿中分别倒入约15mL上述培养基，静置30min后倒扣。
②TSA平板的配制：称取3g胰蛋白胨大豆肉汤、2g琼脂粉分散于1L双蒸水中，灭菌处理，于无菌平皿中分别倒入约15mL上述培养基，静置30min后倒扣。
③TSB肉汤的配制：称取3g胰蛋白胨大豆肉汤分散于1L双蒸水中，灭菌处理。
④菌种的复苏：取出-80℃冰箱中的菌种冻存管，室温下解冻，用移液器吸取100μL冻存液，接种到10mL无菌TSB肉汤中，置于恒温摇床中37℃孵育20h，取100μL孵育后的菌液重复上述活化步骤，三次后得到活力值高的菌悬液。
⑤菌种的验纯：用接种环蘸取活化后的菌液，采用平板划线法划部于平板上，大肠杆菌用麦康凯平板验纯(ATCC25922菌株菌落表现出与培养基相近的紫红色)，金黄色葡萄球菌用TSA平板验纯(ATCC6538菌株菌落呈金黄色，颜色随放置天数慢慢加深)。
(2)吉拉尔特试剂T和吉拉尔特试剂T碳点(GRT-CDs)的抑菌圈评价：
①取100μL大肠杆菌悬液接种于TSB肉汤，培养6h达到生长对数期，然后用TSB肉汤校正到0.5麦氏比浊标准，再按1:100进行稀释，含菌量为1.5×106CFU/mL。用棉签蘸取稀释后的菌液，均匀地涂布于麦康凯平板上。在平板上放置两个牛津杯，左侧对照组的牛津杯加入200μL含10mg/mL吉拉尔特试剂T，右侧实验组的牛津杯加入200μL含10mg/mL吉拉尔特试剂T碳点。将平板在培养箱中37℃孵育20h，孵育完成后用游标卡尺测量并记录抑制圈的直径。
如图5(a)所示，吉拉尔特试剂T(直径＝7.63mm)和吉拉尔特试剂T碳点(直径＝43.80mm)在同浓度(10mg/mL)下对大肠杆菌的抑制效果。可以看出，吉拉尔特试剂对大肠杆菌几乎不显示抑制活性，而吉拉尔特试剂T碳点引起一个非常明显的抑制区。
②取100μL金黄色葡萄球菌悬液接种于TSB肉汤，培养6h达到生长对数期，然后用TSB肉汤校正到0.5麦氏比浊标准，再按1:100进行稀释，含菌量为1.5×106CFU/mL。用棉签蘸取稀释后的菌液，均匀地涂布于TSA平板上。在平板上放置两个牛津杯，左侧对照组的牛津杯加入200μL含10mg/mL吉拉尔特试剂T，右侧实验组的牛津杯加入200μL含10mg/mL吉拉尔特试剂T碳点。将平板在培养箱中37℃孵育20h，孵育完成后用游标卡尺测量并记录抑制圈的直径。
如图5(b)所示，吉拉尔特试剂T(左＝24.89mm)和吉拉尔特试剂T碳点(右＝36.50mm)在同浓度(10mg/mL)下对金黄色葡萄球菌的抑制作用。可以看出，吉拉尔特试剂T碳点也比吉拉尔特试剂T显示出更明显的抑制效果。
(3)吉拉尔特试剂T和吉拉尔特试剂T碳点(GRT-CDs)的MIC的测定：
以公式：细菌抑制率(％)＝(1-实验孔的OD600/对照孔的OD600)×100％计算吉拉尔特试剂T和吉拉尔特试剂T碳点分别对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细菌抑制率。
①用双蒸水分别配制浓度为10、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05和0.025mg/mL的吉拉尔特试剂T溶液和吉拉尔特试剂T碳点溶液使用；
在96孔板的每孔中加入100μL含菌量为1.5×106CFU/mL的大肠杆菌悬浮液，分成三组，分别为碳点实验组、原料实验组和对照组。碳点实验组分别加入100μL上述浓度的吉拉尔特试剂T碳点溶液，原料实验组加入100μL上述浓度的吉拉尔特试剂T溶液，对照组加入100μL的双蒸水，均置于生化培养箱中37℃孵育18h。孵育结束后，用多功能酶标仪测定各孔在600nm处的吸光度(OD600)。
如图6(a)所示，吉拉尔特试剂T碳点在12.5～200μg/mL剂量范围内对大肠杆菌的抑制率随剂量增加呈现上升趋势，在200～5000μg/mL剂量范围内对大肠杆菌的抑制率＞90％，经计算，得出吉拉尔特试剂T碳点对大肠杆菌的MIC90＝200μg/mL。
如图6(a)所示，吉拉尔特试剂T在12.5～1600μg/mL剂量范围内对大肠杆菌并未表现出明显的抗菌活性，在3200～5000μg/mL对大肠杆菌的抑制率随剂量增加呈现上升趋势，在5000μg/mL剂量时对大肠杆菌的抑制率＞90％，经计算，得出吉拉尔特试剂T对大肠杆菌的MIC90＝5000μg/mL。
②用双蒸水分别配制浓度为10、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05和0.025mg/mL的吉拉尔特试剂T溶液和吉拉尔特试剂T碳点溶液使用；
在96孔板的每孔中加入100μL含菌量为1.5×106CFU/mL的金黄色葡萄球菌悬浮液，分成三组，分别为碳点实验组、原料实验组和对照组。碳点实验组分别加入100μL上述浓度的吉拉尔特试剂T碳点溶液，原料实验组加入100μL上述浓度的吉拉尔特试剂T溶液，对照组加入100μL的双蒸水，均置于生化培养箱中37℃孵育18h。孵育结束后，用多功能酶标仪测定各孔在600nm处的吸光度(OD600)。
如图6(b)所示，吉拉尔特试剂T碳点在12.5～200μg/mL剂量范围内对金黄色葡萄球菌的抑制率随剂量增加呈现上升趋势，在200～5000μg/mL剂量范围内对金黄色葡萄球菌的抑制率＞90％，经计算，得出吉拉尔特试剂T碳点对金黄色葡萄球菌的MIC90＝200μg/mL。
如图6(b)所示，吉拉尔特试剂T在12.5～1600μg/mL剂量范围内对金黄色葡萄球菌的抑制率随剂量增加呈现上升趋势，在1600～5000μg/mL剂量范围内对金黄色葡萄球菌的抑制率＞90％，经计算，得出吉拉尔特试剂T对金黄色葡萄球菌的MIC90＝1600μg/mL。
综上所述，可以看出吉拉尔特试剂T碳点在抗大肠杆菌和抗金黄色葡萄球菌时的MIC90均显著高于吉拉尔特试剂T，并且吉拉尔特试剂T碳点具有明显的剂量依赖的抗菌活性。
(4)吉拉尔特试剂T碳点(GRT-CDs)的时间杀菌曲线分析：
①使用含菌量为1.5×105CFU/mL的大肠杆菌悬浮液将吉拉尔特试剂T碳点溶液稀释至400μg/mL、200μg/mL、100μg/mL，同时设立一个细菌正常生长的空白对照组，各组均放于200rpm，37℃的摇床中培养；分别在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24h取样并测定OD600，以时间为横坐标，OD600为纵坐标进行绘制不同浓度的吉拉尔特试剂T碳点对大肠杆菌的细菌生长曲线。
如图7(a)所示，对照组的大肠杆菌数量在0～4h内缓慢增长，4～8h内呈对数增长，然后在8～20h趋于平稳，进入缓慢增长阶段；在100μg/mL吉拉尔特试剂T碳点溶液组中，对数增长期的大肠杆菌存活率明显降低，细菌增殖受到抑制；在200μg/mL吉拉尔特试剂T碳点溶液组，大肠杆菌在8h内几乎没有增殖，直到8h才开始新一轮的小幅度对数增殖；在400μg/mL吉拉尔特试剂T碳点溶液组，从0～24h期间没有观察到明显的大肠杆菌增殖。
②使用含菌量为1.5×105CFU/mL的金黄色葡萄球菌悬浮液将吉拉尔特试剂T碳点溶液稀释至400μg/mL、200μg/mL、100μg/mL，同时设立一个细菌正常生长的空白对照组，各组均放于200rpm，37℃的摇床中培养；分别在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24h取样并测定OD600，以时间为横坐标，OD600为纵坐标进行绘制不同浓度的吉拉尔特试剂T碳点对金黄色葡萄球菌的细菌生长曲线。
如图7(b)所示，对照组的金黄色葡萄球菌数量在0～4h无明显增长，4～12h进入对数生长期，在12～24h期间达到平台期；100μg/mL吉拉尔特试剂T碳点溶液组中，金黄色葡萄球菌的对数生长期延迟至6～16h，平台期达到的金黄色葡萄球菌数量几乎与对照组持平；在200μg/mL吉拉尔特试剂T碳点溶液组，金黄色葡萄球菌的对数生长期延迟至14～16h，并且细菌量明显低于正常组；在400μg/mL吉拉尔特试剂T碳点溶液组，从0～24h期间没有观察到明显的金黄色葡萄球菌增殖。
(5)细菌荧光染色：
为了正常生长和经吉拉尔特试剂T碳点处理后的细菌活力的变化，使用用CalceinAM和碘化丙啶(PI)双染试剂盒，对细菌进行荧光染色，染色后，在490nm的激发下可以观察到活的细菌(黄绿色的荧光)，在545nm的激发下可以通过荧光显微镜观察到死的细菌(红色的荧光)。
①将大肠杆菌培养到对数生长阶段，取10mL菌液，分为两组，分别为实验组和对照组，每组5mL。实验组中加入吉拉尔特试剂T碳点溶液至终浓度为5mg/mL，对照组中加入双蒸水，均在37℃下培养4h。分别从两组中吸出5mL大肠杆菌悬浮液，然后在5000rpm下离心2min，收集下层沉淀的大肠杆菌；用1×Assay Buffer充分洗涤大肠杆菌3次，并稀释含菌量为1.5×108CFU/mL的大肠杆菌悬浮液；将100μL染色液加入200μL大肠杆菌悬浮液中，混合均匀，37℃下孵育20min；染色完成后，将少量的大肠杆菌悬浮液涂抹至载玻片上；于490nm或545nm波长的激发下，观察并记录被染色大肠杆菌的荧光图像，对照组大肠杆菌荧光显微镜图像如图8(a)所示，呈黄绿色，细菌存活，实验组大肠杆菌荧光显微镜图像如图8(b)所示，呈红色，细菌死亡。
②将金黄色葡萄球菌培养到对数生长阶段，取10mL菌液，分为两组，分别为实验组和对照组，每组5mL。实验组中加入吉拉尔特试剂T碳点溶液至终浓度为5mg/mL，对照组中加入双蒸水，均在37℃下培养4h。分别从两组中吸出5mL金黄色葡萄球菌悬浮液，然后在5000rpm下离心2min，收集下层沉淀的金黄色葡萄球菌；用1×Assay Buffer充分洗涤大肠杆菌3次，并稀释含菌量为1.5×108CFU/mL的金黄色葡萄球菌悬浮液；将100μL染色液加入200μL金黄色葡萄球菌悬浮液中，混合均匀，37℃下孵育20min；染色完成后，将少量的金黄色葡萄球菌悬浮液涂抹至载玻片上；于490nm或545nm波长的激发下，对照组金黄色葡萄球菌荧光显微镜图像如图8(c)所示，呈黄绿色，细菌存活，实验组金黄色葡萄球菌荧光显微镜图像如图8(d)所示，呈红色，细菌死亡。
从图8(b)和图8(d)，可以看出，用吉拉尔特试剂T碳点溶液培养的细菌显示红色荧光，表明几乎所有经吉拉尔特试剂T碳点溶液处理的细菌都死亡，进一步证实吉拉尔特试剂T碳点的强效杀菌作用。
(6)吉拉尔特试剂T碳点(GRT-CDs)的抗菌机制分析：
①为了探索GRT-CDs的抗菌机制，用SEM观察与吉拉尔特试剂T碳点共培养前后的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的外观。如图9(a)所示，未经吉拉尔特试剂T碳点处理的大肠杆菌显示出规则的、形态完整的杆状结构，如图9(c)所示，未经吉拉尔特试剂T碳点处理的金黄色葡萄球菌显示出典型的球形形状，表面光滑。如图9(b)图9(d)所示，可以看出，经5mg/mL吉拉尔特试剂T碳点处理4h后，两种细菌的形态都发生了明显的变化，细菌形态的破坏、细菌壁的起皱和内容物的溢出。大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在经吉拉尔特试剂T碳点处理后的形态变化意味着吉拉尔特试剂T碳点粘附在细菌表面，破坏细菌生理结构，导致细菌丧失正常生理功能致死。
②将大肠杆菌被培养到对数生长阶段，取10mL菌液，分为两组，分别为实验组和对照组，每组5mL。实验组中加入吉拉尔特试剂T碳点溶液至终浓度为5mg/mL，对照组中加入双蒸水，均在37℃下培养4h；从每组吸出5mL细菌悬浮液，8000rpm下离心5min，收集下层沉淀的细菌并用0.2mol/L pH＝7.4的PBS缓冲液清洗3次；再往沉淀中加入3mL 2.5％的戊二醛，并于4℃冰箱中固定4h后用0.2mol/L pH＝7.4的PBS缓冲液清洗3次；再依次用30％、50％、70％、80％和90％浓度的乙醇水溶液对细菌进行梯度脱水，每次约15min；再在无水乙醇中脱水2次，每次15min，收集的细菌沉淀物在37℃真空下干燥24h；通过扫描电镜(SEM)观察形态，并测定每组的Zeta电位。
③将金黄色葡萄球菌到对数生长阶段，取10mL菌液，分为两组，分别为实验组和对照组，每组5mL。实验组中加入吉拉尔特试剂T碳点溶液至终浓度为5mg/mL，对照组中加入双蒸水，均在37℃下培养4h；从每组吸出5mL细菌悬浮液，8000rpm下离心5min，收集下层沉淀的细菌并用0.2mol/L pH＝7.4的PBS缓冲液清洗3次；再往沉淀中加入3mL 2.5％的戊二醛，并于4℃冰箱中固定4h后用0.2mol/L pH＝7.4的PBS缓冲液清洗3次；再依次用30％、50％、70％、80％和90％浓度的乙醇水溶液对细菌进行梯度脱水，每次约15min；再在无水乙醇中脱水2次，每次15min，收集的细菌沉淀物在37℃真空下干燥24h；通过扫描电镜(SEM)观察形态，并测定每组的Zeta电位。
如图10(a)和图10(b)所示，吉拉尔特试剂T碳点具有弱的正电荷(0.449±0.0149mV)，而大肠杆菌(-24.4667±0.0577mV)和金黄色葡萄球菌(-23.5±0.1732mV)都具有强的负表面电荷，用吉拉尔特试剂T碳点处理后，大肠杆菌的Zeta电位被中和至(-19±0.6245mV)，金黄色葡萄球菌的Zeta电位被中和至(-20.2333±0.4163mV)。这些结果表明吉拉尔特试剂T碳点吸附在细菌表面并形成复合体。
实施例5
吉拉尔特试剂T碳点(GRT-CDs)的抗生物膜性能：
(1)吉拉尔特试剂T碳点(GRT-CDs)抑制细菌生物膜形成能力：
细菌形成的生物膜是导致耐药性的重要原因之一，为了吉拉尔特试剂T碳点确定对耐药菌的抑制作用，以公式：形成抑制率(％)＝(1-实验孔的OD570/对照孔的OD570)×100％计算吉拉尔特试剂T碳点分别对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细菌生物膜形成抑制率，分析吉拉尔特试剂T碳点的抗生物膜活性能力。
①用双蒸水配制浓度为800、400、200、100和50μg/mL的吉拉尔特试剂T碳点溶液使用；
在96孔板的每孔中加入100μL用TSB肉汤将过夜培养稀释至含菌量为1.5×105CFU/mL的大肠杆菌悬浮液，再向每孔加入100μL含有上述浓度吉拉尔特试剂T碳点的新鲜TSB培养基，在37℃恒温培养箱中静态培养96h后，弃去孔中液体，用0.2mol/L pH＝7.4的PBS缓冲液清洗每个孔，重复3次，以去除游离细菌。
将获得的细菌生物膜用200μL甲醇固定15min，然后加入100μL 1.0wt％的结晶紫溶液染色5min，用0.2mol/L pH＝7.4的PBS缓冲液清洗以去除未结合的染料，再加入200μL33.3％的乙酸溶液处理30min，以溶解生物膜，用多功能酶标仪测量每个孔的OD570。
如图11(a)所示，可以看出，随着吉拉尔特试剂T碳点浓度的增加，细菌生物膜的生物量逐渐减少，结晶紫颜色强度的下降所示，50～400μg/mL的吉拉尔特试剂T碳点对大肠杆菌生物膜的形成的抑制率随着浓度的增加而变大，400～800μg/mL的吉拉尔特试剂T碳点对大肠杆菌生物膜的形成的抑制率＞90％；吉拉尔特试剂T碳点对大肠杆菌成熟生物膜的清除效果不佳，没有明显的剂量依赖性。
②用双蒸水配制浓度为800、400、200、100和50μg/mL的吉拉尔特试剂T碳点溶液使用；
在96孔板的每孔中加入100μL用TSB肉汤将过夜培养稀释至含菌量为1.5×105CFU/mL的金黄色葡萄球菌悬浮液，再向每孔加入100μL含有上述浓度吉拉尔特试剂T碳点的新鲜TSB培养基，在37℃恒温培养箱中静态培养96h后，弃去孔中液体，用0.2mol/L pH＝7.4的PBS缓冲液清洗每个孔，重复3次，以去除游离细菌。
将获得的细菌生物膜用200μL甲醇固定15min，然后加入100μL 1.0wt％的结晶紫溶液染色5min，用0.2mol/L pH＝7.4的PBS缓冲液清洗以去除未结合的染料，再加入200μL33.3％的乙酸溶液处理30min，以溶解生物膜，用多功能酶标仪测量每个孔的OD570。
如图11(b)所示，可以看出，随着吉拉尔特试剂T碳点浓度的增加，细菌生物膜的生物量逐渐减少，结晶紫颜色强度的下降所示，50～400μg/mL的吉拉尔特试剂T碳点对金黄色葡萄球菌生物膜的形成的抑制率随着浓度的增加而变大，400～800μg/mL的吉拉尔特试剂T碳点对金黄色葡萄球菌生物膜的形成的抑制率＞90％，即使在低浓度下，吉拉尔特试剂T碳点对金黄色葡萄球菌的成熟生物膜也有良好的清除作用。
实施例6
吉拉尔特试剂T碳点(GRT-CDs)的细胞相容性：
MTS法分析吉拉尔特试剂T碳点的细胞相容性，即人真皮成纤维细胞-成人(HDFa)的细胞生存能力：用10％的胎牛血清(DMEM)的培养液配制成HDFa细胞悬液，接种到96孔板中，每孔约5000个细胞，每孔体积为100μL，提前24h接种和培养细胞；将HDFa细胞分别与400、200、100、50和25μg/mL的吉拉尔特试剂T碳点溶液混合，在96孔细胞培养板上进行测试，设置三个重复孔和一个不含测试物的空白对照；整个体系在37℃培养48h后，弃去孔中的培养液，每孔加入20μL MTS溶液和100μL培养液；设置三个空白重复孔(20μL MTS溶液和100μL培养液的混合物)，继续培养2～4h，使反应充分进行，最后用多功能酶标仪测定每个孔的OD490，以公式：细胞存活率(％)＝实验孔的OD490/空白孔的OD490×100％计算各浓度对应的细胞存活率。
如图12所示，吉拉尔特试剂T碳点在100～400μg/mL的浓度范围内对HDFa并无明显细胞毒性，而且在25～50μg/mL的浓度范围内反而促进了HDFa的增殖。合理推测大剂量的吉拉尔特试剂T碳点可以发挥抗菌作用，治疗细菌感染的皮肤伤口而不损伤皮肤细胞，随着吉拉尔特试剂T碳点的消耗，低剂量吉拉尔特试剂T碳点可以促进皮肤细胞的增殖，有助于伤口的愈合。
吉拉尔特试剂T碳点的合成和抗菌过程如图1所示，综上所述，吉拉尔特试剂T碳点对细胞毒性低，细胞相容性好，甚至在低浓度下还能促进细胞增殖，由于其优秀的抗菌性能、良好的细胞相容性、对耐药菌的抑制作用以及其抗生物膜的特性使该吉拉尔特试剂T碳点具有良好的抗菌应用前景，特别是对伤口的细菌感染具有良好的应用前景。
以上所述，只是本发明的较佳实施例而已，本发明并不局限于上述实施方式，只要其以相同的手段达到本发明的技术效果，都应属于本发明的保护范围。在本发明的保护范围内其技术方案和实施方式可以有各种不同的修改和变化。

Claims (6)

1.一种吉拉尔特试剂T抗菌碳点，其特征在于，由吉拉尔特试剂T溶解在双蒸水中，在180℃下反应12h，然后冷却至室温后离心，保留上层液体过滤后获得。
2.根据权利要求1所述的一种吉拉尔特试剂T抗菌碳点，其特征在于，所述吉拉尔特试剂T和双蒸水的比例是5~10mg：1mL。
3.根据权利要求1所述的一种吉拉尔特试剂T抗菌碳点，其特征在于，制备方法包括以下步骤：将吉拉尔特试剂T溶解在双蒸水中，转移至反应釜内，在温度为180℃下反应12h，冷却到室温后，离心，保留上层液体并用滤膜过滤，最后将过滤后的上层液体冷冻干燥，获得吉拉尔特试剂T碳点，其中，所述吉拉尔特试剂T和双蒸水的比例是10mg：1mL。
4.根据权利要求3所述的一种吉拉尔特试剂T抗菌碳点，其特征在于，所述反应釜为PTFE 内衬反应釜。
5.根据权利要求3所述的一种吉拉尔特试剂T抗菌碳点，其特征在于，离心条件为：10000rpm 离心10min。
6.根据权利要求3所述的一种吉拉尔特试剂T抗菌碳点，其特征在于，所述滤膜的规格为0.22μm。
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