CN108690199B - 一种嵌段共聚物纳米复合抗菌材料及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种嵌段共聚物纳米复合抗菌材料及其制备方法与应用。本发明利用2个异氰酸根的活性不同的偶联剂，通过3‑羟基丁酸和3‑羟基戊酸共聚酯(PHBV)与聚乙二醇(PEG)合成PEG‑PHBV‑PEG两亲三嵌段共聚物，以此为基材与纳米抗菌剂自组装得到本发明的嵌段共聚物纳米复合抗菌材料，该方法实现了嵌段共聚物的可控合成与抗菌性能的调控；所得到的嵌段共聚物的数均分子量介于0.35～1.3万，分子量分布相对较窄。本发明的嵌段共聚物纳米复合抗菌材料呈抑菌、抗菌双重功能，抑菌效果及杀菌效果得到了显著的提高，胶束包裹的纳米抗菌剂分散均匀，在水相中稳定，细胞相容性良好，具有广泛的应用前景。

Description

一种嵌段共聚物纳米复合抗菌材料及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于高分子材料及高分子基复合材料技术领域，特别涉及一种嵌段共聚物纳米复合抗菌材料及其制备方法与应用。
背景技术
随着生物材料使用领域不断拓展，生物材料相关感染的发病率逐年增高，已成为现代医学的一个主要问题。高发的感染会导致人体组织破坏、患者残疾、甚至死亡。传统抗生素治疗常因感染处浓度低而失败，而生物材料表面细菌生物膜及细菌多药耐药性的出现更降低抗生素的功效。浮游细菌数分钟可附着于表面，与材料发生特异反应，使可逆附着发展为不可逆粘附，而材料表面的亲疏水性、电荷及形貌等结构因素影响细菌粘附。聚乙二醇修饰的抑菌表面，降低非特异性蛋白的吸附，利于阻止细菌的早期粘附，但不能主动进攻杀死细菌，最终会因表面缺陷或生物质污染而失效。使用银、氧化锌、氧化石墨烯等纳米杀菌剂，通过改变抗菌剂的表面官能团、形状、尺寸分布等因素，抑制聚集阶段细菌的蛋白及核酸合成、破坏细胞膜甾醇、抑制细胞壁合成或影响新陈代谢，但粘附细菌尸体及碎片往往造成抗菌剂失效。
抑菌-杀菌双功能纳米材料的复合是开发抗菌生物材料的重要途径之一。抑菌或抗菌活性组分间通过物理或化学的方式进行复合，是制备复合材料的常用方法。其中，自组装法以纳米抗菌剂为模板，自发形成不同形貌的有序结构，为实现抑菌/抗菌功能区块化设计提供了一种有效的方法。两亲嵌段共聚物的疏水作用是形成有序自组装体的源动力之一，而嵌段共聚物在纳米材料表面的自组装行为受两亲嵌段共聚物的结构影响。因此，两亲嵌段共聚物的可控合成是实现抑菌-杀菌双功能纳米复合材料的关键。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，为了解决现有技术中抗菌材料功能单一、嵌段共聚物无法可控合成等技术问题，提供一种嵌段共聚物纳米复合抗菌材料的制备方法。3-羟基丁酸和3-羟基戊酸共聚酯(PHBV)的强疏水性、易脆及生物惰性等缺点限制了其在生物医学领域的应用，本发明选用生物相容聚乙二醇(PEG)为亲水段，合成PEG-PHBV-PEG两亲三嵌段共聚物，以此为基材复合纳米抗菌剂，制备了抑菌-杀菌双功能抗菌材料。
本发明的另一目的在于提供通过所述的制备方法制得的嵌段共聚物纳米复合抗菌材料。该嵌段共聚物纳米复合抗菌材料为胶束结构复合纳米材料，其嵌段共聚物的疏水链在纳米抗菌剂表面自组装，亲水链突出表面，使得纳米抗菌剂可均匀分散，且具有抑菌/杀菌双功能，以及良好的生物相容和抗菌协同效果。
本发明的又一目的在于提供所述的嵌段共聚物纳米复合抗菌材料的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种嵌段共聚物纳米复合抗菌材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)在惰性气氛下，PHBV溶液与二醇单体在催化剂作用下发生酯交换反应，纯化后得到双羟基封端PHBV(PHBV-diol)；
(2)在惰性气氛下，在有机溶剂中将步骤(1)制得的双羟基封端PHBV与二异氰酸酯在催化剂作用下反应，纯化后得到异氰酸酯封端PHBV(PHBV-2NCO)；
(3)在惰性气氛下，在有机溶剂中将步骤(2)制得的异氰酸酯封端PHBV与聚乙二醇在催化剂作用下反应，纯化后得到PEG-PHBV-PEG嵌段共聚物；
(4)溶解步骤(3)制得的PEG-PHBV-PEG嵌段共聚物，再与纳米抗菌剂混合，室温静置后干燥，即得所述的嵌段共聚物纳米复合抗菌材料；
所述的二异氰酸酯为两个异氰酸根的活性不同的二异氰酸酯。
步骤(1)中所述的PHBV优选为数均分子量为1.85×105的PHBV。
步骤(1)中所述的惰性气氛优选为氮气、氩气中的至少一种。
步骤(1)中所述的PHBV溶液的溶剂优选为二甘醇二甲醚；进一步优选为浓度为0.06～0.1g/mL的二甘醇二甲醚。PHBV溶解于所述的二甘醇二甲醚时的温度优选为135～140℃。
步骤(1)中所述的二醇单体优选为乙二醇和丁二醇中的至少一种；所述的二醇单体与PHBV的配比优选为每克PHBV配比1.5～3.5mL二醇单体。
步骤(1)中所述的催化剂优选为二月桂酸二丁基锡；所述的催化剂与PHBV优选按质量比(0.03～0.06):1配比。
所述的催化剂优选为先按每克PHBV配比0.01g催化剂加入，每隔1h按相同配比再次加入催化剂；所述的加入的方式优选为滴加。
步骤(1)中所述的酯交换反应的反应时间可根据PHBV-diol的分子量调整，优选为3～40h；进一步优选为7.5～40h；更优选为7.5～9h。
步骤(1)中所述的纯化的具体操作优选为：用冷乙醇或冷甲醇沉降，反复3～10次，然后依次采用丙酮、水洗。
步骤(2)中所述的有机溶剂优选为无水1,2-二氯乙烷；所述的有机溶剂的用量优选按每0.1mmol双羟基封端PHBV配比10～15mL计算。
步骤(2)中所述的双羟基封端PHBV优选为重均分子量Mw为1500～6000，数均分子量Mn为1300～4200的双羟基封端PHBV。
步骤(2)的反应优选在75℃下进行；反应的时间优选为3～5h。
步骤(2)中所述的二异氰酸酯优选为异佛尔酮二异氰酸酯(IPDI)；所述的二异氰酸酯与双羟基封端PHBV优选按摩尔比(2～2.6):1进行配比。
步骤(2)中所述的催化剂优选为二月桂酸二丁基锡、辛酸亚锡中的至少一种；所述的催化剂与双羟基封端PHBV的质量比为(0.05～0.1):1。
步骤(2)中所述的纯化的操作优选为：正己烷或甲醇与乙醚或石油醚组成的混合液沉降，反复洗涤3～10次；所述的正己烷或甲醇与乙醚或石油醚的配比优选为体积比1:1。
步骤(3)中所述的PEG-PHBV-PEG嵌段共聚物的数均分子量介于0.35～1.3万，重均分子量介于0.95～2.5万；分子量多分散系数<2.5；进一步优选为数均分子量介于0.39～1.3万，重均分子量介于0.97～2.2万。
步骤(3)中所述的有机溶剂优选为无水1,2-二氯乙烷；所述的有机溶剂的用量优选按每0.1mmol异氰酸酯封端PHBV配比5～15mL计算。
步骤(3)的反应优选在75℃下进行；反应的时间优选为3～8h。
步骤(3)中的所述的聚乙二醇优选为重均分子量Mw为1000～4000的聚乙二醇；所述的聚乙二醇与异氰酸酯封端PHBV优选按摩尔比(2～5):1配比。
步骤(3)中所述的催化剂优选为二月桂酸二丁基锡；所述的催化剂与双羟基封端PHBV的摩尔比为(0.04～0.08):1。
步骤(3)中所述的纯化方式的具体操作为：正己烷或甲醇与乙醚或石油醚组成的混合液沉降，反复洗涤3～10次；所述的正己烷或甲醇与乙醚或石油醚的配比优选为体积比1:1。
步骤(4)中所述的纳米抗菌剂优选为ZnO、Ag-ZnO和氧化石墨烯(GO)中的至少一种；所述的纳米抗菌剂的添加量优选按质量百分数5％～15％添加。
步骤(4)中所述的溶解的溶剂优选为CHCl3和CH2Cl2中的至少一种。
步骤(4)中所述的纳米抗菌剂优选先分散于溶剂中，再加入到PEG-PHBV-PEG嵌段共聚物溶液中进行混合。
所述的分散优选为超声分散。
所述的混合方式优选为先进行搅拌，再进行超声分散。
步骤(4)中所述的室温静置的时间优选为8～12h。
步骤(4)中所述的干燥优选为真空干燥，进一步优选为40℃真空干燥24h。
所述的嵌段共聚物纳米复合抗菌材料在制备抗菌材料中的应用，可将所述的嵌段共聚物纳米复合抗菌材料加入到抗菌材料实现抗菌抑菌的双重效果。
所述的抗菌材料可包括生物医药、食品包装领域等中的抗菌材料。
所述的应用优选为在制备药物载体或医用材料中应用。
所述的嵌段共聚物纳米复合抗菌材料的浓度优选为50μg/mL以下；进一步优选为10～50μg/mL。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1.实现了嵌段共聚物的可控合成
本发明采用2个异氰酸根的活性不同的IPDI作为偶联剂，使PHBV-diol发生双端基官能团化几率增大，减少PHBV-diol间的反应。产物的数均分子量介于0.35～1.3万，重均分子量介于0.95～2.5万，分子量分布相对较窄。通过改变PHBV-diol和PEG的链长实现嵌段共聚物的可控合成。
2.制备得到抑菌/抗菌双功能抗菌材料
本发明制备了抑菌/抗菌复合纳米材料，嵌段共聚物疏水段以疏水作用与纳米抗菌剂组装。本发明的抗菌材料具备可调控的抑菌/杀菌功效，能克服目前单功能的抑菌材料或杀菌材料抗菌效果不稳定的缺陷。表面亲水链的引入，不仅改善纳米抗菌剂的分散效果，还可以提高其在水相中的稳定性；同时，所述的复合纳米材料也可在体内环境中释放抗菌剂，从而消除感染，达到治疗的目的；50μg/mL浓度以下的纳米复合材料对细胞活性无显著影响，具有良好的细胞相容性。
3.实现了抗菌性能可调控
本发明可控制亲水和疏水段长度，制备不同亲疏水链长的嵌段共聚物，与纳米抗菌剂自组装，形成了PEG亲水链分布在胶束外侧，PHBV疏水片段组装形成胶束内核，胶束中包裹了纳米抗菌剂的纳米颗粒。本发明的嵌段共聚物可以通过控制PEG链的长度，实现对分布在胶束外侧的亲水链的抑菌范围及效果的调控。同时，由于本发明的嵌段共聚物与纳米抗菌剂通过自组装方式构建形成复合抗菌材料，该嵌段共聚物对包裹其中的纳米抗菌剂有较大的灵活性与包容性，可适应不同的纳米抗菌剂，应用范围广泛。50μg/mL纳米复合材料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有良好的抗菌效果。加入纳米抗菌剂比单纯嵌段共聚物胶束的抑菌效果提高50％，且长亲水链的纳米复合材料的抑菌效果提高40％；纳米复合抗菌材料的杀菌率高于50％，而含银复合纳米抗菌材料的杀菌率更是均高于90％。
附图说明
图1是PHBV(a),PHBV-diol(b),PHBV-2NCO(c)和PEG-PHBV-PEG(d)的红外光谱图。
图2是PHBV(A),PHBV-diol(B),PHBV-2NCO(C)和PEG-PHBV-PEG(D)的1H核磁波谱图。
图3是S1,S2和S3嵌段共聚物的X射线衍射谱图。
图4是S1(a)和S1-10％Ag-ZnO(b)胶束的扫描电镜图。
图5是S4和不同含量Ag-ZnO和ZnO复合材料的热失重曲线及其微分曲线图；其中，(a)S4；(b)S4-10％Ag-ZnO；(c)S4-5％Ag-ZnO；(d)S4-10％ZnO；(e)S4-5％ZnO。
图6是S1(1)和S4(6)及其纳米复合材料对大肠杆菌(a,b)和金黄色葡萄球菌(c,d)的抑制效果照片图，其中，(2)S1-10％Ag-ZnO；(3)S1-5％Ag-ZnO；(4)S1-10％ZnO；(5)S1-5％ZnO；(7)S4-10％Ag-ZnO；(8)S4-5％Ag-ZnO；(9)S4-10％ZnO；(10)
S4-5％ZnO。
图7是50μg/L纳米复合材料处理大肠杆菌和金黄色葡萄球菌24h时的杀菌率结果分析图。
图8是纳米复合材料与E.coli孵育后死/活染色激光共聚焦显微图(上，活细菌；中，死细菌；下，叠加)。
图9是纳米复合材料与S.aureus孵育后死/活染色激光共聚焦显微图(上，活细菌；中，死细菌；下，叠加)。
图10是ATDC5细胞与纳米复合抗菌材料共培养时死/活染色显微图。
图11是ATDC5细胞与50μg/mL纳米复合抗菌材料共培养时的细胞增殖结果分析图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
2g PHBV(数均分子量1.85×105)溶于20mL二甘醇二甲醚，升温至140℃，N2保护，加4mL乙二醇，搅拌5min，加0.02g二月桂酸二丁基锡，搅拌5min，滴加0.08g二月桂酸二丁基锡，反应7.5h，冷乙醇沉降，反复6次，真空抽滤，真空干燥24h，得PHBV-diol。取0.0001molPHBV-diol，溶于15mL无水1,2-二氯乙烷，N2保护，升温至75℃，加0.0002mol IPDI，搅拌5min，加0.02g二月桂酸二丁基锡，搅拌3h，冷却至室温，加正己烷和乙醚混合液(正己烷和乙醚的体积比为1:1)沉降，反复洗涤3次，过滤，40℃真空干燥12h，得PHBV-2NCO。将0.0001mol PHBV-2NCO溶于15mL无水1,2-二氯乙烷，N2保护，分别加0.0002、0.0003和0.0004mol PEG(重均分子量2000)，升温至75℃，加1wt％二月桂酸二丁基锡，搅拌反应3h，冷却至室温，加正己烷和乙醚体积比为1:1的混合液沉降，反复洗涤3次，过滤，60℃真空干燥12h，产物标记为S1、S2和S3。
实施例2
2g PHBV(数均分子量1.85×105)溶于20mL二甘醇二甲醚，升温至140℃，N2保护，加4mL乙二醇，搅拌5min，加0.02g二月桂酸二丁基锡，搅拌5min，加0.10g二月桂酸二丁基锡，反应9h，冷甲醇沉降，反复3次，真空抽滤，真空干燥24h。取0.0001mol产物溶于10mL无水1,2-二氯乙烷，N2保护，升温至75℃，加0.0002mol IPDI，搅拌5min，加0.02g二月桂酸二丁基锡，搅拌5h，冷却至室温，加正己烷和石油醚混合液(正己烷和石油醚的体积比为1:1)沉降，反复洗涤6次，过滤，40℃真空干燥12h，得PHBV-2NCO。将0.0001mol PHBV-2NCO溶于10mL无水1,2-二氯乙烷，N2保护，分别加0.0002mol PEG(重均分子量1000)，升温至75℃，加1wt％二月桂酸二丁基锡，搅拌反应3h，冷却至室温，加正己烷和石油醚混合液(正己烷和石油醚体积比1:1)沉降，反复洗涤6次，过滤，60℃真空干燥12h，产物标记为S4。
实施例3
2g PHBV(数均分子量1.85×105)溶于10mL二甘醇二甲醚，升温至140℃，N2保护，加3mL丁二醇，搅拌5min，加0.02g二月桂酸二丁基锡，搅拌5min，滴加0.08g二月桂酸二丁基锡，反应7.5h，冷乙醇沉降，反复6次，丙酮、水洗，真空抽滤，真空干燥24h，得PHBV-diol。取0.0001mol PHBV-diol，溶于15mL无水1,2-二氯乙烷，N2保护，升温至75℃，加0.00026molIPDI，搅拌5min，加0.01g辛酸亚锡，搅拌3h，冷却至室温，加正己烷和石油醚混合液(正己烷和石油醚体积比1:1)沉降，反复洗涤6次，过滤，40℃真空干燥12h，得PHBV-2NCO。将0.0001mol PHBV-2NCO溶于15mL无水1,2-二氯乙烷，N2保护，分别加0.0002mol PEG(重均分子量2000)，升温至75℃，加1wt％二月桂酸二丁基锡，搅拌反应3h，冷却至室温，加正己烷和石油醚混合液(正己烷和石油醚体积比1:1)沉降，反复洗涤6次，过滤，60℃真空干燥12h，产物标记为S5。
实施例4
7.425g Zn(NO3)2·H2O溶于50mL去离子水，滴加0.4mol/L NaOH，调pH达8～9，室温搅拌6h，去离子水洗，抽滤，60℃干燥24h，得ZnO纳米颗粒。
取0.02g实施例1中S1和实施例2中S4，分别溶于10mL CHCl3，超声1h；将5％或10％质量比的ZnO分散于5mL CHCl3，超声4h，转移至S1和S4溶液，磁力搅拌12h，超声2h，室温静置8h，40℃真空干燥24h，产物分别标记为S1-ZnO复合材料(S1-5％ZnO、S1-10％ZnO)及S4-ZnO复合材料(S4-5％ZnO、S4-10％ZnO)。
实施例5
取0.25g实施例4制得的ZnO，加497.5mL去离子水，超声10min，加5mL50mM AgNO3，超声分散，调pH至8，80℃搅拌5h，冷却至室温，去离子水和乙醇洗涤，60℃干燥48h，得Ag-ZnO纳米颗粒(Ag的质量分数约为3.39％)。
取0.02g实施例1中S1和实施例2中S4，分别溶于10mL CHCl3，超声1h；将5％或10％质量比的Ag-ZnO分散于5mL CHCl3，超声4h，转移至S1和S4溶液，磁力搅拌12h，超声2h，室温静置8h，40℃真空干燥24h，产物分别标记为S1-Ag-ZnO复合材料(S1-5％Ag-ZnO、S1-10％Ag-ZnO)及S4-Ag-ZnO复合材料(S4-5％Ag-ZnO、S4-10％Ag-ZnO)。
实施例6
取0.02g实施例1中S1，溶于10mL CHCl3，超声1h；将5％质量比的GO分散于5mLCHCl3，超声4h，转移至S1溶液，磁力搅拌12h，超声2h，室温静置8h，40℃真空干燥24h，产物标记为S1-GO复合材料。
实施例7嵌段共聚物化学结构分析
取实施例1中的PEG-PHBV-PEG嵌段共聚物样品S1、原料PHBV及中间产物PHBV-diol、PHBV-2NCO，采用傅里叶变换红外光谱仪进行分析(图1)。PHBV在2983.7和2936.9cm-1出现甲基的反对称和对称伸缩振动峰，2882.0cm-1亚甲基的伸缩振动峰，1728.2cm-1酯基中羰基伸缩振动峰。PHBV-diol在3436.8cm-1附近出现宽峰谱带，为端羟基伸缩振动的缔合峰，说明PHBV分子链引入了端羟基。PHBV-2NCO在2269.3cm-1处出现-NCO伸缩振动峰，1642.7cm-1和1529.9cm-1酰胺Ⅰ带的羰基伸缩振动峰和酰胺Ⅱ带的N-H弯曲振动峰。嵌段共聚物的红外光谱无-NCO伸缩振动吸收峰，而在948.1cm-1处出现PEG结晶相特征吸收峰，在3441.0cm-1处出现羟基特征吸收峰。
实施例8嵌段共聚物化学结构分析
取实施例3中的PEG-PHBV-PEG嵌段共聚物样品S5、原料PHBV及中间产物PHBV-diol、PHBV-2NCO，采用氢核磁共振波谱仪进行分析(图2)。PHBV在0.88ppm和1.508ppm处为PHBV中HV重复单元a(-CH3)和b(-CH2-)的特征峰，5.292ppm附近的多重裂分峰对应HB和HV重复单元中c及c'(≡CH)，2.529ppm和2.607ppm处特征峰对应HB、HV单元中d及d'(-CH2-)，1.153～1.298ppm附近弱多重峰是PHB中a(-CH3)的质子峰。PHBV-diol的典型峰出现在4.272ppm(-O-CH2-CH2-,f)、3.956ppm(-CH2-CH2-OH,g)，上述两特征峰在PHBV-2NCO的核磁图谱中消失，而在3.050ppm(i)出现顺式IPDI(ONC-CH2-)的质子吸收峰，0.940ppm(h,k)和1.090ppm(m)处出现IPDI中环己烷骨架上所连3个CH3的质子峰。嵌段共聚物的谱图同时含有PHBV中HB和HV单元及IPDI的特征峰，还在3.681ppm(j)处出现PEG单元的特征峰(-O-CH2-CH2-O-)。
实施例9嵌段共聚物分子量及结晶结构分析
取实施例1和实施例2中的样品S1、S2、S3和S4，采用凝胶渗透色谱仪测定分子量及分子量分布，结果如表1。其中，S1、S2和S3数均分子量介于1.0～1.3万，重均分子量1.6～2.2万，分子量多分散系数<2，分子量分布较窄。随PEG和PHBV-diol的投料比增加，嵌段共聚物的分子量变化不明显。采用X射线衍射仪测定样品在2θ介于10°～80°范围内的X射线衍射光谱，如图3所示。PEG能形成有序微晶区，随着PEG和PHBV-diol的投料比提高，PHBV相关衍射峰仍尖锐且峰强度高，而PEG的无序程度明显增加。
表1.S1～S3嵌段共聚物的分子量及分子量分布
Figure BDA0001671144530000091
实施例10嵌段共聚物及其复合材料胶束的形貌研究
取实施例1中的样品S1和实施例5中的样品S1-10％Ag-ZnO，溶于15mL氯仿，初始浓度0.25mg/mL，磁力搅拌30min；取15mL去离子水，滴加至聚合物溶液，磁力搅拌至氯仿挥发完毕，取样品滴加于5mm×5mm玻片，自然风干，喷金，采用扫描电对胶束样品的表面形貌进行分析(图4)。S1胶束呈近杆状，直径约为2μm，宽度约为1μm。胶束颜色外浅内深，表明共聚物聚集及介质分散的作用下使PHBV疏水片段组装形成胶束的内核，而PEG亲水链分布在胶束外侧。S1-10％Ag-ZnO胶束形状和大小不一，与S1的短杆状胶束不同。这可能是因为棒状Ag-ZnO NPs嵌入S1嵌段共聚物，改变了原有共聚物分子链间的分子间作用力，使共聚物沿纳米颗粒表面形成新的自组装结构。
实施例11嵌段共聚物及其复合材料的热性能分析
取实施例2中的样品S4，采用热重分析仪分析热性能，如图5所示。嵌段共聚物的降解分为两个明显的阶段：(1)265.8℃～295.2℃范围内发生共聚物中PHBV的降解，失重率为46.32％；(2)372.0℃～420.4℃发生PEG的热降解，失重率为26.61％；在800℃时，余重为7.49％。纳米复合材料的降解过程亦呈2个主失重阶段，即第一阶段PHBV段的热降解及第二阶段PEG段的热降解。在第一阶段，添加10％NPs的复合物材料在243.5～278.6℃间失重约34.8％，而添加5％NPs的复合物材料则于252.2～285.4℃间失重41.1～42.5％。随着纳米颗粒含量增加，起始且终止温度均明显降低，且失重明显减小，最大失重速率的峰值温度降低。在第二阶段，添加10％NPs的复合物材料在355.5～417.5℃间失重24.9～27.4％，添加5％NPs的复合物材料在353.7～418.4℃间失重24.6～25.4％。可见，添加纳米颗粒对PEG段热降解的影响不明显。温度在500℃以上时，复合材料的残余质量变化不明显。
实施例12抑菌效果实验
通过纳米复合材料对E.coli(ATCC8099，购自广东省微生物研究所)和S.aureus(ATCC6538，购自广东省微生物研究所)的抑制圈研究其抑菌性。取实施例1中S1、实施例2中S4、实施例3中样品S1-ZnO、S4-ZnO及实施例4中样品S1-Ag-ZnO、S4-Ag-ZnO复合材料，采用抑菌环实验测定抑菌性。取冻干的E.coli和S.aureus，加适量营养肉汤，轻吹数次分散菌种；取10mL营养肉汤，加少许菌种悬浮液，置于37℃恒温摇床中培养18～24h，至细菌细胞的生长对数期，收集，0.85％NaCl溶液洗涤，得108cfu/mL细菌悬液(OD600＝0.1～0.4)。取100μL细菌培养物，转移至固体琼脂平板，涂抹均匀。待细菌在琼脂培养基扩散后，将含10mg纳米复合材料的滤纸(d＝1.0cm)置于培养基平板上，37℃培养24h，测量抑菌圈直径，结果如表2和图6所示。S1、S4对E.coli和S.aureus具有一定的抑制作用，抑菌圈直径分别为14.27mm和12.83mm(E.coli)以及11.97mm和11.93mm(S.aureus)。S1对E.coli的抑菌环大于S4，而二者对S.aureus的抑菌环则差异不显著。S1-5％ZnO和S1-10％ZnO对E.coli的抑菌圈直径分别为13.37mm和14.20mm，与S1差别不显著。S1-5％Ag-ZnO和S1-10％Ag-ZnO对E.coli的抑菌圈直径分别为21.73mm和22.27mm，分别提高了52.28％和56.06％。与S4相比，S4-5％ZnO、S4-10％ZnO、S4-5％Ag-ZnO和S4-10％Ag-ZnO对E.coli的抑菌效果分别提高了4.68％、21.36％、28.84％和23.93％。
表2.嵌段共聚物及其纳米复合材料的抑菌环
Figure BDA0001671144530000111
实施例13杀菌效果研究
纳米复合材料对E.coli和S.aureus的杀菌性研究。取实施例1中S1、实施例2中S4、实施例3中样品S1-ZnO、S4-ZnO及实施例4中样品S1-Ag-ZnO、S4-Ag-ZnO复合材料，研究纳米复合材料的杀菌率。取100μL活化的细菌，置于10mL纳米复合材料的悬浮液，确保细菌浓度为105～106cfu/mL，37℃震荡24h。取1.0mL细菌悬液，按10倍制稀释细菌悬浮液；取1.0mL每种浓度梯度的细菌悬浮液，涂布3个琼脂营养平板，37℃培养24h，以生理盐水作对照组，计算抗菌率(图7)。50μg/L S1-10％Ag-ZnO，S1-5％Ag-ZnO，S4-10％Ag-ZnO，S4-5％Ag-ZnO和S1-10％ZnO，S1-5％ZnO，S4-10％ZnO，S4-5％ZnO处理的大肠杆菌杀菌率分别达到99.49％，91.05％，97.05％，92.66％，62.73％，81.02％，81.02％和81.93％；处理金黄色葡萄球菌的杀菌率分别达到99.97％，98.40％，98.00％，99.60％，93.22％，53.58％，81.44％和62.57％。相同纳米粒子负载量的条件下，负载Ag NPs的复合材料的杀菌性明显提高。50μg/L浓度负载Ag NPs的复合材料，对大肠杆菌的杀菌率超过91％，对金黄色葡萄球菌的杀菌率均在98％以上，已表现出较好的抗菌性能。
纳米复合材料与E.coli和S.aureus共孵育后，采用Live/Dead BacLight细菌活力试剂染色。将Syto 9和碘化丙啶分别溶于4mL生理盐水，各取1mL，混合，加2滴BacLight固定剂，得染色剂溶液。取9mL纳米复合材料悬浮液(50mg/L)，加1mL细菌悬液(1×108cfu/mL)，37℃振荡24h，加150μL染色剂溶液，37℃孵育15min，离心，生理盐水洗涤。采用激光共聚焦扫描显微镜，在488nm和561nm固态激光束下激发Syto 9和碘化丙啶，分别记录500～550nm(绿色，活细菌)和570～620nm(红色，死细菌)的信号，测定E.coli(图8)和S.aureus(图9)的活力，以未处理和乙醇处理的E.coli和S.aureus分别作为活细菌和死亡细菌的对照组。纳米复合材料与E.coli共孵育后，细菌大量死亡。其中，S1-10％Ag-ZnO的杀菌效果明显强于S1-10％ZnO和S4-10％ZnO，而S4-10％Ag-ZnO则小于或近似于后二者的杀菌效果。与S.aureus作用时，抗菌效果按材料种类S1-10％Ag-ZnO、S4-10％Ag-ZnO、S1-10％ZnO、S4-10％ZnO呈递降趋势，且前两者的抗菌效果明显优于后二者。
实施例14纳米复合材料对ATDC5细胞活性及增殖的影响
取实施例1中S1、实施例2中S4、实施例3中样品S1-ZnO、S4-ZnO及实施例4中样品S1-Ag-ZnO、S4-Ag-ZnO复合材料，采用细胞死活荧光染色试剂盒(货号A1016-01，购自天津卫凯生物工程有限公司)及CCK-8试剂盒(购自上海碧云天生物科技有限公司)，研究复合材料的细胞相容性。
选用ATDC5细胞(ATCC，USA)，以H-DMEN为基础培养基，加10％FBS及1％双抗(青霉素-链霉素混合溶液)，37℃、95％湿度及5％CO2培养箱中培养，待细胞融合率达80～90％，胰酶消化，离心，传代至P6。取样品20mg，加75％乙醇浸泡，震荡12h，离心，加PBS和适量培养基，配成1000μg/mL样品原液。ATDC5细胞以3000个/孔接种至24孔板培养6h，取Transwell小室置于孔板小孔，加10μg/mL及50μg/mL的纳米复合材料，在培养的第1和3天进行Live/Dead染色，先用预温PBS清洗细胞2次，每次5min，加染色液，PBS润洗3次，去除多余染料，倒置荧光显微镜下观察并成像，如图10所示。S1处理的细胞没有出现较明显的死亡现象，且S1浓度变化对ATDC5细胞活性的影响不显著，而随着培养时间延长，细胞迅速增殖，细胞数量快速增加。采用10μg/mLS1-10％Ag-ZnO与细胞共培养1d，ATDC5出现死亡；若采用同浓度S4-10％Ag-ZnO，死细胞数量相对增加。在浓度<50μg/mL时，两种纳米复合材料对细胞活性的影响较小，且随着培养时间的延长，与对照组的差异已不明显。
取ATDC5细胞(P6)，以3000个/孔接种至24孔板培养6h，取Transwell小室置于孔板小孔，加10μg/mL及50μg/mL的纳米复合材料；在培养第1、3和5天，吸出培养基，灭菌PBS清洗，每孔加300μL(CCK-8:培养基＝1:10)培养液，培养2h，每孔取100μL培养液至96孔板，进行酶标仪检测，记录450nm波长下的吸光值，以未加纳米复合材料的细胞为对照组。结果如图11所示，细胞与纳米复合材料共培养1～5d，细胞增殖活力随纳米复合材料浓度增加而明显降低。使用含Ag的纳米颗粒，细胞增殖活力降低较明显。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种嵌段共聚物纳米复合抗菌材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）在惰性气氛下，PHBV溶液与二醇单体在催化剂作用下发生酯交换反应，纯化后得到双羟基封端PHBV；
（2）在惰性气氛下，在有机溶剂中将步骤（1）制得的双羟基封端PHBV与二异氰酸酯在催化剂作用下反应，纯化后得到异氰酸酯封端PHBV；
（3）在惰性气氛下，在有机溶剂中将步骤（2）制得的异氰酸酯封端PHBV与聚乙二醇在催化剂作用下反应，纯化后得到PEG-PHBV-PEG嵌段共聚物；
（4）溶解步骤（3）制得的PEG-PHBV-PEG嵌段共聚物，再与纳米抗菌剂混合，室温静置后干燥，即得所述的嵌段共聚物纳米复合抗菌材料；
步骤（2）中所述的二异氰酸酯为两个异氰酸根的活性不同的二异氰酸酯。
2.根据权利要求1所述的嵌段共聚物纳米复合抗菌材料的制备方法，其特征在于：
步骤（2）中所述的二异氰酸酯为异佛尔酮二异氰酸酯；
所述的二异氰酸酯与双羟基封端PHBV按摩尔比(2～2.6):1进行配比。
3.根据权利要求2所述的嵌段共聚物纳米复合抗菌材料的制备方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的PHBV为数均分子量为1.85 × 105的PHBV；
步骤（2）中所述的双羟基封端PHBV为重均分子量为1500～6000，数均分子量为1300～4200的双羟基封端PHBV。
4.根据权利要求1或2所述的嵌段共聚物纳米复合抗菌材料的制备方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的二醇单体为乙二醇和丁二醇中的至少一种；
步骤（3）中所述的PEG-PHBV-PEG嵌段共聚物的数均分子量介于0.35～1.3万，重均分子量介于0.95～2.5万；分子量多分散系数<2.5；
步骤（4）中所述的纳米抗菌剂为ZnO、Ag-ZnO和氧化石墨烯中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的嵌段共聚物纳米复合抗菌材料的制备方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的催化剂为二月桂酸二丁基锡；
步骤（1）中所述的PHBV溶液的溶剂为二甘醇二甲醚；
步骤（2）中所述的催化剂为二月桂酸二丁基锡、辛酸亚锡中的至少一种；
步骤（2）中所述的有机溶剂为无水1,2-二氯乙烷；
步骤（3）中所述的聚乙二醇为重均分子量为1000～4000的聚乙二醇；
步骤（3）中所述的有机溶剂为无水1,2-二氯乙烷；
步骤（4）中所述的溶解的溶剂为CHCl3和CH2Cl2中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的嵌段共聚物纳米复合抗菌材料的制备方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的二醇单体与PHBV的配比为每克PHBV配比1.5～3.5 mL二醇单体；
步骤（1）中所述的催化剂与PHBV按质量比(0.03～0.06):1配比；
步骤（2）中所述的催化剂与双羟基封端PHBV的质量比为(0.05～0.1):1；
步骤（3）中所述的聚乙二醇与异氰酸酯封端PHBV按摩尔比(2～5):1配比；
步骤（4）中所述的纳米抗菌剂的添加量按质量百分数5%～15%添加。
7.根据权利要求1、5或6任一项所述的嵌段共聚物纳米复合抗菌材料的制备方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的催化剂为先按每克PHBV配比0.01 g催化剂加入，每隔1h按相同配比再次加入催化剂；
步骤（1）中所述的酯交换反应的反应时间可根据双羟基封端PHBV的分子量调整，为3～40h。
8.一种嵌段共聚物纳米复合抗菌材料，其特征在于：
通过权利要求1～7任一项所述的制备方法制得。
9.权利要求8所述的嵌段共聚物纳米复合抗菌材料在制备抗菌材料中的应用。
10.根据权利要求9所述的嵌段共聚物纳米复合抗菌材料在制备抗菌材料中的应用，其特征在于：
所述的嵌段共聚物纳米复合抗菌材料的添加浓度为50 μg/mL以下。
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