WO2006002616A1 - Kompositmaterialien mit tetraetherlipiden und deren herstellung - Google Patents

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WO2006002616A1
WO2006002616A1 PCT/DE2005/001162 DE2005001162W WO2006002616A1 WO 2006002616 A1 WO2006002616 A1 WO 2006002616A1 DE 2005001162 W DE2005001162 W DE 2005001162W WO 2006002616 A1 WO2006002616 A1 WO 2006002616A1
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tetraether
groups
lipids
composite materials
tetraether lipids
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PCT/DE2005/001162
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Inventor
Udo Bakowsky
Carsten Kneuer
Ulrich Rothe
Klaus Liefeith
Marion Frant
Karin Dölling
Ruth Schmid
Heidi Johnsen
Per Martin Stenstad
Original Assignee
Surface And Interface Technologies Rosenhof Gmbh
Institut Für Bioprozess-Und Analysenmesstecnik E.V.
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    • B05—SPRAYING OR ATOMISING IN GENERAL; APPLYING FLUENT MATERIALS TO SURFACES, IN GENERAL
    • B05D—PROCESSES FOR APPLYING FLUENT MATERIALS TO SURFACES, IN GENERAL
    • B05D1/00—Processes for applying liquids or other fluent materials
    • B05D1/18—Processes for applying liquids or other fluent materials performed by dipping
    • B05D1/185—Processes for applying liquids or other fluent materials performed by dipping applying monomolecular layers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
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    • C07D323/00—Heterocyclic compounds containing more than two oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
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    • C09D5/00—Coating compositions, e.g. paints, varnishes or lacquers, characterised by their physical nature or the effects produced; Filling pastes
    • C09D5/16—Antifouling paints; Underwater paints
    • C09D5/1606—Antifouling paints; Underwater paints characterised by the anti-fouling agent
    • C09D5/1612—Non-macromolecular compounds
    • C09D5/1625—Non-macromolecular compounds organic

Definitions

  • the invention relates to novel composite materials prepared using tetraether lipids with small head groups and synthetically generated reaction products derived from this structure.
  • lipid-coated matrices can also be used for the chromatographic separation of membrane-bound proteins (DE 19814775 and US Pat. No. 6051372), the temperature-dependent change in the viscoelastic properties and the lateral charge distribution of the lipid matrix being used as separation principle.
  • the starting material of the tetraether lipids used in the present specification for surface modification are bipolar membrane-spanning amphiphiles originally isolated from natural sources (archaebacteria) (Langworthy et al., System Appl. Microbiol 1986, 7, pp. 253-257 and Gulik et al. , J. Mol. Biol. 1985 J82 p.131-149). Tetraether lipids possess remarkable chemical and biological stability and are capable of organizing at interfaces with monomolecular layers or forming vesicles (Lo & Chang in Biochem., Biophys. Res. Commun. 1990 167 p.238-243 and Bakowsky et al in Chem. Phys., Lipids 2000, 105, pp.
  • the invention is therefore based on the object to develop composite materials using tetraether lipids with small head groups, which have high stabilities and novel properties. Another object of the invention is the development of a suitable process for the preparation of said composite materials.
  • the composite materials with tetraether lipids are characterized by covalently coupled monomolecular layers of tetraether lipids with small head groups. (DE 10228857) on planar or curved surfaces of base materials, wherein 1.1 have the tetraether lipids with small head groups following general structure
  • the composite materials according to the invention are characterized in that additional hydrogels bound to reactive head groups of the tetraether lipids, including those having a cationic, anionic, zwitterionic or uncharged nature, cover the composite surface.
  • additional hydrogels bound to reactive head groups of the tetraether lipids including those having a cationic, anionic, zwitterionic or uncharged nature, cover the composite surface.
  • specific ligands as well as bioactive substances and aggregates covalently bonded to reactive groups of the tetraether lipids or hydrogels may be contained on the surface of the composite materials.
  • the process for producing the composite materials according to the invention is claimed in the characterizing features of claims 6 and 7.
  • the surfaces of the base materials for covalent attachment of Tetraetherlipide be preactivated with small head groups or according to claim 7 Tetraetherlipide with reactive, small head groups are covalently bonded to the base material or an intermediate layer, the tetraether lipids can be used as mono- or disubstituted variant , Archaebacterial lipids, due to their evolutionary position, have special properties compared to lipids from eubacteria and eukaryotes (temperature resistance, chemical resistance, reduced biodegradability). These features make them unique with regard to specific applications.
  • the invention relates to novel composite materials which are characterized by a covalent modification with specific derivatives of such lipids, so-called tetraether lipids, their advantageous properties and their use for selected purposes.
  • Another object of the present invention is to provide methods for producing such composites. Special tetraether lipids with small head groups are used for this purpose. Such composites are particularly suitable
  • the physico-chemical properties of the surface e.g. the free energy and the wettability and / or the surface morphology changes. This makes it possible to bring about targeted suppression or activation of the interaction with biological substrates (serum, cell cultures, tissue).
  • biological substrates serum, cell cultures, tissue.
  • the model studies carried out are indicative of later application in vivo, in vitro and ex vivo.
  • targeted bioactive species can be fixed to the surface.
  • bioactive species such as enzymes, organic catalysts, ribozymes, organometallic compounds, proteins, glycoproteins, peptides, polyamino acids, nucleic acids, antibodies or subcomponents thereof, carbohydrates, cytokines, lipids and extracellular matrix components, inter alia. the basis for specific biological properties.
  • negatively charged groups preferably carboxyl, phosphate or sulfate or sulfonate groups
  • positively charged groups preferably quaternary nitrogen compounds.
  • hydrophilic groups on the surface of the composite according to the invention is possible, especially suitable for it are polyethylene glycols and carbohydrate oligomers. Furthermore, a stable, self-supporting, monomolecular pore overvoltage is realized on the modified material surface.
  • the tetraether lipids are previously covalently coupled to hydrophilic chain polymers (eg polylysine).
  • both the preorganization of the modified tetraether lipids at the water / air interface and subsequent transfer of the Flims with the Langmuir-Blodgett method to the matrix materials as well as the self-assembly method can be used from organic solvents. It is possible to anchor the resulting surface film both chemisorbed and physisorbed on the substrate. With this method it is possible to produce surface layers with a thickness of 4 nm to 100 nm.
  • the composites according to the invention can furthermore be used as affinity separating materials.
  • base materials are commercially available porous supports on ceramic, glassy, silicate or polymeric basis, such. polystyrene,
  • the lipid was dissolved in acetone at a concentration of 1 mg / ml.
  • Alternative solvents which were also used successfully were chloroform and a 1: 1 mixture of chloroform and methanol.
  • the silicone film was immersed for 2 hours at 40 0 C in the lipid solution.
  • the reaction was carried out with addition of N, N-diisopropylethylamine as catalyst.
  • unbound lipid was removed by washing the film several times with acetone or chloroform and finally with methanol.
  • the contact angle changed only insignificantly due to the coating with tetraether lipid.
  • Glass surface sensor chips were cleaned and activated with ozone generating UV radiation.
  • the surface to be coated was placed at a distance of 5 mm under a Xeradex lamp and exposed to UV radiation with a wavelength of 173 nm for 5 min.
  • the sensor was immediately immersed in the solution with cyanuric chloride-activated TL (1 mg / ml solution in chloroform) and at 70 0 C. reacted for 12 h under pressure in a closed Teflon chamber. Excess lipid was washed with chloroform after sonication and the surface dried in a stream of nitrogen.
  • the surface was cleaned with sulfuric acid / hydrogen peroxide and then preactivated by applying an aminoalkyl silane layer (1 mmol solution of aminobutyl dimethyl chlorosilane in dry chloroform).
  • the contact angle of the surfaces so lipidated was between 60 and 70 °.
  • the reactivity of the cyanuric chloride functions contained on the lipid surface was detected by coupling of a fluorescent molecule (fluorescein isothiocyanate) and fluorescence microscopy and was maintained for at least 2 weeks.
  • the composite was active, for example with a mixture of taurine (aminoethanesulfonic acid), and glycine (aminoacetic acid) in a ratio of 10: 1 respectively in borate buffer pH 8.8 for 12 h at 50 0 C.
  • the resulting surface had a negative zeta potential due to the presence of sulfonic and carboxylic acid groups, and the COOH group was successfully used to attach sensor molecules such as antibodies / proteins via the carbodiimide method.
  • the reactivity of the cyanuric chloride group of the tetraether-lipid-glass composite surface was used for the covalent coupling of aminobiotin, which in turn allowed the connection of diverse sensor molecules via biotin-avidin-biotin bridges.
  • tetraether lipid composites based on glass (borosilicate glass, B33) and silicone.
  • the biological model system was a mixed culture of staph. epidermidis and staph. aureus in the ratio 50:50 for use, which are known mainly as biofilm-forming infection germs from the biomedical field.
  • a tetraether lipid layer was covalently bonded to the surface on both substrates and the subsequent derivatization was carried out in accordance with the defined modification.
  • the peggylation is carried out with polyethylene glycol PEG 5000, which acts as a water-binding or hydrophilic surface group (TL-PEG).
  • Bioadhesion was quantified on the basis of the counted adhered microorganisms associated with a visualization using a live / dead staining (BacLight ®) using a fluorescent dye.
  • the Figures 6 and 7 show the significantly reduced cell numbers on the composite surfaces after 24 h incubation time. Furthermore, the preservation of cell vitality was observed with reduced bioadhesion.
  • Figure 2a Number of cells (live / total) per square centimeter after 24 h incubation of the base material glass and the glass-TL-PEG composite material (static conditions)
  • Figure 2b Cell count (live / total) per square centimeter after 24 h incubation of the base material silicone and the silicone TL-PEG composite material (static conditions)
  • Figure 3A / B SEM images (350Ox) of the adherent bacteria after 24 h incubation of the base material glass B33 (left) and the glass TL-PEG composite material (right).
  • the adherent bacteria appear as a white contrast. Their number is significantly reduced on the TL-modified surface.
  • Figure 3A / B SEM images (350Ox) of the adhered bacteria after 24 h incubation of the base material silicone (left) and the silicone TL-PEG composite material (right). The adherent bacteria appear as a white contrast. Their number is significantly reduced on the TL-modified surface.
  • the flow channel of the bypass cell used had a dimension of 15 mm x 1 mm.
  • Escherichia coli indicator germ for fecal contamination
  • the simulation of biofilm formation was based on an accumulation phase (seed phase), followed by a proliferation phase (feed phase).
  • the analysis of the proliferation behavior was carried out by confocal laser scanning microscopy over a period of 5 h and thus enabled the description of the initial biofilm formation under dynamic conditions.
  • covalently fixed tetraether lipid layers were available, which on the one hand with Polyethylene glycol PEGylated to create a biomimetic layer.
  • a second modification served to generate an inert lipid film coupled to a negatively charged surface to attach glycine.
  • the laser micrographs after 3 h incubation ( Figure 4) and the adhesion kinetics ( Figure 5) show a marked reduction in bioadhesion even under dynamic flow conditions.
  • Figure 4 A-C CLSM micrographs of bacterial adhesion after 3 h in a flow chamber on A: glass, B: TL-PEG modified glass composite, C: TL glass composite with additional negative charge.
  • the adherent bacteria appear as bright structures. On the tetraether lipid-modified surface, the number is greatly reduced.
  • Quartz crystals (18mm diameter) designed for QCM measurements with a 160 nm thick gold coating should be covered by a stable and hydrophobic layer, which, in contrast to gold, has a chemical reactivity that allows permanent attachment of ligands to the sensor.
  • the gold surface of the base material was cleaned and activated with high-energy ozone-generating VUV radiation.
  • the gold surface was placed at a distance of 5 mm under a Xeradex lamp and exposed for 5 min UV radiation of 173 nm. It formed a thin, about 2 nm thick gold oxide layer.
  • the contact angle against water dropped correspondingly from 54 ° for pure gold to values below 10 ° after irradiation.
  • the senor was immediately immersed in a solution with tetraether lipid mesylate (1 mg / ml solution in chloroform) and coated at 70 0 C for 12 hours. Excess lipid was removed with chloroform with simultaneous sonication and the surface dried in a stream of nitrogen. The contact angle increased to values of 70 ° after the lipid coating. By ellipsometric method, a layer thickness of 3.2 nm was detected. If the disubstitution product (tetraether lipid dimesylate) was used at least partially for the lipidation, the free mesylate functions exposed on the lipid surface could be used for further surface functionalization.
  • disubstitution product tetraether lipid dimesylate
  • the sensors were immersed for 12 h in a solution containing 0.1 mg / ml of a monoclonal antibody against cathepsin B in borate buffer pH 8. After intensive rinsing with PBS, the coated sensor was placed in a QCM flow cell and successfully used for the analytical detection of cathepsin B in diluted serum samples.
  • the free amino groups of the polymer were first partially converted into carboxyl groups by incubation with a 10OmM solution of glutaric anhydride (PBS, 2h, RT, freshly prepared solution). It was then rinsed with water and dried in a stream of nitrogen (contact angle 18 °).
  • PBS glutaric anhydride
  • the carboxyl groups were reacted with N-hydroxysuccinimide and diisopropylcarbodiimide (1M in dimethylformamide, 4h, RT), then rinsed with dimethylformamide and again dried in a stream of nitrogen.
  • the modification of the material surface was followed by known physical-chemical investigation methods, such as contact angle measurement, ellipsometry, FT-IR and AFM.
  • a hydroxyl-containing solid was reacted with sodium hydride dispersed in tetrahydrofuran. This approach was heated to reflux for 6 hours at reflux. The free hydroxyl groups are converted into this by this reaction Converted to sodium salts. After separating the solid and the liquid phase, the surface was cleaned by repeated rinsing with tetrahydrofuran. Subsequently, the dissolved, for example with cyanuric activated tetraether lipid can be contacted with the surface.
  • the activation of the hydroxyl groups is also possible by incubation of the surface in 6 molar KOH or NaOH. Here, too, the hydroxyl groups are converted into their respective salts.
  • Activation of the hydroxyl groups is also accomplished by reaction with silanes, e.g. Trimethoxyaminoalkylsilan and the introduction of a free amino function on the solid surface, which replaces the hydroxyl group.
  • silanes e.g. Trimethoxyaminoalkylsilan
  • the pre-activation of the silica-containing spherical particles is carried out with aminoalkylsilanes, in particular trimethoxyaminoalkylsilane. Subsequently, the coupling with cyanuric chloride-modified tetraether lipid in the manner described.
  • the material was treated as follows. The samples were treated with conc. Sulfuric acid / H 2 O 2 (50:50, v: v) until a contact angle with water of less than 20 ° was observed.
  • the surface was then preactivated by application of an aminoalkylsilane layer (10 "3 mol / l solution of aminobutyldimethylchlorosilane in dry chloroform, rt, 1 hour), after which the sample was removed from the solution, washed with chloroform and dried in an oven at 125 ° C. for 2
  • the surface angle of the layer increased to about 48 °, the low surface roughness was maintained, and the thickness of the layer obtained was 0.6 nm (AFM) contacted with a cyanuric chloride solution in chloroform (10-3 mol / l, N, N diisopropylethylamine as catalyst, 5 hours, RT).
  • the lipid was dissolved in chloroform at a concentration of approximately 5 ⁇ 10 -3 mol / l The glass was immersed in the lipid solution for 10 hours. The thickness of the layer thus obtained was 3.8 nm, and the contact angle was 76 °.
  • a polished and cleaned steel sample (molar h in chloroform, 10 2X10 "4, RT) in a solution of the Monoethoxydimethylsilan-Tetraetherlipids immersed. Ansch manend the reaction solution was removed, dried in the steel at 125 ° C in a drying oven for 2 hours, excess lipid having Washed off the chloroform and dried the modified material under identical conditions again The angle of contact with water increased from 56 ° before the modification to 75 °. The layer thickness was 4.8 nm. The surface roughness was not measurably changed by the coating.
  • the contact angle with respect to water decreased depending on the reaction parameters to values between 88 ° and 115 ° (pure PTFE 125 °).
  • the surface morphology of the PTFE polymers was not changed.
  • the activation of the surface can be done in different solvents. Typically, chloroform, methanol, ethanol, dioxane, acetone or mixtures thereof with various catalysts, such as N 1 N-diisopropylethylamine or Dimethylfluoropyriden among other things, used.
  • the reaction was monitored and characterized by FT-IR spectroscopy. Upon coupling of cyanuric chloride to the PTFE surface, a new band was observed in the FT-IR.
  • the contact angle with respect to water increased from approx. 90 ° to 110 °.
  • the polymer activated in this way was storable for at least 2 weeks.
  • PTFE implant material for the prosthetic replacement of small-lumen blood vessels was oxidized by incubation for 15 minutes with a mixture of one part each of 30% hydrogen peroxide and 96% sulfuric acid on the luminal surface. The decrease in surface hydrophobicity was detected by measuring the wetting angle (water). This decreased from originally 125 ° to about 90 °.
  • An analysis of the IR spectrum showed next to the bands for unmodified PTFE new, characteristic of hydroxyl groups bands between 1000 and 1400 cm '1 .
  • the thus activated implant material was linked to the OH reactive crosslinker cyanuric chloride. This could be achieved after prior neutralization of the oxidized surface by incubation in a saturated solution of cyanuric chloride in chloroform for 30 minutes.
  • the successful covalent modification with cyanuric chloride was detected by IR spectroscopy.
  • the wetting angle increased from 90 ° to 110 ° after the reaction with cyanuric chloride Procedure not adversely affected.
  • PUR polyurethane surfaces
  • the PUR was contacted at RT with a concentrated (6N) NaOH for 20 min. The NaOH was then poured off and rinsed three times with distilled water.
  • the free amino groups could now be directly reacted with the cyanuric chloride-modified tetraether lipid derivative.
  • the lipid was dispersed in a buffer pH 8.4 and contacted at 40 0 C for 12 hours with the surface. Through a combined spreading and coupling mechanism, the surface was modified with the tetraether lipid derivative. Excess unbound lipid was removed by washing the surface several times with isopropanol / water (70/30 v: v).
  • Silicone gum and other silicone polymers can be prepared by treatment with alkali hydroxides, e.g. As NaOH or ammonium hydroxide, preactivate without affecting their structural properties. This leads to a cleavage of the Si-O bond, whereby hydroxyl groups are released for further activation or direct reaction at the material surface.
  • alkali hydroxides e.g. As NaOH or ammonium hydroxide
  • the silicone material was contacted at 37 ° C. for 3 hours with a solution of 5M NaOH. The solution was then poured off and the silicone rubber rinsed several times with distilled water. The free hydroxyl groups could now be reacted directly with the silane-Tetraetherlipid derivative. For this purpose, the lipid was dispersed and contacted at 4O 0 C for 12 hours with the surface. Excess unbound lipid was removed by washing the surface several times.
  • the free hydroxyl groups could be further activated by other techniques.
  • various aminoalkyl-alkoxysilanes were free Amino groups introduced on the surface.
  • the preactivated silicone surface was then immersed in pure aminopropyltrimethoxysilane at RT for 16 hours.
  • the solution was then poured off and dipped briefly 3 times in methanol and 3 times in distilled water.
  • the solid was dried at 8O 0 C for 17 hours and the last surface again rinsed three times with acetone, three times with methanol and three times with distilled water.
  • a pulsed excimer radiator generates high-energy UV radiation and additionally generates ozone at the irradiation site. This is suitable for freeing glass, ceramic and polymer surfaces but also metal surfaces with a thin oxide layer from organic soiling. At the same time, the radiation on the polymer surfaces causes a mass removal, so that a smoothing effect is observed.
  • Oxidative ablation generates reactive oxygen functionalities (activated hydroxyl groups, oxides or peroxides) on all (including the inorganic) surfaces, which can immediately combine with all activated tetraether lipids described above and lead to covalently fixed tetraether lipid monolayers, if the irradiated objects in the self-assembly process can be contacted with the lipids.
  • reactive oxygen functionalities activated hydroxyl groups, oxides or peroxides
  • a cyanuric activated tetraether lipid (it is irrelevant whether one or both sides are active) was for the coating of an amino group-containing solid surface in chloroform, dioxane, toluene, benzene, THF, acetone or mixtures thereof and dissolved with a tert.
  • Amine as a catalyst preferably N 1 N-diisopropylethylamine, added.
  • the endeavor to molecular self-assembly of the tetraether lipid led to a monomolecular, physical adsorption at the interface.
  • a chemical bond formed by reaction of the activated head group of the tetraether lipid with functional groups on the surface of the base material.
  • the reaction was carried out at temperatures between 20 0 C and 40 0 C over a period of 3-12 hours. Prerequisite for the reaction was the presence of suitable functional groups on the surface to be modified.
  • Reactive OH groups were generated on the material surfaces by the aforementioned methods. Thereafter, the hydroxyl-containing surface was incubated with cyanuric chloride-modified tetraether lipid (1 mg / ml) dissolved in acetone, chloroform or chloroform / methanol (1: 1). The reaction proceeded with the addition of tert. Amine as a catalyst, preferably N, N-diisopropylethylamine. The reaction time was 2 hours at 40 0 C. Excess unbound lipid was removed by washing the surface several times with acetone or chloroform and finally with methanol.
  • both the mono- and the disubstitution product of the tetraether lipid (mesyl-TL-mesyl) were used, the latter producing superficially exposed mesyl groups on the composite, which were reacted with further hydroxyl or amino-containing low molecular weight or polymeric substances.
  • Figure 5 shows the result of modifying a commercially available dialysis tube (cellulose) according to this method.
  • the material was immersed in a chloroform, 6O 0 C warm solution of tetraether lipid mesylate (1 mg / ml), removed from the solution after 12 hours and rinsed intensively with chloroform. Unused tetraether lipid was recovered by washing with chloroform. The thickness of the lipid layer was 3.8 nm.
  • the equilibrium edge angle (versus water) of the film increased from 21 ° to 69 ° by the modification. Even after repeated rinsing the edge angle remained unchangeable.
  • Comparable tetraether lipid composites based on hydroxyl-containing polymers, metals, ceramics and glasses were obtained by adaptation of the method described.
  • Base materials with natural oxide layer eg silicon sensors were used with conc. Sulfuric acid / H 2 O 2 (50:50, v: v) until a contact angle to water of less than 18 ° C was observed. Subsequently, the surface was by modification with an aminoalkylsilane preactivated (10 -3 mol / l solution of aminobutyl dimethyl-chlorosilane in dry chloroform, 150 cm2 / 50 ml solution, RT, 1 hour), intensively washed with chloroform and dried in nitrogen stream , After that was to Generation of a stable covalently bonded silane surface layer a heating at 125 0 C for 2 hours necessary. The contact angle of the layer increased to about 42 °.
  • the surface roughness did not change significantly.
  • the activated materials were contacted with a concentrated solution of succinic anhydride in PBS (2 hours, RT, RW 35 °), rinsed thoroughly with water and then dried at RT.
  • EDC ethyl (dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Kompositmaterialien mit Tetraetherlipiden, gekennzeichnet durch kovalent angekoppelte monomolekulare Schichten von Tetraetherlipiden mit kleinen Kopfgruppen an planare oder gekrümmte Oberflächen von benannten Basismaterialien. Zur Anbindung der Tetraetherlipide werden die Oberflächen der Basismaterialien voraktiviert oder es wird eine Zwischenschicht erzeugt. Die erfindungsgemäss hergestellten Kompositmaterialien sind unter anderem geeignet als Antihaftbeschichtungen, Bewuchsschutzoberflächen sowie biokompatible Oberflächen beziehungsweise spezifische Sensorbeschichtungen.

Description

KOMPOSITMATERIALIEN MIT TETRAETHERLIPIDEN UND DEREN HERSTELLUNG
Die Erfindung betrifft neue Kompositmaterialien, die unter Verwendung von Tetraetherlipiden mit kleinen Kopfgruppen sowie von dieser Struktur abgeleiteten, synthetisch erzeugten Reaktionsprodukten hergestellt werden.
In den Ingenieurwissenschaften, der Pharmazie, der Biotechnologie und der Biomedizin hat eine Vielzahl von Werkstoffen mit unterschiedlichsten Materialeigenschaften Eingang gefunden. Gerade in der modernen Medizintechnik werden diese als permanente oder temporäre Implantatmaterialien angewendet. Dabei können Eigenschaften von biologisch inert bis hin zu vollständig biokompatibel oder biodegradierbar notwendig sein. Eine seit geraumer Zeit verfolgte Strategie zur Verbesserung der Biokompatibilität dieser und anderer relevanter Materialien besteht in der nachträglichen, gezielten Beschichtung ihrer Oberflächen mit Biomembrananaloga. Für solche Modifizierungen wurden beispielsweise Hydrogele, hydrophile Polymere wie Polyethylenglycol oder Phospholipide herangezogen (Emoto et al. in Coli. Surf. B Biointeraces 2000 18 p. 337-346, Klee et al. in Medizintechnik mit biokompatiblen Werkstoffen, E. Wintermantel, S.W. Ha (Eds) Springer Verlag p. 347-360 2003, Tziampazis et al. in Biomaterials 2000 21 p.511-520 , Drury et al. in Biomaterials 2003 24 p. 4337-4351). Gemeinsames Merkmal dieser Beschichtungen ist, dass die aufgebrachten Oberflächenmodifizierungen selten kovalent an das Basismaterial angebunden werden können. Auch bei der Methode der kovalenten Beschichtung von Oberflächen mit Phospholipiden zur Erzeugung Biomembran-analoger Materialüberzüge, wird lediglich die innere Monoschicht der Lipid-Doppelschicht direkt und teilweise kovalent an der Materialoberfläche verankert (DE 297170). Mit Lipid-Monoschichten modifizierte Oberflächen werden technisch bereits zur affinitätschromatographischen Trennung bzw. Analytik von Carotenoiden an sogenannten RP-C30 Phasen verwendet. Prinzipiell lassen sich solche mit Lipid beschichteten Matrizes auch zur chromatographischen Trennung membranständiger Proteine heranziehen (DE 19814775 und US 6051372), wobei die temperaturabhängige Änderung der viskoelastischen Eigenschaften sowie die laterale Ladungsverteilung der Lipidmatrix als Trennprinzip herangezogen wird.
Ein Verfahren zum Aufbau von Lipidschichtsystemen auf Polymeren unter kovalenter Fixierung der innersten Monoschicht wurde von Rothe et al. beschrieben (DE 297170). Die auf solchen Lipiden aufbauenden Schichtsysteme besitzen insbesondere aufgrund der fehlenden kovalenten Fixierung der äußeren Schichten jedoch nur eine geringe physikalische Langzeitstabilität bzw. Resistenz gegenüber aggressiven chemischen Medien. Schließlich beschrieb Foresto die Aufbringung von dicken Lipidschichten auf Bootsrümpfe durch Verwendung deren Schmelzen (FR 2701713) zum Zweck der antiadhäsiven Beschichtung. Derartige Anstriche sind unter chemischer und physikalischer Belastung ebenfalls von geringer Dauerstabilität.
Die Ausgangssubstanz der in der vorliegenden Patentschrift zur Oberflächenmodifizierung herangezogenen Tetraetherlipide sind bipolare, membrandurchspannende Amphiphile, die ursprünglich aus natürlichen Quellen (Archaebakterien) isoliert wurden (Langworthy et al. in System. Appl. Microbiol 1986 7 p. 253-257 und Gulik et al., in J. Mol. Biol. 1985 J82 p.131 -149). Tetraetherlipide besitzen eine bemerkenswerte chemische und biologische Stabilität und sind in der Lage, sich an Grenzflächen zu monomolekularen Schichten zu organisieren oder Vesikel zu bilden (Lo & Chang in Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990 167 p. 238-243 und Bakowsky et al. in Chem. Phys. Lipids 2000 105 p. 31-42). Bislang existieren nur wenige Veröffentlichungen, welche die Verwendung archaebakterieller Tetraetherlipide in der Materialwissenschaft, der Pharmazie oder der Biotechnologie beschreiben. Die bisher genutzten Lipide leiten sich chemisch meist vom natürlichen Hauptlipid von Thermoplasma acidophilum, dem Main-Phospho-Lipid (MPL) ab, dessen Kopfgruppen ein ß-Gulosidderivat bzw. ein Phosphatidylglycerolderivat sind. Daneben wurden derartige Lipide zur Herstellung von Schmierstoffen (US 5098588), sowie nichtkovalent angebundenen Überzügen (US 5401378 und US 5443955), vorgeschlagen. Die Beschichtung planarer Membranen mit den obengenannten Glyco- und Phosphatidyl-Tetraetherlipiden sowie die Anwendung der erhaltenen Oberflächen zur Trennung von Stoffgemischen (Chromatographie) wurde von Braunschweig et al. beschrieben (US 6051372). Kürzlich wurden Tetraetherlipide mit kleinen Kopfgruppen, welche zur stabilen kovalenten Anbindung an bestimmte Oberflächen geeignet sind, beschrieben (DE 10228857).
Alle bisher offengelegten Oberflächenbeschichtungen mit herkömmlichen Lipiden und Tetraetherlipiden sind für die Mehrzahl der Anwendungen nicht von ausreichender mechanischer und chemischer Beständigkeit. Die nativen Tetraetherlipide sind in ihrer Kopfgruppenstruktur nicht zur kovalenten Anbindung geeignet. In Vorarbeiten wurden unterschiedliche Tetraetherlipid-Derivate mit zur kovalenten Anbindung geeigneten kleinen Kopfgruppen synthetisiert.
Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, Kompositmaterialien unter Verwendung von Tetraetherlipiden mit kleinen Kopfgruppen zu entwickeln, die hohe Stabilitäten und neuartige Eigenschaften aufweisen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Entwicklung eines geeigneten Verfahrens zur Herstellung der genannten Kompositmaterialien.
Die erfindungsgemäße Lösung dieser Aufgabe ist im Patentanspruch 1 angegeben. Danach sind die Kompositmaterialien mit Tetraetherlipiden gekennzeichnet durch kovalent angekoppelte monomolekulare Schichten von Tetraetherlipiden mit kleinen Kopfgruppen gem. (DE 10228857) an planare oder gekrümmte Oberflächen von Basismaterialien, wobei 1.1 die Tetraetherlipide mit kleinen Kopfgruppen folgende allgemeine Struktur aufweisen
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1.2 und wobei die Basismaterialien sind: 1.2.1 Metalle und Metalloxide sowie deren Legierungen und formstabile Mischungen
1.2.2 Polymere mit vorhandenen oder nachträglich erzeugten funktionellen Gruppen
1.2.3 Gläser und Keramiken auf Basis von Silikaten und Boraten
1.2.4 Kohlenstoff und dessen Modifikationen
1.2.5 Silizium, Gallium und Verbindungen 1.2.6 Halbleiter und dotierte Halbleiter.
Weiter sind die erfindungsgemäßen Kompositmaterialien nach Patentanspruch 3 dadurch gekennzeichnet, dass zusätzliche an reaktive Kopfgruppen der Tetraetherlipide gebundene Hydrogele einschließlich solcher mit kationischer, anionischer, zwitterionischer oder ungeladener Natur die Kompositoberfläche abdecken. Zusätzlich können gemäß den Patentansprüchen 4 und 5 spezifische Liganden sowie bioaktive Substanzen und Aggregate, die kovalent an reaktive Gruppen der Tetraetherlipide oder Hydrogele gebunden sind, auf der Oberfläche der Kompositmaterialien enthalten sein. Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Kompositmaterialien ist in den kennzeichnenden Merkmalen der Patentansprüche 6 und 7 beansprucht.
Danach werden gemäß Patentanspruch 6 die Oberflächen der Basismaterialien zur kovalenten Anbindung der Tetraetherlipide mit kleinen Kopfgruppen voraktiviert oder gemäß Patentanspruch 7 werden Tetraetherlipide mit reaktiven, kleinen Kopfgruppen kovalent an das Basismaterial oder eine Zwischenschicht gebunden, wobei die Tetraetherlipide als mono- oder disubstituierte Variante eingesetzt werden können. Archaebakterielle Lipide haben, offensichtlich aufgrund ihrer evolutiven Stellung, besondere Eigenschaften im Vergleich zu Lipiden aus Eubakterien und Eukaryonten (Temperaturbeständigkeit, chemische Resistenz, verringerte biologische Abbaubarkeit). Diese Eigenschaften machen sie einzigartig mit Blick auf spezifische Anwendungen.
Gegenstand der Erfindung sind neue Kompositmaterialien, welche sich durch eine kovalente Modifizierung mit speziellen Abkömmlingen derartiger Lipide, sogenannten Tetraetherlipiden, auszeichnen, deren vorteilhafte Eigenschaften sowie deren Anwendung für ausgewählte Zwecke. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, Verfahren zur Herstellung derartiger Komposite bereitzustellen. Verwendet werden dazu spezielle Tetraetherlipide mit kleinen Kopfgruppen. Derartige Komposite sind besonders geeignet
- zum Zweck der Minimierung des biologischen Bewuchses der Oberfläche (Antifouling),
- zur Schaffung eines monomolekularen Gleitfilmes zur Reduktion der Reibungskräfte und zum Schutz der Oberfläche,
- zur Verbesserung der biologischen Eigenschaften von Implantatmaterialien sowie zur Verbesserung der Eigenschaften und Erhöhung der Lebensdauer von Kontaktlinsen und Medizinprodukten (z.B. Katheter).
- zur Verbesserung der Eigenschaften und Erhöhung der Standzeit und Lebensdauer von optischen Sensoren sowie von elektrochemischen Sensoren oder Biosensoren,
- als Filtrationsmembran mit optimierter Probenwechselwirkung,
- als Affinitätsmatrix zur präparativen und analytischen Trennung von Substanz¬ gemischen,
- als Biosensoren nach Anbindung von sensorischen Funktionsmolekülen. Der Einsatz der entwickelten Methoden gestattet die Bildung stabiler, monomolekularer Tetraetherlipid-Filme auf unterschiedlichen Basismaterialien - insbesondere Metallen und Metalloxiden, Kohlenstoff, Silizium, Gallium und deren Verbindungen, Keramiken und Gläsern, sowie Polymeren - und eröffnet zudem die Möglichkeit, nachträglich an der reaktiven Außenseite (bio)relevante Strukturen anzukoppeln.
Durch die Modifizierung der Oberfläche werden die physikochemischen Eigenschaften der Oberfläche wie z.B. die freie Energie und die Benetzbarkeit und/oder die Oberflächenmorphologie verändert. Damit ist es möglich, eine gezielte Unterdrückung oder Aktivierung der Wechselwirkung mit biologischen Substraten (Serum, Zellkulturen, Gewebe) herbeizuführen. Die durchgeführten Modelluntersuchungen (Vergleich der natürlichen und synthetischen supportfixierten Strukturen) sind indikativ für eine spätere Applikation in vivo, in vitro und ex vivo. Aufbauend auf den erfindungsgemäßen Kompositmaterialien können gezielt bioaktive Spezies an der Oberfläche fixiert werden. Die Chemisorption bzw. Physisorption bioaktiver Spezies wie Enzyme, organische Katalysatoren, Ribozyme, Organometallverbindungen, Proteine, Glycoproteine, Peptide, Polyaminosäuren, Nucleinsäuren, Antikörper oder Teilkomponenten davon, Carbohydrate, Zytokine, Lipide und Bestandteile der extrazellulären Matrix, stellt u.a. die Grundlage für spezifische biologische Eigenschaften dar.
Weiterhin können an der Oberfläche der erfindungsgemäßen Komposite zusätzlich negativ geladene Gruppen, vorzugsweise Carboxyl-, Phosphat- oder Sulfat- bzw. Sulfonatgruppen angebunden werden. Ebenfalls können positiv geladene Gruppen, vorzugsweise quarternäre Stickstoffverbindungen angebunden werden.
Auch die Ankopplung hydrophiler Gruppen auf der Oberfläche der erfindungsgemäßen Komposite ist möglich, insbesondere geeignet dafür sind Polyethylenglycole und Kohlenhydratoligomere. Weiterhin wird eine stabile, freitragende, monomolekulare Porenüberspannung auf der modifizierten Materialoberfläche realisiert. Dazu werden die Tetraetherlipide zuvor kovalent an hydrophile Kettenpolymere (z.B. Polylysin) gekoppelt. Durch die Kombination der Eigenschaften eines hydrophilen, flexiblen Kettenpolymers mit der Selbstorganisationsfähigkeit der hydrophoben Tetraetherlipide entsteht ein neuartiges Kompositmaterial, welches ein wassseraufnehmendes, flexibles Strukturelement besitzt, mit dem sowohl das Spacer-Prinzip erfüllt wird und das zudem reaktive Gruppen besitzt, über die eine kovalente, hydrolyseresistente Anbindung an die Substratoberfläche gewährleistet werden kann. Auf diese Weise resultiert eine Stabilisierung des Lipidüberzugs im porenüberspannenden Bereich, ohne dabei die Wasserpermeation zu beeinflussen. Als Präparationsverfahren kann sowohl die Vororganisation der modifizierten Tetraetherlipide an der Wasser/Luft Grenzfläche und anschließendem Übertrag des Flims mit der Langmuir-Blodgett Methode auf die Matrixmaterialien wie auch die Self-Assembly Methode aus organischen Lösungsmitteln eingesetzt werden. Es ist dabei möglich, den entstandenen Oberflächenfilm sowohl chemisorbiert als auch physisorbiert auf dem Substrat zu verankern. Mit diesem Verfahren ist es möglich, Oberflächenschichten mit einer Dicke von 4 nm bis 100 nm zu erzeugen.
Die erfindungsgemäßen Komposite können weiterhin als Affinitätstrennmaterialien herangezogen werden. Als Basismaterialien sind kommerziell zugängliche poröse Träger auf keramischer, glasartiger, silikatartiger oder polymerer Grundlage, wie z.B. Polystyren,
Melamin oder Methylmethacrylat, geeignet, wobei die Chemie zur kovalenten Fixierung der Lipide analog zu der für glatte Oberflächen beschriebenen Vorgehensweise erfolgen kann. Das erlaubt eine Phase, die nach der üblichen Nomenklatur etwa als C40 beschrieben würde. Dies ist bisher nicht erreicht. Weiterhin besitzt eine derartige Phase ebenfalls temperaturabhängig veränderliche elastische Eigenschaften. Damit ist zusätzlich die Kombination zweier voneinander unabhängiger Trennprinzipien möglich. Im Folgenden wird die Erfindung anhand mehrerer Gruppen von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Diese Gruppen umfassen unter
1. Beispiele für neue Kompositmaterialien
2. Beispiele zur Voraktivierung von Basismaterialien 3. Beispiele für Verfahren zur kovalenten Ankopplung von reaktiven Tetraetherlipiden an Oberflächen nichtaktivierter Basismaterialien.
1. Ausführungsbeispiele zu neuen Kompositmaterialien
Die Reaktionsfähigkeit der Tetraetherlipide mit kleinen Kopfgruppen konnte erfolgreich zur Herstellung von Kompositen genutzt werden. Dabei wurden verschiedene Matrices mit planaren oder gekrümmten Oberflächen mit Tetraetherlipid-Derivaten kovalent beschichtet. Die neuen Komposite zeigen überraschende Eigenschaften wie
Antiadhäsivität, eine außergewöhnliche Stabilität und hohe Kopplungs- bzw.
Packungsdichte. Um eine möglichst integere und dicht gepackte Schicht mit spezifischen Eigenschaften zu erzeugen, war es notwendig, das Tetraetherlipid sowie das
Kopplungsverfahren dem jeweiligen Basismaterial bzw. der jeweiligen Aufgabe anzupassen. So konnten Lipidoberflächen mit stark variierenden physikochemischen
Parametern (extrem hydrophob, extrem hydrophil, positiv und negativ geladen) erzeugt werden. Zudem gelingt die Präparation von Lipidschichten mit zwitterionischen Kopfgruppen. Im Rahmen einer zusätzlichen Funktionalisierung erfolgte die Bindung spezifischer antimikrobieller Peptide, Saccharide und Nanopartikel.
1.1. Stabile lipophilisierende Modifizierung von Silikon Eine 1mm dicke, kommerziell erhältliche Silikonfolie wurde zuerst in einer 5M NaOH- Lösung präaktiviert (3 Stunden, 37°C). Dann wurde die Folie gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen. Der Gleichgewichtsrandwinkel (gegenüber Wasser) änderte sich dabei von ca. 105° zu ca. 115°. Anschließend wurde die Oberfläche durch Aufbringen einer Aminoalkylsilanschicht präaktiviert (bevorzugt reines Aminopropyltrimethoxysilan, RT, 16 Stunden). Die Folie wurde aus der Lösung entfernt, kurz dreimal in Methanol und dreimal in destilliertes Wasser getaucht und danach im Trockenschrank bei 80°C für 17 Stunden getrocknet. Schließlich wurde nochmals gut mit Aceton, Methanol und zuletzt destilliertem Wasser gewaschen. Der Randwinkel änderte sich während dieses Aktivierungsschrittes unwesentlich.
Zur kovalenten Bindung der Tetraetherlipidschicht (beidseitig Cyanurchlorid-modifiziertes Caldarchaeol) wurde das Lipid mit einer Konzentration von 1 mg/ml in Aceton gelöst. Alternative Lösungsmittel, welche ebenfalls mit Erfolg eingesetzt wurden, waren Chloroform und eine 1 :1 Mischung von Chloroform und Methanol. Die Silikonfolie wurde für 2 Stunden bei 400C in die Lipidlösung getaucht. Die Reaktion erfolgte unter Zugabe von N,N-Diisopropylethylamin als Katalysator. Anschließend wurde nicht gebundenes Lipid durch mehrmaliges Waschen der Folie mit Aceton oder Chloroform und schließlich Methanol entfernt. Der Randwinkel änderte sich durch die Beschichtung mit Tetraetherlipid nur unwesentlich.
Die hohe Rauhigkeit des Ausgangsmaterials blieb über alle Reaktionsstufen erhalten. Eine Analyse mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie nach Anfärbung der angekoppelten Tetraetherlipid-Schicht mit einem lipophilen Farbstoff (3,3'-Dioctadecyloxa- carbocyaninperchlorat) zeigten im Gegensatz zur unmodifizierten Silikonfolie eine regelmäßige Anfärbung.
1.2 Herstellung biofunktionalisierbarer Sensoren aus einem Tetraetherlipid-Glas Komposit
Sensorchips mit Glasoberfläche wurden mit ozongenerierender UV-Strahlung gereinigt und aktiviert. Dazu wurde die zu beschichtende Oberfläche mit einem Abstand von 5 mm unter eine Xeradex Lampe platziert und für 5 min einer UV-Strahlung mit einer Wellenlänge von 173 nm ausgesetzt. Anschließend wurde der Sensor sofort in die Lösung mit Cyanurchlorid-aktiviertem TL (1 mg/ml Lösung in Chloroform) getaucht und bei 70 0C über 12 h unter Druck in einer geschlossenen Teflonkammer zur Reaktion gebracht. Überschüssiges Lipid wurde mit Chloroform nach Ultraschallbehandlung abgewaschen und die Oberfläche im Stickstoffstrom getrocknet. Alternativ wurde die Oberfläche mit Schwefelsäure/ Wasserstoffperoxid gereinigt und danach durch Aufbringen einer Aminoalkylsilanschicht voraktiviert (1 mmolare Lösung von Aminobutyl-dimethyl-chlorsilan in trockenem Chloroform).
Der Randwinkel der so lipidierten Oberflächen lag zwischen 60 und 70°. Die Reaktivität der auf der Lipidoberfläche enthaltenen Cyanurchlorid-Funktionen wurde durch Ankopplung eines fluoreszenten Moleküls (Fluorescein-Isothiocyanat) und Fluoresenzmikroskopie nachgewiesen und blieb über mind. 2 Wochen erhalten.
Zur Funktionalisierung der Tetraetherlipid-Glas Sensoren wurde das aktive Komposit beispielsweise mit einer Mischung von Taurin (Aminoethansulfonsäure) und Glycin (Aminoessigsäure) in Verhältnis von 10:1 in Boratpuffer pH 8,8 für 12 h bei 500C umgesetzt. Die resultierende Oberfläche wies durch das Vorhandensein von Sulfon- und Carbonsäuregruppen ein negatives Zetapotenzial auf, wobei die COOH-Gruppe erfolgreich zur Anbindung von Sensormolekülen wie Antikörpern / Proteinen über die Carbodiimidmethode genutzt wurde.
Alternativ zur Beschichtung mit Taurin / Glycin wurden die Reaktivität der Cyanurchloridgruppe der Tetraetherlipid-Glas Kompositoberfläche zur kovalenten Ankopplung von Aminobiotin genutzt, welches wiederum die Anbindung vielfältiger Sensormoleküle über Biotin-Avidin-Biotin Brücken ermöglichte.
Weitere Optionen, die erfolgreich getestet wurden, waren die PEGylierung mit Amino- Polyethylenglycol, sowie die Aminierung mit Diaminen, z.B. Diaminoethan.
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Abbildung 1. Biosensoren bestehend aus einem Tetraetherlipid-Glas Komposit und dazu entwickelte Funktionalisierungsoptionen
1.3 Kompositmaterialien mit antiadhäsiven Eigenschaften (Antifouling)
Verschiedene hergestellte Kompositmaterialien wiesen deutliche Antiadhesivität auf. Der Nachweis der reduzierten Bioadhäsion bzw. eines Antifouling-Effektes unter statischen Bedingungen wurde an Tetraetherlipid-Kompositen auf Basis von Glas (Borosilikatglas, B33) und Silikon dargestellt. Als biologisches Modellsystem kam eine Mischkultur aus Staph. epidermidis und Staph. aureus im Verhältnis 50:50 zur Anwendung, welche vor allem als biofilmbildende Infektionskeime aus dem biomedizinischen Bereich bekannt sind. Mit dem Ziel, den Effekt einer gezielten Beschichtung der Oberflächen mit Biomembrananaloga nachzuweisen, wurde auf beiden Substraten eine Tetraetherlipidschicht kovalent an die Oberfläche gebunden und entsprechend der definierten Modifizierung die Nachfolgederivatisierung durchgeführt. Es erfolgt die Peggylierung mit Polyethylenglykol PEG 5000, welches als wasserbindende bzw. hydrophile Oberflächengruppe wirkt (TL-PEG). Die Bioadhäsion wurde quantifiziert anhand der gezählten adhärierten Mikroorganismen verbunden mit einer Visualisierung über eine Lebend/Tot-Färbung (BacLight®) mit Hilfe eines Fluoreszenzfarbstoffes. Die Abbildungen 6 und 7 zeigen die nach 24 h Inkubationszeit deutlich reduzierten Zellzahlen auf den Kompositoberflächen. Des weiteren wurde der Erhalt der Zellvitalität bei reduzierter Bioadhäsion festgestellt.
St. aureus / St. epidermidis
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Glas Glas TL PEG
Abbildung 2a: Zellzahl (lebend/gesamt) je Quadratzentimeter nach 24 h Inkubation des Basismaterials Glas und des Glas-TL-PEG Kompositmaterials (statische Bedingungen)
St. aureus / St. epidermidis
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Abbildung 2b: Zellzahl (lebend/gesamt) je Quadratzentimeter nach 24 h Inkubation des Basismaterials Silikon und des Silikon-TL-PEG Kompositmaterials (statische Bedingungen)
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Abbildung 3A/B: REM-Aufnahmen (350Ox) der adhärierten Bakterien nach 24h Inkubation des Basismaterials Glas B33 (links) und des Glas-TL-PEG Kompositmaterials (rechts). Die adhärierten Bakterien erscheinen als weißer Kontrast. Auf der TL-modifzierten Oberfläche ist deren Anzahl deutlich verringert.
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Abbildung 3A/B: REM-Aufnahmen (350Ox) der adhärierten Bakterien nach 24h Inkubation des Basismaterials Silikon (links) und des Silikon-TL-PEG Kompositmaterials (rechts). Die adhärierten Bakterien erscheinen als weißer Kontrast. Auf der TL-modifzierten Oberfläche ist deren Anzahl deutlich verringert.
Reduzierung der Biofilmbildung unter dynamischen Bedingungen
Weiterhin erfolgten Untersuchungen mit Hilfe der in vitro-Technik unter Fließbedingungen.
Der Fließkanal der verwendeten Bypasszelle besaß eine Dimension von 15 mm x 1 mm. Als Modellorganismus wurde Escherichia coli (Indikatorkeim für fäkale Verunreinigungen) verwendet. Es wurde dabei zur Simulation der Biofilmbildung von einer Anlagerungsphase (Seedphase) ausgegangen, gefolgt von einer Proliferationsphase (Feedphase). Die Analyse des Proliferationsverhaltens erfolgte mittels konfokaler Laser-Scanning- Mikroskopie über einen Zeitraum von 5 h und ermöglichte so die Beschreibung der initialen Biofilmbildung unter dynamischen Bedingungen. Für die Prüfung standen kovalent fixierte Tetraetherlipidschichten zur Verfügung, welche zum einen mit Polyethylenglykol PEGyliert wurden, um eine biomimetische Schicht zu kreieren. Eine zweite Modifizierung diente der Erzeugung eines inerten Lipidfilms gekoppelt mit einer negativ geladenen Oberfläche unter Anbindung von Glycin. Die lasermikroskopischen Abbildungen nach 3h Inkubation (Abb. 4) sowie die Adhäsionskinetiken (Abb. 5) zeigen eine deutliche Reduzierung der Bioadhäsion auch unter dynamischen Fließbedingungen.
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Abbildungen 4 A-C: CLSM-Aufnahmen der bakteriellen Adhäsion nach 3 h in einer Fließkammer auf A: Glas, B: TL-PEG modifiziertem Glas-Komposit, C: TL-Glas-Komposit mit zusätzlicher negativer Ladung. Die adhärierten Bakterien erscheinen als helle Strukturen. Auf der Tetraetherlipid-modifzierten Oberfläche ist die Anzahl stark verringert.
E.coli
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0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00
Abbildung 5: Initiale Bioadhäsion auf Basis(Glas)- und Kompositmaterial unter dynamischen Bedingungen über einen Zeitraum von 5 Stunden. 1.4 Tetraetherlipid-Gold Komposite mit reaktiver hydrophober Oberfläche
Für QCM-Messungen vorgesehene Schwingquarze (18mm Durchmesser) mit einer 160 nm dicken Goldbeschichtung sollten durch eine stabile und hydrophobe Schicht abgedeckt werden, die im Gegensatz zum Gold eine chemische Reaktivität aufweist, welche eine dauerhaften Anbindung von Liganden an den Sensor ermöglicht. Die Goldoberfläche des Basismaterials wurde mit energiereicher Ozon-generierender VUV-Strahlung gereinigt und aktiviert. Dazu wurde die Goldoberfläche mit einem Abstand von 5 mm unter einer Xeradex-Lampe platziert und für 5 min einer UV-Strahlung von 173 nm ausgesetzt. Es bildete sich eine dünne, ca. 2 nm starke Goldoxidschicht. Der Randwinkel gegen Wasser fiel entsprechend von 54 ° für reines Gold auf Werte unter 10° nach der Bestrahlung. Anschließend wurde der Sensor sofort in eine Lösung mit Tetraetherlipid-Mesylat (1 mg/ml Lösung in Chloroform) getaucht und bei 70 0C über 12 Stunden beschichtet. Überschüssiges Lipid wurde mit Chloroform unter gleichzeitiger Ultraschallbehandlung entfernt und die Oberfläche im Stickstoffstrom getrocknet. Der Randwinkel stieg nach der Lipidbeschichtung auf Werte von 70° an. Mit ellipsometrischen Verfahren wurde eine Schichtdicke von 3,2 nm nachgewiesen. Wurde für die Lipidierung zumindest teilweise das Disubstitutionsprodukt (Tetraetherlipid- Dimesylat) eingesetzt, konnten die freien, auf der Lipidoberfläche exponierten Mesylat- Funktionen zur weiteren Oberflächenfunktionalisierung genutzt werden. Dazu wurden die Sensoren für 12 h in eine Lösung mit 0,1 mg/ml eines monoklonalen Antikörpers gegen Kathepsin B in Boratpuffer pH 8 getaucht. Nach intensivem Abspülen mit PBS wurde der so beschichtete Sensor in eine QCM-Flusszelle eingebaut und erfolgreich zum analytischen Nachweis von Kathepsin B in verdünnten Serumproben genutzt. 1.5 Herstellung eines Tetraetherlipid-Kompositmaterials auf Basis von Silizium- Sensoren mit zusätzlicher Polymer- Zwischenschicht
Zur Herstellung von Tetraetherlipid-Schichten mit polymeren Zwischenschichten auf Silizium-Sensoren (Silizium-Wafer mit natürlicher Oxidschicht von 2,4-3,8 nm Dicke) wurde das Material mit konz. Schwefelsäure/H2O2 (50:50, v:v) gereinigt und anschließend mit einer chloroformischen Lösung aus Glycidyloxypropyltrimethoxysilan (GOPTS, 10"3 mol/l 150 cm2/50 ml Lösung, RT, 1 Stunde) präaktiviert. Die Epoxidgruppen wurden durch Behandlung mit 1mM HCl bei 50°C (5h) zu den entsprechenden Diolen umgesetzt. Die Sensoren wurden intensiv mit Chloroform gespült, unter Stickstoffstrom trocken geblasen und danach mit Tresylchlorid (50 mM chloroformische Lösung) umgesetzt. Anschließend wurde mit Aceton gespült und mit einer Polyethylenimin Lösung für 8 Stunden bei RT inkubiert (50 mg/ml, PBS pH 7,5). Nach dem Spülen mit Wasser wurde im Stickstoffstrom getrocknet. Der Randwinkel gegenüber Wasser veränderte sich während der Substrataktivierung von 16° für den gereinigten Sensor, über 34° beim silanisierten, zu 6° beim Polymer beschichteten. Die Gesamtschichtdicke betrug ca. 6,3nm, bei einem nun positiven Zetapotential von 12,7 mV (pH 5,6).
Zur Beschichtung mit Amino-Tetraetherlipiden wurden die freien Aminogruppen des Polymers zunächst durch Inkubation mit einer 10OmM Lösung von Glutarsäureanhydrid (PBS, 2h, RT, frisch hergestellte Lösung) teilweise in Carboxylgruppen umgewandelt. Anschließend wurde mit Wasser gespült und im Stickstoffstrom getrocknet (Randwinkel 18°). Zur Aktivierung wurden die Carboxylgruppen mit N-Hydroxysuccinimid und Diisopropylcarbodiimid (1M in Dimethylformamid, 4h, RT) umgesetzt, danach mit Dimethylformamid gespült und wiederum im Stickstoffstrom getrocknet. Der so vorbehandelte Sensor konnte mit einer 5x10"3 molaren Lösung (120 cm2/50 ml Lösung) des Tetraetherlipid-Derivates (TL-O-C4H8O-NH2) in Chloroform (6 Stunden, RT) umgesetzt werden. Unverbrauchtes Tetraetherlipid wurde durch Waschen entfernt. Der Randwinkel der Schicht erhöhte sich auf 68°, deren Dicke betrug insgesamt 10,3nm (Ellipsometrie nu = 1,492). 2. Beispiele für Verfahren zur Voraktivierung von Basismaterialien
Zur kovalenten Modifizierung von Basismaterialien mit Tetraetherlipiden mit kleinen Kopfgruppen müssen diese in der Regel zunächst präaktiviert werden, um eine ausreichende Reaktionsfähigkeit und damit den gewünschten Kopplungserfolg bzw. -grad sicherzustellen. Folgende Methoden wurden für die erfindungsgemäße kovalente Ankopplung von Tetraetherlipiden entwickelt:
• Aktivierung von Festkörperoberflächen mit freien OH-Gruppen wie Gläser, Keramiken oder Polymere
• Aktivierung von Silizium- oder Silica-Partikeln oder planaren Materialien mit Siliziumoxid-Anteilen
• Aktivierung von PTFE-Polymeren
• Aktivierung von Polyurethanoberflächen • Oberflächenaktivierung von Titan-Implantaten und anderen metallischen Werkstoffen
• Oberflächenaktivierung von Gold, Silber oder Kupfer
• Oberflächenaktivierung von Silikongummi und anderen Silikonpolymeren
Die Modifizierung der Materialoberfläche wurde durch bekannte physikalisch-chemische Untersuchungsmethoden, wie Randwinkelmessung, Ellipsometrie, FT-IR und AFM verfolgt.
2.1 Aktivierung von Festkörperoberflächen mit freien OH-Gruppen wie Glas, unedle Metalle, Keramik und Polymere für die nachfolgende kovalente Ankopplung des Tetraetherlipids.
Ein hydroxylgruppenhaltiger Festkörper wurde mit in Tetrahydrofuran dispergiertem Natriumhydrid umgesetzt. Dieser Ansatz wurde am Rückfluss für 6 Stunden bis zum Sieden erhitzt. Die freien Hydroxylgruppen werden durch diese Reaktion in ihre Natriumsalze umgewandelt. Nach dem Abtrennen des Feststoffes und der flüssigen Phase wurde die Oberfläche durch mehrmaliges Spülen mit Tetrahydrofuran gereinigt. Im Anschluß kann das gelöste, z.B. mit Cyanurchlorid aktivierte Tetraetherlipid mit der Oberfläche kontaktiert werden.
Die Aktivierung der Hydroxylgruppen gelingt ebenfalls durch Inkubation der Oberfläche in 6 molarer KOH bzw. NaOH. Hier werden ebenfalls die Hydroxylgruppen in ihre jeweiligen Salze überführt.
Die Aktivierung der Hydroxylgruppen gelingt auch durch die Umsetzung mit Silanen, z.B. Trimethoxyaminoalkylsilan und der Einführung einer freien Aminofunktion auf der Festkörperoberfläche, welche die Hydroxylgruppe ersetzt.
2.2. Aktivierung von Silizum- oder Silica-Partikeln oder planaren Materialien mit Siliziumoxid-Anteilen (z.B. Glas) zur erfindungsgemäßen kovalenten Ankopplung von Tetraetherlipiden.
Die Präaktivierung der Siliziumoxid-haltigen sphärischen Partikel erfolgt mit Aminoalkylsilanen insbesondere Trimethoxyaminoalkylsilan. Anschließend erfolgt die Kopplung mit Cyanurchlorid-modifiziertem Tetraetherlipid in der beschriebenen Weise. Zur Herstellung von dicht gepackten Tetraetherlipid-Derivat-Schichten auf Glas wurde das Material wie folgt behandelt. Die Proben wurden mit konz. Schwefelsäure/H2O2 (50:50, v:v) gereinigt bis ein Randwinkel gegenüber Wasser von weniger als 20° zu beobachten war. Anschließend wurde die Oberfläche durch Aufbringen einer Aminoalkylsilanschicht voraktiviert (10"3 mol/l Lösung von Aminobutyldimethylchlorsilan in trockenem Chloroform, RT, 1 Stunde). Danach wurde die Probe aus der Lösung entfernt, mit Chloroform gewaschen und im Trockenschrank bei 125 0C für 2 Stunden getrocknet. Der Randwinkel der Schicht vergrößerte sich auf ca. 48°, die geringe Oberflächenrauhigkeit blieb erhalten. Die Dicke der erhaltenen Schicht betrug 0,6 nm (AFM). Danach wurde die Glasoberfläche mit einer Cyanurchloridlösung in Chloroform kontaktiert (10-3 mol/l, N, N Diisopropylethylamin als Katalysator, 5 Stunden, RT).
Zur kovalenten Ankopplung der Tetraetherlipid-Derivat-Schicht (TEL-O-C2H4-NH2) wurde das Lipid in einer Konzentration von ca. 5x10"3 mol/l in Chloroform gelöst. Das Glas wurde für 10 Stunden in die Lipidlösung getaucht, anschließend gewaschen und getrocknet. Die Dicke der so erhaltenen Schicht betrug 3,8 nm, der Randwinkel lag bei 76°.
2.3. Oberflächenaktivierung von Titan-Implantaten zur erfindungsgemäßen kovalenten Bindung von Tetraetherlipiden. Zur Ankopplung von aktivierten Tetraetherlipiden an feste Materialien aus Titan, Titanoxid oder Legierungen und Metallgemischen mit einem ausreichenden Titangehalt wird die Oberfläche zweckmäßigerweise durch Reaktion mit Silanen präaktiviert. Hierzu wurde Trimethoxyaminoalkylsilan in trockenem Chloroform (25 Gewichtsäquivalente) gelöst und mit der Grenzfläche für 12 Stunden bei 25°C kontaktiert. Danach wurde die flüssige Phase abgetrennt. Der Feststoff wurde im Trockenschrank bei 1500C für 2 Stunden getrocknet und die Oberfläche anschließend mehrmals mit Chloroform gespült. Danach wurde die so aktivierte Oberfläche mit in trockenem Chloroform gelöstem Cyanurchlorid-modifiziertem Tetraetherlipid (5mg/ml) inkubiert. Die Reaktion verlief unter Zugabe von z. B. N.N-Diisopropylethylamin als Katalysator. Die Reaktionsdauer betrug 12 Stunden bei 400C.
2.4. Präaktivierung von Stahloberflächen
Eine polierte und gereinigte Stahlprobe wurde in eine Lösung des Monoethoxydimethylsilan-Tetraetherlipids (2X10"4 molar in Chloroform, 10 h, RT) getaucht. Anschießend wurde die Reaktionslösung entfernt, der Stahl bei 125°C im Trockenschrank für 2 Stunden getrocknet, überschüssiges Lipid mit Chloroform abgewaschen und das modifizierte Material nochmals unter identischen Bedingungen getrocknet. Der Randwinkel gegen Wasser vergrößerte sich von 56° vor der Modifizierung auf 75°. Die Schichtdicke betrug 4,8 nm. Die Oberflächenrauhigkeit wurde durch die Beschichtung nicht messbar verändert.
Eine analoge Modifizierung gelang bei Verwendung dieser Methode auch mit Gläsern.
2.5. Aktivierung von PTFE-Polymeren zur erfindungsgemäßen kovalenten Ankopplung von Tetraetherlipiden.
Als Methode wurde hier eine naßchemische Oxydation der Oberfläche, welche durch verschieden konzentrierte (von 1vol% Wasserstoffperoxid bis 40 vol%) Wasserstoffperoxid/Schwefelsäure Gemische erreicht werden konnte, verwendet. Durch Variation der Reaktionstemperatur und der Inkubationszeit kann die Anzahl der erhaltenen reaktiven Hydroxylgruppen variiert werden. Die Oxydation erfolgt bis zu einer Tiefe von ca. 20 nm, Veränderungen der Oberflächenmorphologie finden nicht statt. Dies konnte mit Hilfe der Rasterkraftmikoskopie wie auch der Elektronenmikroskopie belegt werden. Der Nachweis der Entstehung der freien Hydroxylgruppen wurde mit Hilfe der FT- IR Spektroskopie durchgeführt. Neben den unveränderten Basisbanden des PTFE entstanden neue für Hydroxylgruppen charakteristische Banden unterschiedlicher Intensität. Der Randwinkel gegenüber Wasser verkleinerte sich in Abhängigkeit von den Reaktionsparametern auf werte zwischen 88° und 115° (reines PTFE 125°). Die Oberflächenmorphologie der PTFE Polymere wurde nicht verändert. Die Aktivierung der Oberfläche kann in unterschiedlichen Lösungsmitteln erfolgen. Typischerweise wurden Chloroform, Methanol, Ethanol, Dioxan, Aceton oder deren Gemische mit verschiedenen Katalysatoren, wie N1N- Diisopropylethylamin oder Dimethylfluoropyriden u.a., verwendet. Die Reaktion wurde mit Hilfe der FT-IR-Spektroskopie verfolgt und charakterisiert. Bei der Kopplung von Cyanurchlorid an der PTFE Oberfläche wurde im FT-IR eine neue Bande beobachtet. Gleichzeitig vergrößerte sich der Randwinkel gegenüber Wasser von ca. 90° auf 110°. Das so aktivierte Polymer war mindestens 2 Wochen lagerfähig. Implantatmaterial aus PTFE für den prothetischen Ersatz von kleinlumigen Blutgefäßen wurde durch 15 minütige Inkubation mit einem Gemisch aus je einem Teil 30%igem Wasserstoffperoxid und 96%iger Schwefelsäure an der luminalen Oberfläche oxidiert. Die Abnahme der Oberflächenhydrophobizität wurde durch Messung des Benetzungswinkels (Wasser) nachgewiesen. Dieser verringerte sich von ursprünglich 125° auf ca. 90°. Eine Analyse des IR Spektrums zeigte neben den Banden für unmodifiziertes PTFE neue, für Hydroxylgruppen charakteristische Banden zwischen 1000 und 1400 cm'1.
Das so aktivierte Implantatmaterial wurde mit dem OH reaktiven Crosslinker Cyanurchlorid verknüpft. Dies konnte nach vorheriger Neutralisation der oxidierten Oberfläche durch eine 30 minütige Inkubation in einer gesättigten Lösung von Cyanurchlorid in Chloroform erreicht werden. Die erfolgreiche kovalente Modifizierung mit Cyanurchlorid wurde mittels IR-Spektroskopie nachgewiesen. Das Spektrum der so behandelten Oberfläche des Materials zeigte zusätzliche, für C=N Bindungen charakteristische Banden bei 1600 cm"1. Der Benetzungswinkel erhöhte sich nach der Umsetzung mit Cyanurchlorid von 90° auf 110°. Die Struktur und Festigkeit des Implantatmateriales wurde von der beschriebenen Prozedur nicht nachteilig beeinflusst.
2.6. Aktivierung von Polyurethanoberflächen (PUR) zur erfindungsgemäßen kovalenten Ankopplung von Tetraetherlipiden. PUR-Oberflächen lassen sich bedingt durch ihre chemische Struktur auf unterschiedliche Weise voraktivieren. Die Wahl der Methode hängt stark vom jeweiligen PUR-Werkstück (Dicke, Elastizität usw.) ab, da bei der Aktivierung die hauptsächlichen Stoffeigenschaften nicht verändert werden dürfen. Eine milde Aktivierung wurde durch die Behandlung mit konzentrierter NaOH erreicht. Dadurch kam es zu einer Spaltung der Säureamidbindung, wodurch die oberflächlichen freien Amino- bzw. Carboxylgruppen einer weiteren Aktivierung bzw. direkten Umsetzung zugänglich wurden. Das PUR wurde bei RT für 20 min mit einer konzentrierten (6N) NaOH kontaktiert. Anschließend wurde die NaOH abgegossen und dreimal mit destilliertem Wasser gespült. Die freien Aminogruppen konnten jetzt direkt mit dem Cyanurchlorid-modifizierten Tetraetherlipid-Derivat umgesetzt werden. Dazu wurde das Lipid in einem Puffer pH 8,4 dispergiert und bei 400C 12 Stunden mit der Oberfläche kontaktiert. Durch einen kombinierten Spreit- und Kopplungsmechanismus wurde die Oberfläche mit dem Tetraetherlipid-Derivat modifiziert. Überschüssiges nicht gebundenes Lipid wurde durch mehrmaliges Waschen der Oberfläche mit Isopropanol/Wasser (70/30 v:v) entfernt.
Desweiteren wurden die freien Gruppen durch andere Techniken weiter aktiviert. Sowohl die Aktivierung mit Cyanurchlorid (-NH2-Gruppe) oder mit ß-Propiolacton (-COOH-Gruppe) erwiesen sich als möglich und erlaubten die Einführung von Spacermolekülen. Die weitere Reaktion zur Oberfächenmodifizierung erfolgte mit den TL-Derivaten TL-NH2 oder TL- ONa.
2.7. Oberflächenaktivierung von Silikongummi und anderen Silikonpolymeren zur erfindungsgemäßen kovalenten Ankopplung von Tetraetherlipiden.
Silikongummi und andere Silikonpolymere lassen sich durch Behandlung mit Alkalihydroxiden, z. B. NaOH oder Ammoniumhydroxid, ohne Beeinträchtigung ihrer Struktureigenschaften präaktivieren. Dabei kommt es zu einer Spaltung der Si-O-Bindung, wodurch Hydroxylgruppen für eine weitere Aktivierung bzw. direkte Umsetzung an der Materialoberfläche freigesetzt werden.
Das Silikonmaterial wurde bei 370C für 3 Stunden mit einer Lösung von 5M NaOH kontaktiert. Anschließend wurde die Lösung abgegossen und das Silikongummi mehrmals mit destilliertem Wasser gespült. Die freien Hydroxylgruppen konnten jetzt direkt mit dem Silan-Tetraetherlipid-Derivat umgesetzt werden. Dazu wurde das Lipid dispergiert und bei 4O0C 12 Stunden mit der Oberfläche kontaktiert. Überschüssiges nicht gebundenes Lipid wurde durch mehrmaliges Waschen der Oberfläche entfernt.
Desweiteren konnten die freien Hydroxylgruppen durch andere Techniken weiter aktiviert werden. Bei der Umsetzung mit verschiedenen Aminoalkyl-alkoxysilanen wurden freie Aminogruppen auf der Oberfläche eingeführt. Die präaktivierte Silikonoberfläche wurde dazu bei RT für 16 Stunden in reines Aminopropyltrimethoxysilan getaucht. Anschließend wurde die Lösung abgegossen und kurz 3 mal in Methanol und 3 mal in destilliertes Wasser getaucht. Der Feststoff wurde bei 8O0C für 17 Stunden getrocknet und die Oberfläche zuletzt nochmals dreimal mit Aceton, dreimal mit Methanol und dreimal mit destilliertem Wasser gut gespült.
2.8 Oberflächenaktivierung von Gläsern und metallischen Oberflächen mittels energiereicher UV Strahlung Bei der UV-Behandlung erzeugt ein gepulster Eximerstrahler energiereiche UV-Strahlung und generiert dabei zusätzlich Ozon am Bestrahlungsort. Dies ist geeignet, um Glas-, Keramik- und Polymeroberflächen aber auch Metalloberflächen mit dünner Oxidschicht von organischen Verschmutzungen zu befreien. Zugleich bewirkt die Strahlung auf den Polymeroberflächen einen Masseabtrag, so dass ein Glättungseffekt beobachtet wird. Durch die oxidative Ablation werden an allen (auch den anorganischen) Oberflächen reaktive Sauerstoff-funktionalitäten (aktivierte Hydroxylgruppen, Oxide bzw. Peroxide) generiert, die sich sofort mit allen vorstehend beschriebenen aktivierten Tetraetherlipiden verbinden können und zu kovalent fixierten Tetraetherlipid-Monoschichten führen, wenn die bestrahlten Objekte im Self-Assembly Verfahren mit den Lipiden kontaktiert werden.
Sensorchips mit Glasoberfläche wurden mit ozongenerierender VUV-Strahlung gereinigt und aktiviert. Dazu wurde die zu beschichtende Oberfläche mit einem Abstand von 5 mm unter eine Xeradex Lampe platziert und für 5 min einer UV-Strahlung mit der Wellenlänge von 173 nm ausgesetzt. Die erhaltenen Oberflächen wiesen unmittelbar nach der Bestrahlung eine außerordentlich hohe und gleichmäßige Reaktivität gegenüber mit Cyanurchlorid aktiviertem Tetraetherlipid auf. Zur Aktivierung von edlen (z.B. Gold, Silber) und unedlen Metallen (z.B. Stahl) wurde eine analoge Behandlung erfolgreich durchgeführt. 3. Verfahren zur kovalenten Ankopplung von Tetraetherlipiden an Oberflächen von Basismaterialien
3.1 Modifizierung von Materialoberflächen mit freien NH2-Gruppen mit Cyanurchlorid-aktiviertem Tetraetherlipid
Ein mit Cyanurchlorid aktiviertes Tetraetherlipid (dabei ist es unerheblich ob eine oder beide Seiten aktiv sind) wurde für die Beschichtung einer Aminogruppen-aufweisenden Festkörperoberfläche in Chloroform, Dioxan, Toluol, Benzol, THF, Aceton oder deren Gemische gelöst und mit einem tert. Amin als Katalysator, bevorzugt N1N- Diisopropyiethylamin, versetzt. Durch das Bestreben zur molekularen Selbstorganisation des Tetraetherlipids kam es zu einer monomolekularen, physikalischen Adsorption an der Grenzfläche. Nachfolgend bildete sich eine chemischen Bindung durch Reaktion der aktivierten Kopfgruppe des Tetraetherlipids mit funktionellen Gruppen auf der Oberfläche des Basismaterials. Die Reaktion wurde bei Temperaturen zwischen 200C und 400C über einen Zeitraum von 3-12 Stunden ausgeführt. Voraussetzung für die Reaktion war das Vorhandensein geeigneter funktioneller Gruppen auf der zu modifizierenden Oberfläche.
3.2 Modifizierung von Metall-, Metalloxid-, Keramik- oder Silikonmaterialien, die freie OH-Gruppen aulweisen mit Cyanurchlorid-aktiviertem Tetraetherlipid
Reaktionsfähige OH-Gruppen wurden auf den Materialoberflächen nach den vorgenannten Methoden erzeugt. Danach wurde die hydroxylgruppenhaltige Oberfläche mit in Aceton, Chloroform oder Chloroform/Methanol (1:1) gelöstem Cyanurchlorid-modifiziertem Tetraetherlipid (1 mg/ml) inkubiert. Die Reaktion verlief unter Zugabe von tert. Amin als Katalysator, bevorzugt N,N- Diisopropylethylamin. Die Reaktionsdauer betrug 2 Stunden bei 400C. Überschüssiges nicht gebundenes Lipid wurde durch mehrmaliges Waschen der Oberfläche mit Aceton oder Chloroform und schliesslich Methanol entfernt.
Die freien Hydroxylgruppen konnten auf analoge Weise mit Alkoxysilanderivaten umgesetzt werden, worauf die weitere Reaktion zur Oberflächenmodifizierung mit den entsprechenden Tetraetherlipid-Derivaten erfolgte.
3.3. Verfahren zur direkten Modifizierung von nicht voraktivierten Metall-, Metalloxid-, Keramik- oder Silikonmaterialien mit freien OH-Gruppen mit Mesyl- Tetraetherlipiden Das Tetraetherlipid-Derivat mit Mesylkopfgruppen ist so reaktiv, dass in der Regel keine Präaktivierung der oberflächlichen Hydroxylgruppen des Basismaterials notwendig ist. Dieses wurde für 12 Stunden mit dem in Aceton, Chloroform oder Chloroform/Methanol (1 :1) gelöstem Mesylderivat (1 mg/ml) bei 600C inkubiert. Überschüssiges, nicht gebundenes Lipid wurde durch mehrmaliges Waschen im Ultraschallbad mit Aceton oder Chloroform und schließlich Methanol entfernt und anschließend unter Stickstoff getrocknet. Zur Modifizierung wurde sowohl das Mono- als auch das Disubstitutionsprodukt des Tetraetherlipids (Mesyl-TL-Mesyl) eingesetzt, wobei letzteres oberflächlich exponierte Mesylgruppen auf dem Komposit erzeugt, die mit weiteren Hydroxyl- oder Aminogruppenhaltigen niedermolekularen oder polymeren Stoffen zur Reaktion gebracht wurden.
Abbildung 5 zeigt das Ergebnis der Modifizierung eines handelsüblichen Dialyseschlauches (Cellulose) nach dieser Methode. Das Material wurde in eine chloroformische, 6O0C warme Lösung von Tetraetherlipid-Mesylat (1 mg/ml) getaucht, nach 12 Stunden aus der Lösung entnommen und intensiv mit Chloroform gespült. Unverbrauchtes Tetraetherlipid wurde durch Waschen mit Chloroform zurückgewonnen. Die Dicke der Lipidschicht betrug 3,8 nm. Der Gleichgewichtsrandwinkel (gegenüber Wasser) der Folie stieg durch die Modifikation von 21 ° auf 69°. Auch nach wiederholtem Spülen blieb der Randwinkel unveränderlich.
Figure imgf000028_0001
Abbildung 5. Die Struktur der entstandenen Oberfläche ist mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie dargestellt worden. Links: Dialyseschlauch unmodifiziert, rechts: Dialyseschlauch nach Lipidierung
Vergleichbare Tetraetherlipid-Komposite auf der Basis hydroxylgruppenhaltiger Polymere, Metalle, Keramiken und Gläser wurden durch Adaptation der beschriebenen Methode erhalten.
3.4 Verfahren zur Modifizierung von OH-Gruppen haltigen Basismateriaiien mit Amino-Tetraetherlipiden
Basismaterialien mit natürlicher Oxidschicht, z.B. Silizium-Sensoren wurden mit konz. Schwefelsäure/H2O2 (50:50, v:v) gereinigt, bis ein Randwinkel gegenüber Wasser von weniger als 18° zu beobachten war. Anschließend wurde die Oberfläche durch Modifizierung mit einem Aminoalkylsilan präaktiviert (10'3 mol/l Lösung von Aminobutyl- dimethyl-chlorsilan in trockenem Chloroform, 150 cm2/50 ml Lösung, RT, 1 Stunde), intensiv mit Chloroform gespült und im Stickstoffstrom getrocknet. Danach war zur Erzeugung einer stabilen kovalent gebundenen Silan-Oberflächenschicht ein Ausheizen bei 125 0C für 2 Stunden notwendig. Der Randwinkel der Schicht vergrößerte sich auf ca. 42°. Die Oberflächenrauhigkeit veränderte sich nicht signifikant. Die Dicke der erhaltenen Schicht betrug ca. 0,45 nm (Ellipsometrie, nu = 1,386, ns = 3,828, ki = i0,200). Danach wurden die aktivierten Materialien mit einer konzentrierten Lösung aus Bemsteinsäureanhydrid in PBS kontaktiert (2 Stunden, RT, RW 35°), intensiv mit Wasser gespült und anschließend bei RT getrocknet. Die Gesamtdicke der aufgebrachten Schicht erhöhte sich auf ca. 0,68 nm ( nu = 1,395), das Zetapotential (pH 5,6) veränderte sich von + 12,3 nV auf -22,7mV. Zur kovalenten Anbindung des Tetraetherlipid-Derivates (TEL-O-C2H4-NH2) wurde das Lipid in einer Konzentration von ca. 5x10"3 mol/l in Chloroform gelöst und mit Ethyl(dimethylaminopropyl) carbodiimid-Hydrochlorid (EDC) in 2fachem molaren Überschuß gemischt mit den aktivierten Oberflächen (12h, RT, geschlossene Kammer, pH = 6 eingestellt mit HCl). Anschließend wurde mit Chloroform/Methanol (2:1, v.v) gewaschen und im Stickstoffstrom bei RT getrocknet.
Die Dicke der so erhaltenen Schicht betrug ca. 4,8 nm (Ellipsometrie nu = 1,43), der Randwinkel gegenüber Wasser erhöhte sich auf 68°.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Kompositmaterialien mit Tetraetherlipiden, gekennzeichnet durch kovalent angekoppelte monomolekulare Schichten von Tetraetherlipiden mit kleinen Kopfgruppen an planare oder gekrümmte Oberflächen von Basismaterialien, wobei:
1.1 die Tetraetherlipide mit kleinen Kopfgruppen folgende allgemeine Struktur aufweisen
Figure imgf000030_0001
1.2 und wobei die Basismaterialien sind:
1.2.1 Metalle und Metalloxide sowie deren Legierungen und formstabile Mischungen
1.2.2 Polymere mit vorhandenen oder nachträglich erzeugten funktionellen Gruppen
1.2.3 Gläser und Keramiken auf Basis von Silikaten und/ Boraten
1.2.4 Kohlenstoff und dessen Modifikationen
1.2.5 Silizium, Gallium und deren Verbindungen.
2. Kompositmaterialien gemäß Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet dass diese eine weitere zusätzliche Zwischenschicht zwischen der Oberfläche des jeweiligen Basismaterials und den Tetraetherlipiden mit kleinen Kopfgruppen aufweisen, welche aus den Gruppen der Polyethylenglycole, Polymethacrylate, Polylysine, Polyethylenimine, bzw. der gesättigten und ungesättigten Kohlenwasserstoffe mit 6-24 C-Atomen stammt.
3.; Kompositmaterialien gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass zusatzliche, an reaktive Kopfgruppen der Tetraetherlipide kovalent gebundene Hydrogele einschließlich anionischer, kationischer, ungeladener und gemischter Natur, die Kompositoberfläche abdecken.
4. Kompositmaterialien nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich spezifische Liganden, die kovalent an reaktive Gruppen der Tetraetherlipide oder Hydrogele gebunden sind, auf der Oberfläche enthalten sind.
5. Kompositmaterialien nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich bioaktive Substanzen und Aggregate, die vorzugsweise kovalent an reaktive Gruppen der Tetraetherlipide oder Hydrogele gebunden sind, auf der Oberfläche enthalten sind.
6. Verfahren zur Herstellung von Kompositmaterialien gemäß Patentanspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberflächen des Basismaterials zur kovalenten
Ankopplung der Tetraetherlipide mit kleinen Kopfgruppen zunächst voraktiviert werden.
7. Verfahren zur Herstellung von Kompositmaterialien gemäß Patentanspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass Tetraetherlipide mit reaktiven kleinen Kopfgruppen an das Basismaterial oder eine Zwischenschicht kovalent gebunden werden, wobei die Tetraetherlipide als mono- oder direaktive Variante eingesetzt werden können.
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