CN105709241B - 季铵盐化荧光碳点的制备方法及其在抗菌和区分革兰氏阳性菌/阴性菌方面的应用 - Google Patents

季铵盐化荧光碳点的制备方法及其在抗菌和区分革兰氏阳性菌/阴性菌方面的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种季铵盐化荧光碳点的制备方法及其在抗菌和区分革兰氏阳性菌/阴性菌方面的应用。其中，所述季铵盐化荧光碳点的制备方法主要包括两步，首先制得表面氨基化的碳点，然后在氨基化碳点表面接枝烷基甜菜碱，得到季铵盐化碳点。所制得的季铵盐化碳点具有良好的水溶液分散性和低细胞毒性，并能够有效抑制和杀死革兰氏阳性菌。此外该季铵盐化碳点具有优良的荧光性质，能够有选择性地使革兰氏阳性菌成像，从而可以有效区分革兰氏阳性菌和阴性菌。

Description

季铵盐化荧光碳点的制备方法及其在抗菌和区分革兰氏阳性 菌/阴性菌方面的应用
技术领域
本发明涉及纳米材料和纳米医学领域，尤其是水溶性碳点表面季铵盐化及其在抗菌及细菌鉴选领域的应用。
背景技术
近年来，随着抗生素的发展和普及应用，由细菌感染引起的一些病症在很大程度上得到抑制。但由于一些复杂的机理，病原体可以破坏宿主的免疫系统使其产生运输障碍，使得抗生素等小分子抗菌剂不能有效到达患处抑制病菌；与此同时由于抗生素的滥用，细菌的耐药性也引起了广泛的关注，因此开发新型抗菌试剂是现如今面临的紧迫挑战。此外，细菌按照革兰氏染色法可以分为革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌，两者在细胞壁结构上面存在很大差异。区分病原菌是革兰氏阳性菌还是阴性菌，在选择相应抗生素进行治疗方面意义重大。而传统的革兰氏染色法需要用肉眼通过显微镜观察，经常会出现视觉误差，而且操作过于复杂。这就迫切需要我们发展简便、准确的区分革兰氏阴性菌和阳性菌的方法。
而伴随着纳米材料的兴起，纳米材料由于其可修饰性、量子尺寸效应、可通过血脑屏障、透过肾小球血管壁进入尿液(要求小于20nm)等性质使其在生物医药相关领域得到广泛关注。碳基材料由于其良好的生物相容性、低廉的原料、良好的光学性质等优良特点而受到广泛的关注。近年来，各种各样的碳材料(如碳纳米管、石墨烯、富勒烯等)被广泛地应用于生物检测、催化、能源、电子器件以及载药等方面。而荧光碳点作为一种新型的零维的碳材料(<5nm)，具有良好的水溶性、较高的量子产率、易表面修饰的特点，为其在抗菌或抗癌药物载体方面提供了可行性。
另一方面，季铵盐类化合物具有抗菌性能已经被广为人知。烷基甜菜碱(N-alkylbetaine)就是其中的一种重要的季铵盐类化合物，它的四级N原子(quaternary nitrogenatom)上连接有不同碳原子个数的长链烷基。烷基甜菜碱一方面能够通过季铵盐的正电荷吸附在带负电的细菌表面，从而破坏细菌表面的离子平衡；另一方面可以通过长链烷烃插入细菌细胞壁或细胞膜而在细菌表面打孔，进而导致细菌内容物流出并杀死细菌。然而由于游离的季铵盐型抗菌剂净电荷密度小，其抗菌效果也得到限制。
发明内容
发明目的：一个目的是提供一种季铵盐化荧光碳点的制备方法，以解决现有技术存在的上述问题。进一步的目的是提供一种季铵盐化荧光碳点在细菌鉴别和抗菌方面的应用。
技术方案：一种季铵盐化荧光碳点的制备方法，包括如下步骤：
步骤1、向甘油中加入二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷，搅拌均匀，在水热反应釜中反应12小时以上，反应温度为240-280℃；
冷却至室温后离心、透析，得到纯化的氨基化碳点水溶液；
步骤2、用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化烷基甜菜碱，并将活化后的烷基甜菜碱与氨基化碳点水溶液混合，室温反应4小时以上；
透析处理后得到纯化的季铵盐化碳点。
优选的，所述步骤1中，二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷的体积分数为5～30％。
优选的，所述烷基甜菜碱为十二烷基甜菜碱、十四烷基甜菜碱、十六烷基甜菜碱或十八烷基甜菜碱。
优选的，在步骤2中，所述烷基甜菜碱与制备氨基化碳点的原料二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷的摩尔比为2:1～10:1。
优选的，步骤2中的活化过程进一步为：
向2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液中加入摩尔比为1:10:20的烷基甜菜碱、N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温下活化0.5±0.1小时；
按照烷基甜菜碱与制备氨基化碳点的原料二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷的物质的量比为5:1的比例加入氨基化碳点，室温反应4±0.5小时。
一种季铵盐化荧光碳点在抗菌及区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中的应用。
优选的，所述季铵盐化荧光碳点的制备方法包括如下步骤：
步骤1、向甘油中加入二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷，搅拌均匀，在水热反应釜中反应12小时以上，反应温度为240-280℃，冷却至室温后离心、透析，得到纯化的氨基化碳点水溶液；
步骤2、用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化烷基甜菜碱，并将活化后的烷基甜菜碱与氨基化碳点水溶液混合，室温反应4小时以上，透析处理后得到纯化的季铵盐化碳点。在所述步骤1中，二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷的体积分数为5～30％。在步骤2中，所述烷基甜菜碱与制备氨基化碳点的原料二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷的摩尔比为2:1～10:1。
一种季铵盐化荧光碳点在抗菌及区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中的应用。
有益效果：本发明的季铵盐型碳点具有对革兰氏阳性菌有较好的抗菌性质、良好的水溶性及荧光特性。本发明主要具有以下优势：
(1)季铵盐化碳点制备过程简单、产量大、成本低。
(2)该季铵盐化荧光碳点具有对革兰氏阳性菌有良好的杀菌、抑菌效果，在较高浓度下对革兰氏阴性菌有一定的抑菌效果，因此可针对性地用于治疗革兰氏阳性菌感染引起的疾病，避免过度使用广谱抗菌药对细菌造成耐药性。
(3)较小尺寸的碳点作为抗菌试剂，可以透过肾小球血管壁进入尿液进而排出体外，从而将抗菌药物的副作用降低到最小。
(4)低细胞毒性。对正常肺细胞(AT-II)的MTT结果显示，CD-12在60μg/mL的浓度下，细胞仍然有90％左右的存活率，这保证了该抗菌试剂在体内的应用潜力。
(5)良好的荧光性能。该季铵盐化碳点具有良好的荧光性质，在特异性杀死革兰氏阳性菌的同时可实现对细菌的多色(红色、绿色和蓝色)成像，而对革兰氏阴性菌的抑菌效果较弱，且不能成像。
说明书附图
图1a和图1b分别为季铵盐化荧光抗菌碳点制备的流程图和反应原理示意图。
图2a和图2b分别为季铵盐化荧光抗菌碳点(CD-12)的透射电镜图及对应的粒径分析图。
图3为季铵盐化荧光抗菌碳点(CD-12)对大肠杆菌(革兰氏阴性菌代表)细菌毒性试验测试结果。
图4为季铵盐化荧光抗菌碳点(CD-12)对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌代表)细菌毒性试验测试结果。
图5为季铵盐化荧光抗菌碳点(CD-12)对正常肺细胞(AT-II)的MTT结果。
图6为季铵盐化荧光碳点抗菌(CD-12)(30μg/mL)与金黄色葡萄球菌共同孵育2小时后的共聚焦荧光显微镜图。
图7为季铵盐化荧光碳点抗菌(CD-12)(30μg/mL)与大肠杆菌共同孵育2小时后的共聚焦荧光显微镜图。
具体实施方式
实施例1
氨基化碳点(AEEA碳点)的制备(反应原理见图1b)，包括以下步骤：
步骤1.在甘油中加入二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷(AEEA)，搅拌混匀；
步骤2.在水热反应釜中以260℃反应12小时，形成碳点溶液；
步骤3.离心除去沉淀物，上清液用截留分子量为1000的透析袋在超纯水中透析2-3天，即得纯净的碳点溶液。其中，所述二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷的体积分数为9.1％。
实施例2
季铵盐化抗菌碳点(CD-12)的制备(反应原理见图1)，包括以下步骤：
1)十二烷基甜菜碱与NHS和EDC分别以1:10和1:20的摩尔比在pH＝6的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液中室温活化0.5小时；
2)以十二烷基甜菜碱与制备氨基化碳点的原料二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷的物质的量比为5:1的方式加入氨基化碳点，室温反应4小时即得到季铵盐化碳点；
3)使用截留分子量为1000的透析袋在超纯水中透析该季铵盐化碳点溶液2天以上，即得纯净的季铵盐化碳点溶液，其粒径表征结果见图2。
实施例3
氨基化碳点的制备，该组实施例与实施例1类似，区别在于步骤2的反应温度分别为240℃、245℃、250℃、255℃、265℃、275℃和280℃。
实施例4
氨基化碳点的制备，该组实施例与实施例1类似，区别在于二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷的体积分数为5％、15％、20.1％、26.5％和30％。
实施例5a
水溶性季铵盐化荧光抗菌碳点的制备，该组实施例与实施例2类似，区别在于步骤1中为十四烷基甜菜碱、十六烷基甜菜碱和十八烷基甜菜碱。
实施例5b
水溶性季铵盐化荧光抗菌碳点的制备，该组实施例与实施例2类似，区别在于在步骤2中，所述烷基甜菜碱与二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷的摩尔比为2:1、3:1、7:1、9:1和10:1。
实施例6
测试实施例2的季铵盐化碳点(CD-12)对大肠杆菌(革兰氏阴性菌)的毒性，方法如下：
选取培养过夜的大肠杆菌，以1:100的比例稀释，在37℃培养箱中生长2～3个小时至细菌在600nm的浊度为0.5左右(1×108cfu/mL左右)。大肠杆菌以含有梯度浓度的季铵盐碳点(0，5，10，15，20，30μg/mL)的培养基以1:10的比例稀释过后，置于37℃培养箱2.5h后，利用酶标仪采用CCK-8检测法测定450nm处的吸光度，实验结果见图3。实验结果表明，在细菌个数为1×106～1×107cfu/mL情况下，季铵盐化碳点浓度为200μg/mL时，对大肠杆菌只有较弱的抑菌效果。
实施例7
测试实施例2的季铵盐化碳点(CD-12)对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)的毒性，方法如下：
选取培养过夜的金黄色葡萄球菌，以1:100的比例稀释，在37℃培养箱中生长2～3h至细菌在600nm的浊度为0.5左右。金黄色葡萄球菌在与含有不同浓度季铵盐化碳点(0,5,10,15,20,30μg/mL)的培养基以1:10的比例稀释过后，置于37℃培养箱中2.5h，利用酶标仪采用CCK-8检测法测定450nm处的吸光度，实验结果见图4。实验结果表明，在细菌个数为1×106～1×107cfu/mL情况下，季铵盐化碳点浓度为15μg/mL时，即可杀死大部分金黄色葡萄球菌。
实施例8
测试实施例2的季铵盐化碳点(CD-12)对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)的最小抑菌浓度(MIC)，方法如下：
选取培养过夜的金黄色葡萄球菌，以1:100的比例稀释，在37℃培养箱中生长2～3个小时至细菌在600nm的浊度为0.5左右，此时细菌的个数约为1×108cfu/mL。金黄色葡萄球菌在与含有不同浓度的季铵盐化碳点(0,0.25,0.5,1,2,4,8,16,32μg/mL)的培养基以1:100的比例稀释过后，置于37℃培养箱中培养14～18h后，菌液没有出现明显浑浊的加药浓度，即为季铵盐化碳点对金黄色葡萄球菌的MIC。实验结果表明，在金黄色葡萄球菌个数为1×105～1×106cfu/mL情况下，该季铵盐化碳点浓度为8μg/mL时，即没有出现浑浊，8μg/mL即为该季铵盐化碳点对金黄色葡萄球菌的MIC。
实施例9
测试实施例2的季铵盐化碳点(CD-12)对藤黄微球菌(革兰氏阳性菌)的最小抑菌浓度(MIC)，方法如下：
选取培养过夜的藤黄微球菌，以1:100的比例稀释，在37℃培养箱中生长2～3个小时至细菌在600nm的浊度为0.5左右，此时细菌的个数约为1×108cfu/mL。藤黄微球菌在与含有不同浓度的季铵盐化碳点(0、0.25、0.5、1、2、4、8、10、16、32μg/mL)的培养基以1:100的比例稀释过后，置于37℃培养箱中培养14～18h后，菌液没有出现明显浑浊的加药浓度，即为季铵盐化碳点对藤黄微球菌的MIC。实验结果表明，在藤黄微球菌个数为1×105～1×106cfu/mL情况下，该季铵盐化碳点浓度为10μg/mL时，即没有出现浑浊，10μg/mL即为该季铵盐化碳点对藤黄微球菌的MIC。
实施例10
测试实施例2的季铵盐化碳点(CD-12)对枯草芽孢杆菌(革兰氏阳性菌)的最小抑菌浓度(MIC)，方法如下：
选取培养过夜的枯草芽孢杆菌，以1:100的比例稀释，在37℃培养箱中生长2～3个小时至细菌在600nm的浊度为0.5左右，此时细菌的个数约为1×108cfu/mL。枯草芽孢杆菌在与含有不同浓度的季铵盐化碳点(0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32μg/mL)的培养基以1:100的比例稀释过后，置于37℃培养箱中培养14～18h后，菌液没有出现明显浑浊的加药浓度，即为季铵盐化碳点对枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度MIC。实验结果表明，在枯草芽孢杆菌个数为1×105～1×106cfu/mL情况下，该季铵盐化碳点浓度为16μg/mL时，即没有出现浑浊，16μg/mL为该季铵盐化碳点对枯草芽孢杆菌的MIC。
实施例11
测试实施例2的季铵盐化碳点对变形杆菌(革兰氏阴性菌)的最小抑菌浓度(MIC)，方法如下：
选取培养过夜的变形杆菌，以1:100的比例稀释，在37℃培养箱中生长至细菌在600nm的浊度为0.5左右，此时细菌的个数约为1×108cfu/mL。变形杆菌与含有不同浓度的季铵盐化碳点(0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32μg/mL)的培养基以1:100的比例稀释过后，置于37℃培养箱中培养14～18h后，使菌液没有出现明显浑浊的季铵盐化碳点的浓度，即为该季铵盐化碳点对变形杆菌的MIC。实验结果表明，在变形杆菌个数为1×105～1×106cfu/mL时，该季铵盐化碳点浓度在大于32μg/mL时，依然会出现浑浊现象，故变形杆菌MIC>32μg/mL。
实施例12
测试实施例2的季铵盐化碳点(CD-2)对绿脓杆菌(革兰氏阴性菌)的最小抑菌浓度(MIC)，方法如下：
选取培养过夜的绿脓杆菌，以1:100的比例稀释，在37℃培养箱中生长至细菌在600nm的浊度为0.5左右，此时细菌的个数约为1×108cfu/mL。绿脓杆菌与含有不同浓度的季铵盐化碳点(0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32μg/mL)的培养基以1:100的比例稀释过后，置于37℃培养箱中培养14～18h后，使菌液没有出现明显浑浊的季铵盐化碳点的浓度，即为该季铵盐化碳点对绿脓杆菌的MIC。实验结果表明，在绿脓杆菌个数为1×105～1×106cfu/mL时，该季铵盐化碳点浓度在大于32μg/mL时，依然会出现浑浊现象，故绿脓杆菌MIC>32μg/mL。
实施例13
测试实施例2的季铵盐化碳点(CD-12)对大肠杆菌(革兰氏阴性菌)的最小抑菌浓度(MIC)，方法如下：
选取培养过夜的大肠杆菌，以1:100的比例稀释，在37℃培养箱中生长2～3个小时至细菌在600nm的浊度为0.5左右，此时细菌的个数约为1×108cfu/mL。大肠杆菌与含有不同浓度的季铵盐化碳点(0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32μg/mL)的培养基以1:100的比例稀释过后，置于37℃培养箱中培养14～18h后，使菌液没有出现明显浑浊的季铵盐化碳点的浓度，即为该季铵盐化碳点对大肠杆菌的MIC。实验结果表明，在大肠杆菌个数为1×105～1×106cfu/mL时，该季铵盐化碳点浓度在大于32μg/mL时，依然会出现浑浊现象，故大肠杆菌MIC>32μg/mL。
实施例14
测试实施例2的季铵盐化碳点(CD-12)的细胞毒性，方法如下：
选择正常肺细胞(AT-II)，利用酶标仪采用MTT检测法分别测定浓度为0、5、10、20、40、60μg/mL的碳点对AT-II的毒性(碳点加入细胞24小时之后测定)，结果见图5。实验结果表明季铵盐化碳点浓度在远远大于革兰氏阳性菌最小抑菌浓度(MIC)的浓度下，细胞的存活率仍然超过90％，说明该季铵盐化碳点具有良好的生物相容性。
实施例15
验证实施例2的季铵盐化碳点(CD-12)对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌代表)的成像效果，方法如下：
将培养过夜的金黄色葡萄球菌，以1:100的比例稀释，在37℃培养箱中生长2～3个小时至细菌在600nm的浊度为0.5左右，此时细菌的个数约为1×108cfu/mL，加入实施例2中季铵盐化碳点至最终浓度为0.3mg/mL。在37℃中的摇床中培养2小时后，用7000rpm的速度离心，去掉上清液，加入50μL PBS重悬，取10μL滴至盖玻片上在共聚焦显微镜用488nm的激光激发观察。结果见图6，表明该季铵盐化碳点能对金黄色葡萄球菌成像。
实施例16
验证实施例2的季铵盐化碳点(CD-12)对大肠杆菌(革兰氏阴性菌代表)的成像效果，方法如下：
将培养过夜的大肠杆菌，以1:100的比例稀释，在37℃培养箱中生长2～3个小时至细菌在600nm的浊度为0.5左右，此时细菌的个数约为1×108cfu/mL，加入实施例2中季铵盐化碳点至最终浓度为0.3mg/mL。在37℃的摇床中培养2小时后，用7000rpm的速度离心，去掉上清液，加入50μL PBS重悬，取10μL滴至盖玻片上在共聚焦显微镜用488nm的激光激发观察。结果见图7，表明该季铵盐化碳点不能对大肠杆菌成像。
总之，本发明首先制备了一种表面含有氨基的水溶性碳点，然后碳点上的氨基与烷基甜菜碱上的羧基的反应，最终制备出具有优异抗菌性质的季铵盐化荧光碳点。通过将季铵盐类化合物共价修饰在碳点表面，本发明实现了季铵盐型抗菌剂在纳米材料表面的富集，提高了电荷密度，从而大大增强了其抗菌效果。同时，该季铵盐化荧光抗菌碳点继承了碳点本身的荧光性质，在杀死细菌的同时还可以对细菌进行多色成像。由于革兰氏阳性菌的表面负电荷远多于革兰氏阴性菌，因此本发明得到的带正电的季铵盐化碳点的杀菌和细菌成像效果都仅限于革兰氏阳性菌。也就是说，该发明得到的季铵盐化碳点可以有效区分革兰氏阳性菌和阴性菌。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种等同变换，这些等同变换均属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种季铵盐化荧光碳点的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、向甘油中加入二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷，搅拌均匀，在水热反应釜中反应12小时以上，反应温度为240～280℃；
冷却至室温后离心、透析，得到纯化的氨基化碳点水溶液；
步骤2、用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化烷基甜菜碱，并将活化后的烷基甜菜碱与氨基化碳点水溶液混合，室温反应4小时以上；
透析处理后得到纯化的季铵盐化碳点。
2.如权利要求1所述的季铵盐化荧光碳点的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷的体积分数为5～30％。
3.如权利要求1所述的季铵盐化荧光碳点的制备方法，其特征在于，所述烷基甜菜碱为十二烷基甜菜碱、十四烷基甜菜碱、十六烷基甜菜碱或十八烷基甜菜碱。
4.如权利要求1所述的季铵盐化荧光碳点的制备方法，其特征在于，在步骤2中，所述烷基甜菜碱与制备氨基化碳点的原料二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷的摩尔比为2:1～10:1。
5.如权利要求1所述的季铵盐化荧光碳点的制备方法，其特征在于，步骤2中的活化过程进一步为：
向2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液中加入摩尔比为1:10:20的烷基甜菜碱、N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温下活化0.5±0.1小时；
按照十二烷基甜菜碱与制备氨基化碳点的原料二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷的物质的量比为5:1的比例加入氨基化碳点，室温反应4±0.5小时。
6.一种季铵盐化荧光碳点在制备抗菌及区分革兰氏阳性菌和阴性菌的试剂中的应用，其特征在于，所述季铵盐化荧光碳点的制备方法包括如下步骤：
步骤1、向甘油中加入二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷，搅拌均匀，在水热反应釜中反应12小时以上，反应温度为240～280℃，冷却至室温后离心、透析，得到纯化的氨基化碳点水溶液；
步骤2、用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化烷基甜菜碱，并将活化后的烷基甜菜碱与氨基化碳点水溶液混合，室温反应4小时以上，透析处理后得到纯化的季铵盐化碳点。
7.如权利要求6所述的季铵盐化荧光碳点在制备抗菌及区分革兰氏阳性菌和阴性菌的试剂中的应用，其特征在于，在所述步骤1中，二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷的体积分数为5～30％。
8.如权利要求6所述的季铵盐化荧光碳点在制备抗菌及区分革兰氏阳性菌和阴性菌的试剂中的应用，其特征在于，在步骤2中，所述烷基甜菜碱与制备氨基化碳点的原料二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷的摩尔比为2:1～10:1。
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