CN112494517B

CN112494517B - 一种荧光抗菌碳点、其制备方法和应用

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Publication number: CN112494517B
Application number: CN202011471301.4A
Authority: CN
Inventors: 赵丹; 刘雪梅; 郝健
Original assignee: South Central University for Nationalities
Current assignee: South Central Minzu University
Priority date: 2020-12-15
Filing date: 2020-12-15
Publication date: 2022-07-15
Anticipated expiration: 2040-12-15
Also published as: CN112494517A

Abstract

本发明属于纳米功能材料技术领域，更具体地，涉及一种荧光抗菌碳点、其制备方法和应用。通过特别选用壳聚糖季铵盐或壳聚糖作为碳源来加热制备碳点，一步即可合成得到能够同时实现对细菌进行成像和杀灭的蓝色发光碳点，制备方法简单。所制备的功能性碳点抗菌活性高、且具有良好的水分散性、低成本、低细胞毒性和溶血性。

Description

一种荧光抗菌碳点、其制备方法和应用

技术领域

本发明属于纳米功能材料技术领域，更具体地，涉及一种荧光抗菌碳点、其制备方法和应用。

背景技术

近年来，随着抗生素的发展和普及应用，由细菌感染引起的一些病症在很大程度上得到抑制。但由于一些复杂的机理，病原体可以破坏宿主的免疫系统使其产生运输障碍，使得抗生素等小分子抗菌剂不能有效到达患处抑制病菌；与此同时由于抗生素的滥用，细菌的耐药性也引起了广泛的关注，因此开发新型抗菌试剂是现如今面临的紧迫挑战。

伴随着纳米材料的兴起，纳米材料由于其可修饰性、量子尺寸效应、可通过血脑屏障、透过肾小球血管壁进入尿液(要求小于20nm)等性质使其在生物医药相关领域得到广泛关注。碳基材料由于其良好的生物相容性、低廉的原料、良好的光学性质等优良特点而受到广泛的关注。近年来，各种各样的碳材料(如碳纳米管、石墨烯、富勒烯等)被广泛地应用于生物检测、催化、能源、电子器件以及载药等方面。而荧光碳点作为一种新型的零维的碳材料(<5nm)，具有良好的水溶性、较高的量子产率、易表面修饰的特点，为其在抗菌或抗癌药物载体方面提供了可行性。

然而，目前荧光碳点的制备通常存在制备步骤繁琐，抗菌活性不高、不具有广谱抗菌性、不具备同时成像和抗菌功能、毒性较大、易产生耐药性等技术缺陷，比如文献1(ACSBiomaterials-Science&Engineering/DOI:10.1021/acs biomaterials.9b00583)通过将双季铵盐(BQAS)与超纯水混合200℃下反应12h，虽然制备得到的碳点在体外对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐氨苄西林的大肠杆菌均具有较高的抗菌活性，但是该文献所制备碳点在高温下反应时间(12h)过长，而且原料不易制备。文献2(Journal of Ino rganicBiochemistry/DOI:10.1016/j.jinorgbio.2016.11.002)通过“一锅法”成功地将2，3-环氧丙基三甲基氯化铵和烯丙基二甲基氯化铵成功地合成了季铵修饰的碳点，该碳点被证明对革兰氏阳性细菌具有令人满意的抗菌活性，然而对革兰氏阴性菌抗菌效果不佳；文献3(Journal of Inorganic Biochemistry/DOI:10.1016/j.jinorgbio.2016.11.002)通过硅烷偶联剂将碳点与银纳米颗粒接枝，合成了空心的Ag-纳米簇-C壳纳米复合材料，才能实现对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有抗菌活性。文献4(Colloids and Su rfaces B:Biointerfaces/DOI:10.1016/j.colsurfb.2018.06.040)将柠檬酸(2.1g)和乙二胺(670μL)溶于超纯水中(20mL)。然后将混合物转移到聚四氟乙烯衬里的高压釜在250℃下加热反应5h下制备碳点(CDs)，通过共价键将氨苄西林(AMP)连接到CDs上。CDs-AMP在光照下能结合适量的活性氧，抑制革兰氏阳性菌的生长。在文献3和文献4中抗菌材料制备方法中偶联过程复杂，对CDs的荧光性能有一定影响，并且复合材料的稳定性也有存在问题。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种荧光抗菌碳点、其制备方法和应用，旨在解决现有技术荧光抗菌碳点制备方法繁琐、制备得到的碳点抗菌活性不高或毒性较大、易形成耐药性等的技术问题。

为实现上述目的，本发明提供了一种荧光抗菌碳点的制备方法，包括如下步骤：

(1)将碳源分散于溶剂中，得到混合溶液，加热反应得到碳点溶液；所述碳源包括壳聚糖或壳聚糖季铵盐；

(2)将步骤(1)得到的碳点溶液进行纯化后固化，得到固态荧光抗菌碳点。

优选地，步骤(1)加热温度为180℃～210℃，优选为190℃～200℃，反应时间为30～300分钟，优选为120～240分钟。

优选地，步骤(1)所述溶剂为水或乙酸的水溶液。

优选地，所述混合溶液中还包括第二碳源、N-掺杂原料、S-掺杂原料和N,S-掺杂原料中一种或多种；

其中，所述第二碳源为柠檬酸和/或葡萄糖；所述N-掺杂原料为乙二胺、聚乙烯亚胺、精氨酸、赖氨酸和尿素中的一种或多种；所述S-掺杂原料为硫代硫酸钠；所述N,S-掺杂原料为硫脲、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸和甲硫氨酸中的一种或多种。

优选地，步骤(1)为：将壳聚糖季铵盐分散于水中，在190～200℃发生水热反应2～4小时，得到碳点溶液。

优选地，每100毫升所述溶剂中加入所述碳源的质量为0.5-1.5克。

优选地，步骤(1)中，将混合溶液置于密闭的反应容器中，加热使其反应；所述反应容器为水热反应釜或微波反应釜；所述加热方式为水浴、油浴、电热恒温鼓风干燥或微波加热。

优选的，所述反应为高压密闭的水热反应。

优选地，步骤(2)中，所述纯化采用的方法为透析，所述透析采用透析袋，其规格为500D、1KD或3KD。

优选的，所述的透析袋规格为500D。

优选地，步骤(2)中，所述固化采用的方法为减压蒸发法、保护性气体吹干法、冷冻干燥法、真空干燥法或有机溶剂沉淀法。

优选的，所述固化采用的方法为冷冻干燥。

按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的制备方法制备得到的荧光抗菌碳点。

按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的荧光抗菌碳点在制备同时抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和耐药菌的抗菌剂中的应用。

优选地，所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和溶壁微球菌中的一种或多种；所述革兰氏阴性菌为铜绿假单孢杆菌和/或大肠杆菌；所述耐药菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的荧光抗菌碳点在对革兰氏阳性菌成像中的应用。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

(1)本发明提出的一种荧光抗菌碳点的制备方法，以壳聚糖或其衍生物壳聚糖季铵盐为原料，一步加热制备得到荧光抗菌碳点。制备方法简单，而且原料壳聚糖或壳聚糖季铵盐廉价易得，且原料本身具有很好的生物相容性。

(2)本发明制备得到的荧光抗菌碳点对革兰氏阳性菌和阴性菌均有良好的杀菌效能，因此可用于制备治疗革兰氏阳性菌或阴性菌感染引起的疾病的药物，避免过度使用抗生素对细菌造成耐药性。

(3)本发明优选实施例中采用壳聚糖季铵盐的水溶液加热制备得到碳点，相较于采用其它原料和溶剂，制备得到的碳点的抗菌活性更高，其对金黄色葡萄球菌的MIC值仅为10μg/mL。

(4)本发明制备得到的荧光抗菌碳点的尺寸较小，作为抗菌试剂，更容易透过肾小球血管壁进入尿液进而排出体外，从而降低抗菌药物的副作用。

(5)本发明制备得到的荧光抗菌碳点经实验证实其具有很好的生物相容性。

(6)本发明制备得到的荧光抗菌碳点能够实现对细菌的多色(蓝色、绿色和红色)成像，能够用作生物荧光探针。

附图说明

图1是本发明荧光抗菌碳点的制备流程示意图；

图2是本发明制备得到的碳点的荧光光谱图；

图3是本发明实施例1制备得到的碳点的透射电镜图；

图4为本发明实施例1制备得到的碳点对人正常肝细胞(LO2)的毒性结果；

图5为本发明实施例1制备得到的碳点的血液相容性试验结果；

图6为本发明实施例1制备得到的碳点对金黄色葡萄球菌的抗菌结果96孔板图；

图7为本发明实施例5制备得到的碳点对金黄色葡萄球菌的抗菌结果96孔板图；

图8为本发明对比例3制备得到的碳点对金黄色葡萄球菌的抗菌结果96孔板图；

图9为本发明实施例1制备得到的碳点对金黄色葡萄球菌的共聚焦荧光成像结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

现有技术通常将碳点与具有抗菌功能的物质进行偶联修饰以实现细菌的成像与抑制，或者通过繁琐的制备方法制备得到荧光抗菌碳点，但是制备得到的碳点大多抗菌活性不高、生物相容性不好、稳定性差等。针对这些问题，本发明创造性地提出了一种荧光抗菌碳点的制备方法，通过特别选用壳聚糖季铵盐或壳聚糖作为碳源来加热制备碳点，其通过一步即可合成得到能够同时实现对细菌进行成像和杀灭的蓝色发光碳点，制备方法简单绿色。所制备的抗菌功能性碳点不仅抗菌活性高，而且具有良好的水分散性、低成本、低细胞毒性和溶血性，该制备方法具体包括如下步骤：

(1)将碳源分散于溶剂中，得到混合溶液，加热使其反应，得到碳点溶液；所述碳源包括壳聚糖或壳聚糖季铵盐；

本发明通过特别选择壳聚糖或壳聚糖季铵盐作为碳源原料，配合合适的溶剂，用于制备荧光抗菌碳点。该制备方法简单，原料易得，操作绿色环保，经实验证明制备得到的碳点抗菌活性高、光化学性能稳定，细胞毒性低，在细菌治疗成像等领域具有广泛的应用前景。

具体地，一些实施方式中，如图1所示，该荧光抗菌碳点的制备方法具体包括：

S1、先将碳源的溶液在反应容器中进行加热反应。

通过将壳聚糖或壳聚糖季铵盐溶于1％乙酸或水制备得到的碳点能够具有较佳的抗菌和细菌成像能力。需要说明的是，除了采用单一的壳聚糖或壳聚糖季铵盐以外，同时也可以掺杂加入其它原料，例如碳源(柠檬酸和/或葡萄糖等)，N-掺杂原料(乙二胺，聚乙烯亚胺，精氨酸，赖氨酸和尿素等)，S-掺杂原料(硫代硫酸钠)及N,S-掺杂原料(硫脲，半胱氨酸，N-乙酰半胱氨酸和甲硫氨酸等)。

其中，碳源的溶液为通过将碳源分散于超纯水中得到，一些实施方式中，将碳源分散于超纯水后，为了使得其充分分散均匀，在磁力搅拌器或超声仪，进而得到分散均匀的透明溶液。

一些实施例中，步骤(1)加热温度为180℃～210℃，优选为190℃～200℃，反应时间为30～300分钟，优选为60～240分钟。

优选实施例中将壳聚糖季铵盐分散于溶剂水中，在190～200℃发生水热反应2～4小时，最终制备得到的碳点抗菌性能较佳。

一些实施例中，每100毫升所述溶剂中加入碳源的质量为0.5-1.5克。

一些实施例中，步骤(2)所述透析为置于透析袋中透析20～36小时。

具体地，步骤S1中，将碳源分散于溶剂中，将混合溶液置于密闭的反应容器中，然后再将该反应容器置于加热容器中加热使其发生反应。

进一步地，一些实施方式中，所述反应容器为水热反应釜或微波反应釜。所述加热容器为水浴锅、油浴锅、电热恒温鼓风干燥箱或微波消解萃取仪；即加热方法可以水浴加热、微波加热、油浴加热等，对应的碳点制备方法除了微波加热法外，还可以采用水热法和油浴法等其他方法。其中采用微波加热发生反应，比如在微波消解萃取仪中反应时，反应时间为30-120分钟即可；采用常规水浴、油浴或干燥箱中加热反应容器使混合溶液发生水热反应时，反应时间为120-300分钟。优选的，所述反应为高压密闭的水热反应。

S2、将得到的碳点溶液进行固液分离，得到碳点。

一些实施方式中，纯化采用的方法为透析。进一步地，透析可以采用透析袋进行，透析袋规格可为500D，1KD或3KD。优选地，透析袋规格为500D。

进一步地，透析后固化采用的方法为减压蒸发法、保护性气体吹干法、冷冻干燥法、真空干燥法或有机溶剂沉淀法。优选采用冷冻干燥法。

本发明的一些实施方式还提供了一种蓝色发光抗菌碳点，其由上述任一实施方式的制备方法制备得到。

采用壳聚糖作为原料时，壳聚糖不溶于水，因此除了加入水溶剂以外，还加入乙酸，用于助溶。因此本发明步骤(1)所述溶剂为水或乙酸的水溶液。

本发明采用壳聚糖或壳聚糖季铵盐作为碳源原料，发现采用壳聚糖季铵盐作为唯一碳源且采用水作为唯一溶剂时，制备得到的碳点的抗菌活性最高。壳聚糖季铵盐公知本身具有一定的抗菌性，然而其本身没有荧光特性，无法直接用于细菌抗菌成像。但是，本发明在实验中同时发现，采用壳聚糖季铵盐制备碳点，需在一定条件范围内才能获得高抗菌活性的碳点，当反应条件比如碳源种类、溶剂、温度等发生改变时制备得到的碳点或荧光强度降低，或发射波长变短，或抗菌活性大幅度降低。比如采用N-羧甲基壳聚糖按照相同的方法制备碳点，制备得到的碳点其没有抗菌性。此外温度和反应时间的变化对制备得到的碳点的荧光强度和抗菌活性也有很大的影响。

本发明制备得到的荧光抗菌碳点同时对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及耐药菌都表现出了优异的抗菌性，革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和溶壁微球菌，革兰氏阴性菌包括铜绿假单孢杆菌和大肠杆菌，耐药菌包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。因此本发明制备得到的荧光抗菌碳点可用于制备同时抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和耐药菌的抗菌剂，其中尤其对金黄色葡萄球菌抗菌性能最佳。

本发明制备得到的荧光抗菌碳点经实验证明可用于革兰氏阳性菌的成像，尤其是对金黄色葡萄球菌成像性能较好。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

(1)称取200mg壳聚糖季铵盐分散于20mL超纯水中，然后在磁力搅拌器下搅拌，得到分散均匀透明溶液。

(2)将步骤(1)得到的透明溶液转移至聚四氟乙烯反应釜中，于烘箱中在200℃下反应4h，即得到碳点溶液，其荧光光谱如图2所示，其粒径表征结果见图3。

(3)将步骤(2)得到的碳点溶液直接置于500D透析袋透析24h后干燥，即可得到固体碳点。

实施例2

(2)将步骤(1)得到的透明溶液转移至聚四氟乙烯反应釜中，于烘箱中在200℃下反应6h，即得到碳点溶液，其荧光光谱如图2所示，荧光强度与实施例1相比相对较弱，其对金黄色葡萄球菌的MIC为40μg/mL。

实施例3

(2)将步骤(1)得到的透明溶液转移至聚四氟乙烯反应釜中，于烘箱中在180℃下反应2h，即得到碳点溶液，其荧光光谱如图2所示，荧光强度与实施例1相比很弱。

对比例1

(1)称取200mg壳聚糖季铵盐在磁力搅拌器下搅拌分散于10mL超纯水和10mL甲酰胺中，然后在磁力搅拌器下搅拌，得到分散均匀透明溶液.

(2)将步骤(1)得到的透明溶液转移至聚四氟乙烯反应釜中，于烘箱中在200℃下反应4h，即得到碳点溶液，其荧光光谱如图2所示，发射波长与实施例1相比较短，并且对金黄色葡萄球菌没有抗菌性。

可见当采用壳聚糖季铵制备碳点时，溶剂同时采用水和甲酰胺，制备得到的碳点不仅发射波长变短，而且几乎没有没有抗菌性。

实施例4

(1)称取200mg壳聚糖季铵盐和50mg柠檬酸分散于20mL超纯水中，然后在磁力搅拌器下搅拌，得到分散均匀透明溶液。

(2)将步骤(1)得到的透明溶液转移至聚四氟乙烯反应釜中，于烘箱中在200℃下反应4h，即得到碳点溶液，其荧光光谱如图2所示，荧光强度与实施例1相比较弱。

当在实施例1的基础上，体系中同时加入柠檬酸时，制备得到的碳点溶液荧光强度降低，抗菌活性有所降低。

对比例2

(1)称取200mg壳聚糖季铵盐和50mg柠檬酸分散于10mL超纯水和10mL甲酰胺中，然后在磁力搅拌器下搅拌，得到分散均匀的透明溶液。

(2)将步骤(1)得到的透明溶液转移至聚四氟乙烯反应釜中，于烘箱中在200℃下反应4h，即得到碳点溶液，其荧光光谱如图2所示，荧光强度与实施例1相比荧光较强，但对金黄色葡萄球菌几乎没有抗菌性。

同样地，在实施例1的基础上，同时在反应体系中引入柠檬酸和甲酰胺，制备得到的碳点溶液荧光强度显著增强，但是其对金黄色葡萄球菌几乎没有抗菌性。如图1和表1所示。

实施例5

(1)称取200mg壳聚糖分散于20mL 1％乙酸中，然后在磁力搅拌器下搅拌，得到分散均匀透明溶液。

(2)将步骤(1)得到的透明溶液转移至聚四氟乙烯反应釜中，于烘箱中在200℃下反应4h，即得到碳点溶液。

对比例3

(1)称取200mg N-羧甲基壳聚糖分散于20mL水中，然后在磁力搅拌器下搅拌，得到分散均匀透明溶液。

实施例6

测试实施例1的蓝色发光抗菌碳点的细胞毒性，具体方法如下：

选择人正常肝细胞(LO2)，利用酶标仪采用MTT检测法分别测定浓度为0、0.5、10、50、100、200、250μg/mL的碳点对LO2的细胞毒性(碳点加入细胞24小时之后测定)，结果见图4。实验结果表明蓝色发光抗菌碳点的浓度高达250μg/mL时，细胞的存活率仍然超过103％，说明该碳点具有良好的生物相容性。

实施例7

用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(D-PBS)制备不同浓度的实施例1的蓝色发光抗菌碳点(25、50、100、150、200和250μg/mL)的溶液，并在37℃下保持30分钟。然后，通过以9000rpm离心3分钟分离新鲜的兔全血，小心除去上清液，并用D-PBS洗涤亚红血细胞(RBC)。将稀释的RBCs悬浮液(0.2mL)加入不同浓度至1mL的PS-CDs溶液中。将这些混合样品在37℃下孵育3小时，然后在孵育后以9000rpm离心3分钟。将上清液转移至96孔板，并使用酶标仪在545nm处测量吸光度。计算这三个测量值的平均值。作为阳性对照，将0.2mL稀释的RBCs悬浮液添加到1mL去离子水中。作为阴性对照，将0.2mL稀释的RBCs悬浮液添加到1mL D-PBS溶液中。

溶血率计算如下：

溶血率(％)＝[(OD_t-OD_n)/(OD_p-OD_n)]×100％

其中，OD_t，OD_n和OD_p分别表示测试样品、阴性对照组和阳性对照组在545nm处的吸光度值。

图5示出了不同浓度的蓝色发光抗菌碳点的血液相容性的溶血试验结果。当样品浓度大于200μg/mL时，蓝色发光抗菌碳点的溶血率小于4.80％，这说明其血液相容性非常好。

实施例8

测试实施例1、实施例5和对比例3的蓝色发光抗菌碳点对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)的最小抑菌浓度(MIC)，方法如下：

MH肉汤液体培养基：称取2.1g肉汤于锥形瓶中，加100mL超纯水使其混合均匀。将锥形瓶置于灭菌锅里121℃灭菌20min，即得MH肉汤液体培养基。

(1)将金黄色葡萄球菌接种于MH肉汤液体培养基中，置于恒温摇床中，37℃，180rpm培养12h，将活化好的菌种，按5％的接种量接种于MH肉汤液体培养基中，置于恒温摇床中，37℃，180rpm培养9h。

(2)先向96孔板的每孔中加入50μL一系列浓度梯度的实施例1的蓝色发光抗菌碳点(10-200μg/mL)，再向每孔中加入50μL步骤1)中得到的金黄色葡萄球菌悬液。于37℃恒温培养10h后，然后每孔中加入5μL 5mg/mL的MTT溶液，继续37℃恒温20min后，最后向每孔中加入200μL二甲亚砜(DMSO)，通过染色法观察实验结果，实验重复三次。通过观察，实施例1中蓝色发光碳点的MIC值为10μg/mL，其96孔板抗菌结果图如图6所示。实施例1中蓝色发光碳点对金黄色葡萄球菌具有抗菌性。

再依次按照上述操作检测实施例5和对比例3对金黄色葡萄球菌的抗菌性。其结果如图7和图8所示。实施例5的碳点在浓度为250μg/mL时，依然不能抑制金黄色葡萄菌的生长，没有抗菌性能。对比例3的碳点也对金黄色葡萄菌的MIC大于1000μg/mL。

实施例9

测试实施例1的蓝色发光抗菌碳点对枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度(MIC)，方法如下：

(1)将枯草芽孢杆菌接种于MH肉汤液体培养基中，置于恒温摇床中，37℃，180rpm培养12h，将活化好的菌种，按5％的接种量接种于MH肉汤液体培养基中，置于恒温摇床中，37℃，180rpm培养9h。

(2)先向96孔板的每孔中加入50μL一系列浓度梯度的蓝色发光抗菌碳点(31.25-1000μg/mL)，再向每孔中加入50μL步骤1)中得到的枯草芽孢杆菌悬液。于37℃恒温培养10h后，然后每孔中加入5μL 5mg/mL的MTT溶液，继续37℃恒温20min后，最后向每孔中加入200μL二甲亚砜(DMSO)，通过染色法观察实验结果，实验重复三次。通过观察，实施例1蓝色发光抗菌碳点的MIC值为62.5μg/mL。

实施例10

测试实施例1的蓝色发光抗菌碳点对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)，方法如下：

(1)将耐甲氧西林金黄色葡萄球菌接种于MH肉汤液体培养基中，置于恒温摇床中，37℃，180rpm培养12h，将活化好的菌种，按5％的接种量接种于MH肉汤液体培养基中，置于恒温摇床中，37℃，180rpm培养9h。

(2)先向96孔板的每孔中加入50μL一系列浓度梯度的蓝色发光抗菌碳点(5-80μg/mL)，再向每孔中加入50μL步骤1)中得到的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌悬液。于37℃恒温培养10h后，然后每孔中加入5μL 5mg/mL的MTT溶液，继续37℃恒温20min后，最后向每孔中加入200μL二甲亚砜(DMSO)，通过染色法观察实验结果，实验重复三次。通过观察，实施例1蓝色发光抗菌碳点的MIC值为10μg/mL。

实施例11

测试实施例1的蓝色发光抗菌碳点对铜绿假单孢杆菌(革兰氏阴性菌)的最小抑菌浓度(MIC)，方法如下：

(1)将铜绿假单孢杆菌接种于MH肉汤液体培养基中，置于恒温摇床中，37℃，180rpm培养12h，将活化好的菌种，按5％的接种量接种于MH肉汤液体培养基中，置于恒温摇床中，37℃，180rpm培养9h。

(2)先向96孔板的每孔中加入50μL一系列浓度梯度的蓝色发光抗菌碳点(50-1000μg/mL)，再向每孔中加入50μL步骤1)中得到的铜绿假单孢杆菌悬液。于37℃恒温培养8-12h后，然后每孔中加入5μL 5mg/mL的MTT溶液，继续37℃恒温20min后，最后向每孔中加入200μL二甲亚砜(DMSO)，通过染色法观察实验结果，实验重复三次。通过观察，实施例1蓝色发光抗菌碳点的MIC值为200μg/mL。

实施例12

测试实施例1的蓝色发光抗菌碳点对大肠杆菌(革兰氏阴性菌)的最小抑菌浓度(MIC)，方法如下：

(1)将大肠杆菌接种于MH肉汤液体培养基中，置于恒温摇床中，37℃，180rpm培养12h，将活化好的菌种，按5％的接种量接种于MH肉汤液体培养基中，置于恒温摇床中，37℃，180rpm培养8-10h。

(2)先向96孔板的每孔中加入50μL一系列浓度梯度的蓝色发光碳点(2500-800μg/mL)，再向每孔中加入50μL步骤1)中得到的大肠杆菌悬液。于37℃恒温培养8-12h后，然后每孔中加入5μL 5mg/mL的MTT溶液，继续37℃恒温20min后，最后向每孔中加入200μL二甲亚砜(DMSO)，通过染色法观察实验结果，实验重复三次。通过观察，实施例1蓝色发光抗菌碳点的MIC值为625μg/mL。

需要说明的是，实施例9～12所用的MH肉汤液体培养基与试实施例8中相同。

实施例13

验证实施例1的蓝色发光抗菌碳点对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌代表)的成像效果，方法如下：

将金黄色葡萄球菌细胞在37℃的肉汤中培养12小时。然后，取1mL培养悬浮液，以1800rpm离心5分钟，然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH＝7.4)溶液洗涤两次以除去悬浮液，然后将沉淀物悬浮在1mL PBS缓冲液中随后，将1mL碳点溶液(5mg/mL)添加至含有金黄色葡萄球菌的PBS溶液中，并培养2小时。用1800rpm的速度离心，去掉上清液，加入50μL PBS重悬，取10μL滴至盖玻片上在共聚焦显微镜用405nm的激光激发观察。最后，使用共聚焦荧光显微镜观察细菌细胞。结果见图9，表明实施例1蓝色发光抗菌碳点能对金黄色葡萄球菌成像。

将实施例以及对比例不同条件下制备得到的碳点对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)的最小抑菌浓度(MIC)以及发射波长总结在表1和表2中：

表1不同条件下制备的碳点的发射波长以及对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度

表2不同条件下制备的碳点的发射波长以及对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度

表1和表2中，CDs表示碳点，CS表示壳聚糖，CMCS表示N-羧甲基壳聚糖，QCS表示壳聚糖季铵盐，CA表示柠檬酸，FO表示甲酰胺。

从表1和表2中可以看出，采用壳聚糖季铵盐为原料，以超纯水为溶剂，在200℃加热反应2-4小时制备得到的碳点对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)的最小抑菌浓度(MIC)最低，仅为10μg/mL，抗菌活性最高；然而，其他条件不变，仅延长反应时间至6小时时，MIC提高了4倍，抗菌活性有很大程度地降低。其他条件不变，加入第二碳源柠檬酸时，其MIC值为125μg/mL，抗菌活性较不添加柠檬酸时有较大程度的降低。然而，当采用水和甲酰胺的混合溶剂时，制备得到的碳点几乎没有抗菌活性。

实施例1采用壳聚糖季铵盐为原料，以水为溶剂，制备得到的碳点对不同革兰氏菌均具有较高的抗菌活性，比如实验证明该碳点对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)的最小抑菌浓度(MIC)为10μg/mL，对枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度(MIC)为62.5μg/mL，对铜绿假单孢杆菌(革兰氏阴性菌)的最小抑菌浓度(MIC)为200μg/mL，对大肠杆菌(革兰氏阴性菌)的最小抑菌浓度(MIC)为625μg/mL。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种荧光抗菌碳点的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将壳聚糖季铵盐分散于水中，在190～200℃发生水热反应2～4小时，得到碳点溶液；

（2）将步骤（1）得到的碳点溶液进行纯化后固化，得到固态荧光抗菌碳点。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述混合溶液中还包括第二碳源，所述第二碳源为柠檬酸。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述纯化采用的方法为透析，所述固化采用的方法为减压蒸发法、保护性气体吹干法、冷冻干燥法、真空干燥法或有机溶剂沉淀法。

4.如权利要求1至3任一项所述的制备方法制备得到的荧光抗菌碳点。

5.如权利要求4所述的荧光抗菌碳点在制备同时抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和耐药菌的抗菌剂中的应用；所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和溶壁微球菌中的一种或多种；所述革兰氏阴性菌为铜绿假单孢杆菌和/或大肠杆菌；所述耐药菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

6.如权利要求4所述的荧光抗菌碳点在对革兰氏阳性菌成像中的应用。

7.一种荧光抗菌碳点在制备同时抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和耐药菌的抗菌剂中的应用，其特征在于，所述荧光抗菌碳点的制备方法，包括如下步骤：

（1）将碳源分散于溶剂中，得到混合溶液，加热反应得到碳点溶液；所述碳源为壳聚糖，所述溶剂为乙酸的水溶液；

（2）将步骤（1）得到的碳点溶液进行纯化后固化，得到固态荧光抗菌碳点；

所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和溶壁微球菌中的一种或多种；所述革兰氏阴性菌为铜绿假单孢杆菌和/或大肠杆菌；所述耐药菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，每100毫升所述溶剂中加入所述碳源的质量为0.5-1.5克。