CN105596367B - 以壳聚糖-泊洛沙姆为凝胶基质的纳米银抗菌凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

以壳聚糖-泊洛沙姆为凝胶基质的纳米银抗菌凝胶及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于纳米银抗菌凝胶技术领域,公开了一种以壳聚糖‑泊洛沙姆为凝胶基质的纳米银抗菌凝胶的制备方法和应用。其特征在于由包括以下具体步骤的方法制备得到:向硝酸银水溶液中加入泊洛沙姆,搅拌均匀,再加入柠檬酸三钠,搅拌均匀后在紫外光下照射,得到纳米银原液;往纳米银原液中加入冰醋酸溶液、甘油,搅拌均匀,再加入泊洛沙姆与壳聚糖,得到纳米银的壳聚糖‑泊洛沙姆溶胶,调节pH,静置使其凝胶化,得到纳米银抗菌凝胶。本发明的凝胶利用物理交联代替化学交联,避免引入有害化学试剂等交联剂而导致的细胞毒性上升的问题,并以壳聚糖联合泊洛沙姆为载体引入纳米银,凝胶稳定、低毒,可应用于烧伤创面中,对患者的预后和转归大有裨益。

Description

以壳聚糖-泊洛沙姆为凝胶基质的纳米银抗菌凝胶及其制备 方法和应用
技术领域
本发明属于纳米银抗菌凝胶技术领域,特别涉及一种以壳聚糖-泊洛沙姆为凝胶基质的纳米银抗菌凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
现今的用于烧伤创面治疗的抗菌凝胶产品种类比较多,但是其细胞毒性普遍偏大,有些甚至有高的细胞毒性。在促进烧伤创面愈合的过程中,其高的细胞毒性可能会引起比较大的副作用,进而给患者造成二次伤害。例如根据黄清泉等人对当今医疗市场上所销售的18种含纳米银医疗产品的体外细胞毒性比较发现,有5.6%的产品其细胞毒性为3级;而有77.8%的产品其细胞毒性为4级。而根据付海洋等人在对9种含纳米银医疗器械的体外细胞毒性试验中,所有的受试验样品的细胞毒性都大于3级,其中88.9%的受试验样品的体外细胞毒性为4级。所以开发一种在临床上应用低毒且高效的烧伤创面外用药,对于患者的预后和转归是必要的。因此,本发明通过以壳聚糖-泊洛沙姆凝胶体系为基质,并在有效抑菌的前提下严格控制凝胶的纳米银浓度,尽可能降低凝胶整体的细胞毒性。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足,本发明的首要目的在于提供一种低毒、稳定的以壳聚糖-泊洛沙姆为凝胶基质的纳米银抗菌凝胶。
本发明另一目的在于提供一种上述低毒、稳定的以壳聚糖-泊洛沙姆为凝胶基质的纳米银抗菌凝胶的制备方法。
本发明再一目的在于提供上述低毒、稳定的以壳聚糖-泊洛沙姆为凝胶基质的纳米银抗菌凝胶在烧伤创面中的应用。
本发明的目的通过下述方案实现:
一种低毒、稳定的以壳聚糖-泊洛沙姆为凝胶基质的纳米银抗菌凝胶,由包括以下具体步骤的方法制备得到:
向硝酸银水溶液中加入泊洛沙姆,搅拌均匀,再加入柠檬酸三钠,搅拌均匀后在紫外光下照射,得到纳米银原液;往纳米银原液中加入冰醋酸溶液、甘油,搅拌均匀,再加入泊洛沙姆与壳聚糖,得到纳米银的壳聚糖-泊洛沙姆溶胶,调节pH,静置使其凝胶化,得到纳米银抗菌凝胶。
本发明的低毒、稳定的以壳聚糖-泊洛沙姆为凝胶基质的纳米银抗菌凝胶体系中,所述壳聚糖的浓度优选为1.8~2.4wt%。
本发明的低毒、稳定的以壳聚糖-泊洛沙姆为凝胶基质的纳米银抗菌凝胶体系中,所述纳米银的含量优选为3~24μg/mL。
本发明的低毒、稳定的以壳聚糖-泊洛沙姆为凝胶基质的纳米银抗菌凝胶体系中,所述泊洛沙姆的含量优选为1‰~1%。
本发明的低毒、稳定的以壳聚糖-泊洛沙姆为凝胶基质的纳米银抗菌凝胶体系中,所述甘油的含量优选为1~5wt%。
所述冰醋酸溶液的浓度优选为1~2%。
所述调节pH优选使用碳酸氢钠溶液进行,所述调节pH优选调节至pH为5.8~7.0。
所用硝酸银和柠檬酸三钠的摩尔比为1:1~2.5:1。
所述紫外光照射的时间优选为4~6h。
所述前后两次添加泊洛沙姆的量可根据需要进行任意调整。
所述的泊洛沙姆优选为泊洛沙姆407。
本发明的以壳聚糖-泊洛沙姆为凝胶基质的纳米银抗菌凝胶稳定、低毒,可应用于烧伤创面中。
本发明利用物理交联代替化学交联的方法使壳聚糖凝胶化,避免了因引入有害化学试剂如戊二醛等交联剂进行化学交联而导致的细胞毒性上升的问题,实现了低毒、甚至无毒的凝胶化;同时,壳聚糖作为一种自然界普遍存在的高分子化合物,其具有良好的生物相容性,本身就具有一定的抑菌作用,用于烧伤创面外用药对创面的愈合也有积极作用,本发明并以其并联合泊洛沙姆407为载体并引入纳米银,一方面,壳聚糖-泊洛沙姆凝胶基质可以有效吸收烧伤创面的渗出液,并使创面保持湿润状态,有利于肉芽组织的形成,从而促进创面的愈合;另一方面,纳米银粒子能对烧伤创面起到杀菌的作用。因此,本发明的纳米银凝胶负载有纳米银实现抗菌的同时亦可促进烧伤创面的愈合,对患者的预后和转归大有裨益。
附图说明
图1为纳米银的紫外分光图。
图2为纳米银的扫描电镜图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1:低毒、稳定的以壳聚糖-泊洛沙姆为凝胶基质的纳米银抗菌凝胶的制备
(1)纳米银原液的制备:在磁力搅拌下向100mL超纯水中加入37.8mg硝酸银,待其充分溶解后加入30mg泊洛沙姆407,待2min使泊洛沙姆充分溶解在水中后,加入30mg柠檬酸三钠,并在紫外灯照射下4h即可制成银含量为240μg/mL的纳米银原液。
(2)在常温下先配置好17.55mL的加有200μL的冰醋酸溶液,然后加入250μL的纳米银原液与200μL的甘油并搅拌均匀,之后再依次加入20mg泊洛沙姆与0.36g的壳聚糖制备出含有纳米银的壳聚糖-泊洛沙姆溶胶,最后滴加NaHCO3溶液调节溶胶的pH约为6。经过一段时间的凝胶化后得到低毒、稳定的以壳聚糖-泊洛沙姆为凝胶基质的纳米银抗菌凝胶,为淡黄色或灰黄色半透明稠厚液体,凝胶均匀细腻,无相分离,粘稠度适宜,涂展性良好,不油腻,不易黏附于湿润的创伤表面。
实施例2:低毒、稳定的以壳聚糖-泊洛沙姆为凝胶基质的纳米银抗菌凝胶的制备
(1)纳米银原液、壳聚糖-泊洛沙姆抗菌凝胶制备同实施例1;
(2)在常温下先配置好16.4mL的加有200μL的冰醋酸溶液,然后加入1mL的纳米银原液与600μL的甘油并搅拌均匀,之后再依次加入100mg泊洛沙姆与0.42g的壳聚糖制备出含有纳米银的壳聚糖-泊洛沙姆溶胶,最后滴加NaHCO3溶液调节溶胶的pH约为6。经过一段时间的凝胶化后得到低毒、稳定的以壳聚糖-泊洛沙姆为凝胶基质的纳米银抗菌凝胶,pH在5.4~5.8之间,为淡黄色或灰黄色半透明稠厚液体,凝胶均匀细腻,无相分离,粘稠度适宜,涂展性良好,不油腻,不易黏附于湿润的创伤表面。
实施例3:低毒、稳定的以壳聚糖-泊洛沙姆为凝胶基质的纳米银抗菌凝胶的制备
(1)纳米银原液、壳聚糖-泊洛沙姆抗菌凝胶制备同实施例1;
(2)在常温下先配置好15mL的加有200μL的冰醋酸溶液,然后加入2mL的纳米银原液与1mL的甘油并搅拌均匀,之后再依次加入200mg泊洛沙姆与0.48g的壳聚糖制备出含有纳米银的壳聚糖-泊洛沙姆溶胶,最后滴加NaHCO3溶液调节溶胶的pH约为6。经过一段时间的凝胶化后得到低毒、稳定的以壳聚糖-泊洛沙姆为凝胶基质的纳米银抗菌凝胶,为淡黄色或灰黄色半透明稠厚液体,凝胶均匀细腻,无相分离,粘稠度适宜,涂展性良好,不油腻,不易黏附于湿润的创伤表面。
实施例4:性能测试
对实施例1~3制备得到的凝胶进行相关性能测试,具体如下:
(1)稳定性测试:分别取实施例1~3制备得到的凝胶各5g,置于10mL离心管中,以4000r/min离心30min,离心后凝胶外观及涂展性均无明显变化,说明本发明的凝胶具有很好的稳定性。
(2)纳米银粒径测定:
样品的准备:将实施例1新制备好的纳米银原液取适量放入比色皿中,避光保存。
空白组的准备:配置好含有同等浓度柠檬酸三钠和泊洛沙姆407的溶液,取适量放入比色皿中,等待测定。
波长-吸光度曲线的绘制:使用紫外可见分光光度计,对样品在300~500nm波长下的吸光度进行测定,结果如图1所示。根据熊金钰等人在纳米银的制备及表征里关于最大吸光度与纳米银平均粒径的关系(如表1所示),由图1可见,本发明制备得到的纳米银样品的最大吸光度为414nm,则平均粒径为60nm左右。
表1吸收峰的位置与粒径的关系
再利用扫描电镜(SEM)对纳米银原液进行观察:取一或两滴纳米银原液滴于干净的载玻片上,置于烘干机内烘干并进行表面喷金处理。在10kV电压、放大100000倍、高真空模式等技术参数下,所得的扫描电镜图像如图2所示。由图2可知,所得的纳米银颗粒的粒径范围多在30~90nm之间,因此平均粒径应在60nm左右,印证了紫外可见分光光度计试验中的结论。
(3)凝胶的抑菌圈试验
样品的准备:通过添加不同体积的新制备好的纳米银原液,分别制备浓度梯度为24、18、12、6、3μg/mL的纳米银抗菌凝胶,并分别取10mL置于的离心管中密封避光保存,5种浓度梯度的样品的标号分别为1~5。
空白对照组的准备:制备10mL的不含纳米银的空白凝胶,并用离心管密封保存,样品标号为6。
供试菌:使用金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)和大肠杆菌(革兰氏阴性菌)进行抑菌圈试验,均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,CICC。
抑菌圈试验步骤:将已活化好的供试菌(浓度约为108/mL)取1~2μL置于离心管中,用经过高压灭菌处理的PBS溶液(pH=7.4)1mL将细菌悬浊液稀释到105/mL的量级,轻轻震荡均匀后置于恒温培养箱中备用。使用涂布法,向已凝固冷却的琼脂培养基表面分别涂布稀释过的细菌悬液。利用打洞法,将培养基打出大小一致的孔洞(本试验所打孔洞直径为9mm),每个培养皿打3个孔洞,作为平行组。向打好的孔洞中注入凝胶样品。最后,将培养皿置于恒温培养箱中,37℃下培养24h后测量抑菌圈大小。抑菌圈试验结果如表2所示:
表2凝胶的抑菌圈实验结果
凝胶样品 大肠杆菌组抑菌圈(cm) 金黄色葡萄球菌组抑菌圈(cm)
1 1.51 1.857
2 1.50 1.823
3 1.357 1.543
4 1.203 1.397
5 1.20 1.38
6 1.20 1.37
结论:大肠杆菌组与金黄色葡萄球菌组都具有明显的抑菌圈。在大肠杆菌组中,可以看到24μg/mL与18μg/mL凝胶样品小组的抑菌圈大小没有明显差异,但随着浓度梯度的降低,抑菌圈随之变小。且纳米银浓度为12μg/mL的小组与浓度为6、3、0μg/mL的三个组有比较明显的抑菌能力差异。而浓度为6、3、0μg/mL的三个组在对大肠杆菌的抑菌能力上无明显差异。在金黄色葡萄球菌组中,也出现类似的情况,可以看到纳米银浓度为24μg/mL与18μg/mL的凝胶样品小组的抑菌圈大小没有明显差异,而浓度为12μg/mL的小组与浓度为6、3、0μg/mL的三个组有比较明显的抑菌能力差异。且6、3、0μg/mL三组在对大肠杆菌的抑菌能力上无明显差异。最后,通过对比大肠杆菌组与金黄色葡萄球菌组在同等浓度下的抑菌圈大小,可以知道纳米银抗菌凝胶对金黄色葡萄球菌的抑制能力比大肠杆菌更好。
(4)细胞毒性试验
1)实验组的准备:通过添加不同体积的新制备好的纳米银原液,分别制备浓度梯度为0、3、6、12、18、24μg/mL的纳米银抗菌凝胶,并分别取10mL置于离心管中密封避光保存,6种浓度梯度的样品的标号分别为1~6。
2)阴性对照组的准备:制备适量不含纳米银凝胶,仅含有10%胎牛血清(FBS)的H-DMEM培养基,用以培养L929细胞。
3)供试细胞:小鼠成纤维细胞L929,购自biowit technologies,百恩维生物。
4)实验步骤:
①细胞培养与接种
将细胞培养在含有10%胎牛血清(FBS)的H-DMEM培养基中,并在5%CO2浓度,37℃环境下培养。培养基每三天替换一次。培养贴壁细胞使其达到80%左右的汇合度。细胞在培养基中传代,使用其第5~10代的细胞进行试验。
把培养的细胞接种在24孔板中(5000个/孔),在含有10%胎牛血清的H-DMEM培养基中培养24小时。之后,按照国标GB/T16886.5的方法制备浸提液。即液体和凝胶类产品按体积与浸提介质体积之比为1mL:9mL制备。其中浸提介质为含有10%胎牛血清(FBS)的H-DMEM培养基。在37±2℃条件下浸提24h后,取其浸提液,并用此浸提液再培养L929细胞24小时。
②CCK-8试验
在培养24小时后,使用CCK-8方法来评估凝胶的生物相容性。即在指定的时间点,将细胞用PBS溶液冲洗3次。然后每孔加入含有35μL CCK-8溶液的350μL的完全培养基。在37℃、黑暗环境下培养2小时后,将培养液转移到新的96孔板中,每孔100μL。使用ELISA platereader在450nm波长下测量溶液的光密度(OD)值。
5)相对增值率的计算
所测得的OD值通过以下公式计算其相对增值率(RGR):
6)毒性反应评级
按照表3进行凝胶的细胞毒性评级:
表3细胞毒性级别
毒性评级 RGR/%
0 ≥100
1 80~99
2 50~79
3 30~49
4 0~29
7)实验结果如表4所示
表4凝胶细胞毒性测试结果
样品 RGR/% 细胞毒性分级
1 88.1 1
2 82.5 1
3 81.4 1
4 72.9 2
5 61.5 2
6 52.2 2
由结果可知,纳米银浓度为0、3、6μg/mL的凝胶都具有优良的生物相容性,细胞毒性评级都达到1级。纳米银浓度为12、18、24μg/mL的凝胶具有良好的生物相容性,细胞毒性评级可达2级。综合抑菌能力与生物相容性,可得该凝胶体系中,最佳的纳米银浓度为12μg/mL。
(5)粘度试验
1)实验组的准备:按照实施例2的配方制备纳米银抗菌凝胶。
2)试验步骤:使用旋转式粘度计(仪器型号:BROOKFIELD DV-Ⅱ+Pro Viscometer)对试验样品进行粘度测试。
3)试验条件:凝胶体系温度为28.9℃,试验样品使用2号转子测试。
4)试验结果如表5所示,本发明凝胶的粘度随着转速的增大而快速变小,为非牛顿流体。
表5凝胶的粘度实验结果
(6)涂展性与粘性
1)实验样品的制备:按照实施例2制备两份凝胶样品,其中一份含有泊洛沙姆407(记为样品1),另一份不含泊洛沙姆407(记为样品2)。
2)实验步骤:用玻璃棒取适量凝胶涂在纱布上,观察其涂展性;将涂有凝胶的纱布轻轻覆盖到沾有少量水的湿润的皮肤上5分钟,揭开观察凝胶对皮肤的黏附性。
3)实验结果:壳聚糖-泊洛沙姆凝胶体系(样品1)相比于壳聚糖体系(样品2),具有更好的涂展性,能更方便地涂抹到纱布上。且样品1对皮肤的黏附性相比于样品2更小,即有更少量的凝胶样品残留于皮肤上,且两者都可较轻易地去除残留凝胶。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种以壳聚糖-泊洛沙姆为凝胶基质的纳米银抗菌凝胶,其特征在于由包括以下具体步骤的方法制备得到:
向硝酸银水溶液中加入泊洛沙姆,搅拌均匀,再加入柠檬酸三钠,搅拌均匀后在紫外光下照射,得到纳米银原液;往纳米银原液中加入冰醋酸溶液、甘油,搅拌均匀,再加入泊洛沙姆与壳聚糖,得到纳米银的壳聚糖-泊洛沙姆溶胶,调节pH,静置使其凝胶化,得到纳米银抗菌凝胶;
所述纳米银抗菌凝胶中,壳聚糖的浓度为1.8~2.4 wt%;
所述纳米银抗菌凝胶中,纳米银的含量为3~24μg/mL;
所述纳米银抗菌凝胶中,泊洛沙姆的含量为1‰~1%。
2.根据权利要求1所述的以壳聚糖-泊洛沙姆为凝胶基质的纳米银抗菌凝胶,其特征在于:所述纳米银抗菌凝胶中,甘油的含量为1~5 wt%。
3.根据权利要求1所述的以壳聚糖-泊洛沙姆为凝胶基质的纳米银抗菌凝胶,其特征在于:所述冰醋酸溶液的浓度为1~2 %。
4.根据权利要求1所述的以壳聚糖-泊洛沙姆为凝胶基质的纳米银抗菌凝胶,其特征在于:所用硝酸银和柠檬酸三钠的摩尔比为1:1~2.5:1。
5.根据权利要求1所述的以壳聚糖-泊洛沙姆为凝胶基质的纳米银抗菌凝胶,其特征在于:所述紫外光照射的时间为4~6 h。
6.根据权利要求1~5任一项所述的以壳聚糖-泊洛沙姆为凝胶基质的纳米银抗菌凝胶在制备烧伤创面药物中的应用。
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