DD297170A5 - Verfahren zur fixierung von lipidschichten an polymeren traegeroberflaechen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Fixierung von Lipidschichten an polymeren Traegeroberflaechen. Dieses neuartige Kompositmaterial wird angewendet als biokompatible Matrix in der Medizin, in der Zell- und Gewebezuechtung, als Traegermaterial fuer die Bioaffinitaetschromatographie, bzw. fuer immunodiagnostische Verfahren und nach Enzymfixierung in Bioreaktoren zur biotechnologischen Stoffwandlung. Das Wesen der Erfindung besteht darin, Lipide kovalent ueber ihre Kopfgruppe an der Oberflaeche monodisperser Melamin/Formaldehyd-Kugeln zu binden, indem vor der Kupplung entweder die Methylolgruppen an der Traegeroberflaeche oder die Lipidkopfgruppen aktiviert werden und danach die entstandene Lipidmonolayer durch Adsorption zusaetzlichen Lipids zu einem Bischichtsystem aufzubauen.{Oberflaechenbeschichtung; Traegeroberflaeche, polymer; Lipid; Lipidschicht; Monolayer; Bilayer; Proteine, membrangebunden}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Fixierung von Lipidschichten an polymeren Trägeroberflächen.

An derartigen oberflächenmodifizierten Polymerpartikeln können sich membrangebundene Eiweiße in spezifischer Weise anlagern. Lipidbeschichtete Trägermaterialien sind für den Einsatz in der medizinischen Diagnostik, speziell für immunologische Verfahren geeignet, sie können als biokompatible Matrix in der Medizin und in der Zeil- und Gewebezüchtung verwendet worden und eignen sich auch als Trägermaterial für chromatographische Verfahren (HPLC und Bioaffinitätschromatographie).

Nach Enzymfixierung an solcherart lipidbeschichteten Polymeroberflächen können sie in Bioreaktoren zur biotechnologischen Stoffwandlung eingesetzt werden.

Auch als Membranmodell in der biochemischen Forschung sind lipidbeschichtete Trägermaterialien nutzbar.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Bekannt sind Verfahren /1,2,3/ zur oberflächlichen, kovalenten Fixierung von Phospholipiden und Glycolipiden über ihre Kopfgruppe an Methylmethacrylatpartikel. Durch nachfolgende Lipidadsorption wurde eine Bilayerbeschichtung erreicht.

Dieses Bilayersystem ähnelt dem Aufbau der normalen Zellmembran, es ist regenerierbar, und es können darin membrangebundene Eiweiße stabil inkorporiert werden.

Für den Einsatz als Träger wurden bisher nichtporöse CALLOCRYL-Partikel, mikroporöses / CRYLEX-Material und makroporöse Perlzellulose beschrieben. Als Lipide wurden Phosphatidylethanolamin und einige Glycolip Ie eingesetzt und als Spacer wurde bisher nur Pentaalanin verwendet. Die Einführung eines Spacers ist notwendig, wenn transr embrane Eiweiße incorporiert werden sollen.

Die Nachteile der so erhaltenen Materialien liegen in ihrer Größenheterogenität, in der geringen Resistenz gegenüber organischen Lösungsmitteln, in den hohen Herstellungskosten für Träger, Lipid und Spacer und in den extrem alkalischen Bedingungen für die Trägerderivatisierung, die zu uneinheitlichen Produkten führt.

Des weiteren ist die Fixierung einer Lipidmonoschicht an aminopropylmodifiziertes Kieselgel (Nucleosil-300) bekannt /4/.

Allerdings erfolgt die kovalente Kupplung hier über eine zuvor in die KW-Kette des Lipids eingeführte terminate COOH-Gruppe.

Damit ist nur eine Monolayerbeschichtung möglich.

Ferner wurden durch Adsorption erzeugte Lipidauflagen an Polystyrol-Trägerkugeln untersucht /5/. Die Langzeitstabilität solcher adsorbierter Lipidschichten ist unbefriedigend.

Ferner ist bekannt /6,7,8/, Lipidschichten an planen Flächen (Glas, Glimmer, silanisiertes Glas) zu adsorbieren. Dabei bildeten sich an diesen Oberflächen zwar geordnete, regulär strukturierte Lipidmono- und Bilayer aus, jedoch waren diese Schichten empfindlich gegen mechanischen Streß und konnten durch Detergenzeinwirkung zerstört werden,

Literatur:

1. Rolhe, Ulrich Dissertation B (1989) MLU Halle

2. Rothe, U. und Aurich, H. Biotechnology and applied Biochemistry 11 (1989) 18-30

3. Rothe, U. und Aurich, H. Wiss. Beitrage der MLU WB 1989/32 (P38) S.40-61

4. Pidgeon, C. und Venkolaram, U. V. Analyt. Biochem. 176 (1989) S. 36-47

6. Reuinger, G.S.; Meredith,CS.; Lau, S.H.; Kaiser, E.T.; Kezdy, F.J. Analyt. Biochem. 150 (1985) S. 131-140

6. v.Tscharner.V.; McConnell.H.M.Biophys. J.36(1981)S.421-427

7. Tamm, L. K.; McConnell, H. M. Biophys. J. 36 (1985) S. 105-113

8. Sagiv,J.;J.Amer.Chem.Soc.102(1980)S.82-98

Ziel der Erfindung

Es ist das Ziel der Erfindung, an der Oberfläche geeigneter polymerer Materialien eine fest gebundene und dicht gepackte Lipidschicht zu erzeugen, an die durch Adsorption eine weitere Lipidschicht angelagert werden kann, so daß eine der biologischen Membran ähnliche Bilayer entsteht.

-2- 297 170 Darlegung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Beschichtung polymerer Trägeroberflächen mit einer dicht gepackten und durch

kovalente Bindung fest fixierten, monomolekularen Lipldauflage zu entwickeln, wobei die so fixierte Lipidmonoschicht durch

Adsorption zusätzlichen Lipids in eine Bilayer umgewandelt werden kann. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß Methylolgruppen an der Oberfläche monodisperser Melamin/ Formaldehyd-Polymerkugeln mit Teilchengrößen Im Bereich von 1-10μηι mit Fluormethylpyridin aktiviert werden und daß

danach Lipide mit Amlno-Kopfgruppen an die aktivierte Oberfläche gekuppelt werden.

Die funktioneilen Gruppen der Partikeloberfläche reagieren auch ohne vorherige Aktivierung, wenn Lipide eingesetzt werden,

die zuvor an ihrer Kopfgruppe aktiviert wurden.

Da die Träger lösungsmittelreslstent sind, gelingt die Lipldkupplung auch in organischem Milieu mit hohen Ausbeuten. Die

erfindungsgemäß erhaltene Lipldschicht kann auf verschiedene Weise modifiziert werden. Durch nachträgliches Anlagern vonverschiedenen Lipiden oder Lipidgemlschen wird eine Bilayer ausgebildet, die sowohl symmetrisch als auch asymmetrischaufgebaut sein kann. Gleichfalls können hydrophile, linear gebaute Spacermoleküle mit variabler Länge im Bereich von 10-50Azwischen Trägeroberfläche und der inneren Lipidschlcht eingefügt werden.

In die er iindungsgemäß hergestellten Lipiddoppelschlchten können membrangebundene Eiweiße unter Erhalt Ihrer Funktion

stabil inkorporiert werden.

Ausführungsbeispiel Die Erfindung wird nachfolgend an 6 Beispielen beschrieben.

1. Melamln-Harz und Phosphatldylethanolamln (FMP-Aktlvlerung)

1 g trockenes Trägermaterial (Melamin/Formaldehyd-Latex) mit einem Partikeldurchmesser von 2,1 μιη und einer Oberflächevon ca. 2,8m² (Lerche, K-H. und Kretschmar, G. WP DD 224 602 A1) wird in 10 ml trockenes DIV.F eingerührt. Die Suspension wirdentgast und dem gerührten Ansatz werden 0,9g (3,2 mMol) FMP zugefügt. Die Aktivierung oberflächlicher Methylolgruppen istnach Sstündigem Schütteln bei 2O⁰C beendet. Das aktivierte Polymermaterial wird auf einer Fritte mit DMF gewaschen und nachdem Absaugen überschüssiger Flüssigkeit in den Kopplungsansatz überführt.

Kopplungsansatz A: 5 ml eines 5OmM Karbonatpuffers pH 8,3 der 1%ig an Oktylglucosid ist und 50 mg Phosphatidylethanolamin

(Dihexadecyl-etherlipld) enthält und 3min mit Ultraschall dispergiert wurde.

Kopplungsansatz B: 50mg PE gelöst in 5ml trockenem CHCI₃. In beiden Fällen wird die Suspension 24h bei Raumtemperatur

geschüttelt. An Hand des im Überstand bei 297 nm nachweisbaren Reaktionsprodukts Methylpyridon kann der Reaktionsverlaufphotometrisch verfolgt werden.

Nach dem Waschen des lipidierten Trägers werden verbliebene FMP-aktivierte OH-Gruppen mit 0,1 M Ethanolamin umgesetzt.

2. Melamln-Harz und O-Succinyl-Cardiolipln

15mg (10μΜοΙ) des durch Reaktion von Cardiolipin mit Succinanhydrid in Gegenwart von Dimethylaminopyridin in Pyridin hergestellten O-Succinyl-Cardiolipins werden nach Variante A in 5ml 1%iger wäßriger Oktylglucosidlösung suspendiert und durch3minütige Ultraschallbehandlung homogen dispergiert. Mit 1N HCI wird derpH 3,3 eingestellt und 10mg (50μΜοΙ) festes EDC zugefügt. Unter pH-Kontrolle wird 5min aktiviert. Danach gießt man das aktivierte Lipld in die vorbereitete Partikelsuspension (0,25g Melamin/Formaldehyd-Latex mit einem 0 = 2 pm in 5 ml 0,1 M Borax pH 8,5) und schüttelt über Nacht. Variante B nutzt die Resistenz des Trägers gegen organische Lösungsmittel aus. 15mg O-Succ-CL werden in 20ml Chloroform gelöst, und unter Rühren fügt man 0,25g Melamin/Formaldehyd-Latex sowie 0,5g Dicyclohexylcarbodiimid zu. Nach 5 Stunden ist die Reaktion beendet. Durch gründliches Waschen werden die Partikel von anhaftenden Dicyclohexylharnstoff befreit.

3. Einführung unterschiedlich langer PE-(PEG)-Melamin-Spacer

Die beiden endständigen OH-Gruppen von 3 verschiedenen PEG-Chargen (PEG 200,400 und 600) werden mit Succinanhydrid zum Halbester umgesetzt und die freien COOH-Gruppen in das aktive Imidazolid überführt (Ferruti, P.; Tanzi, M. C. und Vaccaroni, F. Macromol.Chem.180 [1979] S.375-382). 0,2g des PEG-200-lmidazolids (bzw. entsprechende Mengen der höheren Oligomeren) werden in 10ml trockenem Chloroform gelöst, und unter kräftigem Rühren fügt man 0,1 g Melamin/Formaldehyd-Latexpartikel zu. Die Umsetzung des Imidazolids mit oberflächlichen Amino-, bzw. rViethylolgruppen ist nach 4 h Lei 4O⁰C beendet. Das überschüssige, nichtreagierte PEG-Imidazolid wird mit Chloroform ausgewaschen. Anschließend wird der Träger erneut in 10ml Chloroform suspendiert und 50mg Phosphatidyl-ethanolamin aus Hühnerei, gelöst in 1 ml CHCI₃ zugesetzt. Man schüttelt über Nacht, filtriert und wäscht den Träger mit Chloroform, Methanol und Wasser.

4. Delipldlerungs-Rellpldlerungsverfahren für PE-Melamin-Harze

Die nach den Beispielen 1-3 hergestellten lipidbeschichteten Trägerpartikel können durch sukzessive Waschung mit dem 20fachem Trägervolumen Chloroform, Methanol und Wasser vom nur adsorptiv gebundenen Lipidanteil befreit werden (Delipidierung).

Durch Dialyse einer Suspension der delipidierten Partikeln gemeinsam mit einem beliebigen Lipid oder einem Lipidgemisch dispergiert in einem Detergenz mit hoher CMC (z. B. Oktylglucosid) gegen einen geeigneten detergenzfreien Puffer kann an die kovalent am Träger fixierte Lipidmonolayer eine zweite Lipidschicht angelagert werden (Relipidierung). Überraschenderweise gelingt die Ablösung und eine erneute Anlagerung dieser äußeren Bilayerhälfte problemlos um* wiederholt, so daß bilayerbeschichtete Partikel regenerierbar sind. Da die adsorptive Lipidanlagerung der oberen Schicht nicht von der Natur des fest gebundenen inneren Lipidanteils abhängt, lassen sich somit auf einfache Weise asymmtrisch aufgebaute Lipidschichten erzeugen.

5. Einbau membrangebundener Proteine In die träger!Ixlerte LlplddoppelschichtMembrangebundene Proteine besitzen hydrophobe Ankerstrukturen, mit denen sie In der Biomembran verankert sind. Sie können durch Detergenzbehandlung aus der Membran herausgelöst werden. 1 mg der Isolierten Ankerform (oder d-Form) der Dipeptldytpeptidaee IV (DPP IV) wurden In 1 ml 1%iger Oktylglucosldlösung (5OmM Trls/HCI pH 7,8) aufgenommen und gemeinsam mit 5ml Trägersuspension (enthaltend 100mg des delipidierten Trägers hergestellt nach Beispiel 4) sowie 20mg Eilecithin (dispergiert in 1 ml 1%lger wäßriger Oktylglucosldlösung) In einem rotierenden Dialyseschlauch 24h gegen einen geeigneten detergenzfreien Puffer dialysiert. Nichtgebundenes Lipid und Protoin werden anschließend durch intensives Waschen der Partikel entfernt. 72% der eingesetzten Enzymaktivität war fest an der Trägoroberfläche fixiert.

Claims (4)

1. Verfahren zur Fixierung von Lipidschichten an polymeren Trägeroberflächen, gekennzeichnet dadurch, daß die Methylolgruppen monodisperser Melamin/Formaldehyd-Polymerkugeln mit Teilchengrößen im Bereich von 1-10Mm mit Fluormethylpyridin aktiviert werden und danach Lipide über ihre Aminokopfgruppe an die aktivierte Oberfläche gekuppelt werden oder daß an der Kopfgruppe modifizierte Lipide verwendet werden, die mit funktioneilen Gruppen an der Trägeroberfläche (-NHz, -CH2-OH) reagieren und daß an die entstandenen Monolayer durch Adsorption eine zweite Lipidschicht unter Ausbildung einer Bilayer angelagert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß verschiedene Lipide oder Lipidgemische zur Ausbildung der Bilayer eingesetzt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Bilayer symmetrisch oder asymmetrisch aufgebaut wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Oberfläche der Partikel vor der Lipidkupplung durch Finfüh <ng hydrophiler, linear gebauter Spacermoleküle mit variabler Länge im Bereich von 10-50Ä modifiziert wurde.