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Die
Erfindung betrifft neue Kompositmaterialien, die unter Verwendung
von Tetraetherlipiden mit kleinen Kopfgruppen sowie von dieser Struktur
abgeleiteten, synthetisch erzeugten Reaktionsprodukten hergestellt
werden.
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In
den Ingenieurwissenschaften, der Pharmazie, der Biotechnologie und
der Biomedizin hat eine Vielzahl von Werkstoffen mit unterschiedlichsten
Materialeigenschaften Eingang gefunden. Gerade in der modernen Medizintechnik
werden diese als permanente oder temporäre Implantatmaterialien angewendet.
Dabei können
Eigenschaften von biologisch inert bis hin zu vollständig biokompatibel
oder biodegradierbar notwendig sein. Eine seit geraumer Zeit verfolgte
Strategie zur Verbesserung der Biokompatibilität dieser und anderer relevanter
Materialien besteht in der nachträglichen, gezielten Beschichtung
ihrer Oberflächen
mit Biomembrananaloga. Für
solche Modifizierungen wurden beispielsweise Hydrogele, hydrophile
Polymere wie Polyethylenglycol oder Phospholipide herangezogen (Emoto
et al. in Coll. Surf. B Biointeraces 2000 18 p. 337–346, Klee
et al. in Medizintechnik mit biokompatiblen Werkstoffen, E. Wintermantel,
S.W. Ha (Eds) Springer Verlag p. 347–360 2003, Tziampazis et al.
in Biomaterials 2000 21 p.511–520,
Drury et al. in Biomaterials 2003 24 p. 4337–4351). Gemeinsames Merkmal
dieser Beschichtungen ist, dass die aufgebrachten Oberflächenmodifizierungen
selten kovalent an das Basismaterial angebunden werden können. Auch
bei der Methode der kovalenten Beschichtung von Oberflächen mit
Phospholipiden zur Erzeugung Biomembran-analoger Materialüberzüge, wird
lediglich die innere Monoschicht der Lipid-Doppelschicht direkt
und teilweise kovalent an der Materialoberfläche verankert (
DE 297170 ).
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Mit
Lipid-Monoschichten modifizierte Oberflächen werden technisch bereits
zur affinitätschromatographischen
Trennung bzw. Analytik von Carotenoiden an sogenannten RP-C30 Phasen
verwendet. Prinzipiell lassen sich solche mit Lipid beschichteten
Matrizes auch zur chromatographischen Trennung membranständiger Proteine
heranziehen (
DE 19814775 und
US 6051372 ), wobei die temperaturabhängige Änderung
der viskoelastischen Eigenschaften sowie die laterale Ladungsverteilung
der Lipidmatrix als Trennprinzip herangezogen wird.
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Ein
Verfahren zum Aufbau von Lipidschichtsystemen auf Polymeren unter
kovalenter Fixierung der innersten Monoschicht wurde von Rothe et
al. beschrieben (
DE 297170 ).
Die auf solchen Lipiden aufbauenden Schichtsysteme besitzen insbesondere
aufgrund der fehlenden kovalenten Fixierung der äußeren Schichten jedoch nur
eine geringe physikalische Langzeitstabilität bzw. Resistenz gegenüber aggressiven
chemischen Medien.
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Schließlich beschrieb
Foresto die Aufbringung von dicken Lipidschichten auf Bootsrümpfe durch
Verwendung deren Schmelzen (FR 2701713) zum Zweck der antiadhäsiven Beschichtung.
Derartige Anstriche sind unter chemischer und physikalischer Belastung
ebenfalls von geringer Dauerstabilität.
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Die
Ausgangssubstanz der in der vorliegenden Patentschrift zur Oberflächenmodifizierung
herangezogenen Tetraetherlipide sind bipolare, membrandurchspannende
Amphiphile, die ursprünglich
aus natürlichen
Quellen (Archaebakterien) isoliert wurden (Langworthy et al. in
System. Appl. Microbiol 1986 7 p. 253–257 und Gulik et al., in J.
Mol. Biol. 1985 182 p.131–149).
Tetraetherlipide besitzen eine bemerkenswerte chemische und biologische
Stabilität
und sind in der Lage, sich an Grenzflächen zu monomolekularen Schichten
zu organisieren oder Vesikel zu bilden (Lo & Chang in Biochem. Biophys. Res.
Commun. 1990 167 p. 238–243
und Bakowsky et al. in Chem. Phys. Lipids 2000 105 p. 31–42). Bislang
existieren nur wenige Veröffentlichungen,
welche die Verwendung archaebakterieller Tetraetherlipide in der
Materialwissenschaft, der Pharmazie oder der Biotechnologie beschreiben.
Die bisher genutzten Lipide leiten sich chemisch meist vom natürlichen
Hauptlipid von Thermoplasma acidophilum, dem Main-Phospho-Lipid
(MPL) ab, dessen Kopfgruppen ein β-Gulosidderivat
bzw. ein Phosphatidylglycerolderivat sind. Daneben wurden derartige
Lipide zur Herstellung von Schmierstoffen (
US 5098588 ), sowie nichtkovalent angebundenen Überzügen (
US 5401378 und
US 5443955 ), vorgeschlagen. Die Beschichtung
planarer Membranen mit den obengenannten Glyco- und Phosphatidyl-Tetraetherlipiden
sowie die Anwendung der erhaltenen Oberflächen zur Trennung von Stoffgemischen
(Chromatographie) wurde von Braunschweig et al. beschrieben (
US 6051372 ).
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Kürzlich wurden
Tetraetherlipide mit kleinen Kopfgruppen, welche zur stabilen kovalenten
Anbindung an bestimmte Oberflächen
geeignet sind, beschrieben (
DE
10228857 ).
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Alle
bisher offengelegten Oberflächenbeschichtungen
mit herkömmlichen
Lipiden und Tetraetherlipiden sind für die Mehrzahl der Anwendungen
nicht von ausreichender mechanischer und chemischer Beständigkeit.
Die nativen Tetraetherlipide sind in ihrer Kopfgruppenstruktur nicht
zur kovalenten Anbindung geeignet. In Vorarbeiten wurden unterschiedliche
Tetraetherlipid-Derivate mit zur kovalenten Anbindung geeigneten
kleinen Kopfgruppen synthetisiert.
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Der
Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, Kompositmaterialien
unter Verwendung von Tetraetherlipiden mit kleinen Kopfgruppen zu
entwickeln, die hohe Stabilitäten
und neuartige Eigenschaften aufweisen. Eine weitere Aufgabe der
Erfindung ist die Entwicklung eines geeigneten Verfahrens zur Herstellung
der genannten Kompositmaterialien.
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Die
erfindungsgemäße Lösung dieser
Aufgabe ist im Patentanspruch 1 angegeben. Danach sind die Kompositmaterialien
mit Tetraetherlipiden gekennzeichnet durch kovalent angekoppelte
monomolekulare Schichten von Tetraetherlipiden mit kleinen Kopfgruppen
gem. (
DE 10228857 )
an planare oder gekrümmte Oberflächen von
Basismaterialien, wobei
- 1.1 die Tetraetherlipide
mit kleinen Kopfgruppen folgende allgemeine Struktur aufweisen
- 1.2 und wobei die Basismaterialien sind:
1.2.1 Metalle
und Metalloxide sowie deren Legierungen und formstabile Mischungen
1.2.2
Polymere mit vorhandenen oder nachträglich erzeugten funktionellen
Gruppen
1.2.3 Gläser
und Keramiken auf Basis von Silikaten und Boraten
1.2.4 Kohlenstoff
und dessen Modifikationen
1.2.5 Silizium, Gallium und Verbindungen
1.2.6
Halbleiter und dotierte Halbleiter.
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Weiter
sind die erfindungsgemäßen Kompositmaterialien
nach Patentanspruch 3 dadurch gekennzeichnet, dass zusätzliche
an reaktive Kopfgruppen der Tetraetherlipide gebundene Hydrogele
einschließlich solcher
mit kationischer, anionischer, zwitterionischer oder ungeladener
Natur die Kompositoberfläche
abdecken.
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Zusätzlich können gemäß den Patentansprüchen 4 und
5 spezifische Liganden sowie bioaktive Substanzen und Aggregate,
die kovalent an reaktive Gruppen der Tetraetherlipide oder Hydrogele
gebunden sind, auf der Oberfläche
der Kompositmaterialien enthalten sein.
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Das
Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Kompositmaterialien ist
in den kennzeichnenden Merkmalen der Patentansprüche 6 und 7 beansprucht.
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Danach
werden gemäß Patentanspruch
6 die Oberflächen
der Basismaterialien zur kovalenten Anbindung der Tetraetherlipide
mit kleinen Kopfgruppen voraktiviert oder gemäß Patentanspruch 7 werden Tetraetherlipide
mit reaktiven, kleinen Kopfgruppen kovalent an das Basismaterial
oder eine Zwischenschicht gebunden, wobei die Tetraetherlipide als
mono- oder disubstituierte Variante eingesetzt werden können.
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Archaebakterielle
Lipide haben, offensichtlich aufgrund ihrer evolutiven Stellung,
besondere Eigenschaften im Vergleich zu Lipiden aus Eubakterien
und Eukaryonten (Temperaturbeständigkeit,
chemische Resistenz, verringerte biologische Abbaubarkeit). Diese
Eigenschaften machen sie einzigartig mit Blick auf spezifische Anwendungen.
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Gegenstand
der Erfindung sind neue Kompositmaterialien, welche sich durch eine
kovalente Modifizierung mit speziellen Abkömmlingen derartiger Lipide,
sogenannten Tetraetherlipiden, auszeichnen, deren vorteilhafte Eigenschaften
sowie deren Anwendung für
ausgewählte
Zwecke. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, Verfahren
zur Herstellung derartiger Komposite bereitzustellen. Verwendet
werden dazu spezielle Tetraetherlipide mit kleinen Kopfgruppen.
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Derartige
Komposite sind besonders geeignet
- – zum Zweck
der Minimierung des biologischen Bewuchses der Oberfläche (Antifouling),
- – zur
Schaffung eines monomolekularen Gleitfilmes zur Reduktion der Reibungskräfte und
zum Schutz der Oberfläche,
- – zur
Verbesserung der biologischen Eigenschaften von Implantatmaterialien
sowie zur Verbesserung der Eigenschaften und Erhöhung der Lebensdauer von Kontaktlinsen
und Medizinprodukten (z.B. Katheter).
- – zur
Verbesserung der Eigenschaften und Erhöhung der Standzeit und Lebensdauer
von optischen Sensoren sowie von elektrochemischen Sensoren oder
Biosensoren,
- – als
Filtrationsmembran mit optimierter Probenwechselwirkung,
- – als
Affinitätsmatrix
zur präparativen
und analytischen Trennung von Substanzgemischen,
- – als
Biosensoren nach Anbindung von sensorischen Funktionsmolekülen.
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Der
Einsatz der entwickelten Methoden gestattet die Bildung stabiler,
monomolekularer Tetraetherlipid-Filme auf unterschiedlichen Basismaterialien – insbesondere
Metallen und Metalloxiden, Kohlenstoff, Silizium, Gallium und deren
Verbindungen, Keramiken und Gläsern,
sowie Polymeren – und
eröffnet
zudem die Möglichkeit,
nachträglich
an der reaktiven Außenseite
(bio)relevante Strukturen anzukoppeln.
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Durch
die Modifizierung der Oberfläche
werden die physikochemischen Eigenschaften der Oberfläche wie
z.B. die freie Energie und die Benetzbarkeit und/oder die Oberflächenmorphologie
verändert.
Damit ist es möglich,
eine gezielte Unterdrückung
oder Aktivierung der Wechselwirkung mit biologischen Substraten
(Serum, Zellkulturen, Gewebe) herbeizuführen. Die durchgeführten Modelluntersuchungen
(Vergleich der natürlichen
und synthetischen supportfixierten Strukturen) sind indikativ für eine spätere Applikation
in vivo, in vitro und ex vivo.
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Aufbauend
auf den erfindungsgemäßen Kompositmaterialien
können
gezielt bioaktive Spezies an der Oberfläche fixiert werden. Die Chemisorption
bzw. Physisorption bioaktiver Spezies wie Enzyme, organische Katalysatoren,
Ribozyme, Organometallverbindungen, Proteine, Glycoproteine, Peptide,
Polyaminosäuren, Nucleinsäuren, Antikörper oder
Teilkomponenten davon, Carbohydrate, Zytokine, Lipide und Bestandteile
der extrazellulären
Matrix, stellt u.a. die Grundlage für spezifische biologische Eigenschaften
dar.
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Weiterhin
können
an der Oberfläche
der erfindungsgemäßen Komposite
zusätzlich
negativ geladene Gruppen, vorzugsweise Carboxyl-, Phosphat- oder
Sulfat- bzw. Sulfonatgruppen angebunden werden.
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Ebenfalls
können
positiv geladene Gruppen, vorzugsweise quarternäre Stickstoffverbindungen angebunden
werden.
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Auch
die Ankopplung hydrophiler Gruppen auf der Oberfläche der
erfindungsgemäßen Komposite
ist möglich,
insbesondere geeignet dafür
sind Polyethylenglycole und Kohlenhydratoligomere.
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Weiterhin
wird eine stabile, freitragende, monomolekulare Porenüberspannung
auf der modifizierten Materialoberfläche realisiert. Dazu werden
die Tetraetherlipide zuvor kovalent an hydrophile Kettenpolymere (z.B.
Polylysin) gekoppelt. Durch die Kombination der Eigenschaften eines
hydrophilen, flexiblen Kettenpolymers mit der Selbstorganisationsfähigkeit
der hydrophoben Tetraetherlipide entsteht ein neuartiges Kompositmaterial,
welches ein wassseraufnehmendes, flexibles Strukturelement besitzt,
mit dem sowohl das Spacer-Prinzip erfüllt wird und das zudem reaktive
Gruppen besitzt, über
die eine kovalente, hydrolyseresistente Anbindung an die Substratoberfläche gewährleistet
werden kann. Auf diese Weise resultiert eine Stabilisierung des
Lipidüberzugs
im porenüberspannenden
Bereich, ohne dabei die Wasserpermeation zu beeinflussen. Als Präparationsverfahren
kann sowohl die Vororganisation der modifizierten Tetraetherlipide
an der Wasser/Luft Grenzfläche
und anschließendem Übertrag
des Flims mit der Langmuir-Blodgett Methode auf die Matrixmaterialien
wie auch die Self-Assembly Methode aus organischen Lösungsmitteln
eingesetzt werden. Es ist dabei möglich, den entstandenen Oberflächenfilm
sowohl chemisorbiert als auch physisorbiert auf dem Substrat zu
verankern. Mit diesem Verfahren ist es möglich, Oberflächenschichten
mit einer Dicke von 4 nm bis 100 nm zu erzeugen.
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Die
erfindungsgemäßen Komposite
können
weiterhin als Affinitätstrennmaterialien
herangezogen werden. Als Basismaterialien sind kommerziell zugängliche
poröse
Träger
auf keramischer, glasartiger, silikatartiger oder polymerer Grundlage,
wie z.B. Polystyren, Melamin oder Methylmethacrylat, geeignet, wobei
die Chemie zur kovalenten Fixierung der Lipide analog zu der für glatte
Oberflächen
beschriebenen Vorgehensweise erfolgen kann. Das erlaubt eine Phase,
die nach der üblichen
Nomenklatur etwa als C40 beschrieben würde. Dies ist bisher nicht
erreicht. Weiterhin besitzt eine derartige Phase ebenfalls temperaturabhängig veränderliche elastische Eigenschaften. Damit ist zusätzlich die
Kombination zweier voneinander unabhängiger Trennprinzipien möglich.
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Im
Folgenden wird die Erfindung anhand mehrerer Gruppen von Ausführungsbeispielen
näher erläutert. Diese
Gruppen umfassen unter
- 1. Beispiele für neue Kompositmaterialien
- 2. Beispiele zur Voraktivierung von Basismaterialien
- 3. Beispiele für
Verfahren zur kovalenten Ankopplung von reaktiven Tetraetherlipiden
an Oberflächen
nichtaktivierter Basismaterialien.
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1. Ausführungsbeispiele
zu neuen Kompositmaterialien
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Die
Reaktionsfähigkeit
der Tetraetherlipide mit kleinen Kopfgruppen konnte erfolgreich
zur Herstellung von Kompositen genutzt werden. Dabei wurden verschiedene
Matrices mit planaren oder gekrümmten
Oberflächen
mit Tetraetherlipid-Derivaten kovalent beschichtet. Die neuen Komposite
zeigen überraschende
Eigenschaften wie Antiadhäsivität, eine
außergewöhnliche
Stabilität
und hohe Kopplungs- bzw. Packungsdichte. Um eine möglichst
integere und dicht gepackte Schicht mit spezifischen Eigenschaften
zu erzeugen, war es notwendig, das Tetraetherlipid sowie das Kopplungsverfahren
dem jeweiligen Basismaterial bzw. der jeweiligen Aufgabe anzupassen.
So konnten Lipidoberflächen
mit stark variierenden physikochemischen Parametern (extrem hydrophob,
extrem hydrophil, positiv und negativ geladen) erzeugt werden. Zudem
gelingt die Präparation
von Lipidschichten mit zwitterionischen Kopfgruppen. Im Rahmen einer
zusätzlichen
Funktionalisierung erfolgte die Bindung spezifischer antimikrobieller
Peptide, Saccharide und Nanopartikel.
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1.1. Stabile lipophilisierende
Modifizierung von Silikon
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Eine
1 mm dicke, kommerziell erhältliche
Silikonfolie wurde zuerst in einer 5M NaOH-Lösung
präaktiviert
(3 Stunden, 37°C).
Dann wurde die Folie gründlich
mit destilliertem Wasser gewaschen. Der Gleichgewichtsrandwinkel
(gegenüber
Wasser) änderte
sich dabei von ca. 105° zu
ca. 115°.
Anschließend
wurde die Oberfläche
durch Aufbringen einer Aminoalkylsilanschicht präaktiviert (bevorzugt reines
Aminopropyltrimethoxysilan, RT, 16 Stunden). Die Folie wurde aus
der Lösung
entfernt, kurz dreimal in Methanol und dreimal in destilliertes
Wasser getaucht und danach im Trockenschrank bei 80°C für 17 Stunden
getrocknet. Schließlich wurde
nochmals gut mit Aceton, Methanol und zuletzt destilliertem Wasser
gewaschen. Der Randwinkel änderte
sich während
dieses Aktivierungsschrittes unwesentlich.
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Zur
kovalenten Bindung der Tetraetherlipidschicht (beidseitig Cyanurchlorid-modifiziertes
Caldarchaeol) wurde das Lipid mit einer Konzentration von 1 mg/ml
in Aceton gelöst.
Alternative Lösungsmittel,
welche ebenfalls mit Erfolg eingesetzt wurden, waren Chloroform
und eine 1:1 Mischung von Chloroform und Methanol. Die Silikonfolie
wurde für
2 Stunden bei 40°C
in die Lipidlösung
getaucht. Die Reaktion erfolgte unter Zugabe von N,N-Diisopropylethylamin
als Katalysator. Anschließend
wurde nicht gebundenes Lipid durch mehrmaliges Waschen der Folie
mit Aceton oder Chloroform und schließlich Methanol entfernt. Der
Randwinkel änderte
sich durch die Beschichtung mit Tetraetherlipid nur unwesentlich.
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Die
hohe Rauhigkeit des Ausgangsmaterials blieb über alle Reaktionsstufen erhalten.
Eine Analyse mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie nach Anfärbung der
angekoppelten Tetraetherlipid-Schicht mit einem lipophilen Farbstoff
(3,3'-Dioctadecyloxacarbocyaninperchlorat)
zeigten im Gegensatz zur unmodifizierten Silikonfolie eine regelmäßige Anfärbung.
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1.2 Herstellung biofunktionalisierbarer
Sensoren aus einem Tetraetherlipid-Glas Komposit
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Sensorchips
mit Glasoberfläche
wurden mit ozongenerierender UV-Strahlung gereinigt und aktiviert. Dazu
wurde die zu beschichtende Oberfläche mit einem Abstand von 5
mm unter eine Xeradex Lampe platziert und für 5 min einer UV-Strahlung
mit einer Wellenlänge
von 173 nm ausgesetzt. Anschließend
wurde der Sensor sofort in die Lösung
mit Cyanurchlorid-aktiviertem TL (1 mg/ml Lösung in Chloroform) getaucht
und bei 70 °C über 12 h
unter Druck in einer geschlossenen Teflonkammer zur Reaktion gebracht. Überschüssiges Lipid wurde
mit Chloroform nach Ultraschallbehandlung abgewaschen und die Oberfläche im Stickstoffstrom
getrocknet. Alternativ wurde die Oberfläche mit Schwefelsäure/Wasserstoffperoxid
gereinigt und danach durch Aufbringen einer Aminoalkylsilanschicht
voraktiviert (1 mmolare Lösung
von Aminobutyl-dimethyl-chlorsilan in trockenem Chloroform).
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Der
Randwinkel der so lipidierten Oberflächen lag zwischen 60 und 70°. Die Reaktivität der auf
der Lipidoberfläche
enthaltenen Cyanurchlorid-Funktionen wurde durch Ankopplung eines
fluoreszenten Moleküls (Fluorescein-Isothiocyanat)
und Fluoresenzmikroskopie nachgewiesen und blieb über mind.
2 Wochen erhalten.
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Zur
Funktionalisierung der Tetraetherlipid-Glas Sensoren wurde das aktive
Komposit beispielsweise mit einer Mischung von Taurin (Aminoethansulfonsäure) und
Glycin (Aminoessigsäure)
in Verhältnis
von 10:1 in Boratpuffer pH 8,8 für
12 h bei 50°C
umgesetzt. Die resultierende Oberfläche wies durch das Vorhandensein von
Sulfon- und Carbonsäuregruppen
ein negatives Zetapotenzial auf, wobei die COOH-Gruppe erfolgreich zur
Anbindung von Sensormolekülen
wie Antikörpern/Proteinen über die
Carbodiimidmethode genutzt wurde.
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Alternativ
zur Beschichtung mit Taurin/Glycin wurden die Reaktivität der Cyanurchloridgruppe
der Tetraetherlipid-Glas Kompositoberfläche zur kovalenten Ankopplung
von Aminobiotin genutzt, welches wiederum die Anbindung vielfältiger Sensormoleküle über Biotin-Avidin-Biotin
Brücken
ermöglichte.
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Weitere
Optionen, die erfolgreich getestet wurden, waren die PEGylierung
mit Amino-Polyethylenglycol,
sowie die Aminierung mit Diaminen, z.B. Diaminoethan.
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Abbildung
1. Biosensoren bestehend aus einem Tetraetherlipid-Glas Komposit
und dazu entwickelte Funktionalisierungsoptionen
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1.3 Kompositmaterialien
mit antiadhäsiven
Eigenschaften (Antifouling)
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Verschiedene
hergestellte Kompositmaterialien wiesen deutliche Antiadhesivität auf. Der
Nachweis der reduzierten Bioadhäsion
bzw. eines Antifouling-Effektes unter statischen Bedingungen wurde
an Tetraetherlipid-Kompositen auf Basis von Glas (Borosilikatglas,
B33) und Silikon dargestellt. Als biologisches Modellsystem kam
eine Mischkultur aus Staph. epidermidis und Staph. aureus im Verhältnis 50:50
zur Anwendung, welche vor allem als biofilmbildende Infektionskeime
aus dem biomedizinischen Bereich bekannt sind.
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Mit
dem Ziel, den Effekt einer gezielten Beschichtung der Oberflächen mit
Biomembrananaloga nachzuweisen, wurde auf beiden Substraten eine
Tetraetherlipidschicht kovalent an die Oberfläche gebunden und entsprechend
der definierten Modifizierung die Nachfolgederivatisierung durchgeführt. Es
erfolgt die Peggylierung mit Polyethylenglykol PEG 5000, welches
als wasserbindende bzw. hydrophile Oberflächengruppe wirkt (TL-PEG).
Die Bioadhäsion
wurde quantifiziert anhand der gezählten adhärierten Mikroorganismen verbunden mit
einer Visualisierung über
eine Lebend/Tot-Färbung
(BacLight®)
mit Hilfe eines Fluoreszenzfarbstoffes. Die 6 und 7 zeigen die nach 24 h Inkubationszeit
deutlich reduzierten Zellzahlen auf den Kompositoberflächen. Des
weiteren wurde der Erhalt der Zellvitalität bei reduzierter Bioadhäsion festgestellt.
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Abbildung
2a: Zellzahl (lebend/gesamt) je Quadratzentimeter nach 24 h Inkubation
des Basismaterials Glas und des Glas-TL-PEG Kompositmaterials (statische
Bedingungen)
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Abbildung
2b: Zellzahl (lebend/gesamt) je Quadratzentimeter nach 24 h Inkubation
des Basismaterials Silikon und des Silikon-TL-PEG Kompositmaterials
(statische Bedingungen)
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Abbildung
3A/3B: REM-Aufnahmen (3500×)
der adhärierten
Bakterien nach 24h Inkubation des Basismaterials Glas B33 (links)
und des Glas-TL-PEG Kompositmaterials (rechts).
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Die
adhärierten
Bakterien erscheinen als weißer
Kontrast. Auf der TL-modifzierten Oberfläche ist deren Anzahl deutlich
verringert.
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Abbildung
3A/B: REM-Aufnahmen (3500×)
der adhärierten
Bakterien nach 24h Inkubation des Basismaterials Silikon (links)
und des Silikon-TL-PEG Kompositmaterials (rechts). Die adhärierten
Bakterien erscheinen als weißer
Kontrast. Auf der TL-modifzierten Oberfläche ist deren Anzahl deutlich
verringert.
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Reduzierung der Biofilmbildung
unter dynamischen Bedingungen
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Weiterhin
erfolgten Untersuchungen mit Hilfe der in vitro-Technik unter Fließbedingungen.
Der Fließkanal
der verwendeten Bypasszelle besaß eine Dimension von 15 mm × 1 mm.
Als Modellorganismus wurde Escherichia coli (Indikatorkeim für fäkale Verunreinigungen)
verwendet. Es wurde dabei zur Simulation der Biofilmbildung von
einer Anlagerungsphase (Seedphase) ausgegangen, gefolgt von einer
Proliferationsphase (Feedphase). Die Analyse des Proliferationsverhaltens
erfolgte mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie über einen Zeitraum von 5 h
und ermöglichte
so die Beschreibung der initialen Biofilmbildung unter dynamischen
Bedingungen. Für
die Prüfung
standen kovalent fixierte Tetraetherlipidschichten zur Verfügung, welche
zum einen mit Polyethylenglykol PEGyliert wurden, um eine biomimetische
Schicht zu kreieren. Eine zweite Modifizierung diente der Erzeugung
eines inerten Lipidfilms gekoppelt mit einer negativ geladenen Oberfläche unter
Anbindung von Glycin. Die lasermikroskopischen Abbildungen nach
3h Inkubation (4) sowie die Adhäsionskinetiken
(5) zeigen eine deutliche Reduzierung
der Bioadhäsion
auch unter dynamischen Fließbedingungen.
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Abbildungen
4A–4C:
CLSM-Aufnahmen der bakteriellen Adhäsion nach 3 h in einer Fließkammer
auf A: Glas, B: TL-PEG modifiziertem Glas-Komposit, C: TL-Glas-Komposit
mit zusätzlicher
negativer Ladung. Die adhärierten
Bakterien erscheinen als helle Strukturen. Auf der Tetraetherlipid-modifzierten
Oberfläche
ist die Anzahl stark verringert.
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Abbildung
5: Initiale Bioadhäsion
auf Basis(Glas)- und Kompositmaterial unter dynamischen Bedingungen über einen
Zeitraum von 5 Stunden.
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1.4 Tetraetherlipid-Gold
Komposite mit reaktiver hydrophober Oberfläche
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Für QCM-Messungen
vorgesehene Schwingquarze (18mm Durchmesser) mit einer 160 nm dicken Goldbeschichtung
sollten durch eine stabile und hydrophobe Schicht abgedeckt werden,
die im Gegensatz zum Gold eine chemische Reaktivität aufweist,
welche eine dauerhaften Anbindung von Liganden an den Sensor ermöglicht.
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Die
Goldoberfläche
des Basismaterials wurde mit energiereicher Ozon-generierender VUV-Strahlung gereinigt
und aktiviert. Dazu wurde die Goldoberfläche mit einem Abstand von 5
mm unter einer Xeradex-Lampe platziert und für 5 min einer UV-Strahlung
von 173 nm ausgesetzt. Es bildete sich eine dünne, ca. 2 nm starke Goldoxidschicht.
Der Randwinkel gegen Wasser fiel entsprechend von 54 ° für reines
Gold auf Werte unter 10° nach
der Bestrahlung. Anschließend
wurde der Sensor sofort in eine Lösung mit Tetraetherlipid-Mesylat
(1 mg/ml Lösung
in Chloroform) getaucht und bei 70 °C über 12 Stunden beschichtet. Überschüssiges Lipid
wurde mit Chloroform unter gleichzeitiger Ultraschallbehandlung
entfernt und die Oberfläche
im Stickstoffstrom getrocknet. Der Randwinkel stieg nach der Lipidbeschichtung
auf Werte von 70° an.
Mit ellipsometrischen Verfahren wurde eine Schichtdicke von 3,2
nm nachgewiesen.
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Wurde
für die
Lipidierung zumindest teilweise das Disubstitutionsprodukt (Tetraetherlipid-Dimesylat) eingesetzt,
konnten die freien, auf der Lipidoberfläche exponierten Mesylat-Funktionen zur weiteren
Oberflächenfunktionalisierung
genutzt werden. Dazu wurden die Sensoren für 12 h in eine Lösung mit
0,1 mg/ml eines monoklonalen Antikörpers gegen Kathepsin B in
Boratpuffer pH 8 getaucht. Nach intensivem Abspülen mit PBS wurde der so beschichtete
Sensor in eine QCM-Flusszelle eingebaut und erfolgreich zum analytischen Nachweis
von Kathepsin B in verdünnten
Serumproben genutzt.
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1.5 Herstellung eines
Tetraetherlipid-Kompositmaterials auf Basis von Silizium-Sensoren mit zusätzlicher
Polymer- Zwischenschicht
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Zur
Herstellung von Tetraetherlipid-Schichten mit polymeren Zwischenschichten
auf Silizium-Sensoren (Silizium-Wafer mit natürlicher Oxidschicht von 2,4–3,8 nm
Dicke) wurde das Material mit konz. Schwefelsäure/H2O2 (50:50, v:v) gereinigt und anschließend mit
einer chloroformischen Lösung
aus Glycidyloxypropyltrimethoxysilan (GOPTS, 10-3 mol/l
150 cm2/50 ml Lösung, RT, 1 Stunde) präaktiviert.
Die Epoxidgruppen wurden durch Behandlung mit 1 mM HCl bei 50°C (5h) zu
den entsprechenden Diolen umgesetzt. Die Sensoren wurden intensiv
mit Chloroform gespült,
unter Stickstoffstrom trocken geblasen und danach mit Tresylchlorid (50
mM chloroformische Lösung)
umgesetzt. Anschließend
wurde mit Aceton gespült
und mit einer Polyethylenimin Lösung
für 8 Stunden
bei RT inkubiert (50 mg/ml, PBS pH 7,5). Nach dem Spülen mit
Wasser wurde im Stickstoffstrom getrocknet. Der Randwinkel gegenüber Wasser
veränderte
sich während
der Substrataktivierung von 16° für den gereinigten
Sensor, über
34° beim
silanisierten, zu 6° beim
Polymer beschichteten. Die Gesamtschichtdicke betrug ca. 6,3nm,
bei einem nun positiven Zetapotential von 12,7 mV (pH 5,6).
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Zur
Beschichtung mit Amino-Tetraetherlipiden wurden die freien Aminogruppen
des Polymers zunächst
durch Inkubation mit einer 100mM Lösung von Glutarsäureanhydrid
(PBS, 2h, RT, frisch hergestellte Lösung) teilweise in Carboxylgruppen
umgewandelt. Anschließend
wurde mit Wasser gespült
und im Stickstoffstrom getrocknet (Randwinkel 18°). Zur Aktivierung wurden die
Carboxylgruppen mit N-Hydroxysuccinimid und Diisopropylcarbodiimid
(1 M in Dimethylformamid, 4h, RT) umgesetzt, danach mit Dimethylformamid
gespült
und wiederum im Stickstoffstrom getrocknet. Der so vorbehandelte
Sensor konnte mit einer 5 × 10-3 molaren Lösung (120 cm2/50
ml Lösung)
des Tetraetherlipid-Derivates (TL-O-C4H8O-NH2) in Chloroform
(6 Stunden, RT) umgesetzt werden. Unverbrauchtes Tetraetherlipid
wurde durch Waschen entfernt. Der Randwinkel der Schicht erhöhte sich
auf 68°,
deren Dicke betrug insgesamt 10,3nm (Ellipsometrie nu = 1,492).
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2. Beispiele für Verfahren
zur Voraktivierung von Basismaterialien
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Zur
kovalenten Modifizierung von Basismaterialien mit Tetraetherlipiden
mit kleinen Kopfgruppen müssen
diese in der Regel zunächst
präaktiviert
werden, um eine ausreichende Reaktionsfähigkeit und damit den gewünschten
Kopplungserfolg bzw. -grad sicherzustellen. Folgende Methoden wurden
für die
erfindungsgemäße kovalente
Ankopplung von Tetraetherlipiden entwickelt:
- • Aktivierung
von Festkörperoberflächen mit
freien OH-Gruppen wie Gläser,
Keramiken oder Polymere
- • Aktivierung
von Silizium- oder Silica-Partikeln oder planaren Materialien mit
Siliziumoxid-Anteilen
- • Aktivierung
von PTFE-Polymeren
- • Aktivierung
von Polyurethanoberflächen
- • Oberflächenaktivierung
von Titan-Implantaten und anderen metallischen Werkstoffen
- • Oberflächenaktivierung
von Gold, Silber oder Kupfer
- • Oberflächenaktivierung
von Silikongummi und anderen Silikonpolymeren
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Die
Modifizierung der Materialoberfläche
wurde durch bekannte physikalisch-chemische Untersuchungsmethoden,
wie Randwinkelmessung, Ellipsometrie, FT-IR und AFM verfolgt.
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2.1 Aktivierung von Festkörperoberflächen mit
freien OH-Gruppen wie Glas, unedle Metalle, Keramik und Polymere
für die
nachfolgende kovalente Ankopplung des Tetraetherlipids.
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Ein
hydroxylgruppenhaltiger Festkörper
wurde mit in Tetrahydrofuran dispergiertem Natriumhydrid umgesetzt.
Dieser Ansatz wurde am Rückfluss
für 6 Stunden
bis zum Sieden erhitzt. Die freien Hydroxylgruppen werden durch
diese Reaktion in ihre Natriumsalze umgewandelt. Nach dem Abtrennen
des Feststoffes und der flüssigen
Phase wurde die Oberfläche
durch mehrmaliges Spülen
mit Tetrahydrofuran gereinigt. Im Anschluß kann das gelöste, z.B.
mit Cyanurchlorid aktivierte Tetraetherlipid mit der Oberfläche kontaktiert
werden.
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Die
Aktivierung der Hydroxylgruppen gelingt ebenfalls durch Inkubation
der Oberfläche
in 6 molarer KOH bzw. NaOH. Hier werden ebenfalls die Hydroxylgruppen
in ihre jeweiligen Salze überführt.
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Die
Aktivierung der Hydroxylgruppen gelingt auch durch die Umsetzung
mit Silanen, z.B. Trimethoxyaminoalkylsilan und der Einführung einer
freien Aminofunktion auf der Festkörperoberfläche, welche die Hydroxylgruppe
ersetzt.
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2.2. Aktivierung von Silizum-
oder Silica-Partikeln oder planaren Materialien mit Siliziumoxid-Anteilen
(z.B. Glas) zur erfindungsgemäßen kovalenten
Ankopplung von Tetraetherlipiden.
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Die
Präaktivierung
der Siliziumoxid-haltigen sphärischen
Partikel erfolgt mit Aminoalkylsilanen insbesondere Trimethoxyaminoalkylsilan.
Anschließend
erfolgt die Kopplung mit Cyanurchlorid-modifiziertem Tetraetherlipid
in der beschriebenen Weise. Zur Herstellung von dicht gepackten
Tetraetherlipid-Derivat-Schichten auf Glas wurde das Material wie
folgt behandelt. Die Proben wurden mit konz. Schwefelsäure/H2O2 (50:50, v:v) gereinigt
bis ein Randwinkel gegenüber
Wasser von weniger als 20° zu
beobachten war. Anschließend
wurde die Oberfläche
durch Aufbringen einer Aminoalkylsilanschicht voraktiviert (10-3 mol/l Lösung von Aminobutyldimethylchlorsilan
in trockenem Chloroform, RT, 1 Stunde). Danach wurde die Probe aus
der Lösung
entfernt, mit Chloroform gewaschen und im Trockenschrank bei 125 °C für 2 Stunden
getrocknet. Der Randwinkel der Schicht vergrößerte sich auf ca. 48°, die geringe
Oberflächenrauhigkeit
blieb erhalten. Die Dicke der erhaltenen Schicht betrug 0,6 nm (AFM).
Danach wurde die Glasoberfläche mit
einer Cyanurchloridlösung
in Chloroform kontaktiert (10-3 mol/l, N,N-Diisopropylethylamin
als Katalysator, 5 Stunden, RT).
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Zur
kovalenten Ankopplung der Tetraetherlipid-Derivat-Schicht (TEL-O-C2H4-NH2)
wurde das Lipid in einer Konzentration von ca. 5 × 10-3 mol/l in Chloroform gelöst. Das
Glas wurde für
10 Stunden in die Lipidlösung
getaucht, anschließend
gewaschen und getrocknet.
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Die
Dicke der so erhaltenen Schicht betrug 3,8 nm, der Randwinkel lag
bei 76°.
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2.3. Oberflächenaktivierung
von Titan-Implantaten zur erfindungsgemäßen kovalenten Bindung von
Tetraetherlipiden.
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Zur
Ankopplung von aktivierten Tetraetherlipiden an feste Materialien
aus Titan, Titanoxid oder Legierungen und Metallgemischen mit einem
ausreichenden Titangehalt wird die Oberfläche zweckmäßigerweise durch Reaktion mit
Silanen präaktiviert.
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Hierzu
wurde Trimethoxyaminoalkylsilan in trockenem Chloroform (25 Gewichtsäquivalente)
gelöst und
mit der Grenzfläche
für 12
Stunden bei 25°C
kontaktiert. Danach wurde die flüssige
Phase abgetrennt. Der Feststoff wurde im Trockenschrank bei 150°C für 2 Stunden
getrocknet und die Oberfläche
anschließend mehrmals
mit Chloroform gespült.
Danach wurde die so aktivierte Oberfläche mit in trockenem Chloroform
gelöstem
Cyanurchlorid-modifiziertem Tetraetherlipid (5mg/ml) inkubiert.
Die Reaktion verlief unter Zugabe von z. B. N,N-Diisopropylethylamin
als Katalysator. Die Reaktionsdauer betrug 12 Stunden bei 40°C.
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2.4. Präaktivierung
von Stahloberflächen
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Eine
polierte und gereinigte Stahlprobe wurde in eine Lösung des
Monoethoxydimethylsilan-Tetraetherlipids (2 × 10-4 molar
in Chloroform, 10 h, RT) getaucht. Anschießend wurde die Reaktionslösung entfernt, der
Stahl bei 125°C
im Trockenschrank für
2 Stunden getrocknet, überschüssiges Lipid
mit Chloroform abgewaschen und das modifizierte Material nochmals
unter identischen Bedingungen getrocknet.
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Der
Randwinkel gegen Wasser vergrößerte sich
von 56° vor
der Modifizierung auf 75°.
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Die
Schichtdicke betrug 4,8 nm. Die Oberflächenrauhigkeit wurde durch
die Beschichtung nicht messbar verändert.
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Eine
analoge Modifizierung gelang bei Verwendung dieser Methode auch
mit Gläsern.
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2.5. Aktivierung von PTFE-Polymeren
zur erfindungsgemäßen kovalenten
Ankopplung von Tetraetherlipiden.
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Als
Methode wurde hier eine naßchemische
Oxydation der Oberfläche,
welche durch verschieden konzentrierte (von 1vol% Wasserstoffperoxid
bis 40 vol%) Wasserstoffperoxid/Schwefelsäure Gemische erreicht werden
konnte, verwendet. Durch Variation der Reaktionstemperatur und der
Inkubationszeit kann die Anzahl der erhaltenen reaktiven Hydroxylgruppen
variiert werden. Die Oxydation erfolgt bis zu einer Tiefe von ca.
20 nm, Veränderungen
der Oberflächenmorphologie
finden nicht statt. Dies konnte mit Hilfe der Rasterkraftmikoskopie
wie auch der Elektronenmikroskopie belegt werden. Der Nachweis der
Entstehung der freien Hydroxylgruppen wurde mit Hilfe der FT-IR Spektroskopie
durchgeführt.
Neben den unveränderten
Basisbanden des PTFE entstanden neue für Hydroxylgruppen charakteristische
Banden unterschiedlicher Intensität. Der Randwinkel gegenüber Wasser
verkleinerte sich in Abhängigkeit
von den Reaktionsparametern auf Werte zwischen 88° und 115° (reines
PTFE 125°).
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Die
Oberflächenmorphologie
der PTFE Polymere wurde nicht verändert. Die Aktivierung der
Oberfläche
kann in unterschiedlichen Lösungsmitteln
erfolgen. Typischerweise wurden Chloroform, Methanol, Ethanol, Dioxan,
Aceton oder deren Gemische mit verschiedenen Katalysatoren, wie
N,N-Diisopropylethylamin oder Dimethylfluoropyriden u.a., verwendet.
Die Reaktion wurde mit Hilfe der FT-IR-Spektroskopie verfolgt und charakterisiert.
Bei der Kopplung von Cyanurchlorid an der PTFE Oberfläche wurde
im FT-IR eine neue Bande beobachtet. Gleichzeitig vergrößerte sich
der Randwinkel gegenüber
Wasser von ca. 90° auf
110°. Das
so aktivierte Polymer war mindestens 2 Wochen lagerfähig.
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Implantatmaterial
aus PTFE für
den prothetischen Ersatz von kleinlumigen Blutgefäßen wurde
durch 15 minütige
Inkubation mit einem Gemisch aus je einem Teil 30%igem Wasserstoffperoxid
und 96%iger Schwefelsäure
an der luminalen Oberfläche
oxidiert. Die Abnahme der Oberflächenhydrophobizität wurde durch
Messung des Benetzungswinkels (Wasser) nachgewiesen. Dieser verringerte
sich von ursprünglich 125° auf ca.
90°. Eine
Analyse des IR Spektrums zeigte neben den Banden für unmodifiziertes
PTFE neue, für Hydroxylgruppen
charakteristische Banden zwischen 1000 und 1400 cm-1.
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Das
so aktivierte Implantatmaterial wurde mit dem OH reaktiven Crosslinker
Cyanurchlorid verknüpft. Dies
konnte nach vorheriger Neutralisation der oxidierten Oberfläche durch
eine 30 minütige
Inkubation in einer gesättigten
Lösung
von Cyanurchlorid in Chloroform erreicht werden. Die erfolgreiche
kovalente Modifizierung mit Cyanurchlorid wurde mittels IR-Spektroskopie
nachgewiesen. Das Spektrum der so behandelten Oberfläche des
Materials zeigte zusätzliche,
für C=N
Bindungen charakteristische Banden bei 1600 cm-1.
Der Benetzungswinkel erhöhte
sich nach der Umsetzung mit Cyanurchlorid von 90° auf 110°. Die Struktur und Festigkeit
des Implantatmateriales wurde von der beschriebenen Prozedur nicht
nachteilig beeinflusst.
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2.6. Aktivierung von Polyurethanoberflächen (PUR)
zur erfindungsgemäßen kovalenten
Ankopplung von Tetraetherlipiden.
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PUR-Oberflächen lassen
sich bedingt durch ihre chemische Struktur auf unterschiedliche
Weise voraktivieren. Die Wahl der Methode hängt stark vom jeweiligen PUR-Werkstück (Dicke,
Elastizität
usw.) ab, da bei der Aktivierung die hauptsächlichen Stoffeigenschaften
nicht verändert
werden dürfen.
Eine milde Aktivierung wurde durch die Behandlung mit konzentrierter
NaOH erreicht. Dadurch kam es zu einer Spaltung der Säureamidbindung,
wodurch die oberflächlichen
freien Amino- bzw. Carboxylgruppen einer weiteren Aktivierung bzw.
direkten Umsetzung zugänglich
wurden. Das PUR wurde bei RT für
20 min mit einer konzentrierten (6N) NaOH kontaktiert. Anschließend wurde
die NaOH abgegossen und dreimal mit destilliertem Wasser gespült. Die
freien Aminogruppen konnten jetzt direkt mit dem Cyanurchlorid-modifizierten
Tetraetherlipid-Derivat umgesetzt werden. Dazu wurde das Lipid in
einem Puffer pH 8,4 dispergiert und bei 40°C 12 Stunden mit der Oberfläche kontaktiert.
Durch einen kombinierten Spreit- und Kopplungsmechanismus wurde
die Oberfläche mit
dem Tetraetherlipid-Derivat modifiziert. Überschüssiges nicht gebundenes Lipid
wurde durch mehrmaliges Waschen der Oberfläche mit Isopropanol/Wasser
(70/30 v:v) entfernt.
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Desweiteren
wurden die freien Gruppen durch andere Techniken weiter aktiviert.
Sowohl die Aktivierung mit Cyanurchlorid (-NH2-Gruppe)
oder mit β-Propiolacton
(-COOH-Gruppe) erwiesen sich als möglich und erlaubten die Einführung von
Spacermolekülen.
Die weitere Reaktion zur Oberfächenmodifizierung
erfolgte mit den TL-Derivaten TL-NH2 oder
TL-ONa.
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2.7. Oberflächenaktivierung
von Silikongummi und anderen Silikonpolymeren zur erfindungsgemäßen kovalenten
Ankopplung von Tetraetherlipiden.
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Silikongummi
und andere Silikonpolymere lassen sich durch Behandlung mit Alkalihydroxiden,
z. B. NaOH oder Ammoniumhydroxid, ohne Beeinträchtigung ihrer Struktureigenschaften
präaktivieren.
Dabei kommt es zu einer Spaltung der Si-O-Bindung, wodurch Hydroxylgruppen
für eine
weitere Aktivierung bzw. direkte Umsetzung an der Materialoberfläche freigesetzt
werden.
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Das
Silikonmaterial wurde bei 37°C
für 3 Stunden
mit einer Lösung
von 5M NaOH kontaktiert. Anschließend wurde die Lösung abgegossen
und das Silikongummi mehrmals mit destilliertem Wasser gespült. Die
freien Hydroxylgruppen konnten jetzt direkt mit dem Silan-Tetraetherlipid-Derivat
umgesetzt werden. Dazu wurde das Lipid dispergiert und bei 40°C 12 Stunden
mit der Oberfläche
kontaktiert. Überschüssiges nicht
gebundenes Lipid wurde durch mehrmaliges Waschen der Oberfläche entfernt.
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Desweiteren
konnten die freien Hydroxylgruppen durch andere Techniken weiter
aktiviert werden. Bei der Umsetzung mit verschiedenen Aminoalkyl-alkoxysilanen
wurden freie Aminogruppen auf der Oberfläche eingeführt. Die präaktivierte Silikonoberfläche wurde
dazu bei RT für
16 Stunden in reines Aminopropyltrimethoxysilan getaucht. Anschließend wurde
die Lösung
abgegossen und kurz 3 mal in Methanol und 3 mal in destilliertes
Wasser getaucht. Der Feststoff wurde bei 80°C für 17 Stunden getrocknet und
die Oberfläche
zuletzt nochmals dreimal mit Aceton, dreimal mit Methanol und dreimal
mit destilliertem Wasser gut gespült.
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2.8 Oberflächenaktivierung
von Gläsern
und metallischen Oberflächen
mittels energiereicher UV Strahlung
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Bei
der UV-Behandlung erzeugt ein gepulster Eximerstrahler energiereiche
UV-Strahlung und generiert dabei zusätzlich Ozon am Bestrahlungsort.
Dies ist geeignet, um Glas-, Keramik- und Polymeroberflächen aber
auch Metalloberflächen
mit dünner
Oxidschicht von organischen Verschmutzungen zu befreien. Zugleich bewirkt
die Strahlung auf den Polymeroberflächen einen Masseabtrag, so
dass ein Glättungseffekt
beobachtet wird. Durch die oxidative Ablation werden an allen (auch
den anorganischen) Oberflächen
reaktive Sauerstoff-funktionalitäten
(aktivierte Hydroxylgruppen, Oxide bzw. Peroxide) generiert, die
sich sofort mit allen vorstehend beschriebenen aktivierten Tetraetherlipiden
verbinden können
und zu kovalent fixierten Tetraetherlipid-Monoschichten führen, wenn
die bestrahlten Objekte im Self-Assembly Verfahren mit den Lipiden
kontaktiert werden.
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Sensorchips
mit Glasoberfläche
wurden mit ozongenerierender VUV-Strahlung gereinigt und aktiviert. Dazu
wurde die zu beschichtende Oberfläche mit einem Abstand von 5
mm unter eine Xeradex Lampe platziert und für 5 min einer UV-Strahlung
mit der Wellenlänge
von 173 nm ausgesetzt. Die erhaltenen Oberflächen wiesen unmittelbar nach
der Bestrahlung eine außerordentlich
hohe und gleichmäßige Reaktivität gegenüber mit Cyanurchlorid
aktiviertem Tetraetherlipid auf. Zur Aktivierung von edlen (z.B.
Gold, Silber) und unedlen Metallen (z.B. Stahl) wurde eine analoge
Behandlung erfolgreich durchgeführt.
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3. Verfahren zur kovalenten
Ankopplung von Tetraetherlipiden an Oberflächen von Basismaterialien
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3.1 Modifizierung von
Materialoberflächen
mit freien NH2-Gruppen mit Cyanurchlorid-aktiviertem
Tetraetherlipid
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Ein
mit Cyanurchlorid aktiviertes Tetraetherlipid (dabei ist es unerheblich
ob eine oder beide Seiten aktiv sind) wurde für die Beschichtung einer Aminogruppen-aufweisenden
Festkörperoberfläche in Chloroform, Dioxan,
Toluol, Benzol, THF, Aceton oder deren Gemische gelöst und mit
einem tert. Amin als Katalysator, bevorzugt N,N-Diisopropylethylamin, versetzt. Durch
das Bestreben zur molekularen Selbstorganisation des Tetraetherlipids
kam es zu einer monomolekularen, physikalischen Adsorption an der
Grenzfläche.
Nachfolgend bildete sich eine chemischen Bindung durch Reaktion
der aktivierten Kopfgruppe des Tetraetherlipids mit funktionellen
Gruppen auf der Oberfläche
des Basismaterials. Die Reaktion wurde bei Temperaturen zwischen 20°C und 40°C über einen
Zeitraum von 3–12
Stunden ausgeführt.
Voraussetzung für
die Reaktion war das Vorhandensein geeigneter funktioneller Gruppen
auf der zu modifizierenden Oberfläche.
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3.2 Modifizierung von
Metall-, Metalloxid-, Keramik- oder Silikonmaterialien, die freie
OH-Gruppen aufweisen mit Cyanurchlorid-aktiviertem Tetraetherlipid
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Reaktionsfähige OH-Gruppen
wurden auf den Materialoberflächen
nach den vorgenannten Methoden erzeugt.
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Danach
wurde die hydroxylgruppenhaltige Oberfläche mit in Aceton, Chloroform
oder Chloroform/Methanol (1:1) gelöstem Cyanurchlorid-modifiziertem
Tetraetherlipid (1mg/ml) inkubiert. Die Reaktion verlief unter Zugabe
von tert. Amin als Katalysator, bevorzugt N,N-Diisopropylethylamin. Die Reaktionsdauer
betrug 2 Stunden bei 40°C. Überschüssiges nicht
gebundenes Lipid wurde durch mehrmaliges Waschen der Oberfläche mit
Aceton oder Chloroform und schliesslich Methanol entfernt.
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Die
freien Hydroxylgruppen konnten auf analoge Weise mit Alkoxysilanderivaten
umgesetzt werden, worauf die weitere Reaktion zur Oberflächenmodifizierung
mit den entsprechenden Tetraetherlipid-Derivaten erfolgte.
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3.3. Verfahren zur direkten
Modifizierung von nicht voraktivierten Metall-, Metalloxid-, Keramik-
oder Silikonmaterialien mit freien OH-Gruppen mit Mesyl-Tetraetherlipiden
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Das
Tetraetherlipid-Derivat mit Mesylkopfgruppen ist so reaktiv, dass
in der Regel keine Präaktivierung der
oberflächlichen
Hydroxylgruppen des Basismaterials notwendig ist. Dieses wurde für 12 Stunden
mit dem in Aceton, Chloroform oder Chloroform/Methanol (1:1) gelöstem Mesylderivat
(1mg/ml) bei 60°C
inkubiert. Überschüssiges,
nicht gebundenes Lipid wurde durch mehrmaliges Waschen im Ultraschallbad
mit Aceton oder Chloroform und schließlich Methanol entfernt und
anschließend
unter Stickstoff getrocknet. Zur Modifizierung wurde sowohl das
Mono- als auch das Disubstitutionsprodukt des Tetraetherlipids (Mesyl-TL-Mesyl)
eingesetzt, wobei letzteres oberflächlich exponierte Mesylgruppen
auf dem Komposit erzeugt, die mit weiteren Hydroxyl- oder Aminogruppenhaltigen
niedermolekularen oder polymeren Stoffen zur Reaktion gebracht wurden.
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5 zeigt das Ergebnis der Modifizierung
eines handelsüblichen
Dialyseschlauches (Cellulose) nach dieser Methode. Das Material
wurde in eine chloroformische, 60°C
warme Lösung
von Tetraetherlipid-Mesylat (1 mg/ml) getaucht, nach 12 Stunden
aus der Lösung
entnommen und intensiv mit Chloroform gespült. Unverbrauchtes Tetraetherlipid
wurde durch Waschen mit Chloroform zurückgewonnen. Die Dicke der Lipidschicht
betrug 3,8 nm. Der Gleichgewichtsrandwinkel (gegenüber Wasser)
der Folie stieg durch die Modifikation von 21 ° auf 69°. Auch nach wiederholtem Spülen blieb
der Randwinkel unveränderlich.
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Abbildung
5. Die Struktur der entstandenen Oberfläche ist mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie
dargestellt worden. Links: Dialyseschlauch unmodifiziert, rechts:
Dialyseschlauch nach Lipidierung
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Vergleichbare
Tetraetherlipid-Komposite auf der Basis hydroxylgruppenhaltiger
Polymere, Metalle, Keramiken und Gläser wurden durch Adaptation
der beschriebenen Methode erhalten.
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3.4 Verfahren zur Modifizierung
von OH-Gruppen haltigen Basismaterialien mit Amino-Tetraetherlipiden
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Basismaterialien
mit natürlicher
Oxidschicht, z.B. Silizium-Sensoren wurden mit konz. Schwefelsäure/H2O2 (50:50, v:v)
gereinigt, bis ein Randwinkel gegenüber Wasser von weniger als
18° zu beobachten
war. Anschließend
wurde die Oberfläche
durch Modifizierung mit einem Aminoalkylsilan präaktiviert (10-3 mol/l
Lösung
von Aminobutyl-dimethyl-chlorsilan
in trockenem Chloroform, 150 cm2/50 ml Lösung, RT,
1 Stunde), intensiv mit Chloroform gespült und im Stickstoffstrom getrocknet.
Danach war zur Erzeugung einer stabilen kovalent gebundenen Silan-Oberflächenschicht
ein Ausheizen bei 125 °C
für 2 Stunden
notwendig. Der Randwinkel der Schicht vergrößerte sich auf ca. 42°. Die Oberflächenrauhigkeit
veränderte
sich nicht signifikant. Die Dicke der erhaltenen Schicht betrug
ca. 0,45 nm (Ellipsometrie, nu = 1,386, ns = 3,828, ki = i0,200).
Danach wurden die aktivierten Materialien mit einer konzentrierten
Lösung
aus Bernsteinsäureanhydrid
in PBS kontaktiert (2 Stunden, RT, RW 35°), intensiv mit Wasser gespült und anschließend bei
RT getrocknet. Die Gesamtdicke der aufgebrachten Schicht erhöhte sich
auf ca. 0,68 nm ( nu = 1,395), das Zetapotential (pH 5,6) veränderte sich
von + 12,3 nV auf –22,7mV.
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Zur
kovalenten Anbindung des Tetraetherlipid-Derivates (TEL-O-C2H4-NH2)
wurde das Lipid in einer Konzentration von ca. 5 × 10-3 mol/l in Chloroform gelöst und mit
Ethyl(dimethylaminopropyl) carbodiimid-Hydrochlorid (EDC) in 2fachem
molaren Überschuß gemischt
mit den aktivierten Oberflächen
(12h, RT, geschlossene Kammer, pH = 6 eingestellt mit HCl). Anschließend wurde
mit Chloroform/Methanol (2:1,v:v) gewaschen und im Stickstoffstrom
bei RT getrocknet.
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Die
Dicke der so erhaltenen Schicht betrug ca. 4,8 nm (Ellipsometrie
nu = 1,43), der Randwinkel gegenüber
Wasser erhöhte
sich auf 68°.