EP1469893A1 - Sternformige prapolymere fur die herstellung ultradunner hydrogel-bildender beschichtungen - Google Patents

Sternformige prapolymere fur die herstellung ultradunner hydrogel-bildender beschichtungen

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EP1469893A1
EP1469893A1 EP20030734689 EP03734689A EP1469893A1 EP 1469893 A1 EP1469893 A1 EP 1469893A1 EP 20030734689 EP20030734689 EP 20030734689 EP 03734689 A EP03734689 A EP 03734689A EP 1469893 A1 EP1469893 A1 EP 1469893A1
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EP
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groups
star
reactive
prepolymer
coating
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP20030734689
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Martin Möller
Claudia Mourran
Joachim Spatz
Haitao Rong
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Henkel AG and Co KGaA
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Sustech GmbH and Co KG
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Definitions

  • the present invention relates to the use of star-shaped polymers with hydrophilic polymer arms, which carry a reactive functional group R at their free ends, for the production of ultra-thin, hydrogel-forming coatings.
  • the hydrogel-forming coatings obtained in this way effectively suppress non-specific protein absorption on surfaces provided with them.
  • the suppression of non-specific protein adsorption and cell colonization in the field of medical technology, e.g. B. with catheters, contact lenses or prostheses is also important.
  • the targeted suppression of non-specific adsorption processes is a prerequisite for specific coupling via the integration of ligands, signal substances and growth factors of molecules and cells, which enables the healing and ingrowth of biological tissue.
  • Hydrogel-forming coatings are coatings that are swollen by water.
  • adsorbate layers made from polyethylene glycol (PEG) reduce subsequent adsorption of proteins from biological media (see, for example: Merrill EW, in Poly (ethylene glycol) Chemistry, publisher JM Harris, p. 199-220, Plenum Press, New York: 1992; C.-G. Gölander, Jamea N. Herron, Cape Lim, P. Claesson, P. Stenius, JD Andrade, in Poly (ethylene glycol) Chemistry, editor JM Harris, Plenum Press, New York: 1992).
  • Polymer surfaces that have been modified with poly (ethylene oxide) to reduce protein adsorption on implant materials have also been intensively investigated in recent years (Paine et al. Macromolecules 1990, 23, p. 3104).
  • EP 272842 A2 describes coatings with low affinity for proteins, which by applying compositions of hydroxyl-containing polymers, for. B. cellulose derivatives and crosslinking agents, e.g. B. copolymers of acrylic acid and N-methylolacrylamide, on microporous substrates and subsequent crosslinking of the coating.
  • B. cellulose derivatives and crosslinking agents e.g. B. copolymers of acrylic acid and N-methylolacrylamide
  • EP 335308 A2 describes the use of prepolymers made from polyethylene oxide diols and triols, the terminal OH groups of which have been reacted with polyisocyanates, for the production of coatings with low non-specific protein adsorption.
  • No. 6,087,415 discloses antimicrobial coatings for biomedical articles such as contact lenses, which are produced by coupling polymers containing carboxyl groups to the OH or NH 2 groups on the surface of the biomedical article.
  • US Pat. No. 6,150,459 and 6,207,749 propose synthetic comb polymers for this purpose which have a hydrophobic polymer backbone, e.g. B. a polylactide or a polymer derived from methyl methacrylate, and grafted hydrophilic polymer chains, which are preferably derived from polyethylene glycols or polyacrylic acid.
  • a hydrophobic polymer backbone e.g. B. a polylactide or a polymer derived from methyl methacrylate
  • grafted hydrophilic polymer chains which are preferably derived from polyethylene glycols or polyacrylic acid.
  • a diffusion barrier for gluing or sealing of tissues, in vivo medication or use as a direct implant, eg. B. in the form of a hydrogel cell suspension, peptide hydrogel or a growth factor hydrogel.
  • hydrogel-forming coatings known from the prior art reduce the unspecific cell and protein adsorption, the long-term stability of the coatings is often unsatisfactory. In other cases, the barrier effect for proteins is insufficient. In many cases, complicated manufacturing processes for these coatings prevent their wide applicability, especially on irregularly shaped surfaces. There is therefore a need for suitable processes for the production of extremely thin, hydrogel-forming coatings which form reproducibly dense and controllable layers, show a sufficiently high long-term resistance to protein and cell adsorption and can be used universally, that is to say they can be widely used for material coatings. Furthermore, it should be possible to integrate specific, functional molecules into the layers in a defined manner or to anchor them on the surface.
  • the coatings in the application fields mentioned should be able to be applied as ultra-thin, molecularly smooth films. It is also desirable to incorporate defined functionalities into these coatings.
  • the coating process should advantageously also be able to be carried out from aqueous preparations. As far as possible, existing procedures should Ren for the production of the substrates and components by the use of hydrogel coatings are not impaired and the applicability in various fields of application.
  • the present invention relates to the use of star-shaped prepolymers which have on average at least four polymer arms A, which are in themselves soluble in water and carry a reactive functional group R at their free ends, with groups R 'complementary thereto or with them react themselves to form bonds to produce ultra-thin, hydrogel-forming coatings.
  • the present invention also relates to a method for producing ultra-thin, hydrogel-forming coatings, which is characterized in that
  • hydrogel-forming coating to be those coatings which are swollen by water as a result of the intercalation of water molecules in the coating.
  • Star-shaped polymers are understood to mean those polymers which have a plurality of polymer chains bonded to a low-molecular central unit, the low-molecular central unit generally having 4 to 100 skeletal atoms such as C atoms, N atoms or O atoms. Accordingly, the star-shaped polymers used in accordance with the invention can be described by the following general formula I:
  • n is an integer with a value of at least 4, e.g. B. 4 to 12, in particular 5 to 12 and especially 6 to 8;
  • Z stands for a low molecular weight n-valent organic radical as the central unit, which generally has 4 to 100, preferably 5 to 50 framework atoms, in particular 6 to 30 framework atoms.
  • the central unit can have both aliphatic and aromatic groups. It stands for example for one of at least 4-valent alcohol, e.g. B. a 4- to 12-valent, preferably an at least 5-valent, especially a 6- to 8-valent alcohol, e.g. B.
  • pentaerythritol dipentaerythritol, a sugar alcohol such as erythritol, xylitol, mannitol, sorbitol, maltitol, isomaltulose, isomaltitol, trehalulose, or the like;
  • A is a hydrophilic polymer chain which as such is water soluble
  • B is a chemical bond or a divalent, low molecular weight organic radical preferably having from 1 to 20, preferably 2 to 10 carbon atoms, for example, a C 2 0 -C ⁇ alkylene group, a phenylene or a naphthylene group or a C 5 -C ⁇ o-cycloalkylene group, wherein the phenylene, naphthylene and the cycloalkylene group additionally one or more, e.g. B. 1, 2, 3, 4, 5, or 6 substituents, e.g. B. may have alkyl groups with 1 to 4 carbon atoms, alkoxy groups with 1 to 4 carbon atoms or halogen; and R is a reactive group which can react with a complementary reactive functional group R 'or with itself to form bonds.
  • Reactive groups R in this sense are those which react with nucleophiles in an addition or substitution reaction, e.g. B. isocyanate groups, (meth) acrylic groups, oxirane groups, oxazoline groups, carboxylic acid groups, carboxylic acid ester and carboxylic acid anhydride groups, carboxylic acid and sulfonic acid halide groups, but also the complementary, reacting as nucleophile groups such as alcoholic OH groups, primary and secondary amino groups, thiol groups and the like.
  • active ester groups of the formula - C (0) 0-X in which X is pentafluorophenyl, pyrrolidin-2,5-dion-1-yl, benzo-1, 2,3-triazol-1-yI, are particularly preferred as examples of carboxylic acid ester groups or a carboxamidine residue.
  • C C double bonds
  • R reactive groups
  • C C double bonds
  • acrylic groups also vinyl ether and vinyl ester groups
  • activated C C double bonds
  • N N double bonds
  • allyl groups in the sense of an en reaction or with conjugated diolefin groups react in the sense of a Diels-Alder reaction.
  • Examples of groups which can react with allyl groups in the sense of an en reaction or with dienes in the sense of a Diels-Alder reaction are maleic acid and fumaric acid groups, maleic acid esters and fumaric acid ester groups, cinnamic acid ester groups, propiolic acid (ester) groups, Maleic acid amide and fumaric acid amide groups, maleimide groups, azodicarboxylic acid ester groups and 1, 3,4-triazoline-2,5-dione groups.
  • the star-shaped prepolymer has functional groups which are amenable to an addition or substitution reaction by nucleophiles. This also includes groups that react in the sense of a Michael reaction. Examples are in particular isocyanate groups, (meth) acrylic groups (react in the sense of a Michael reaction), oxirane groups or carboxylic ester groups.
  • a particularly preferred embodiment relates to star-shaped prepolymers which have isocyanate groups as reactive groups R.
  • the prepolymer has ethylenically unsaturated, free-radically polymerizable double bonds as reactive groups R.
  • the star-shaped prepolymer has an average of at least 4, e.g. B. 4 to 12, preferably at least 5 and in particular 6 to 8 polymer arms.
  • the number average molecular weight of the polymer arms is preferably in the range from 300 to 3000 g / mol, and in particular in the range from 500 to 2000 g / mol.
  • the star-shaped prepolymer has a number average molecular weight in the range from 2000 to 20,000 g / mol, in particular 2500 to 15000 g / mol.
  • the molecular weight can be determined in a manner known per se by means of gel permeation chromatography, using commercially available columns, detectors and evaluation software. If the number of end groups per polymer molecule is known, the molecular weight can also be determined by titration of the end groups, in the case of isocyanate groups e.g. B. by reaction with a defined amount of a secondary amine such as dibutylamine and subsequent titration of the excess amine with acid.
  • isocyanate groups e.g. B. by reaction with a defined amount of a secondary amine such as dibutylamine and subsequent titration of the excess amine with acid.
  • Adequate swellability of the coating by water is ensured by the water solubility of the polymer arms A. Adequate swellability of the coating by water is generally guaranteed when the molecular structure, ie. H. at least the type of repeat units, preferably also the molecular weight of the polymer arm, corresponds to a polymer whose solubility in water is at least 1% by weight and preferably at least 5% by weight (at 25 ° C. and 1 bar).
  • polymers with sufficient water solubility examples include poly-C 2 -C 4 -alkylene oxides, polyoxazolines, polyvinyl alcohols, homo- and copolymers which contain at least 50% by weight of copolymerized N-vinylpyrrolidone, homo- and Copolymers which contain at least 30% by weight of hydroxyethyl (meth) acrylate, hydroxypropyl (meth) acrylate, acrylamide, methacrylamide, acrylic acid and / or methacrylic acid in copolymerized form, hydroxylated polydienes and the like.
  • the polymer arms A are derived from poly-C2-C 4 -alkylene oxides and are selected in particular from polyethylene oxide, polypropylene oxide and polyethylene oxide / polypropylene oxide copolymers, which can have a block or a statistical arrangement of the repeating units.
  • Star-shaped prepolymers whose polymer arms A are derived from polyethylene oxides or from polyethylene oxide / polypropylene oxide copolymers with a propylene oxide content of not more than 50% are particularly preferred.
  • the prepolymers used according to the invention are e.g. T. known, e.g. B. from WO 98/20060, US 6,162,862 (polyether star polymers), Chujo Y. et al., Polym. J. 1992, 24 (11), 1301-1306 (star-shaped polyoxazolines), WO 01/55360 (star-shaped polyvinyl alcohols, copolymers containing star-shaped vinylpyrrolidone) or can be prepared by the methods described therein.
  • star-shaped prepolymers used in accordance with the invention are generally produced by functionalizing suitable star-shaped prepolymer precursors which already have the prepolymer structure described above, ie at least 4 water-soluble polymer arms, and which each have a functional group R "at the ends of the polymer arms, which can be converted into one of the aforementioned reactive groups R.
  • prepolymer precursors are known from the prior art, for. B. from US 3,865,806, US 5,872,086, US 6,162,862, Polym. J. 1992, 24 (11), 1301-1306, WO 01/55360 and commercially available, e.g. B.
  • Controlled / Living radical polymerization Progress in ATRP, NMP, and RAFT, Washington, DC: American Chemical Society, 2000) or in particular in the case of ethylenically unsaturated monomers by atom transfer radical polymerization (ATRP) according to the processes described in WO 98/40415.
  • ATRP atom transfer radical polymerization
  • the star-shaped prepolymer precursors can in principle be functionalized in analogy to known functionalization processes of the prior art.
  • prepolymer precursors which have A OH groups at the ends of the polymer arms.
  • the conversion of OH groups to amino groups can e.g. B. in analogy to that of Skarzewski, J. et al. Monatsh. Chem. 1983, 114, 1071-1077 method described.
  • the OH groups in a conventional manner, (z. B. by Organikum, 15th ed., VEB, Berlin 1981 S. 241ff .; J. March, Advanced Organic Synthesis 3rd ed. S. 382 ff.
  • a halogenating agent such as thionyl chloride, sulfuryl chloride, thionyl bromide, phosphorus tribromide, phosphorus oxychloride, oxalyl chloride and the like, optionally in the presence of an auxiliary base such as pyridine or triethylamine, in the corresponding halide, or with methanesulfonyl chloride in the corresponding mesylate.
  • the halogen compound thus obtained, or the mesylate then with an alkali metal azide, preferably in an aprotic polar solvent such as dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, dimethylacetamide or N-methylpyrrolidone, into which the corresponding azide is converted.
  • an alkali metal azide preferably in an aprotic polar solvent such as dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, dimethylacetamide or N-methylpyrrolidone, into which the corresponding azide is converted.
  • the azide is then converted to the amino compound with hydrogen in the presence of a transition metal catalyst or with a complex hydride such as lithium aluminum hydride.
  • prepolymers which carry oxirane groups at the ends of the polymer arms A can be achieved, for example, by reacting prepolymer precursors which have OH groups at the ends of the polymer arms with glycidyl chloride.
  • Prepolymers which carry A (meth) acrylic groups at the ends of the polymer arms can be produced, for example, by esterifying prepolymer precursors which carry A OH groups at the ends of the polymer arms with acrylic acid or methacrylic acid or by reacting the OH- Groups with acrylic chloride or with methacryl chloride in analogy to known processes.
  • prepolymer precursors which carry A NH 2 groups at the ends of the polymer arms the NH 2 groups can be reacted with acrylic acid or methacrylic acid or with their acid chlorides.
  • the preparation of (meth) acrylate-terminated prepolymers can e.g. B. in analogy to that of Cruise et al. Biomaterials_1998, 19, 1287-1294 and Han et al. Macromolecules 1997, 30, 6077-6083 for the modification of polyether diols and triols described methods take place.
  • Prepolymers which carry thiol groups at the ends of polymer arms A can be prepared, for example, by reacting prepolymer precursors which carry halogen atoms at the ends of polymer arms A with thioacetic acid and subsequent hydrolysis in analogy to that in Houben-Weyl, Methods of Organic Chemistry, Ed. E. Müller, 4th ed., Vol. 9, p. 749, G. Thieme, Stuttgart 1955.
  • aromatic diisocyanates such as toluene-2,4-diisocyanate, toluene-2,6-diisocyanate, commercially available mixture of toluene-2,4- and -2,6-diisocyanate (TDI), m-phenylene diisocyanate, 3, 3 'diphenyl-4,4' - biphenylene diisocyanate, 4,4'-biphenylene diisocyanate, 4,4'-
  • diisocyanates whose isocyanate groups differ in their reactivity, such as toluene-2,4-diisocyanate, toluene-2,6-diisocyanate, and a mixture of toluene-2,4- and -2,6-diisocyanate and ice and trans-isophorone.
  • Star-shaped prepolymers with aliphatic diisocyanate end groups are particularly preferred, in particular those as obtained by adding IPDI to the chain ends of OH-group-terminated star-shaped prepolymer precursors.
  • the star polymers are naturally reacted with the diisocyanate in such a way that a diisocyanate unit is added to each chain end of the star molecules, the second isocyanate group of the diisocyanate remaining free.
  • each end group of the star molecules is provided with a free isocyanate group via a urethane linkage. Methods for this are described, for example, in US Pat. No. 5,808,131, WO 98/20060 and US 6,162,862 and Bartelink CF et al. J. Polymer Science 2000, 38, 2555-2565.
  • the prepolymer precursor to avoid the formation of multimeric adducts i. H.
  • Adducts in which two or more prepolymers are linked to one another via diisocyanate units give an excess of the diisocyanate.
  • the excess is at least 10 mol%, based on the stoichiometry of the reaction, i.e. H. at least 1.1 moles, preferably at least 2 moles and in particular at least 5 moles of diisocyanate and especially at least 10 moles of diisocyanate are used per mole of functional group in the prepolymer precursor.
  • the reaction is preferably carried out under controlled reaction conditions, i.e. H. the prepolymer precursor is added under reaction conditions so slowly that heating of the reactor contents by more than 20 K is avoided.
  • the prepolymer precursor is preferably reacted with the diisocyanate in the absence of a solvent or diluent.
  • the reaction can take place in the absence or in the presence of small amounts of conventional catalysts which promote the formation of urethanes.
  • Suitable catalysts are, for example, tertiary amines such as diazabicyclooctane (DABCO) and organotin compounds, e.g. B. DialkyIzinn (IV) salts of aliphatic carboxylic acids such as dibutyltin dilaurate and dibutyltin dioctoate.
  • the amount of catalyst is generally not more than 0.5% by weight, based on the prepolymer precursor, eg. B. 0.01 to 0.5 wt .-%, in particular 0.02 to 0.3 wt .-%.
  • no catalyst is used.
  • the required reaction temperatures naturally depend on the reactivity of the prepolymer precursor used, the diisocyanate, and if used on the type and amount of the catalyst used. It is generally in the range from 20 to 100 ° C. and in particular in the range from 35 to 80 ° C. It goes without saying that the reaction of the prepolymer precursor with the diisocyanate takes place in the absence of moisture ( ⁇ 2000 ppm, preferably ⁇ 500 ppm).
  • the reaction mixture thus obtained is generally worked up by distilling off the excess diisocyanate, preferably under reduced pressure.
  • the reaction products obtained predominantly contain the star-shaped prepolymer which has isocyanate groups at the ends of the polymer arms.
  • the proportion of the star-shaped prepolymer is generally at least 70% by weight, preferably at least 80% by weight, of the reaction product.
  • the remaining constituents of the reaction product are essentially dimers and, in small proportions, trimers, which in these quantities are also suitable for producing the coatings according to the invention.
  • the substrates to be coated with the star-shaped prepolymers according to the invention are in principle not subject to any restrictions.
  • the substrates can have regularly or irregularly shaped, smooth or porous surfaces.
  • suitable surface materials are oxidic surfaces, e.g. B.
  • silicates such as glass, quartz, silicon dioxide such as in silica gels, or ceramics, further semimetals such as silicon, semiconductor materials, metals and metal alloys such as steel, polymers such as polyvinyl chloride, polyethylene, polymethylpentene, polypropylene, polyester, fluoropolymers (eg Teflon ®), polyamides, polyurethanes, poly (meth) acrylates, blends and composites of the aforementioned materials surfaces, including cellulose and natural fibers such as cotton fibers and wool.
  • the polymers can be woven or non-woven material.
  • the ultrathin, hydrogel-forming coatings are produced by depositing the star-shaped prepolymers on the layered surface from a solution of the prepolymers by methods known per se and subsequent crosslinking of the reactive groups of the prepolymers.
  • the deposition and crosslinking steps can be repeated if desired. This leads to thicker layers.
  • Examples of deposition processes are the immersion of the surface to be coated in the solution of the prepolymer and the spin coating - the solution of the prepolymer is applied to the surface to be coated rotating at high speed. It goes without saying that the coating measures are usually carried out under dust-free conditions for the production of ultra-thin coatings.
  • the substrates are immersed in a solution of the star polymer in a suitable solvent and then the solution is run off, so that a thin liquid film with the most uniform thickness remains on the substrate. This is then dried. The resulting film thickness depends on the concentration of the star polymer solution. The networking is then triggered.
  • the substrate which is initially not rotating, is generally completely wetted with the solution of the star-shaped prepolymer. Subsequently, the substrate to be coated is rotated at high speeds, preferably above 1000 rpm, eg. B. 1000 to 10000 U / min in rotation, the solution is largely spun off and a thin coating film remains on the surface of the substrate. Then networking is also triggered here.
  • the concentration of the prepolymer in the solution will generally not exceed 100 mg / ml, preferably 50 mg / ml and in particular 20 mg / ml.
  • the concentration is usually at least 0.001 mg / ml, preferably at least 0.005 and in particular at least 0.01 mg / ml.
  • the thickness of the coating can of course be controlled via the concentration, whereby very low concentrations usually lead to monolayers of the star polymers on the coated surfaces.
  • the coating measures are chosen so that the coating thickness (measured by means of ellipsometry according to the method described in Guide to using WVASE 32 TM, JA Woollam Co. Ind., Lincoln NE USA 1998) has a value of 500 nm, preferably 200 nm and in particular does not exceed 100 nm.
  • the process also enables the production of monolayers with thicknesses below 2 nm, e.g. B. 0.5 to 2 nm.
  • layer thicknesses in the range from 1 to 100 nm, in particular in the range from 2 to 50 nm, are preferred.
  • solvents are suitable as solvents which have no or only a low reactivity towards the functional groups R of the prepolymer.
  • those are preferred which have a high vapor pressure and are therefore easy to remove.
  • Preferred solvents are therefore those which have a boiling point below 150 ° C. and preferably below 120 ° C. at normal pressure.
  • suitable solvents are aprotic solvents, e.g. B. ethers such as tetrahydrofuran (THF), dioxane, diethyl ether, tert-butyl methyl ether, aromatic hydrocarbons such as xylenes and toluene, acetonitrile, propionitrile and mixtures of these solvents.
  • protic solvents such as water or alcohols, e.g. B. methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol and tert-butanol, and mixtures thereof with aprotic solvents.
  • water and mixtures of water with aprotic solvents are surprisingly suitable in addition to the abovementioned aprotic solvents, since the degradation of the isocyanate groups in the prepolymers presumably takes place comparatively slowly.
  • the type of networking can be done in different ways.
  • the article coated with the uncrosslinked prepolymer will generally be treated with a crosslinking agent.
  • one embodiment of the invention relates to a method in which the linking of the reactive groups R is initiated by adding a compound V1 which has at least two reactive groups R 'per molecule which reacts with the reactive groups R of the star-shaped prepolymer to form bonds.
  • the polyfunctional compounds V1 can be low molecular weight compounds, e.g. B. aliphatic or cycloaliphatic diols, triols and tetraols, e.g. B. ethylene glycol, butanediol, diethylene glycol, triethylene glycol, trimethylolpropane, pentaerythritol and the like, aliphatic or cycloaliphatic diamines, triamines or tetramines, for.
  • B. aliphatic or cycloaliphatic diols, triols and tetraols e.g. B. ethylene glycol, butanediol, diethylene glycol, triethylene glycol, trimethylolpropane, pentaerythritol and the like, aliphatic or cycloaliphatic diamines, triamines or tetramines, for.
  • the low-molecular polyfunctional In contrast to the prepolymers, ionic compounds generally have a molecular weight of ⁇ 500 g / mol.
  • the polyfunctional compound V1 can already be contained in the solution of the prepolymer which is used for the coating. Then react in the initially formed coating of largely uncrosslinked prepolymers, e.g. B. when drying or when heating the coating, the reactive groups R 'of the crosslinking agent with the reactive groups R of the prepolymer and in this way form a layer of crosslinked prepolymers.
  • the compound V1 will accordingly have at least two denophilic groups and vice versa. If the prepolymers have reactive groups which undergo an en reaction, the compound V1 will have at least two allylic double bonds. As a rule, in such systems for the production of the coatings, solutions are used which contain both the prepolymer and the compounds V1. The crosslinking then takes place when the primarily obtained coating dries, if appropriate after heating.
  • prepolymers are also suitable as polyfunctional compounds V1 which have at least four polymer arms A, which are in themselves soluble in water and have a reactive functional group R 'at their free ends, which react with the reactive groups R of the prepolymer to form bonds.
  • solutions of at least two different prepolymers can also be used for the process according to the invention, in which one prepolymer has reactive groups R and the other has reactive groups R 'which are complementary thereto. In this way too, a layer of crosslinked prepolymers is obtained.
  • the linking of the reactive groups R is initiated by adding a sufficient amount of a compound V2 which reacts with a part of the reactive groups R to form ver groups R 'reacts, which reacts with the remaining reactive groups R to form bonds.
  • a compound V2 which reacts with a part of the reactive groups R to form ver groups R 'reacts, which reacts with the remaining reactive groups R to form bonds.
  • crosslinking can be triggered, for example, by treating the coated article with water, e.g. B. by storage in a damp atmosphere or under water.
  • some of the isocyanate groups react to form amino groups, which in turn react with the remaining isocyanate groups to form bonds, forming a layer of crosslinked prepolymers.
  • the crosslinking agent V2 is therefore water here.
  • the group R is selected from ethylenically unsaturated, free-radically polymerizable double bonds.
  • the crosslinking takes place in a thermal or photochemical manner, i. H. by irradiation with UV radiation or with electron radiation.
  • suitable photoinitiators will generally be added to the solution of the prepolymer. The type and amount of photoinitiator required to initiate photochemical crosslinking is known to the person skilled in the art from radiation-curing lacquer technology.
  • a star-shaped prepolymer preferably as a monolayer, is first applied to the surface to be coated in the manner described above, partial crosslinking of the reactive groups R is optionally carried out and then at least one further star-shaped prepolymer 2 is applied to the surface applied surface treated in this way, which has at least four polymer arms A, which are in themselves soluble in water and have at their free ends a reactive functional group R ', which have a complementary to the reactive groups R of the prepolymer 1 reactivity. If necessary, the remaining reactive groups R 'are then crosslinked again. This process can be repeated one or more times. In this way it is possible to produce multilayer coatings in a targeted manner.
  • the layer-by-layer process can be carried out in a particularly elegant manner with such prepolymers can be realized which have reactive groups R which react with compounds V2 to form reactive groups R 'which have a reactivity which is complementary to the groups R.
  • groups R are isocyanate groups.
  • the connection V2 is water.
  • NH 2 groups then form as complementarily reactive groups R '. If the crosslinking of the first layer with compound V2 is triggered, the coating obtained has free groups R '(for example amino groups) on its surface. These then react with the groups R (for example isocyanate groups) of the prepolymers applied in a second coating process to form bonds.
  • the second coating process is preferably also controlled such that a monolayer of prepolymers is deposited on the first coating.
  • Crosslinking of the second layer by means of compound V2 (for example water) and repetition of this procedure thus allows the production of highly crosslinked, highly ordered layers, in particular if the amount of coating in the individual coating stages has been chosen so that monolayers are obtained.
  • the coatings can also with mixtures of star-shaped prepolymers and water-soluble polysaccharides such as hyaluronates, heparins, alginates or z.
  • B. dextran When using prepolymers with functional groups reactive towards OH functions, e.g. B. isocyanate groups then the polysaccharide acts as a crosslinker.
  • the method according to the invention also allows the targeted incorporation of foreign materials, ie materials that do not form hydrogel-forming coatings, into the coating.
  • bioactive materials such as drugs, oligonucleotides, peptides, proteins, signaling substances, growth factors, cells, carbohydrates and lipids, inorganic components such as apatites and hydroxyapatides, quaternary ammonium salt compounds, compounds from bisguanidines, quaternary pyridinium salt compounds, compounds from phosphonium salts, thiazoylbenzimidazoles, sulfonyl compounds, Salicyl compounds or organometallic compounds.
  • the installation is preferably carried out by coadsorption from solutions which contain the prepolymer and the foreign component.
  • prepolymers with the bioactive materials mentioned before Sorption are implemented or reacted as a mixture with unmodified prepolymers on the surface.
  • biological components can also be introduced in the form of an intermediate layer that does not completely cover.
  • the top layer of the star-shaped prepolymers usually still carry reactive groups, which react specifically with frequently occurring chemical groups of biomolecules even under mild conditions (in aqueous solution, at room temperature).
  • reactive groups which react specifically with frequently occurring chemical groups of biomolecules even under mild conditions (in aqueous solution, at room temperature).
  • examples are the reaction of NCO groups on the surface of the polymer layer with alcohol, thiol or amino groups which are present in proteins and peptides, or which can be easily introduced into many biomolecules by methods of the prior art.
  • Another example is the Michael addition of thiol or amino groups to acrylates and acrylamides in the top layer of the coating.
  • suitable biological components which can be introduced into the hydrogel coatings produced by the process according to the invention are medicaments, e.g. B. heparins, antibiotics such as streptomycin, gentomycin, penicillin, neomycin, acriflavin, ampillicin, chitin, chitosan and their derivatives, as well as other bactericidal substances, further growth factors such as BMPs (bone morphogenic proteins), HGHs (human growth hormons), GMCSF (macrophages colony stimulating factors), heparin-binding factors such as FGFs, VGF, TGFs, communication and architecture-mediating signal substances such as BHL, HHL, OHL, DHLs, OHHL, OOHL, ODHL, OdDHL, HBHL, HtDHL and other, integrin-mediating signaling molecules, proteins such as Fibronectin, laminin, vitronectin, collagen, thrombospondin and other adhesion-promoting proteins, me
  • cyclic peptide sequences amino acid sequences and oligonucleotides that enable molecular recognition such as sequences from RNA or DNA, carbohydrates and lipids, such as sugar and long-chain hydrocarbon compounds that allow interaction with the cell membrane, cells or cell assemblies of fibroblasts, osteoblasts, chondrocytes and other cell types, but also pluripotent cell material.
  • the surfaces of inert materials will often be chemically activated before coating. This can be done, for example, by treating the surface to be coated with acid or alkali, by oxidation (flaming), by electron radiation or by plasma treatment with an oxygen-containing plasma, as described by P. Chevallier et al. J. Phys. Chem. B 2001, 105 (50), 12490-12497; in JP 09302118 A2; in DE 10011275; or by D. Klee, et al. Adv. Polym. Be. 1999, 149, 1-57.
  • the surface to be coated can also be treated with compounds which are known to have good adhesion to the surface and which also have functional groups R 'which are complementary to the functional groups R of the star-shaped prepolymer.
  • Suitable groups R ' depending on the reactive group R of the prepolymer: isocyanate, amino, hydroxyl and epoxy groups, furthermore groups which react in the sense of Michael addition, dienophilic groups which enter into Diels-Alder addition reactions, are electron-poor double bonds which react in a Diels-Alder addition or en reaction with allylic double bonds; activated ester groups; oxazoline; as well as vinyl groups and thiols, which specifically undergo free radical addition.
  • the type of group that causes adhesion to the surface to be coated naturally depends on the chemical nature of the surface to be coated.
  • oxidic such as ceramic and glass-like surfaces
  • metallic surfaces compounds which have silane groups, in particular trialkoxysilane groups, have proven useful.
  • trialkoxyaminoalkylsilanes such as triethoxyaminopropylsilane and N [(3-triethoxysilyl) propyl] ethylenediamine
  • trialkoxyalkyl-3-glycidyl ether silanes such as triethoxypropyl-3-glycidyl ether silane
  • trialkoxy alkyl mercaptoxy tranhexane triloxiloxylalkylsiloxylalkylsiloxylalkylsiloxylalkylsiloxylalkylsiloxylalkylsiloxylalkylsiloxylalkylsiloxylalkylsiloxylalkylsiloxylalkylsiloxylalkylsiloxylalkylsiloxylalkylsiloxylalkylsiloxylalkylsiloxylalkylsiloxylalkylsiloxylalkylsiloxylalkylsiloxy
  • Polyoxidic polyammonium groups are also suitable as adhesion-promoting groups for oxidic materials and plastic materials.
  • Examples of such compounds are polyammonium compound with free primary amine groups such as z. B. by J. Scheerder, J.F.J Engbersen, and D.N. Reinhoudt, Recl. Trav. Chim. Pays-Bas 1996, 115 (6), 307-320, and von Decher, Science 1997, 277, 1232-1237 for this purpose.
  • the aforementioned compounds are preferably applied as a monolayer to the surface to be coated.
  • Such monolayers can be achieved in a manner known per se by treating the surfaces to be coated with dilute solutions of the compounds, for. B. according to the immersion process described above or by means of spin coating. Solvents and concentrations correspond to the information given for the application of the prepolymers. It is often advisable to treat the surfaces with the abovementioned compounds, which are known to have good adhesion to the surface, following activation by flame, by electron radiation or by plasma treatment.
  • the surfaces coated according to this invention swell in direct contact with water, aqueous solutions and moist gases to form very stable hydrogels.
  • the coatings are stable even after prolonged contact with aqueous solutions, since the deposits can be removed by simply rinsing with water.
  • the coatings obtained according to the invention effectively prevent the non-specific adsorption of proteins and cells over a long period of time and are superior in this point to the hydrogel coatings of the prior art. Due to their chemical composition, the coatings are biocompatible and non-toxic.
  • star-shaped prepolymers with reactive end groups advantageously enables the use of simple coating processes such as immersion, spin coating (rotary spin processes) and in particular a layer-by-layer structure.
  • the peculiarity of the star-shaped prepolymers with reactive end groups also makes it possible, in a very simple and controlled manner, to produce thin to ultra-thin hydrogel coatings with a layer thickness below 100 nm, preferably below 50 nm and, if desired, below 10 nm.
  • the coatings prevent unspecific protein adsorption and cell adhesion and can thus prevent bacterial colonization.
  • the low thickness of the coating is particularly advantageous since the macroscopic properties and the appearance of the underlying material remain practically unchanged.
  • star-shaped prepolymers with reactive end groups also makes it possible in a simple manner to produce ordered monolayers and multilayers whose structure and properties such as water absorption, penetrability and flexibility can be set very precisely for the respective application.
  • the method according to the invention also allows in a unique way, various functions such.
  • the suppression of non-specific bacterial colonization can be increased by incorporating bactericides, biological signaling substances and colloidal particles with a diameter preferably below 100 nm.
  • the method according to the invention also opens up the possibility of specifically promoting colonization with specific bacteria and cells by incorporating biological signaling molecules and ligands.
  • the method according to the invention can be used for the production of micro sensors and micro analysis systems, for coating micro cannulas for the introduction of genetic material into cells and of capillary systems in which the adsorption of biological compounds on the capillary surfaces is large Represents a problem and can significantly impair the analytical sensitivity.
  • the use of star-shaped prepolymers for the production of hydrogel coatings opens up areas of application in which conventional polymers and hydrogels cannot be used or have not been used due to their inadequate protein resistance.
  • the method according to the invention is also particularly suitable for coating objects which are in direct contact with living matter, such as implants.
  • the coatings can be applied to a wide range of laboratory utensils, medical products and instruments, but also in the semi-technical area to surfaces that must be kept extremely clean, i.e. as free of protein and cells as possible, or that are difficult to access for cleaning steps.
  • the coatings obtainable according to the invention are also particularly advantageous where only extremely thin coatings are possible.
  • the method according to the invention can be used to produce ultra-thin coatings on the inner walls of hose and tube systems. those who in turn only have a particularly small diameter, e.g. B. in the ⁇ m range, have (implantable pump systems, thin catheters, microbiological and genetic engineering laboratory equipment).
  • the method according to the invention is also suitable for coating extremely large areas (ship hulls, technical pipe systems, swimming pools, operating theaters, etc.).
  • FIG. 1 shows the ellipsometrically determined layer thickness of a coating according to the invention as a function of the number of coating processes.
  • FIG. 2 shows the increase in the thickness of a dried coating according to the invention which is exposed to atmospheric moisture (determined by ellipsometry).
  • FIG. 3 shows a light micrograph of a glass plate coated according to the invention (thickness of the coating about 50 nm) which had been incubated with a fibroblast suspension.
  • FIGS. 4a and 4b show light microscopic images of glass platelets which have a coating according to the invention on one half and a polystyrene coating on the other half and which were incubated with a fibroblast suspension.
  • FIG. 5 shows an optical micrograph of a glass plate which was half coated with a mixture of star prepolymers and dextran (1: 1) and half uncoated and which was incubated with a fibroblast suspension.
  • the prepolymer precursors used are commercially available 6-armed polyalkylene ethers (hereinafter referred to as polyols) which have been prepared by anionic ring-opening polymerization from ethylene oxide and / or propylene oxide using sorbitol as the initiator.
  • the polyol used was dried to a residual water content of less than 350 ppm before use. Residues of the alkali metal hydroxide used for the preparation of the polyols were bound by neutralization with phosphoric acid.
  • the polyol was slowly added via a pump (approx. 80 ml / h), so that the reaction temperature did not deviate from the specified temperature by more than 10 K.
  • the elution diagrams were adapted for evaluation on two Gaussian curves, the proportion of bi- / trimer being determined via the area ratios.
  • the polyol used is a 6-arm statistical poly (ethylene / propylene oxide) with an EO / PO ratio of 80/20 with a molecular weight of 3100 g / mol.
  • 0.05% by weight of phosphoric acid was added to the polyol and the mixture was heated to 80 ° C. in vacuo with stirring.
  • the polyol used corresponds to the polyol from Preparation Example 1.
  • the polyol used is a 6-arm statistical poly (ethylene / propylene oxide) with an EO / PO ratio of 80/20 with a molecular weight of 10,000 g / mol.
  • 0.05% by weight of phosphoric acid was added to the polyol and heated to 80 ° C. in vacuo with stirring.
  • IPDI (100 g, 0.45 mol) was placed in a reactor and heated to 50 ° C. in a protective gas atmosphere.
  • the dried and degassed polyol 50 g, 0.005 mol was slowly added with the aid of a peristaltic pump (approx. 80 ml / h).
  • the reaction mixture was stirred at 50 ° C for an additional 60 hours.
  • thin-film distillation 100 ° C., 0.025 mbar
  • the polyol used is a 6-arm polypropylene oxide with a molecular weight of 3000 g / mol. Before the reaction, 0.05% by weight of phosphoric acid was added to the polyol and heated in vacuo at 80 ° C. for 1 h.
  • a saturated solution of 100 g (32.3 mmol) of the predried polyether used in Preparation 1 in 400 ml of dichloromethane was cooled to 0 ° C. under a nitrogen atmosphere.
  • 580 mmol of pyridine were first added very slowly and then 580 mmol of methanesulfonyl chloride.
  • the precipitate was filtered off and the mesylate formed was precipitated by adding diethyl ether.
  • the mesylate obtained was dissolved in dimethylformamide and stirred with 1.16 mol of sodium azide at 60 ° C. for 24 hours. After cooling, the mixture was diluted with water and extracted with dichloromethane.
  • a strong band at 1670 cm “1 can be seen in the IR spectrum, which can be assigned to the amide EO group.
  • the nitrogen value determined by elemental analysis corresponds to a degree of functionalization> 5.
  • Glass platelets floated glass, quartz glass, standard glass
  • hydrophilic silicon wafers were used as substrates (Si [100]).
  • the substrates were cleaned in an ultrasonic bath first in acetone, then in Millipore water and then in isopropanol. All substrates were kept in suitable protective containers under a layer of liquid in order to avoid contamination by dust and grease droplets from the air.
  • the water used was basically desalinated (18 M ⁇ -cm or better). All solutions were cleaned of dust and particulate contamination with a 0.05 ⁇ filter. Filtered deionized water is also referred to below as Millipore water.
  • Coatings with the exclusion of water were carried out in a glove box (brown) under an atmosphere with a water content of less than 1 ppm H 2 O / Q 2 .
  • the cleaned substrates were treated in a plasma system of the TePla 100-E type from Plasma Systeme for 10 minutes in oxygen plasma (pressure: 0.15 mbar). The substrates treated in this way were then stored in deionized water.
  • the substrate surface was first coated with an aminosilian monolayer as a promoter.
  • an aminosilian monolayer as a promoter.
  • the sample taken from the water and blown dry with nitrogen was transferred to a glove box.
  • the substrates were stored in a 0.4% (v / v) solution of N- (3- (trimethoxysilyl) propyl) ethylenediamine in dry toluene for 16 h, then washed thoroughly with toluene and, before use, in a glove box under a nitrogen atmosphere a filtered nitrogen stream dried.
  • the substrates were treated with oxygen under a 40 W UV lamp for 10 min (distance between substrate surface and light source 2 mm) and then placed in Millipore water (MP-H 2 0).
  • the sample taken from the MP-H 2 O and blown dry with nitrogen was then treated as in 1.1 with (trimethoxysilyl) propyl) ethylenediamine.
  • the substrates functionalized according to the instructions under 1.1 are immersed in a solution of the respective prepolymer in dry THF (0.05 mg / ml to 5 mg / ml). The solution is allowed to drain carefully so that a thin liquid film of uniform thickness remains on the substrate. This is dried. The resulting film thickness depends on the concentration of the star polymer solution.
  • the samples are then removed from the glovebox, protected from dust, and reacted in a humid atmosphere. The samples are placed in MP-H2O until use / examination.
  • the substrates functionalized according to the instructions under 1.1 are immersed in a freshly prepared solution of the prepolymer (0.005 mg / ml to 20 mg / ml in 1: 1 THF: MP-H 2 O). The solution is allowed to drain carefully so that a thin liquid film of uniform thickness remains on the substrate, which is dried. After the film has reacted, the samples are placed in MP-H 2 0 until use. Table 3 lists tests and resulting layer thicknesses which were obtained by an immersion coating. The layer thicknesses were determined by ellipsometry ("Guide to using WVASE32 TM", JA Woollam Co., Ind., Lincoln, NE, USA, 1998).
  • the coating of 1 amine-functionalized substrates produced was carried out using a spin coater (model: WS-400A-6TFM / lite from the company: SPS).
  • a spin coater model: WS-400A-6TFM / lite from the company: SPS.
  • the non-rotating, dried substrate is completely wetted with the prepolymer solution (0.05 mg / ml to 5 mg / ml star polymer in THF) before the solution at acceleration level "5" and a final speed of 5000 rpm for 40 Is flung for seconds.
  • the sample is then dry.
  • the substrates coated in this way were stored in the absence of dust overnight at a humidity of 50 to 80%.
  • the samples treated in this way can then be used immediately for the desired application or placed in MP-H 2 0 until use.
  • the amine-functionalized substrate prepared according to 1 is rinsed on the spin coater with rotation (3000 rpm) with salt-free water before the coating is carried out with a freshly prepared water-containing star polymer solution in THF. In this way, better wetting of the substrate and a very thin polymer film are achieved.
  • the results are summarized in Table 4.
  • the layer thickness was determined ellipsometrically.
  • the surface of the still rotating substrate is washed several times by applying a drop of anhydrous dichloromethane in order to remove excess prepolymer. The procedure is repeated to achieve a dense monofilm.
  • the sample coated in this way is then crosslinked by placing it in MP-H 2 O. The procedure is repeated according to the number of monolayers to be applied.
  • the substrates pretreated according to point 1 are placed for one hour with exclusion of moisture in a solution of the prepolymer in anhydrous THF.
  • the samples are then washed several times with anhydrous THF to rinse off non-chemically bound prepolymer molecules.
  • the samples are then placed in MP-H 0 for one hour.
  • the sample is dried and then placed in a THF bath to remove water from the coating.
  • the samples are then dried in a dust-free atmosphere or in a filtered nitrogen stream. To apply a further monofilm, this procedure is repeated, starting with immersing the sample in the anhydrous solution of the prepolymer in THF.
  • the samples coated in this way can be used immediately for the desired application or placed in MP-H 2 0 until they are used.
  • the layer thickness of the hydrogel films obtained was determined by means of ellipsometry. The values are given in Table 5:
  • a monolayer was first prepared as described under 1., using a solution of the prepolymer from Preparation Example 1 in THF with a concentration of 1.0 mg / ml. The substrate coated in this way was then placed in a solution of the same prepolymer in anhydrous THF (concentration 1.0 mg / ml). The sample was then washed several times with anhydrous THF. After the subsequent one-hour soak in MP-H 2 0, they were removed and dried as described above. This procedure was repeated a total of five times, the layer thickness being determined by means of ellipsometry after each application of a further layer. The results are shown in Figure 1.
  • the layer thickness increases linearly with increasing number of layers, the slope of the compensating line is approximately 4.7 A / layer, which corresponds to the thickness of a monolayer.
  • the swelling behavior was examined by means of ellipsometry on a thin coating.
  • the change in layer thickness which directly reflects the swelling behavior of the hydrogel layer, was measured in situ.
  • the samples were pretreated as described under II.-1. After the sample had been dried in a filtered nitrogen stream, a solution of the polymer from Preparation Example 1 (5 mg / ml in dry THF) was spin-coated at a speed of 6000 rpm. (40 sec.) As described under II-2.2. The sample produced in this way was then stored in water for one hour and, after drying in the filtered nitrogen stream, was dried for 30 minutes at 90 ° C./0.1. The dried sample was then exposed to the laboratory atmosphere (20 ° C, 60% relative humidity) exposed and the change in layer thickness caused by water absorption was examined in-situ by means of ellipsometry. The results of the investigation are shown in FIG. 2.
  • the layer thickness of the dried sample initially increases continuously as a result of contact with the moist air. After approx. 10 h no further increase in layer thickness can be seen.
  • the total relative increase in layer thickness is approx. 2%, which corresponds to an absolute increase of a few angstroms.
  • the investigation was carried out by means of confocal laser microscopy and by means of confocal fluorescence correlation spectroscopy (FCS) using the fluorescent dye MR 121.
  • the dye was in PBS buffer (140 mM NaCl, 10 mM KCI, 6.4 mM Na 2 HP0 4 x 2H 2 0, 2 mM KH 2 P0 4 ) diluted to a concentration of 10 "10 M. 120 .mu.l of the solution were pipetted into the approx. 100 .mu.l well of the above-mentioned slide and covered with the 170 .mu.m coated cover glass. For reference an uncoated glass slide and an uncoated cover slip were used.
  • the slide with the sample was positioned with the cover slip down over the microscope objective.
  • the laser focus was focused about 10 ⁇ m above the cover slip in the sample solution.
  • FCS Confocal fluorescence correlation spectroscopy
  • the FCS curve for a sample of MR 121-IP (T30) on the surface coated according to the invention has a turning point at 238 ⁇ s, which almost corresponds to that of a freely diffusing MR 121-IP. If the detection volume is shifted 4 ⁇ m into the solution, no more surface influence can be determined in the case of the glass coated according to the invention. In the case of glass surfaces, it can be seen that the FCS curve (glass, focused on 4 ⁇ m) shows a turning point at 23.5 ms, which in turn indicates very clear interactions of the fluorescent-labeled oligonucleotide with the surface. Only when the detection volume has been shifted by 40 ⁇ m into the solution do both curves approach the freely moving MR 121-IP.
  • Table 6 The diffusion times obtained for MR 121-IP (T30) are summarized in Table 6.
  • Table 6 Average diffusion times of MR 121 on and at different heights above a glass or hydrogel surface
  • the cell adhesion experiments were carried out with GFP-Actin 3T3 fibroblasts (chicken) and MC3T3-E1 osteoblasts (chicken).
  • the cells were stored in 50 ml PMMA cell culture boxes at 37 ° C. and 5% CO 2 in a steam-saturated atmosphere in an incubator and replicated.
  • the cell media used are standard cell media.
  • the cell medium consisted of an aqueous solution of 88 vol% DMEM (Dulbecco's modified eagle's medium, Biochrom KG) with 10 vol% fetal calf serum (FCS, Invitrogen), 1 vol% penecillin solution (penstrep, Sigma), 1 vol% Glutamine (Invitrogen) and 0.5 mg / ml antibiotic, Geneticin (Sigma), while for the osteoblasts the cell medium from an aqueous solution of 94 vol% ⁇ -MEM ( ⁇ -modified eagle's medium) with 5 vol% calf serum (FCS, Invitrogen) and 1 vol% glutamine (Invitrogen) was produced. The cells were split regularly to guarantee maximum growth and to maintain GFP expression.
  • Adhesion experiments were carried out in sterile PS petri dishes (50 mm diameter). Before the cells were added to the petri dishes, they were removed from the cell culture boxes with 2 ml trypsin per petri dish and then deposited in a centrifuge (10 min. At 1000 rpm) as sediment. Diluted again with medium, the cell suspension was then applied to the substrates using pipettes and then incubated. If the cells adhere to the substrate, they form a uniform layer that can be clearly seen under the light microscope. If the cells cannot attach to the substrate, i.e. the adhesion of the cell to the substrate is suppressed, the cells die and can be recognized as small, round cell clusters on the surface.
  • experiment 1 a glass plate coated according to the invention was used as the substrate, which was spin-coated according to the instructions given in II-2.2 with a solution of the prepolymer from preparation example 3 (5.0 mg / ml), one according to 11-1. pretreated glass plate was produced. The thickness of the coating was approximately 50 nm.
  • the sample was then treated with the cell suspension in the manner described above and examined in a light microscope. The results of the investigation are shown in FIG. 3.
  • FIG. 3 shows that the coating is cell-resistant, because the cells have died and can be recognized as small, round cell clusters on the surface. The surface shows no cell growth even after 120 h, which demonstrates the long-term effect and stability of the coating. Similar results can also be found with thinner coatings which have a thickness of approximately 5 nm.
  • FIGS. 4a and 4b show that the cells colonize on the surface treated with polystyrene and die on the surface coated according to the invention.
  • the sample was then treated with the cell suspension in the manner described above and examined in a light microscope. The results of the investigation are shown in FIG. 5.
  • FIG. 5 shows that the cells colonize on the untreated surface and die on the surface coated according to the invention.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von sternförmigen Polymeren mit hydrophilen Polymerarmen, die an ihren freien Enden eine reaktive funktionelle Gruppe R tragen, zur Herstellung ultradünner, Hydrogel-bildender Beschichtungen. Die dabei erhaltenen Hydrogel-bildenden Beschichtungen unterdrücken wirksam eine unspezifische Proteinabsorption auf damit ausgerüsteten Oberflächen.

Description

Sternförmige Präpolymere für die Herstellung ultradünner, Hydrogel- bildender Beschichtungen
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von sternförmigen Polymeren mit hydrophilen Polymerarmen, die an ihren freien Enden eine reaktive funktioneile Gruppe R tragen, zur Herstellung ultradünner, Hydrogel-bildender Beschichtungen. Die dabei erhaltenen Hydrogel-bildenden Beschichtungen unterdrücken wirksam eine unspezifische Proteinabsorption auf damit ausgerüsteten Oberflächen.
Die spezifische und unspezifische Wechselwirkung von Proteinen und Zellen mit künstlichen Oberflächen bildet die Grundlage vieler medizinischer, biochemischer und biotechnologischer Anwendungen. Zur Verhinderung unerwünschter Ablagerungen, auch als Biofouling und Plaque bezeichnet, sowie für die Stimulierung einer erwünschten Zellbesiedlung ist es notwendig, eine unspezifische Protein- und Zelladsorption zu unterbinden. Da biologische Systeme ihre Umgebung (Oberflächen) selbst aktiv modifizieren können, muss man zur Reduktion unspezifischer Protein- und Zelladsorption die Zellen daran hindern, ihre Umgebung durch Membranproteine oder extrazelluläre Matrixproteine in einer Weise zu konditionie- ren, die eine unspezifischen Zellbesiedlung vorbereitet.
Die Nutzung spezifischer Adsorptionsprozesse für die Analytik erfordert naturgemäß, Art, Menge und Konformation unspezifisch adsorbierter Moleküle genau zu kontrollieren oder besser noch eine unspezifische Adsorption ganz zu unterbinden. Für die Detektion von Biomolekülen, welche nur in extrem geringen Mengen vorliegen, muss sichergestellt sein, dass die nachzuweisenden Substanzen auf dem Weg zur Detektion nicht durch unspezifische Adsorption verloren gehen.
Die Unterdrückung einer unspezifischen Proteinadsorption und Zellbesiedlung im Bereich der Medizintechnik, z. B. bei Kathetern, Kontaktlinsen oder Prothesen ist ebenfalls wichtig. Für Prothesen und Implantate bildet die gezielte Unterdrückung unspezifischer Adsorptionsprozesse eine Voraussetzung, um über die Einbindung von Liganden, Signalstoffen und Wachstumsfaktoren eine spezifische Ankopplung von Molekülen und Zellen zu ermöglichen, welche die Heilung und das Einwachsen von biologischem Gewebe ermöglicht.
Weiterhin spielt die Verhinderung von biologischen Ablagerungen von Proteinen oder Bakterien eine wesentliche Rolle im Hygienebereich und bei der Reinhaltung von Oberflächen, welche nicht permanent rückstandsfrei gereinigt werden können. Ebenso stellen unerwünschte, biologische Ablagerungen auf extrem großen benetzten Oberflächen wie Schiffsrümpfen, Wasserbecken und dergleichen sowie Ablagerungen an unzugänglichen Stellen, wie großen Rohrsystemen, ein großes wirtschaftliches Problem dar. Die derzeit eingesetzten Antipiaquebeschichtungen sind meist giftige metallorganische Verbindungen oder verlieren ihre bakterizide Wirkung sehr schnell.
Plaquebildung und Biofouling stellen somit eine erhebliche wirtschaftliche und ö- kologische Belastung dar, die bislang noch nicht zufriedenstellend gelöst werden konnte.
Verschiedentlich wurden polymere, insbesondere Hydrogel-bildende Beschichtungen zur Vermeidung einer unspezifischen Proteinadsorption an Oberflächen vorgeschlagen. Hydrogel-bildende Beschichtungen sind Beschichtungen, die durch Wasser gequollen werden. So verringern Adsorbatschichten aus Polyethylenglykol (PEG) eine nachfolgende Adsorption von Proteinen aus biologischen Medien (siehe z. B.: Merrill E. W., in Poly(ethylene glycol) Chemistry, Herausgeber J. M. Harris, p. 199-220, Plenum Press, New York: 1992; C.-G. Gölander, Jamea N. Herron, Kap Lim, P. Claesson, P. Stenius, J. D. Andrade, in PoIy(ethylene glycol) Chemistry, Herausgeber J. M. Harris, Plenum Press, New York: 1992). Ebenso wurden Polymeroberflächen, die mit Poly(ethylenoxid) zur Reduktion der Proteinadsorption auf Implantatmaterialien modifiziert wurden, in den letzten Jahren intensiv untersucht (Paine et al. Macromolecules 1990, 23, p. 3104).
Die US 5,993,890 beschreibt Triblockcopolymere, die einen Polysacharid-Block, z. B. einen Heparin- oder Dextranblock und hydrophobe Kohlenwasserstoffreste aufweisen. Die Polymere sind insbesondere zur Verhinderung der Proteinadsorption auf hydrophoben Oberflächen geeignet.
Die EP 272842 A2 beschreibt Beschichtungen mit geringer Affinität zu Proteinen, die durch Aufbringen von Zusammensetzungen aus Hydroxylgruppen aufweisenden Polymeren, z. B. Cellulosederivaten und Vernetzern, z. B. Copolymeren aus Acrylsäure und N-Methylolacrylamid, auf mikroporöse Substrate und anschließendes Vernetzen der Beschichtung hergestellt werden.
Die EP 335308 A2 beschreibt die Verwendung von Präpolymeren aus Polyethyle- noxiddiolen und -triolen, deren terminale OH-Gruppen mit Poly-isocyanaten umgesetzt wurden, für die Herstellung von Beschichtungen mit niedriger unspezifischer Proteinadsorption.
Aus der US 6,087,415 sind antimikrobielle Beschichtungen für biomedizinische Gegenstände wie Kontaktlinsen bekannt, die durch Kupplung von Carboxylgrup- pen aufweisenden Polymeren an die OH- bzw. NH2-Gruppen auf der Oberfläche des biomedizinischen Gegenstands hergestellt werden.
Weiterhin werden in den US 6,150,459 und 6,207,749 für diesen Zweck synthetische Kammpolymere vorgeschlagen, die ein hydrophobes Polymerrückgrat, z. B. ein Polylactid oder ein von Methylmethacrylat abgeleitetes Polymer, und darauf gepfropfte hydrophile Polymerketten, die vorzugsweise von Polyethylenglykolen oder Polyacrylsäure abgeleitet sind, aufweisen.
J. Rühe et al. (Prucker O. and Rühe J. Langmuir 1998, 14(24), 6893-6898; Mac- romolecules, 1998, 31 (3), 592-601 ; Macromolecules, 1998, 31 (3), 602-613.) beschreiben ein Beschichtungsverfahren, bei dem zunächst eine Oberfläche mit einer Monolage eines Initiator modifiziert wird. Dieser wird dann zur Auslösung einer radikalischen Polymerisation genutzt. Es ergeben sich sehr dichte Schichten, wobei die Schichtdicke bis zu mehreren hundert Nanometem dick anwachsen kann. Cruise et al. (Biomaterials 1998, 19, 1287-1294) sowie und Han et al. (Macromo- lecules 1997, 30, 6077-6083.0) beschreiben die Verwendung von Acrylat- terminierten Präpolymeren, die entweder aus PEG-Diolen oder PEG-Triolen hergestellt wurden, zur Herstellung von Hydrogelschichten. Zur Anbindung an die O- berfläche wird das Acrylat-terminierte Präpolymer auf einem entsprechen vorbehandelten Substrat belichtet, wodurch das Präpolymer alleine oder mit Acrylat- terminierten Glyceroltriol unter Zugabe von Benzoldimethylketal zu einem Hydro- gel vernetzen. Auf diese Weise werden Hydrogelschichten mit Schichtdicken zwischen 135 μm und 180 μm erhalten. Als Einsatzgebiete für diese Hydrogelschichten wird der in vivo Einsatz, z. B. zur Unterdrückung postoperativer Adhäsionsvorgängen, die Verwendung als Diffusionsbarriere, zur Verklebung oder Versiegelung von Geweben, die in vivo Medikamentierung oder die Verwendung als direktes Implantat, z. B. in Form einer Hydrogel-Zellsuspension, Peptid-Hydrogels oder eines Wachstumsfaktor-Hydrogels, vorgeschlagen.
Obwohl die aus dem Stand der Technik bekannten Hydrogel-bildenden Beschichtungen eine Verringerung der unspezifischen Zeil- und Proteinadsorption bewirken, ist oftmals die Langzeitbeständigkeit der Beschichtungen nicht zufriedenstellend. In anderen Fällen wiederum ist die Barrierewirkung für Proteine unzureichend. In vielen Fällen verhindern komplizierte Herstellungsverfahren für diese Beschichtungen eine breite Anwendbarkeit, insbesondere auf unregelmäßig geformten Oberflächen. Es besteht daher ein Bedarf an geeigneten Verfahren zur Herstellung von extrem dünnen, Hydrogel-bildenden Beschichtungen, die reproduzierbar dichte und kontrollierbare Schichten bilden, eine genügend hohe Langzeitresistenz gegenüber Protein- und Zelladsorption zeigen und universell einsetzbar sind, also einem breiten Einsatz für Materialbeschichtungen erlauben. Weiterhin sollte es möglich sein, spezifische, funktionelle Moleküle definiert in die Schichten einzubinden, bzw. an der Oberfläche zu verankern. Wünschenswerterweise sollten die Beschichtungen in den angesprochenen Applikationsfeldern als ultradünne, molekular glatte Filme aufgebracht werden können. Ferner ist es erwünscht, in diese Beschichtungen definierte Funktionalitäten einzubringen. Darüber hinaus sollte das Beschichtungsverfahren vorteilhafterweise auch aus wäss- rigen Zubereitungen erfolgen können. Dabei sollten möglichst bestehende Verfah- ren für die Herstellung der Substrate und Bauteile durch die Verwendung von Hydrogelbeschichtungen nicht beeinträchtigt und die Applizierbarkeit in verschiedenen Einsatzfeldern möglich sein.
Es wurde gefunden, dass diese Aufgabe gelöst werden kann durch Beschichtungen auf Basis von untereinander vernetzten sternförmigen Präpolymeren, die im Mittel wenigstens vier Polymerarme A aufweisen, welche für sich gesehen in Wasser löslich sind und die an ihren freien Enden eine reaktive funktionelle Gruppe R tragen, die mit einer hierzu komplementären reaktiven funktionellen Gruppen R1 oder mit sich selber unter Bindungsbildung reagiert.
Demnach betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von sternförmigen Präpolymeren, die im Mittel wenigstens vier Polymerarme A aufweisen, welche für sich gesehen in Wasser löslich sind und an ihren freien Enden eine reaktive funktioneile Gruppe R tragen, die mit hierzu komplementären Gruppen R' oder mit sich selber unter Bindungsbildung reagieren, zur Herstellung ultradünner, Hydrogel- bildender Beschichtungen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung ultradünner, Hydrogel-bildender Beschichtungen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man
i. eine Lösung eines sternförmigen Präpolymers, das im Mittel wenigstens vier Polymerarme A aufweist, die für sich gesehen in Wasser löslich sind und an ihren freien Enden eine reaktive funktioneile Gruppe R tragen, auf die zu beschichtende Oberfläche aufbringt und ii. anschließend eine Verknüpfungsreaktion der reaktiven Gruppen untereinander durchführt.
Unter einer Hydrogel-bildenden Beschichtung versteht der Fachmann solche Beschichtungen, die durch Wasser gequollen werden als Folge der Interkalation von Wassermolekülen in die Beschichtung. Unter sternförmigen Polymeren versteht man solche Polymere, die mehrere an eine niedermolekulare Zentraleinheit gebundene Polymerketten aufweisen, wobei die niedermolekulare Zentraleinheit in der Regel 4 bis 100 Gerüstatome wie C- Atome, N-Atome oder O-Atome aufweisen wird. Dementsprechend lassen sich die erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden sternförmigen Polymere durch die nachfolgende allgemeine Formel I beschreiben:
Z(A-B-R)n (I) worin n eine ganze Zahl ist, mit einem Wert von wenigstens 4, z. B. 4 bis 12, insbesondere 5 bis 12 und speziell 6 bis 8;
Z für einen niedermolekularen n-valenten organischen Rest als Zentraleinheit steht, der in der Regel 4 bis 100, vorzugsweise 5 bis 50 Gerüstatome, insbesondere 6 bis 30 Gerüstatome aufweist. Die Zentraleinheit kann sowohl aliphatische als auch aromatische Gruppen aufweisen. Sie steht beispielsweise für einen von einem wenigstens 4-wertigen Alkohol, z. B. einem 4- bis 12-wertigen, vorzugsweise einem wenigstens 5-wertigen, insbesondere einem 6- bis 8-wertigen Alkohol, z. B. Pentaerythrit, Dipentaerythrit, einen Zuckeralkohol wie Erythritol, Xylitol, Mannitol, Sorbitol, Maltitol, Isomaltulo- se, Isomaltit, Trehalulose, oder dergleichen abgeleiteten Rest;
A eine hydrophile Polymerkette, die als solche wasserlöslich ist;
B eine chemische Bindung oder ein zweiwertiger, niedermolekularer organischer Rest mit vorzugsweise 1 bis 20, insbesondere 2 bis 10 C-Atomen, beispielsweise eine C2-Cι0-Alkylengruppe, eine Phenylen- oder eine Naphthylengruppe oder eine C5-Cιo-Cycloalkylengruppe, wobei die Phenylen-, Naphthylen und die Cycloalkylengruppe zusätzlich ein oder mehrere, z. B. 1 , 2, 3, 4, 5, oder 6 Substituenten, z. B. Alkylgruppen mit 1 bis 4 C- Atomen, Alkoxygruppen mit 1 bis 4 C-Atomen oder Halogen aufweisen können; und R eine reaktive Gruppe die mit einer hierzu komplementären reaktiven funktioneilen Gruppen R' oder mit sich selber unter Bindungsbildung reagieren kann.
Reaktive Gruppen R in diesem Sinne sind solche, die mit Nucleophilen in einer Additions- oder Substitutionsreaktion reagieren, z. B. Isocyanat-Gruppen, (Meth)acrylgruppen, Oxiran-Gruppen, Oxazolingruppen, Carbonsäuregruppen, Carbonsäureester- und Carbonsäureanhydridgruppen, Carbonsäure- und Sulfon- säurehalogenid-Gruppen, aber auch die hierzu komplementären, als Nucleophil reagierenden Gruppen wie alkoholische OH-Gruppen, primäre und sekundäre A- minogruppen, Thiolgruppen und dergleichen. Als Beispiel für Carbonsäureestergruppen sind insbesondere sogenannte Aktivestergruppen der Formel - C(0)0-X bevorzugt, worin X für Pentafluorphenyl, Pyrrolidin-2,5-dion-1-yl, Benzo- 1 ,2,3-triazol-1-yI oder einen Carboxamidin-Rest steht.
Geeignet sind als reaktive Gruppen R auch radikalisch polymerisierbare C=C- Doppelbindungen, z. B. neben den oben genannten (Meth)acrylgruppen auch Vi- nylether- und Vinylestergruppen, weiterhin aktivierte C=C-Doppelbindungen, aktivierte C≡C-Dreifachbindung und N=N-Doppelbindungen, die mit Allylgruppen im Sinne einer en-Reaktion oder mit konjugierten Diolefin-Gruppen im Sinne einer Diels-Alder-Reaktion reagieren. Beispiele für Gruppen, die mit Allylgruppen im Sinne einer en-Reaktion oder mit Dienen im Sinne einer Diels-Alder-Reaktion reagieren können, sind Maleinsäure- und Fumarsäure-Gruppen, Maleinsäureesterund Fumarsäureester-Gruppen, Zimtsäureestergruppen, Propiolsäu- re(ester)gruppen, Maleinsäureamid- und Fumarsäureamid-Gruppen, Maleinimid- Gruppen, Azodicarbonsäureester-Gruppen und 1 ,3,4-Triazolin-2,5-dion-Gruppen.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist das sternförmige Präpolymer solche funktioneilen Gruppen auf, die einer Additions- oder Substitutionsreaktion durch Nucleophile zugänglich sind. Hierzu zählen auch Gruppen, die im Sinne einer Michael-Reaktion reagieren. Beispiele sind insbesondere Isocyanat-Gruppen, (Meth)acrylgruppen (reagieren im Sinne einer Michael-Reaktion), Oxiran-Gruppen oder Carbonsäureestergruppen. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform betrifft sternförmige Präpolymere, die als reaktive Gruppen R Isocyanat-Gruppen aufweisen.
In einer anderen Ausführungsform weist das Präpolymer ethylenisch ungesättigte, radikalisch polymerisierbare Doppelbindungen als reaktive Gruppen R auf.
Zur Erreichung möglichst kompakter Schichten ist es erforderlich, dass das sternförmige Präpolymer im Mittel wenigstens 4, z. B. 4 bis 12, vorzugsweise wenigstens 5 und insbesondere 6 bis 8 Polymerarme aufweist. Das zahlenmittlere Molekulargewicht der Polymerarme liegt vorzugsweise im Bereich von 300 bis 3000 g/mol, und insbesondere im Bereich von 500 bis 2000 g/mol. Dementsprechend weist das sternförmige Präpolymer ein zahlenmittleres Molekulargewicht im Bereich von 2000 bis 20000 g/mol, insbesondere 2500 bis 15000 g/mol auf.
Die Bestimmung des Molekulargewichts kann in an sich bekannter Weise mittels Gelpermeationschromatographie erfolgen, wobei man auf handelsübliche Säulen, Detektoren und Auswertungssoftware zurückgreifen kann. Bei bekannter Anzahl von Endgruppen je Polymermolekül kann man das Molekulargewicht auch durch Titration der Endgruppen bestimmen, im Falle von Isocyanatgruppen z. B. durch Umsetzung mit einer definierten Menge eines sekundären Amins wie Dibutylamin und anschließende Titration des überschüssigen Amins mit Säure.
Die hinreichende Quellbarkeit der Beschichtung durch Wasser wird durch die Wasserlöslichkeit der Polymerarme A gewährleistet. Eine ausreichende Quellbarkeit der Beschichtung durch Wasser ist in der Regel dann gewährleistet, wenn der molekulare Aufbau, d. h. zumindest die Art der Wiederholungseinheiten, vorzugsweise auch das Molekulargewicht des Polymerarms, einem Polymeren entspricht, dessen Löslichkeit in Wasser wenigstens 1 Gew.-% und vorzugsweise wenigstens 5 Gew.-% (bei 25 °C und 1 bar) beträgt.
Beispiele für derartige Polymere mit hinreichender Wasserlöslichkeit sind Poly-C2- C4-alkylenoxide, Polyoxazoline, Polyvinylalkohole, Homo- und Copolymere, die wenigstens 50 Gew.-% N-Vinylpyrrolidon einpolymerisiert enthalten, Homo- und Copolymere, die wenigstens 30 Gew.-% Hydroxyethyl(meth)acrylat, Hydroxypro- pyl(meth)acrylat, Acrylamid, Methacrylamid, Acrylsäure und/oder Methacrylsäure einpolymerisiert enthalten, hydroxilierte Polydiene und dergleichen.
In einer bevorzugten Ausführungsform leiten sich die Polymerarme A von Poly-C2- C4-aIkylenoxiden ab und sind insbesondere ausgewählt unter Polyethylenoxid, Polypropylenoxid und Polyethylenoxid/Polypropylenoxid-Copolymeren, die eine Block- oder eine statistische Anordnung der Wiederholungseinheiten aufweisen können. Insbesondere bevorzugt sind sternförmige Präpolymere deren Polymerarme A von Polyethylenoxiden oder von Polyethylenoxid/Polypropylenoxid- Copolymeren mit einem Propylenoxid-Anteil von nicht mehr als 50 % abgeleitet sind.
Die erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Präpolymere sind z. T. bekannt, z. B. aus der WO 98/20060, US 6,162,862 (Polyether-Stern-polymere), Chujo Y. et al., Polym. J. 1992, 24(11), 1301-1306 (sternförmige Polyoxazoline), WO 01/55360 (sternförmige Polyvinylalkohole, sternförmige Vinylpyrrolidon enthaltende Copolymere) oder können nach den dort beschriebenen Methoden hergestellt werden.
Die Herstellung der erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden sternförmigen Präpolymere erfolgt in der Regel durch Funktionalisierung geeigneter sternförmiger Präpolymer-Vorstufen, welche bereits die oben beschriebene Präpolymerstruktur, d. h. wenigstens 4 wasserlösliche Polymerarme, aufweisen und die an den Enden der Polymerarme je eine funktionelle Gruppe R" aufweisen, die in eine der vorgenannten reaktiven Gruppen R umgewandelt werden kann. Zu den Gruppen R" zählen an aliphatische oder aromatische C-Atome, vorzugsweise an ein primäres aliphatisches C-Atom gebundene Halogen-Atome, insbesondere Chlor, Brom oder lod, an ein aliphatisches oder aromatisches und insbesondere an ein primäres, aliphatisches C-Atom gebundene OH-Gruppen, Thiol-Gruppen und NHR2-Gruppen mit R2 = Wasserstoff oder Cι-C4-Alkyl. Derartige Präpolymervorstufen sind aus dem Stand der Technik bekannt, z. B. aus der US 3,865,806, US 5,872,086, US 6,162,862, Polym. J. 1992, 24(11 ), 1301-1306, WO 01/55360 und im Handel erhältlich, z. B. im Falle sternförmiger Poly-C2-C4-alkylenoxide unter den Handelsbezeichnungen VORANOL®, TERRALOX®, SYNALOX® und DOWFAX® der Dow-Chemical Corporation, SORBETH® der Glyco-Chemicals Inc. und GLUCAM® der Amerchol Corp. oder können nach bekannten Verfahren der Polymerchemie durch Polymerisation geeigneter Monomere in Gegenwart polyfunktionelle Starter hergestellt werden, z. B. durch „lebende" Polymerisation (siehe hierzu: Hsieh, H.L.; Quirk, R.P. Anionic po- lymerization: Principles and Practical Applications, New York, Marcel Dekker, 1996; Matyjaszewski, K. Controlled/Living radical polymerization: Progress in ATRP, NMP, and RAFT, Washington, DC: American Chemical Society, 2000) o- der insbesondere im Falle ethylenisch ungesättigter Monomere durch Atom Transfer Radical Polymerization (ATRP) nach den in WO 98/40415 beschriebenen Verfahren.
Die Funktionalisierung der sternförmigen Präpolymer-Vorstufen kann grundsätzlich in Analogie zu bekannten Funktionalisierungsverfahren des Standes der Technik erfolgen.
Zur Herstellung von Präpolymeren, welche an den Enden der Polymerarme A A- minogruppen tragen, bieten sich als Ausgangsmaterialien insbesondere solche Präpolymer-Vorstufen an, die an den Enden der Polymerarme A OH-Gruppen aufweisen. Die Umwandlung von OH-Gruppen in Aminogruppen kann z. B. in A- nalogie zu der von Skarzewski, J. et al. Monatsh. Chem. 1983, 114, 1071-1077 beschriebenen Methode durchgeführt werden. Hierzu werden die OH-Gruppen in an sich bekannter Weise, (z. B. nach Organikum, 15. Aufl., VEB, Berlin 1981 S. 241ff.; J. March, Advanced Organic Synthesis 3rd ed. S. 382 ff.; siehe auch Beispiel 12) mit einem Halogenierungsmittel wie Thionylchlorid, Sulfurylchlorid, Thio- nylbromid, Phosphortribromid, Phosphoroxychlorid, Oxalylchlorid und dergleichen, gegebenenfalls in Gegenwart einer Hilfsbase wie Pyridin oder Triethylamin, in das entsprechende Halogenid, oder mit Methansulfonylchlorid in das entsprechende Mesylat überführt. Die so erhaltene Halogenverbindung, bzw. das Mesylat wird anschließend mit einem Alkalimetallazid, vorzugsweise in einem aprotisch polaren Lösungsmittel wie Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Dimethylacetamid oder N- Methylpyrrolidon in die das entsprechende Azid überführt. Das Azid wird anschließend mit Wasserstoff in Gegenwart eines Übergangsmetallkatalysators oder mit einem Komplexhydrid wie Lithiumaluminiumhydrid in die Aminoverbindung überführt.
Die Herstellung von Präpolymeren, welche an den Enden der Polymerarme A Oxi- rangruppen tragen, gelingt beispielsweise durch Umsetzung von Präpolymer- Vorstufen, die an den Enden der Polymerarme A OH-Gruppen aufweisen, mit Glycidylchlorid.
Die Herstellung von Präpolymeren, welche an den Enden der Polymerarme A (Meth)acrylgruppen tragen, gelingt beispielsweise durch Veresterung von Präpolymer-Vorstufen, die an den Enden der Polymerarme A OH-Gruppen tragen, mit Acrylsäure bzw. Methacrylsäure oder durch Umsetzung der OH-Gruppen mit Ac- rylchlorid bzw. mit Methacrylchlorid in Analogie zu bekannten Verfahren. Alternativ kann man in Präpolymer-Vorstufen, die an den Enden der Polymerarme A NH2- Gruppen tragen, die NH2-Gruppen mit Acrylsäure bzw. Methacrylsäure oder mit deren Säurechloriden umsetzen. Die Herstellung (Meth)acrylat-terminierter Präpolymere kann z. B. in Analogie zu den von Cruise et al. Biomaterials_1998, 19, 1287-1294 und Han et al. Macromolecules 1997, 30, 6077-6083 für die Modifizierung von Polyetherdiolen und -triolen beschriebenen Methoden erfolgen.
Die Herstellung von Präpolymeren, welche an den Enden der Polymerarme A Thiolgruppen tragen, gelingt beispielsweise durch Umsetzung von Präpolymer- Vorstufen, die an den Enden der Polymerarme A Halogenatome tragen, mit Thi- oessigsäure und nachfolgender Hydrolyse in Analogie zu dem in Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, Ed. E. Müller, 4. Aufl., Bd. 9, S. 749, G. Thieme, Stuttgart 1955 beschriebenen Verfahren.
Die Herstellung von Präpolymeren, welche an den Enden der Polymerarme A Iso- cyanat tragen, gelingt bevorzugt durch Addition eines niedermolekularen Diisocy- anats an Präpolymer-Vorstufen, die an den Enden der Polymerarme A OH-, SH-, oder NHR"-Gruppen aufweisen (R' = H, oder eine aliphatische Rest). Vorzugsweise werden sternförmige Polyole mit OH-Endgruppen eingesetzt.
Als Diisocyanate kommen sowohl aromatische Diisocyanate wie Toluol-2,4- diisocyanat, Toluol-2,6-diisocyanat, kommerzielle erhältliche Mischung von Toluol- 2,4- und -2,6-diisocyanat (TDI), m-Phenylendiisocyanat, 3,3'-Diphenyl-4,4'- biphenylendiisocyanat, 4,4'-biphenylendiisocyanat, 4,4'-
Diphenylmethandiisocyanat, 3,3'-Dichlor-4,4'-biphenylendiisocyanat, Cumen-2,4- diisocyanat, 1 ,5-Napthalindiisocyanat, p-Xylylendiisocyanat, p-
Phenylendiisocyanat, 4-Methoxy-1 ,3-phenylendiisocyanat, 4-Chloro-1 ,3- phenylendiisocyanat, 4-Bromo-1 ,3-phenylendiisocyanat, 4-Ethoxy-1 ,3- phenylendiisocyanat, 2,4-Dimethyl-1 ,3-phenylendiisocyanat, 5,6-Dimethyl-1 ,3- phenylendiisocyanat, 2,4-Diisocyanatodiphenylether, Benzidindiisocyanat, 4,6- Dimethyl-1 ,3-phenylendiisocyanat, 9,10-Anthracendiisocyanat, 4,4'-
Diisocyanatodibenzyl, 3,3'-Dimethyl-4,4'-diisocyanatodiphenylmethane, 2,6- Dimethyl-4,4'-diisocyantodiphenyl, 2,4-Diisocyanatostilben, 3,3'-Dimethoxy-4,4'- diisocyantodiphenyl, 1 ,4-Anthracenediisocyanat, 2,5-Fluorendiisocyanat, 1 ,8- Naphtalindiisocyanat, 2,6-Diisocyanatobenzofuran, als auch aliphatische und cycloaliphatische Diisocyanate wie Isophorondiisocyanat (IPDI), Ethylendiisocya- nat, Ethylidendiisocyanat, Propylen-1 ,2-diisocyanat, Cyclohexylen-1 ,2-diisocyanat, Cyclohexylen-1 ,4-diisocyanat, 1 ,6-Hexamethylendiisocyanat, 1 ,4-
Tetramethylendiisocyanat, 1 ,10-Decamethylendiisocyanat und Methylendicyclo- hexyldiisocyanat.
Bevorzugt sind Diisocyanate, deren Isocyanatgruppen sich in ihrer Reaktivität zu unterscheiden, wie Toluol-2,4-diisocyanat, Toluol-2,6-diisocyanat, sowie Mischung von ToluoI-2,4- und -2,6-diisocyanat und eis- und trans-lsophorondiisocyanat.
Besonders bevorzugt sind sternförmige Präpolymere mit aliphatischen Diisocya- natendgruppen, insbesondere solchen wie sie durch Addition von IPDI auf die Kettenenden von OH-Gruppen-terminierten sternförmigen Präpolymervorstufen erhalten werden. Die Sternpolymere werden naturgemäß so mit dem Diisocyanat umgesetzt, dass an jedes Kettenende der Sternmoleküle eine Diisocyanateinheit addiert wird, wobei die zweite Isocyanatgruppe des Diisocyanats frei bleibt. Auf diese Weise wird jede Endgruppe der Sternmoleküle über eine Urethanverknüpfung mit einer freien Isocyanatgruppe versehen. Verfahren hierzu sind z.B. aus den US 5,808,131 , WO 98/20060 und US 6,162,862 sowie Bartelink C. F. et al. J. Polymer Science 2000, 38, 2555-2565 bekannt.
In der Regel wird man zu diesem Zweck die Präpolymervorstufe zur Vermeidung der Bildung von multimeren Addukten, d. h. Addukte, in denen zwei oder mehrere Präpolymere über Diisocyanateinheiten miteinander verknüpft sind, zu einem Ü- berschuss des Diisocyanats geben. In der Regel beträgt der Überschuss wenigstens 10 Mol-%, bezogen auf die Stöchiometrie der Reaktion, d. h. man setzt wenigstens 1 ,1 Mol, vorzugsweise wenigstens 2 Mol und insbesondere wenigstens 5 Mol Diiso-cyanat und speziell wenigstens 10 Mol Diisocyanat pro Mol funktioneller Gruppe in der Präpolymervorstufe ein. Vorzugsweise erfolgt die Reaktion unter kontrollierten Reaktionsbedingungen, d. h. die Zugabe der Präpolymervorstufe erfolgt unter Reaktionsbedingungen so langsam, dass eine Erwärmung des Reaktorinhalts um mehr als 20 K vermieden wird. Vorzugsweise erfolgt die Umsetzung der Präpolymervorstufe mit dem Diisocyanat in Abwesenheit eines Lösungsoder Verdünnungsmittels.
Die Umsetzung kann in Abwesenheit oder in Gegenwart geringer Mengen üblicher Katalysatoren, welche die Bildung von Urethanen fördern, erfolgen. Geeignete Katalysatoren sind beispielsweise tertiäre Amine wie Diazabicyclooctan (DABCO) und zinnorganische Verbindungen, z. B. DialkyIzinn(IV)salze von aliphatischen Carbonsäuren wie Dibutylzinndilaurat und Dibutylzinndioctoat. Die Menge an Katalysator beträgt in der Regel nicht mehr als 0,5 Gew.-%, bezogen auf die Präpo- lymer-Vor-stufe, z. B. 0,01 bis 0,5 Gew.-%, insbesondere 0,02 bis 0,3 Gew.-%. In einer bevorzugten Vorgehensweise wird kein Katalysator eingesetzt. Die erforderlichen Reaktionstemperaturen hängen naturgemäß von der Reaktivität der eingesetzten Präpolymervorstufe, des Diisocyanats, und sofern eingesetzt von der Art und Menge des verwendeten Katalysators ab. Sie liegt in der Regel im Bereich von 20 bis 100 °C und insbesondere im Bereich von 35 bis 80 °C. Es versteht sich von selbst, dass die Umsetzung der Präpolymervorstufe mit dem Diisocyanat in Abwesenheit von Feuchtigkeit (< 2000 ppm, vorzugsweise < 500 ppm) erfolgt.
Die Aufarbeitung der so erhaltenen Reaktionsmischung erfolgt in der Regel durch Abdestillieren des überschüssigen Diisocyanats, vorzugsweise bei vermindertem Druck. Die erhaltenen Reaktionsprodukte enthalten zu einem überwiegenden Anteil das sternförmige Präpolymer, das an den Enden der Polymerarme Isocya- natgruppen aufweist. Der Anteil des sternförmigen Präpolymeren beträgt in der Regel wenigstens 70 Gew.-%, vorzugsweise wenigstens 80 Gew.-% des Reaktionsprodukts. Die übrigen Bestandteile des Reaktionsproduktes sind im Wesentlichen Dimere und in geringen Anteilen Trimere, die in diesen Mengen ebenfalls zur Herstellung der erfindungsgemäßen Beschichtungen geeignet sind.
Die mit den erfindungsgemäßen sternförmigen Präpolymeren zu beschichtenden Substraten unterliegen grundsätzlich keinen Einschränkungen. Die Substrate können regelmäßig oder unregelmäßig geformte, glatte oder poröse Oberflächen aufweisen. Beispiele für geeignete Oberflächenmaterialien sind oxidische Oberflächen, z. B. Silikate wie Glas, Quarz, Siliciumdioxid wie in Silicagelen, oder Keramik, weiterhin Halbmetalle wie Silicium, Halbleitermaterialien, Metalle und Metalllegierungen wie Stahl, Polymere wie Polyvinylchlorid, Polyethylen, Polymethyl- pentene, Polypropylen, Polyester, Fluorpolymere (z. B. Teflon®), Polyamide, Polyurethane, Poly(meth)acrylate, Blends und Komposite der vorgenannten Materialien Oberflächen, auch Zellulose und natürliche Fasern wie Baumwollfasern und Wolle. Bei den Polymeren kann es sich um verwebtes oder nichtverwebtes Material handeln.
Die Herstellung der ultradünnen, Hydrogel-bildenden Beschichtungen erfolgt erfindungsgemäß durch Abscheiden der sternförmigen Präpolymere auf der zu be- schichtenden Oberfläche aus einer Lösung der Präpolymere nach an sich bekannten Verfahren und anschließendes Vernetzen der reaktiven Gruppen der Präpolymere. Die Schritte der Abscheidung und der Vernetzung können ge- wünschtenfalls wiederholt durchgeführt werden. Man gelangt auf diese Weise zu dickeren Schichten.
Beispiele für Abscheidungsverfahren sind die Immersion der zu beschichtenden Oberfläche in der Lösung des Präpolymeren sowie das Spincoating - hierbei wird die Lösung des Präpolymeren auf die mit hoher Geschwindigkeit rotierende zu beschichtende Oberfläche aufgebracht. Es versteht sich von selbst, dass man zur Herstellung ultradünner Beschichtungen die Beschichtungsmaßnahmen in der Regel unter staubfreien Bedingungen durchführt.
Bei dem Immersionsverfahren taucht man die Substrate in eine Lösung des Sternpolymers in einem geeigneten Lösungsmittel und lässt anschließend die Lösung ablaufen, so dass ein dünner Flüssigkeitsfilm mit möglichst einheitlicher Dicke auf dem Substrat verbleibt. Dieser wird anschließend eingetrocknet. Die resultierende Filmdicke hängt von der Konzentration der Sternpolymer-Lösung ab. Anschließend wird die Vernetzung ausgelöst.
Beim Spincoating wird in der Regel das zunächst nicht rotierende Substrat mit der Lösung des sternförmigen Präpolymeren vollständig benetzt. Anschließend wird das zu beschichtende Substrat mit hohen Umdrehungszahlen, vorzugsweise o- berhalb 1000 U/min, z. B. 1000 bis 10000 U/min in Rotation versetzt, wobei die Lösung weitgehend abgeschleudert wird und ein dünner Beschichtungsfilm auf der Oberfläche des Substrats verbleibt. Anschließend wird auch hier eine Vernetzung ausgelöst.
Die Konzentration des Präpolymeren in der Lösung wird in der Regel einen Wert von 100 mg/ml, vorzugsweise 50 mg/ml und insbesondere 20 mg/ml nicht überschreiten. Üblicherweise beträgt die Konzentration wenigstens 0,001 mg/ml, vorzugsweise wenigstens 0,005 und insbesondere wenigstens 0,01 mg/ml. Über die Konzentration lässt sich naturgemäß die Dicke der Beschichtung steuern, wobei sehr geringe Konzentration in der Regel zu Monolagen der Sternpolymere auf den beschichteten Oberflächen führen.
In der Regel wird man die Beschichtungsmaßnahmen so wählen, dass die Be- schichtungsdicke (gemessen mittels Ellipsometrie nach dem in Guide to using WVASE 32™, J. A. Woollam Co. Ind., Lincoln NE USA 1998 beschriebenen Verfahren) einen Wert von 500 nm, vorzugsweise 200 nm und insbesondere 100 nm nicht überschreitet. Das Verfahren ermöglicht auch die Herstellung von Monolagen, die Dicken unterhalb 2 nm, z. B. 0,5 bis 2 nm, aufweisen. Für viele Anwendungszwecke sind Schichtdicken im Bereich von 1 bis 100 nm, insbesondere im Bereich von 2 bis 50 nm bevorzugt.
Als Lösungsmittel sind grundsätzlich alle Lösungsmittel geeignet, welche keine o- der nur eine geringe Reaktivität gegenüber den funktionellen Gruppen R des Präpolymeren aufweisen. Hierunter sind solche bevorzugt, die einen hohen Dampfdruck aufweisen und sich somit leicht entfernen lassen. Bevorzugt sind daher solche Lösungsmittel die bei Normaldruck eine Siedetemperatur unterhalb 150 °C und vorzugsweise unterhalb 120 °C aufweisen. Beispiele für geeignete Lösungsmittel sind aprotische Lösungsmittel, z. B. Ether wie Tetrahydrofuran (THF), Dio- xan, Diethylether, tert.-Butylmethylether, aromatische Kohlenwasserstoffe wie Xylole und Toluol, weiterhin Acetonitril, Propionitril und Mischungen dieser Lösungsmittel. Im Falle von Präpolymeren mit OH-, SH-, Carboxyl-, (Meth)acryl- und Oxirangruppen sind auch protische Lösungsmittel wie Wasser oder Alkohole, z. B. Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol und tert.-Butanol, sowie deren Mischungen mit aprotischen Lösungsmitteln geeignet. Im Falle von Präpolymeren mit Isocyanat-Gruppen sind neben den vorgenannten aprotischen Lösungsmitteln überraschenderweise auch Wasser sowie Mischungen von Wasser mit aprotischen Lösungsmitteln geeignet, da vermutlich der Abbau der Isocya- natgruppen in den Präpolymeren vergleichsweise langsam erfolgt.
Die Art der Vernetzung kann auf unterschiedliche Weise erfolgen. In einer Ausführungsform der Erfindung wird man in der Regel den mit dem un- vernetzten Präpolymeren beschichteten Gegenstand mit einem Vernetzungsmittel behandeln.
Als Vernetzungsmittel sind grundsätzlich alle polyfunktionellen Verbindungen geeignet, deren funktioneile Gruppen mit den funktionellen Gruppen des Präpolymeren unter Bindungsbildung reagieren. Diese funktionellen Gruppen werden im Folgenden auch als komplementäre funktionelle Gruppen R' bezeichnet. Eine Übersicht über komplementäre funktionelle Gruppen R' gibt die Tabelle 1 , wobei die Reaktiven Gruppen R des Präpolymeren in der ersten Zeile und die hierzu komplementären Gruppen R' in der ersten Spalte angegeben sind:
Tabelle 1 : Komplementäre funktionelle Gruppen
Reaktive Gruppe Isocyanat Acrylat/ -SH -NH2 -OH Oxiran
R Acrylamid
Komplementäre
Gruppe R'
Isocyanat X* X X X
Acrylat X X X
Acrylamid X X X
-SH X X X
-NH2 X X X
-OH X X X
-COOH X
Oxiran X X X
Aktivester X X
* In Gegenwart von Wasser
Demnach betrifft eine Ausführungsform der Erfindung ein Verfahren, bei dem man die Verknüpfung der reaktiven Gruppen R durch Zugabe einer Verbindung V1 auslöst, die wenigstens zwei reaktive Gruppen R' pro Molekül aufweist, die mit den reaktiven Gruppen R des sternförmigen Präpolymers unter Bindungsbildung reagiert.
Bei den polyfunktionellen Verbindungen V1 kann es sich um niedermolekulare Verbindungen handeln, z. B. um aliphatische oder cycloaliphatische Diole, Triole und Tetraole, z. B. Ethylenglykol, Butandiol, Diethylenglykol, Triethylenglykol, Tri- methylolpropan, Pentaerythrit und dergleichen, aliphatische oder cycloaliphatische Diamine, Triamine oder Tetramine, z. B. Ethylendiamin, Diethylentriamin, Triethy- lentetramin, Tetraethylenpentamin, 1 ,8-Diamino-3,6-dioxaoctan, Diaminocyclohe- xan, Isophorondiamin und dergleichen, Aminoalkohole wie Ethanolamin, Dietha- nolamin, aliphatische oder cycloaliphatische Dithiole, um Dicarbonsäuren oder Tricarbonsäuren wie Sebazinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Phthalsäure, I- sophthalsäure, oder um die vorgenannten Diisocyanate, je nachdem welche Art von reaktiven Gruppen das Präpolymer aufweist. Die niedermolekularen polyfunk- tionellen Verbindungen weisen im Unterschied zu den Präpolymeren in der Regel ein Molekulargewicht < 500 g/mol auf.
Die polyfunktionelle Verbindung V1 kann bereits in der Lösung des Präpolymeren enthalten sein, die zur Beschichtung eingesetzt wird. In der zunächst entstehende Beschichtung aus weitgehend unvemetzten Präpolymeren reagieren dann, z. B. beim Trocknen oder beim Erwärmen der Beschichtung, die reaktiven Gruppen R' des Vernetzungsmittels mit den reaktiven Gruppen R des Präpolymeren und bilden auf diese Weise eine Schicht aus miteinander vernetzten Präpolymeren.
Wenn es sich bei den reaktiven Gruppen R des Präpolymeren um konjugierte Diene handelt, wird die Verbindung V1 dementsprechend wenigstens zwei die- nophile Gruppen aufweisen und umgekehrt. Wenn die Präpolymere reaktive Gruppen aufweisen, die eine en-Reaktion eingehen, wird die Verbindung V1 wenigstens zwei allylische Doppelbindungen aufweisen. In der Regel wird man bei derartigen Systemen zur Herstellung der Beschichtungen Lösungen verwenden die sowohl das Präpolymer als auch die Verbindungen V1 enthalten. Die Vernetzung erfolgt dann beim Trocknen der primär erhaltenen Beschichtung, gegebenenfalls nach Erwärmen.
Als polyfunktionelle Verbindungen V1 sind grundsätzlich auch Präpolymere geeignet, die wenigstens vier Polymerarme A aufweisen, welche für sich gesehen in Wasser löslich sind und an ihren freien Enden eine reaktive funktionelle Gruppe R' aufweisen, die mit den reaktiven Gruppen R des Präpolymeren unter Bindungsbildung reagieren. Mit anderen Worten, für das erfindungsgemäße Verfahren können auch Lösungen von wenigstens zwei unterschiedlichen Präpolymeren eingesetzt werden, worin das eine Präpolymer reaktive Gruppen R und das andere dazu komplementäre reaktive Gruppen R' aufweist. Auch auf diese Weise wird eine Schicht aus miteinander vernetzten Präpolymeren erhalten.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird die Verknüpfung der reaktiven Gruppen R ausgelöst, indem man eine ausreichende Menge einer Verbindung V2 zugibt, die mit einem Teil der reaktiven Gruppen R unter Bildung reakti- ver Gruppen R' reagiert, welche mit den verbliebenen reaktiven Gruppen R unter Bindungsbildung reagiert. Im Falle von Präpolymeren mit Isocyanatgruppen kann man beispielsweise die Vernetzung auslösen, indem man den beschichteten Gegenstand mit Wasser behandelt, z. B. durch Lagern in einer feuchten Atmosphäre oder unter Wasser. Hierbei reagiert ein Teil der Isocyanatgruppen unter Bildung von Aminogruppen ab, die ihrerseits mit den verbleibenden Isocyanatgruppen unter Bindungsbildung reagieren, wobei eine Schicht aus miteinander vernetzten Präpolymeren entsteht. Das Vernetzungsmittel V2 ist hier somit Wasser.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Gruppe R ausgewählt unter ethylenisch ungesättigten, radikalisch polymerisierbaren Doppelbindungen. Die Vernetzung erfolgt in diesem Fall auf thermische oder photochemische Weise, d. h. durch Bestrahlen mit UV-Strahlung oder mit Elektronenstrahlung. Im Falle der photochemischen Vernetzung durch UV-Strahlung wird man der Lösung des Präpolymeren in der Regel geeignete Photoinitiatoren zusetzen. Die Art und Menge an Photoinitiator, die zur Auslösung einer photochemischen Vernetzung erforderlich ist, ist dem Fachmann aus der Technologie Strahlungshärtenden Lacke geläufig.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird man zunächst in der oben beschriebenen Weise ein sternförmiges Präpolymer, vorzugsweise als Mono- schicht, auf der zu beschichtenden Oberfläche aufbringen, gegebenenfalls eine partielle Vernetzung der reaktiven Gruppen R durchführen und anschließend wenigstens ein weiteres sternförmiges Präpolymer 2 auf die so behandelte Oberfläche aufbringt, das wenigstens vier Polymerarme A aufweist, die für sich gesehen in Wasser löslich sind und an ihren freien Enden eine reaktive funktionelle Gruppe R' aufweisen, welche eine zu den reaktiven Gruppen R des Präpolymeren 1 komplementäre Reaktivität aufweisen. Gegebenenfalls führt man im Anschluss daran eine erneute Vernetzung der verbliebenen reaktiven Gruppen R' durch. Dieser Vorgang kann ein oder mehrmals wiederholt werden. Auf diese Weise gelingt es gezielt mehrschichtige Beschichtungen herzustellen. Diese Vorgehensweise wird im Folgenden auch als Schicht-für-Schicht-Verfahren bezeichnet. Das Schicht-für- Schicht-Verfahren kann in besonders eleganter Weise mit solchen Präpolymeren realisiert werden, die reaktive Gruppen R aufweisen, welche mit Verbindungen V2 zu reaktiven Gruppen R' abreagieren, die eine zu den Gruppen R komplementäre Reaktivität aufweisen. Beispiele für Gruppen R sind Isocyanatgruppen. Die Verbindung V2 ist in diesem Fall Wasser. Als komplementär reaktive Gruppen R' entstehen dann NH2-Gruppen. Wird nämlich die Vernetzung der ersten Schicht mit der Verbindung V2 ausgelöst, weist die erhaltene Beschichtung an ihrer Oberfläche freie Gruppen R' (z.B. Aminogruppen) auf. Diese reagieren dann mit den Gruppen R (z.B. Isocyanatgruppen) der in einem zweiten Beschichtungsvorgang aufgebrachten Präpolymeren unter Bindungsbildung. Vorzugsweise wird auch der zweite Beschichtungsvorgang so gesteuert, dass eine Monolage an Präpolymeren auf der ersten Beschichtung abgeschieden wird. Vernetzung der zweiten Schicht mittels Verbindung V2 (z.B. Wasser) und Wiederholung dieser Vorgehensweise erlaubt somit die Herstellung hochvernetzter, hochgeordneter Schichten, insbesondere dann, wenn die Beschichtungsmenge in den einzelnen Beschichtungs- stufen jeweils so gewählt wurde, dass Monoschichten erhalten werden.
Die Beschichtungen können auch mit Mischungen aus sternförmigen Präpolymeren und wasserlöslichen Polysacchariden, wie Hyaluronaten, Heparinen, Alginaten oder z. B. Dextran hergestellt werden. Bei Verwendung von Präpolymeren mit gegenüber OH-Funktionen reaktiven funktionellen Gruppen, z. B. Isocyanatgruppen wirkt dann das Polysacharid als Vernetzer.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt auch die gezielte Inkorporation von Fremdmaterialen, also Materialien, die keine Hydrogel-bildenden Beschichtungen bilden, in die Beschichtung. Hierzu zählen bioaktive Materialien wie Medikamente, Oligonucleotide, Peptide, Proteine, Signalstoffe, Wachstumsfaktoren, Zellen, Kohlehydrate und Lipide, anorganische Komponenten wie Apatite und Hydroxya- patide, quartäre Ammoniumsalzverbindungen, Verbindungen aus Bisguanidinen, quartäre Pyridinumsalzverbindungen, Verbindungen aus Phosphoniumsalzen, Thiazoylbenzimidazolen, Sulfonylverbindungen, Salicylverbindungen oder metallorganische Verbindungen. Der Einbau erfolgt vorzugsweise durch Coadsorption aus Lösungen, die das Präpolymer und den Fremdbestandteil enthalten. Außerdem können die Präpolymere mit den genannten bioaktiven Materialien vor Ad- Sorption umgesetzt werden oder als Mischung mit nicht modifizierten Präpolymeren auf der Oberfläche zur Reaktion gebracht werden. Selbstverständlich ist es auch möglich, gezielt durch Physisorption oder Chemisorption auf das fertige Hydrogel-Beschichtung aufzubringen.
Bei Beschichtung nach dem Schicht-für-Schicht-Verfahren können biologische Komponenten auch in Form einer nicht vollständig deckenden Zwischenschicht eingebracht werden.
Hierzu wird genutzt, dass die oberste Schicht der sternförmigen Präpolymere in der Regel noch reaktive Gruppen trägt, welche auch unter milden Bedingungen (in wässriger Lösung, bei Raumtemperatur) spezifisch mit häufig vorkommenden chemischen Gruppen von Biomolekülen reagieren. Beispiele sind die Reaktion von auf der Oberfläche der Polymerschicht befindlichen NCO-Gruppen mit Alkohol-, Thiol- oder Aminogruppen, die in Proteinen und Peptiden vorhanden sind o- der die nach Methoden des Standes der Technik leicht in viele Biomoleküle eingeführt werden können. Ein weiteres Beispiel ist die Michaeladdition von Thiol- o- der Aminogruppen an Acrylate und Acrylamide in der obersten Schicht der Beschichtung. Ein weiteres Beispiel ist die Umsetzung von aktivierten Estern in der obersten Schicht der Beschichtung mit Alkohol- oder Aminogruppen der Biomoleküle.
Beispiele für geeignete biologische Komponenten, die in die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Hydrogel-Beschichtungen eingebracht werden können, sind Medikamente, z. B. Heparine, Antibiotika wie Streptomycin, Gentomycin, Penicillin, Neomycin, Acriflavin, Ampillicin, Chitin, Chitosan und deren Derivate, sowie andere bakterizide Substanzen, weiterhin Wachstumsfaktoren wie BMPs (bone morphogenic proteins), HGHs (human growth hormons), GMCSF (Macrophage colony stimulating factors), an Heparin bindende Faktoren wie FGFs, VGF, TGFs, kommunikations- und architekturvermittelnde Signalstoffe wie BHL, HHL, OHL, DHLs, OHHL, OOHL, ODHL, OdDHL, HBHL, HtDHL und andere, Integrin vermittelnde Signalmoleküle, Proteine wie Fibronectin, Laminin, Vitronec- tin, Collagen, Thrombospondin und andere adhäsionsvermittelnde Proteine, me- chanisch oder anders physikalisch modulierte Proteine wie gerecktes Fibronectin, adhäsionsvermittelnde Peptidsequenzen wie RGD, RGDS, RGDV, RDT, LRGDN, LDV, REDV, IKVAV, YIGSR, PDSGR, DGEA, Peptidsequenzen, die sich lediglich durch eine Änderung in der Konformation unterscheiden, z. B. zyklische Peptidsequenzen Aminosäuresequenzen und Oligonukleotide, die eine molekulare Erkennung ermöglichen wie Sequenzen aus der RNA oder DNA, Kohlenhydrate und Li- pide, wie Zucker und langkettige Kohlenwasserstoffverbindungen, die eine Wechselwirkung mit der Zellmembran erlauben, Zellen oder Zellverbände von Fibroblasten, Osteoblasten, Chondrozyten und anderen Zellarten, aber auch plu- ripotentes Zellmaterial.
Häufig ist es vorteilhaft, die zu beschichtende Oberfläche in einer Weise vorzube- handeln, dass sie eine erhöhte Anzahl (Flächendichte) an funktionellen Gruppen R' aufweist, die mit den funktionellen Gruppen R des Präpolymeren unter Bindungsbildung reagieren können.
Hierzu wird man die Oberflächen inerter Materialien häufig vor der Beschichtung chemisch aktivieren. Dies kann beispielsweise durch Behandlung der zu beschichtenden Oberfläche mit Säure oder Laugen, durch Oxidation (Abflammen), durch Elektronenbestrahlung oder durch eine Plasmabehandlung mit einem sau- erstoffhaltigen Plasma erfolgen wie sie von P. Chevallier et al. J. Phys. Chem. B 2001, 105(50), 12490-12497; in JP 09302118 A2; in DE 10011275; oder von D. Klee, et al. Adv. Polym. Sei. 1999, 149, 1-57, beschrieben wurde.
Man kann die zu beschichtende Oberfläche auch mit Verbindungen behandeln, die bekanntermaßen eine gute Haftung zu den Oberfläche aufweisen und die außerdem funktionelle Gruppen R' aufweisen, die mit den funktionellen Gruppen R des sternförmigen Präpolymeren komplementär sind. Geeignete Gruppen R' sind, abhängig von der reaktiven Gruppe R des Präpolymeren: Isocyanat-, Amino-, Hydroxyl- und Epoxygruppen, weiterhin Gruppen, die im Sinne einer Michael- Addition reagieren, dienophile Gruppen, die Diels-Alder Additionsreaktionen eingehen, elektronenarme Doppelbindungen, die in einer Diels-Alder Addition oder En-Reaktion mit allylischen Doppelbindungen reagieren; aktivierten Estergruppen; Oxazolingruppen; sowie Vinylgruppen und Thiole, die spezifisch eine freie Radikaladdition eingehen.
Die Art der Gruppe, die eine Haftung auf der zu beschichteten Oberfläche bewirkt, hängt naturgemäß von der chemischen Natur der zu beschichtenden Oberfläche ab. Im Fall von oxidischen, wie keramischen und glasartigen Oberflächen, sowie im Falle metallischer Oberflächen haben sich Verbindungen bewährt, die als haftungsvermittelnde Gruppen Silangruppen, insbesondere Trialkoxysilangruppen aufweisen. Beispiele für derartige Verbindungen sind Trialkoxyaminoalkylsilane wie Triethoxyaminopropylsilan und N[(3-Triethoxysilyl)propyl]ethylendiamin, Trial- koxyalkyl-3-glycidylethersilane wie Triethoxypropyl-3-glycidylethersilan, Trialkoxy- alkylmercaptane wie Triethoxypropylmercaptan, Trialkoxyallylsilane wie Allyltri- methoxysilan sowie Trialkoxysilylacryloxyalkane und -acrylamidoalkane wie 1- Triethoxysilyl-3-acryloxypropan. Für oxidische Materialien und Kunststoff materia- lien sind als haftungsvermittelnde Gruppen auch polyfunktionalen Polyammoni- umgruppen geeignet. Beispiele für derartige Verbindungen sind Polyammonium- verbindung mit freien primären Amingruppen wie sie z. B. von J. Scheerder, J.F.J Engbersen, und D.N. Reinhoudt, Recl. Trav. Chim. Pays-Bas 1996, 115(6), 307- 320, und von Decher, Science 1997, 277, 1232-1237 zu diesem Zweck beschrieben werden.
Bevorzugt werden die vorgenannten Verbindungen als Monolage auf die zu beschichtende Oberfläche aufgebracht. Derartige Monolagen lassen sich in an sich bekannter Weise durch Behandeln der zu beschichtenden Oberflächen mit verdünnten Lösungen der Verbindungen erreichen, z. B. nach dem oben beschriebenen Immersionsverfahren oder mittels Spincoating. Lösungsmittel und Konzentrationen entsprechen dabei den für das Aufbringen der Präpolymere gemachten Angaben. Häufig empfiehlt es sich, die Oberflächen mit den vorgenannten Verbindungen behandeln, die bekanntermaßen eine gute Haftung auf den Oberfläche aufweisen, im Anschluss an eine Aktivierung durch Abflammen, durch Elektronenbestrahlung oder durch Plasmabehandlung durchzuführen. Die gemäß dieser Erfindung beschichteten Oberflächen quellen im direkten Kontakt mit Wasser, wässrigen Lösungen und feuchten Gasen unter Bildung von sehr stabilen Hydrogelen. Die Beschichtungen sind im Unterschied zu vielen Hydrogel- bildenden Beschichtungen des Standes der Technik auch bei längerem Kontakt mit wässrigen Lösungen stabil können mehrmals verwendet werden, da sich die Ablagerungen durch einfaches Spülen mit Wasser entfernen lassen. Die erfindungsgemäß erhaltenen Beschichtungen verhindern wirksam die unspezifische Adsorption von Proteinen und Zellen über einen langen Zeitraum und sind in diesem Punkt den Hydrogelbeschichtungen des Standes der Technik überlegen. Die Beschichtungen sind aufgrund ihrer chemischen Zusammensetzung biokompatibel und nicht toxisch.
Die Verwendung der sternförmigen Präpolymere mit reaktiven Endgruppen ermöglicht vorteilhafterweise den Einsatz einfacher Beschichtungsverfahren wie Immersion, Spincoating (Rotationsschleuderprozesse) und insbesondere einen Aufbau Schicht für Schicht.
Die Besonderheit der sternförmigen Präpolymere mit reaktiven Endgruppen erlaubt es weiterhin, in sehr einfacher und kontrollierter Weise, dünne bis ultradünne Hydrogelbeschichtungen mit einer Schichtdicke unter 100 nm, vorzugsweise unter 50 nm und wenn gewünscht unter 10 nm herzustellen. Die Beschichtungen verhindern eine unspezifische Proteinadsorption sowie die Adhäsion von Zellen und können so eine Bakterienbesiedlung verhindern. Die geringe Dicke der Beschichtung ist dabei von besonderem Vorteil, da die makroskopischen Eigenschaften und die Erscheinung des unterliegenden Materials praktisch unverändert bleiben.
Die Verwendung sternförmiger Präpolymere mit reaktiven Endgruppen erlaubt es weiterhin in einfacher Weise, geordnete Mono- und Multischichten zu erzeugen, deren Struktur und Eigenschaften wie Wasseraufnahme, Durchdringbarkeit und Flexibilität für die jeweilige Anwendung sehr genau eingestellt werden können.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt weiterhin in einzigartiger Weise, unterschiedlichste Funktionen z. B. biologische Wirkstoffe, Funktionszentren, Signal- Stoffe, Wachstumsfaktoren, etc. in die einzelnen Hydrogellagen einzulagern und somit eine biofunktionelle Beschichtung auf Substrate zu übertragen. Die Unterdrückung einer unspezifischen bakteriellen Besiedlung kann durch den Einbau von Bakteriziden, biologischen Signalstoffen und von kolloidalen Teilchen mit einem Durchmesser vorzugsweise unter 100 nm verstärkt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren eröffnet andererseits auch die Möglichkeit, durch die Einbindung von biologischen Signalmolekülen und Liganden eine Besiedlung mit spezifischen Bakterien und Zellen gezielt zu fördern.
Aufgrund der Eigenschaften der erfindungsgemäß erhaltenen Beschichtungen ist eine Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Mikro- sensoren und Mikroanalysesystemen, zur Beschichtung von Mikrokanülen für die Einbringung von genetischem Material in Zellen und von Kapillarsystemen, bei denen die Adsorption von biologischen Verbindungen an den Kapillaroberflächen ein großes Problem darstellt und die analytische Empfindlichkeit erheblich beinträchtigen kann, möglich. Mit anderen Worten, die Verwendung sternförmiger Präpolymere zur Herstellung von Hydrogel-Beschichtungen eröffnet Anwendungsbereiche, in den konventionelle Polymere und Hydrogele keine Anwendung finden können oder aufgrund ihrer ungenügende Proteinresistenz nicht angewendet wurden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere auch zur Beschichtung von Gegenständen geeignet, die in direktem Kontakt mit lebender Materie stehen wie beispielsweise Implantate. Die Beschichtungen können auf vielerlei Laborutensilien, medizinischen Produkten und Instrumenten, aber auch im halbtechnischen Bereich auf Oberflächen aufgetragen werden, die extrem sauber, also möglichst protein- und zellfrei gehalten werden müssen oder die für Reinigungsschritte schwer zugänglich sind.
Die erfindungsgemäß erhältlichen Beschichtungen sind außerdem besonders dort vorteilhaft, wo nur extrem dünne Beschichtungen möglich sind. Beispielweise kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung ultradünner Beschichtungen auf den Innenwänden von Schlauch- und Röhrensystemen eingesetzt wer- den, die ihrerseits nur einen besonders geringen Durchmesser, z. B. im μm- Bereich, besitzen (implantierbare Pumpsysteme, dünne Katheter, mikrobiologische und gentechnologische Laborgeräte). Das erfindungsgemäße Verfahren ist aber auch zur Beschichtung von extrem großen Flächen (Schiffsrümpfe, technische Rohrsysteme, Schwimmbäder, Operationssäle usw.) geeignet.
Figur 1 zeigt die ellipsometrisch bestimmte Schichtdicke einer erfindungsgemäßen Beschichtung in Abhängigkeit von der Anzahl der Beschichtungs- vorgänge.
Figur 2 zeigt die Zunahme der Dicke einer getrockneten erfindungsgemäßen Beschichtung, die Luftfeuchtigkeit ausgesetzt ist (ellipsometrisch bestimmt).
Figur 3 zeigt eine lichtmikroskopische Aufnahme eines erfindungsgemäß beschichteten Glasplättchens (Dicke der Beschichtung etwa 50 nm), das mit einer Fibroblasten-Suspension inkubiert worden war.
Figuren 4a und 4b zeigen lichtmikroskopische Aufnahmen von Glasplätt- chen, die auf der einen Hälfte eine erfindungsgemäße Beschichtung und auf der anderen Hälfte eine Polystyrol-Beschichtung aufweisen und die mit einer Fibroblasten-Suspension inkubiert waren.
Figur 5 zeigt eine lichtmikroskopische Aufnahme eines Glasplättchens, das zur Hälfte mit einer Mischung aus Stern-Präpolymeren und Dextran (1 :1 ) beschichtet und auf der anderen Hälfte unbeschichtet war und die mit einer Fibroblasten-Suspension inkubiert war.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter erläutern.
I. Herstellungsbeispiele Sechsarmige Isocyanat-terminierte Polyether.
Als Isocyanat diente in allen Fällen ein handelsübliches Isophorondiisocya- nat (IPDI: 72 % eis- und 28 % trans-lsomer)
Bei den eingesetzten Präpolymervorstufen handelt es sich um handelsübliche 6-armige Polyalkylenether (im Folgenden Polyole), die durch anionische ringöffnende Polymerisation aus Ethylenoxid und/oder Propylenoxid unter Verwendung von Sorbitol als Initiator hergestellt wurden. Das eingesetzte Polyol wurde vor Einsatz auf einen Restwassergehalt von weniger als 350 ppm getrocknet. Reste des für die Herstellung der Polyole eingesetzten Alkalihydroxids wurden durch Neutralisieren mit Phosphorsäure gebunden.
Das Polyol wurde in allen Herstellungsbeispielen über eine Pumpe langsam zugegeben (ca. 80 ml/h), so dass die Reaktionstemperatur nicht mehr als 10 K von der angegebene Temperatur abwich.
Die Bestimmung des Molekulargewichts (angegeben ist jeweils das Zahlenmittel) erfolgte durch Gelpermeationschromatographie bei Raumtemperatur an drei in Reihe geschalteten Säulen (Säule 1 : Waters μ-Styragel 1000 Angström, I = 30 cm; Säule 2: Waters μ-Styragel 100 Angström, I = 30 cm; Säule 3: PSS SDV 50 Angström, I = 60 cm) unter Verwendung von Tetrahydrofuran als Eluenten, einen Refraktometrie-Detektor (Waters Rl 2410) und unter Verwendung der Auswertungssoftware PSS Win-GPC V 4.02. Die Elutionsdiagramme wurden zur Auswertung an zwei Gausskurven angepasst, wobei über die Flächenverhältnisse der Anteil an Bi-/Trimer bestimmt wurde.
Die Charakterisierung der Endgruppen funktionalisierter Präpolymere sowie die Funktionalisierungsausbeute erfolgte, wo angegeben, zudem elementaranalytisch (Schwefel, Stickstoff), mittels IR-Spektroskopie (v SH, C=0, NH) oder mittels Titration (nicht umgesetzte OH-Gruppen). Die Bestimmung der nicht umgesetzten OH-Gruppen erfolgte durch Umsetzung der Präpolymere mit Acetanhydrid in Pyridin und Titration überschüssiger Säure (Hydrolyse des nicht umgesetzten Acetanhydrids) mit NaOH.
Herstellungsbeispiel 1 :
Das verwendete Polyol ist ein 6-armiges statistisches Po- ly(ethylen/propylenoxid) mit einem EO/PO-Verhältnis von 80/20 mit einem Molekulargewicht von 3100 g/mol. Vor der Umsetzung gab man 0,05 Gew.- % Phosphorsäure zu dem Polyol und erwärmte unter Rühren 1 h auf 80 °C im Vakuum.
In einem Reaktor legte man 262 g IPDI (1 ,18 Mol) vor und erwärmte unter Schutzgas-Atmosphäre auf 50 °C. Danach gab man unter heftigem Rühren das getrocknete und entgaste Polyol (50 g, 0,016 Mol) mit Hilfe einer pe- ristaltischen Pumpe langsam zu (ca. 80 ml/h). Nach Beendigung der Zugabe wurde das Reaktionsgemisch bei 50 °C für weitere 60 Stunden gerührt. Überschüssiges IPDI wurde bei 130 °C und einem Druck von 0,025 mbar mit Hilfe einer Dünnschichtdestillationsapparatur vollständig abdestilliert.
Herstellungsbeispiel 2:
Das verwendete Polyol entspricht dem Polyol des Herstellungsbeispiels 1.
In einem Reaktor legte man 210 g IPDI (0,94 Mol) und 0,06 g (0,1 Gew.-%) Diazabicyclooctan (DABCO) vor und erwärmte unter Schutzgas- Atmosphäre auf 50 °C. Danach gab man unter heftigem Rühren das getrocknete und entgaste Polyol (58 g, 0,019 Mol) mit Hilfe einer peristalti- schen Pumpe langsam zu (ca. 80 ml/h). Nach Beendigung der Zugabe wurde das Reaktionsgemisch bei 50 °C weitere 60 Stunden gerührt. Überschüssiges IPDI wurde bei 130 °C und einem Druck von 0,025 mbar mit Hilfe einer Dünnschichtdestillationsapparatur abdestilliert. Herstellungsbeispiel 3:
Das verwendete Polyol ist ein 6-armiges statistisches Po- ly(ethylen/propylenoxid) mit einem EO/PO-Verhältnis von 80/20 mit einem Molekulargewicht von 10000 g/mol. Vor der Umsetzung gab man 0,05 Gew.-% Phosphorsäure zu dem Polyol und erwärmte unter Rühren 1 h auf 80 °C im Vakuum.
IPDI (100 g, 0,45 Mol) wurde in einem Reaktor vorgelegt und unter Schutzgas-Atmosphäre gerührt auf 50 °C ausgeheizt. Dazu gab man unter heftigem Rühren das getrocknete und entgaste Polyol (50 g, 0,005 Mol) mit Hilfe einer peristaltischen Pumpe langsam zu (ca. 80 ml/h). Nach Beendigung der Zugabe wurde das Reaktionsgemisch bei 50 °C für weitere 60 Stunden gerührt. Nach der Dünnschicht-Destillation (100 °C, 0,025 mbar) erhielt man die Isocyanat-terminierten Stern-Präpolymere.
Herstellungsbeispiel 4:
Das verwendete Polyol ist ein 6-armiges Polypropylenoxid mit einem Molekulargewicht von 3000 g/mol. Vor der Umsetzung gab man 0,05 Gew.-% Phosphorsäure zu dem Polyol und erwärmte 1 h bei 80 °C im Vakuum.
480 g (0,154 Mol) des Polyols wurden unter Schutzgas-Atmosphäre mit Hilfe einer peristaltischen Pumpe langsam (80 ml/h) zu einer bei 50 °C ausgeheizten, heftig gerührten Mischung von 840 g IPDI (3,78 Mol) und 0,99 g Dibutylzinn-Dilaurat (DBTL) gegeben. Nach der Beendigung der Zugabe wurde das Reaktionsgemisch bei 50 °C für weitere 48 Stunden gerührt. Nach der Dünnschicht-Destillation (160 °C, 0,01 mbar) erhielt man die Isocyanat-terminierten Stern-Präpolymere.
Analog Herstellungsbeispiel 1 wurden die Präpolymere der Herstellungsbeispiele Nr. 5, 6, 7 und 9 hergestellt. Analog Herstellungsbeispiel 2 wur- den die Präpolymere der Herstellungsbeispiele 8 und 10 hergestellt. Das Molverhältnis von Diisocyanat zu OH-Gruppen im Polyol (NCO/2/OH) ist in Tabelle 2 angegeben. In Tabelle 2 sind außerdem die Anteile an monomolekularen sternförmigen Polymeren (Mono-Stern) und an bi- und trimoleku- laren Reaktionsprodukten (Bi- und Tri-Stem) angegeben, wie sie mittels Gelpermeationschromatographie bestimmt wurden.
Herstellungsbeispiel 11 :
Analog Herstellungsbeispiel 1 wurden 30 g eines 6-armigen statistischen Poly(ethylenoxid/propylenoxids) mit einem EO/PO-Verhältnis von 80/20 mit einem zahlenmittleren Molekulargewicht von 12000 mit 50 g (0,23 Mol) IPDI umgesetzt. Nach Dünnschichtdestillation (100 °C/0,001 mbar) erhielt man das Isocyanat-terminierte Stern-Präpolymer.
Tabelle 2: Herstellungsbeispiele
Herstellung von Sternpolymeren mit Thiol-, Acrylat-, Acrylamid oder NH2- Gruppen
Herstellungsbeispiel 12: Thiol-terminierter Stern-Polyether
Ein handelsübliches 6-armiges Polyethylenoxid, das an den Enden der Po- lyetherketten OH-Gruppen aufwies wurde nach einem üblichen Verfahren mit PBr3 bromiert (Mills et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2, (4), 697-706, 1995, siehe auch Tetrahedron 44(5), 1988, S. 1553-1558 sowie Inorg. Chim. Acta 97(2) 1985, S. 143-150 und allgemein J. March, Advances in Organic Synthesis 3rd ed. J. Wiley & Sons, New York 1985, S. 383), wobei man ein 6-armiges Polyethylenoxid erhielt, das an den Enden der Poly- etherketten Bromatome aufwies. Dieses wurde in der für Beispiel 1 beschriebenen Weise vorgetrocknet. Anschließend tropfte man hierzu langsam bei 100 °C eine Lösung von 15 eq. Thioessigsäure in 200 ml Ethanol mit 15 eq. Natriumethanolat. Nach weiteren 24 h wurde das Thioacetat mit 1 N wässriger HCI hydrolysiert. Nach Hydrolyse des intermediär erhaltenen Thioacetats wurde die Lösung unter Stickstoff weitere zwei Stunden bei 78 °C gerührt. Das gewünschte Thiolgruppen-haltige Produkt wurde über eine Dünnschicht-Destillationsapparatur unter Luftausschluss abgetrennt.
Ein IR-Spektrum des erhaltenen Produkts zeigte eine schwache Bande bei 2558 cm"1, die der SH-Schwingung zuzuordnen ist. Der elementaranalytisch bestimmte Schwefelgehalt entspricht einem Funktionalisierungsgrad von 5,1.
Herstellungsbeispiel 13: Acrylat-terminierter Stern-Polyether
Eine Lösung von 40 g (12,9 mmol) des in Herstellungsbeispiel 1 eingesetzten, vorgetrockneten Polyethers in 400 ml Dichlormethan wurde auf 0 °C gekühlt und über mehrere Stunden mit einer Lösung von 465 mmol Py- ridin und 465 mmol Acryloylchlorid in 30 ml Dichlormethan versetzt. Die Reaktionslösung wurde weitere sechs Stunden bei 0 °C und anschließend weitere 30 h bei Raumtemperatur gerührt. Das ausgefallene Salz wurde abfiltriert und das Filtrat wurde zunächst mit verdünnter Salzsäure und dann mit wässeriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Produkt wurde durch Zugabe von Diethylether gefällt, abfiltriert und im Vakuum getrocknet.
Ein IR-Spektrum des Präpolymers zeigte eine intensive charakteristische Bande bei 1730 cm"1, die der C=0-Schwingung zuzuordnen ist. Titrimetri- sche Bestimmung des OH-Gruppen-Gehalts ergab einen Funktionalisierungsgrad von > 5.
Herstellungsbeispiel 14: Amin-terminierter Stern-Polyether
Eine gesättigte Lösung von 100 g (32,3 mmol) des in Herstellungsbeispiel 1 eingesetzten, vorgetrockneten Polyethers in 400 ml Dichlormethan wurde unter Stickstoffatmosphäre auf 0 °C abgekühlt. Hierzu gab man zunächst sehr langsam 580 mmol Pyridin und anschließend 580 mmol Methansulfo- nylchlorid. Nach 24 h wurde der ausgefallene Niederschlag abfiltriert und das entstandene Mesylat durch Zugabe von Diethylether gefällt. Das erhaltene Mesylat wurde in Dimethylformamid gelöst und mit 1 ,16 Mol Natri- umazid bei 60 °C 24 Stunden gerührt. Nach dem Abkühlen wurde die Mischung mit Wasser verdünnt und mit Dichlormethan extrahiert. Anschließend trocknete man die organische Phase über Magnesiumsulfat, fällte das Produkt durch Zugabe von Diethylether, filtrierte und trocknete das Produkt im Vakuum. Den so gewonnenen mit Azid-Gruppen funktionalisierten Poly- ether löste man in trockenem Tetrahydrofuran und tropfte die Lösung zu einer Suspension von 290 mmol LiAIH4 in Tetrahydrofuran. Die Mischung wurde 16 h bei 60 °C gerührt und nach dem Abkühlen langsam mit 15%iger Natronlauge versetzt bis ein weißer körniger Niederschlag entstand. Danach wurde über Kieselerde filtriert. Aus der so erhaltenen Lösung wurde der Amin-terminierte Polyether durch Zugabe von Diethylether gefällt und im Vakuum getrocknet. Im IR-Spektrum des Präpolymers ist eine scharfe Bande bei 3310 cm"1 zu erkennen, die der NH-Schwingung zuzuordnen ist. Der elementaranalytisch bestimmte Stickstoffgehalt entspricht einem Funktionalisierungsgrad > 5.
Herstellungsbeispiel 15: Acrylamid-terminierter Stern-Polyether
Eine Lösung von 30 g (ca. 9,6 mmol) des vorgetrockneten Amin- terminierten Polyethers aus Herstellungsbeispiel 14 in 300 ml Toluol wurde unter Stickstoffatmosphäre auf 0 °C abgekühlt und mit Dichlormethan verdünnt, bis eine klare Lösung entstand. Hierzu gab man 320 mmol Pyridin und anschließend über mehrere Stunden 320 mmol Acryloylchlorid. Nach Beendigung der Zugabe wurde die Mischung mit BHT stabilisiert, mindestens für weitere 6 Stunden bei 0 °C unter Lichtausschluss gerührt und auf 200 ml eingeengt. Das ausgefallene Salz wurde abfiltriert und das Filtrat in 500 ml kalten Diethylether gegeben. Hierbei fiel ein Feststoff an, der in 200 ml destilliertem Wasser gelöst wurde. Die Lösung wurde mit 10 g NaCI versetzt. Durch Zugabe von 1N NaOH wurde der pH-Wert auf 7 eingestellt und die neutralisierte Lösung mehrfach mit Dichlormethan extrahiert. Die organischen Phasen werden vereint mit Diethylether versetzt, wobei ein Feststoff ausfiel. Dieser wurde ein zweites Mal in Dichlormethan aufgenommen, mit einem Stabilisator versetzt und erneut in 500 ml kaltem Diethylether gefällt, abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Auf diese Weise erhielt man den mit Acrylamidgruppen terminierten Stern-Polyether.
Im IR-Spektrum ist eine starke Bande bei 1670 cm"1 zu erkennen, die der Amid-EO-Gruppe zugeordnet werden kann. Der mittels Elementaranalyse bestimmte Stickstoffwert entspricht einem Funktionalisierungsgrad > 5.
Herstellung der Hydrogel-Beschichtungen
Als Substrate wurden Glasplättchen (flotiertes Glas, Quarzglas, Standardglas) und hydrophile Silizium-Wafer eingesetzt (Si [100]). Die Substrate wurden vor der Beschichtung im Ultraschallbad zunächst in Aceton, dann in Millipore-Wasser und anschließend in Isopropanol gereinigt. Alle Substrate wurden grundsätzlich zur Vermeidung einer Kontamination durch Staub und Fetttröpfchen aus der Luft in geeigneten Schutzbehältern unter einer Flüssigkeitsschicht aufbewahrt.
Das verwendete Wasser wurde grundsätzlich entsalzt (18 MΩ-cm oder besser). Alle Lösungen wurden mit einem 0,05 μ-Filter von Staub und partikulären Verunreinigungen gereinigt. Filtriertes entionisiertes Wasser wird im Folgenden auch als Millipore-Wasser bezeichnet.
Beschichtungen unter Ausschluss von Wasser wurden in einer Handschuhbox (Braun) unter einer Atmosphäre mit einem Wassergehalt von weniger als 1 ppm H2O/Q2 durchgeführt.
1. Aminofunktionalisierung der Substrate
1.1. Die gereinigten Substrate wurden in einer Plasmaanlage des Typs TePla 100- E der Firma Plasma Systeme 10 Minuten im Sauerstoffplasma behandelt (Druck: 0,15 mbar). Die so behandelten Substrate wurden anschließend in entsalztem Wasser aufbewahrt.
Zur Aminofunktionalisierung wurde die Substratoberfläche zunächst mit einer Aminosilian-Monolage als Promoter beschichtet. Hierzu wurde die aus dem Wasser entnommene und mit Stickstoff trockengeblasene Probe in eine Glovebox transferiert. Dort wurden die Substrate in einer 0,4%igen (v/v) Lösung von N-(3-(Trimethoxysilyl)propyl)ethylendiamin in trockenem Toluol 16 h gelagert, anschließend mit Toluol gründlich gewaschen und vor Benutzung unter Stickstoffatmosphäre in der Glovebox mittels eines gefilterten Stickstoffstroms getrocknet.
1.2 Alternativ wurden die Substrate unter einer 40 W UV-Lampe für 10 min mit Sauerstoff behandelt (Abstand zwischen Substrat-oberfläche und Licht- quelle 2 mm) und anschließend in Millipore-Wasser (MP-H20) eingelegt. Die aus dem MP-H2O entnommene und mit Stickstoff trockengeblasene Probe wurde anschließend wie unter 1.1 mit (Trimethoxysi- lyl)propyl)ethylendiamin behandelt.
2. Beschichtung der Substrate
Alle Maßnahmen erfolgten unter staubfreien Bedingungen (Reinraumbedingungen).
2.1 Beschichtung durch Immersion
Allgemeine Vorschrift a)
Die nach der Vorschrift unter 1.1 aminofunktionalisierten Substrate werden in eine Lösung des jeweiligen Präpolyolymers in trockenem THF (0,05 mg/ml bis 5 mg/ml) eingetaucht. Man lässt die Lösung sorgfältig ablaufen, so dass ein dünner Flüssigkeitsfilm einheitlicher Dicke auf dem Substrat verbleibt. Dieser wird getrocknet. Die resultierende Filmdicke hängt von der Konzentration der Sternpolymer-Lösung ab. Danach werden die Proben, geschützt vor Staub, aus der Glovebox ausgeschleust und in einer feuchten Atmosphäre ausreagiert. Die Proben werden bis zur Verwendung/Untersuchung in MP-H2O eingelegt.
Allgemeine Vorschrift b)
Die nach der Vorschrift unter 1.1 aminofunktionalisierten Substrate werden in eine frisch hergestellte Lösung des Präpolymers (0,005 mg/ml bis 20 mg/ml in 1 :1 THF:MP- H20) eingetaucht. Man lässt die Lösung sorgfältig ablaufen, so dass ein dünner Flüssigkeitsfilm einheitlicher Dicke auf dem Substrat verbleibt, der eingetrocknet wird. Nachdem der Film ausreagiert ist werden die Proben bis zur Verwendung in MP-H20 eingelegt. Tabelle 3 listet Versuche und resultierenden Schichtdicken die durch eine Immersionsbeschichtung erhalten wurden. Die Schichtdicken wurden durch Ellipsometrie ("Guide to using WVASE32 TM", J. A. Woollam Co., Ind., Lincoln, NE, USA, 1998) bestimmt.
Tabelle 3:
Präpolymer Konzentration Vorschrift Lösemittel Schichtdicke
Herstellungs[mg/ml] beispiel
Nr. 3 0,005 b THF/H20 1,3 nm
Nr. 3 0,05 b THF/H2O 3,0 nm
Nr. 3 0,5 b THF/H2O 4,9 nm
Nr. 3 1 ,0 b THF/H2O 12,0 nm
Nr. 3 20,0 b THF/H2O 23,0 nm
Nr. 1 0,05 a THF 4 - 5 Ä
Nr. 1 2,0 a THF 7 -8 Ä
Nr. 1 5,0 a THF 9 -10 Ä
2.2 Beschichtung mittels Spincoating (Rotationsschleuderverfahren) einer dünnen Polymerschicht (allgemeine Vorschrift)
Die Beschichtung nach 1 hergestellten Amin-funktionalisierten Substrate erfolgte mit Hilfe eines Spincoaters (Modell: WS-400A-6TFM/lite von der Firma: SPS). Hierzu wird zunächst das nicht rotierende, getrocknete Substrat mit der Präpolymerlösung (0,05 mg/ml bis 5 mg/ml Sternpolymer in THF) vollständig benetzt, bevor die Lösung bei der Beschleunigungsstufe "5" und einer Endgeschwindigkeit von 5000 U/min für 40 Sekunden abgeschleudert wird. Danach ist die Probe trocken. Die so beschichteten Substrate wurden unter Staubausschluss über Nacht bei einer Luftfeuchtigkeit von 50 bis 80 % gelagert. Die so behandelten Proben können dann sofort der gewünschten Anwendung zugeführt oder in MP-H20 bis zur Verwendung eingelegt werden. In einer Variante des oben beschrieben Verfahrens wird das nach 1 hergestellten Amin-funktionalisierten Substrat auf dem Spincoater unter Rotation (3000 rpm) mit salzfreiem Wasser abgespült bevor die Beschichtung mit einer frisch angesetzten wasserhaltigen Sternpolymerlösung in THF erfolgt. Auf diese Weise erreicht man eine bessere Benetzung des Substrats und einen sehr dünnen Polymerfilm.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefasst. Die Schichtdicke wurde ellipsometrisch bestimmt.
Tabelle 4:
Präpolymer Konzentration Schichtdicke
Herstellungsbeispiel [mg/ml]
Nr. 3 0,005 0,9 nm
Nr. 3 0,01 3,1 nm
Nr. 3 0,05 5,4 nm
Nr. 3 0,1 7,5 nm
Nr. 3 0,5 11 ,4 nm
Nr. 3 1 ,0 14,6 nm
Nr. 3 2,5 15,5 nm
Nr. 3 5,0 43,2 nm
Nr. 3 10,0 112,0 nm
Nr. 3 20,0 211 ,2 nm
Nr. 1 0,5 7 - 9 nm
Nr. 1 1 ,0 12 -13,5 nm
Nr. 1 2,0 14 -17 nm
Beschichtung Schicht für Schicht:
3.1 Allgemeine Vorschrift für die Herstellung von Monolagen mittels Spincoating: Die nach Punkt 1 aminofunktionalisierten und gewaschenen Substrate werden auf dem Spincoater in einem gefiltertem Stickstoffstrom vorsichtig trockengeblasen. Dabei wird das Substrat mit dem auf 50 °C vorgeheiztem Stickstoffstrom leicht erwärmt, bevor unter Ausschluss von Feuchtigkeit eine Lösung des Präpolymers aus Herstellungsbeispiel 1 (in THF; 0,5 bis 5 mg/ml, siehe 111-1) aufgeschleudert wird (Spincoater-Modell: WS-400A- 6TFM/lite von der Firma: SPS, Beschleunigungsstufe "2" und einer Geschwindigkeit von 1500 U/min). Noch bevor der Film ganz eingetrocknet ist, wird die Oberfläche des noch rotierenden Substrats mehrmals durch Aufbringen eines Tropfens wasserfreien Dichlormethan gewaschen, um überschüssiges Präpolymer zu entfernen. Um einen dichten Monofilm zu erreichen wird die Prozedur wiederholt. Anschließend wird die so beschichtete Probe durch Einlegen in MP-H2O vernetzt. Die Vorgehensweise wird entsprechend der Anzahl der aufzubringenden Monoschichten wiederholt.
3.2 Allgemeine Vorschrift für die Herstellung von Monolagen mittels Immersion:
Die nach Punkt 1 vorbehandelten Substrate werden für eine Stunde unter Ausschluss von Feuchtigkeit in einer Lösung des Präpolymers in wasserfreiem THF eingelegt. Anschließend werden die Proben zum Abspülen von nicht chemisch gebundenen Präpolymermolekülen mehrmals mit wasserfreiem THF gewaschen. Danach werden die Proben für eine Stunde in MP- H 0 eingelegt. Die Probe wird getrocknet und anschließend zur Entfernung von Wasser aus der Beschichtung in ein THF-Bad gelegt. Dann werden die Proben in staubfreier Atmosphäre oder in einem gefilterten Stickstoffstrom getrocknet. Zum Aufbringen eines weiteren Monofilms wird diese Vorgehensweise, beginnend mit dem Eintauchen der Probe in die wasserfreie Lösung des Präpolymers in THF, wiederholt. Die so beschichteten Proben können sofort der gewünschten Anwendung zugeführt oder bis zur Verwendung in MP-H20 eingelegt werden. III. Untersuchung der Polymerfilme
1. Untersuchung der Konzentrationsabhängigkeit der Dicke einer Monolage:
Silizium-Wafer, die nach der Vorschrift unter 11-1. vorbehandelt waren, wurden in eine Lösung des Präpolymers aus Herstellungsbeispiel 1 in wasserfreiem THF eingelegt. Nach Immersion wurden die Proben mehrmals mit wasserfreiem THF gewaschen. Nach dem anschließenden einstündigen Einlegen in MP-H20 wurden sie entnommen und wie unter II-3.2 beschrieben getrocknet. Die Schichtdicke der erhaltenen Hydrogelfilme wurde mittel Ellipsometrie bestimmt. Die Werte sind in Tabelle 5 angegeben:
Tabelle 5:
Die Werte in Tabelle 5 zeigen, dass die Schichtdicke mit zunehmender Konzentration der Präpolymerlösung zuerst stark zunimmt und sich bei hoher Konzentration (z. B. 5 mg/ml) einem Grenzwert annähert. Man nimmt an, dass bei niedriger Konzentration aufgrund des geringeren Oberflächenbedeckungsgrades mehr NCO-Gruppen mit reaktiven Gruppen an der O- berfläche kovalente Bindungen eingehen. Im Gegensatz dazu führt eine höhere Konzentration vermutlich zu einer dichtgepackten Adsorbatschicht von Sternmolekülen mit geringerer Anbindung über die NCO-Gruppen an die Oberfläche. 2. Untersuchung Schichtdicke als Funktion der Zahl der aufgebrachten Schichten:
Hierzu wurde zunächst wie unter 1. beschrieben eine Monolage hergestellt, wobei man eine Lösung des Präpolymeren aus Herstellungsbeispiel 1 in THF mit einer Konzentration 1 ,0 mg/ml verwendete. Anschließend wurde das so beschichte Substrat in eine Lösung des gleichen Präpolymers in wasserfreiem THF (Konzentration 1 ,0 mg/ml) eingelegt. Danach wurde die Probe mehrmals mit wasserfreiem THF gewaschen. Nach dem anschließenden einstündigen Einlegen in MP-H20 wurden sie entnommen und wie oben beschrieben getrocknet. Diese Vorgehensweise wurde insgesamt fünfmal wiederholt, wobei man nach jedem Aufbringen einer weiteren Lage die Schichtdicke mittels Ellipsometrie bestimmte. Die Ergebnisse sind in Figur 1 dargestellt.
Wie aus Figur 1 hervorgeht, nimmt die Schichtdicke mit zunehmender Schichtanzahl linear zu, die Steigung der Ausgleichsgeraden beträgt ca. 4.7 A/Schicht, was der Dicke einer Monolage entspricht.
3. Bestimmung der Wasserquellung einer dünnen Hydrogel-Schicht
Das Quellverhalten wurde mittels Ellipsometrie an einer dünnen Beschichtung untersucht. Die Schichtdickenänderung, die das Quellverhalten der Hydrogelschicht direkt widerspiegelt, wurde in-situ gemessen.
Die Proben wurden wie unter II.-1 beschrieben vorbehandelt. Nach dem Trocknen der Probe im gefilterten Stickstoffstrom wurde mittels Spincoating eine Lösung des Polymeren aus Herstellungsbeispiel 1 (5 mg/ml in trockenem THF) bei einer Geschwindigkeit von 6000 U/min. (40 sek.) wie unter II- 2.2 beschrieben aufgetragen. Die so hergestellte Probe wurde dann eine Stunde in Wasser gelagert und nach dem Trocknen im gefilterten Stick- stoffstrom 30 Minuten bei 90 °C/0,1 getrocknet. Die getrocknete Probe wurde dann der Laboratmosphäre (20 °C, 60 % relative Luftfeuchtigkeit) ausgesetzt und die durch Wasseraufnahme verursachte Schichtdickenänderung wurde in-situ mittels Ellipsometrie untersucht. Die Ergebnisse der Untersuchung sind in Figur 2 dargestellt.
Wie aus Figur 2 hervorgeht, nimmt die Schichtdicke der getrockneten Probe durch den Kontakt mit der feuchten Luft zunächst kontinuierlich zu. Nach ca. 10 h ist keine weitere Schichtdickenzunahme mehr zu erkennen. Die gesamte relative Schichtdickenzunahme liegt bei ca. 2 %, was einer absoluten Zunahme von einigen Angström entspricht.
4. Untersuchung der Adsorption von Biopolymeren durch Beobachtung der Diffusion von Einzelmolekülen
Als Substrate wurden Glas-Objektträger mit einer Vertiefung als auch Deckgläschen (d = 170 μm) verwendet und zunächst wie unter 11-1. beschrieben vorbehandelt. Anschließend wurden die verwendeten Substrate mit dem Präpolymer aus Herstellungsbeispiel 3 in der für N-2.2 beschriebenen Weise beschichtet (Spincoating einer Lösung 5 mg/ml Präpolymer in trockenem THF bei einer Geschwindigkeit von 5000 U/min).
Die Untersuchung erfolgte mittels konfokaler Lasermikroskopie und mittels konfokaler Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) unter Verwendung des Fluoreszenzfarbstoffs MR 121. Der Farbstoff wurde in PBS-Puffer (140 mM NaCI, 10 mM KCI, 6,4 mM Na2HP04 x 2H20, 2 mM KH2P04) auf eine Konzentration von 10"10 M verdünnt. 120 μl der Lösung wurden in die ca. 100 μl fassende Vertiefung des oben genannten Objektträgers pipettiert und mit dem 170 μm dicken beschichteten Deckgläschen abgedeckt. Als Referenz wurden ein unbeschichteter Glas-Objektträger und ein unbeschichtetes Deckgläschen verwendet.
Für die konfokale Lasermikroskopie wurde der Objektträger mit der Probe mit dem Deckgläschen nach unten über dem Mikroskopobjektiv positioniert. Durch Verschieben des Objektivs wurde der Laserfokus ca. 10 μm oberhalb des Deckgläschens in die Probelösung fokussiert.
Auf diese Weise konnten die Wechselwirkung des Farbstoffs (MR121), a- ber auch die mit dem Farbstoff markierten Oligonucleotide (MR 121-IPs) in Lösungen von 10"9-10"10 M in einem Volumen von ca. 1 μm3 direkt an der Glasoberfläche beobachtet werden. Um die Verhältnisse direkt an der O- berfläche zu beobachten, wurde das Anregungslicht des Lasers so auf die Glasoberfläche fokussiert, dass der Reflex, der durch den Glas-Wasser- Übergang verursacht wird, maximal war. Es zeigte sich, dass bei der Referenz die markierten Oligonucleotide aus der PBS (zusätzlich mit 5 mM MgC ) Lösung adsorbieren und dann nicht mehr frei beweglich waren. In den mikroskopischen Bildern konnten dann an der Oberfläche die einzelnen Moleküle lokalisiert werden. In dem erfindungsgemäß beschichteten Probenraum sind die Oligonukleotide demgegenüber - ähnlich wie in Lösung - frei beweglich und können wie in Lösung nicht lokalisiert werden, so dass für das gesamte Bild eine erhöhte Untergrundfluoreszenz gemessen wurde.
Durch die konfokale Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) kann die Wechselwirkung des Farbstoff-Oligonucieotide (MR 121-IPs) von 10"9- 10"10 M mit der Oberfläche quantitativ gemessen werden (siehe auch M. Sauer et al., Anal. Chem. 2000, 72, 3717-3724). FCS-Kurven von homogenen Lösungen, das heißt alle Fluorophore verhalten sich gleich und können unter Vernachlässigung von Triplettermen durch einen sigmoidalen Fit beschrieben werden. Dessen Wendepunkt entspricht einer mittleren Diffusi- onszeit für die Bewegung eines Fluorophors durch das Detektionsvolumen. Je höher die mittlere Diffusionszeit, desto geringer ist die Wechselwirkung des Fluorophors mit seiner Umgebung oder, je höher die Diffusionszeiten des Fluorophors, desto stärker ist die Adhäsion des markierten Moleküls an den untersuchten Oberflächen. Dies kann als Qualitätsmerkmal einer nich- tadhäsiven Beschichtung herangezogen werden. Beschreibt man die FCS-Kurve für die Probe von MR 121-IP(T30) im Bereich der unbeschichteten Glasoberfläche (Glas, fokussiert auf 0 μm) mit einer sigmoidalen Kurve, erhält man einen Wendepunkt von ca. 1 Sekunde. Dies weist auf eine sehr starke Wechselwirkung des Farbstoffs mit der Glasoberfläche hin. Die FCS-Kurve für eine Probe von MR 121-IP(T30) auf erfindungsgemäß beschichtete Oberfläche (Hydrogel, fokussiert auf 0 μm) dagegen besitzt einen Wendepunkt bei 238 μs, was nahezu dem eines frei diffundierenden MR 121-IP entspricht. Wird das Detektionsvolumen 4 μm in die Lösung verschoben, kann im Falle des erfindungsgemäß beschichteten Glases kein Oberflächeneinfluss mehr festgestellt werden. Im Falle der Glasoberflächen kann man erkennen, dass die FCS-Kurve (Glas, fokussiert auf 4μm) bei 23,5 ms einen Wendepunkt zeigt, was wiederum auf noch sehr deutliche Wechselwirkungen des fluoreszensmarkierten Oligonucleo- tids mit der Oberfläche hinweist. Erst wenn das Detektionsvolumen um 40 μm in die Lösung verschoben wurde nähern sich beide Kurven dem frei beweglichen MR 121-IP. Die erhaltenen Diffusionszeiten sind für MR 121- IP(T30) in Tabelle 6 zusammengefasst.
Tabelle 6: Mittlere Diffusionszeiten von MR 121 auf und in verschiedenen Höhen über einer Glas- bzw. Hydrogeloberfläche
5. Zelladhäsionsexperimente:
Die Zelladhäsionsexperimente wurden mit GFP-Actin 3T3 Fibroblasten (chicken) und MC3T3-E1 Osteoblasten (chicken) durchgeführt. Die Zellen wurden in 50 ml PMMA Zellkulturboxen bei 37 °C und 5% C02 in einer wasserdampfgesättigten Atmosphäre in einem Inkubator aufbewahrt und repliziert. Die verwendeten Zellmedien sind Standardzellmedien. Für Fibroblasten bestand das Zellmedium aus einer wässrigen Lösung von 88 Vol% DMEM (Dulbecco's modified eagle's medium, Biochrom KG) mit 10 Vol% fetalem Kälberserum (FCS, Invitrogen), 1 Vol% Penecillinlösung (pen- strep, Sigma), 1 Vol% Glutamin (Invitrogen) und 0,5 mg/ml Antibiotikum, Geneticin (Sigma), während für die Osteoblasten das Zellmedium aus einer wässrigen Lösung von 94 Vol% α-MEM (α-modified eagle's medium) mit 5 Vol% Kälberserum (FCS, Invitrogen) und 1 Vol% Glutamin (Invitrogen) hergestellt wurde. Die Zellen wurden regelmäßig gesplittet, um maximales Wachstum zu garantieren und die GFP Expression zu erhalten.
Adhäsionsexperimente wurden in sterilen PS Petrischalen (50 mm Durchmesser) durchgeführt. Vor der Zugabe der Zellen in die Petrischalen wurden diese mit 2 ml Trypsin pro Petrischale aus den Zellkulturboxen entfernt und anschließend in einer Zentrifuge (10 min. bei 1000 U/min.) als Bodensatz abgeschieden. Erneut mit Medium verdünnt, wurde die Zellsuspension anschließend mittels Pipetten auf die Substrate aufgebracht und anschließend inkubiert. Sofern die Zellen auf dem Substrat haften, bilden sie eine gleichmäßige Schicht, die im Lichtmikroskop gut zu erkennen ist. Wenn die Zellen sich nicht auf dem Substrat festsetzen können, also die Adhäsion der Zelle zum Substrat unterdrückt ist, sterben die Zellen ab und sind als kleine, runde Zellhaufen auf der Oberfläche zu erkennen.
Als Substrat diente in Versuch 1 ein erfindungsgemäß beschichtetes Glasplättchens das durch Spincoating nach der in II-2.2 angegeben Vorschrift mit einer Lösung des Präpolymeren aus Herstellungsbeispiel 3 (5,0 mg/ml) eines nach 11-1. vorbehandelten Glasplättchen hergestellt wurde. Die Dicke der Beschichtung betrug etwa 50 nm. Die Probe wurde anschließend in der oben beschriebenen Weise mit der Zellsuspension behandelt und im Lichtmikroskop untersucht. Die Ergebnisse der Untersuchung zeigt Figur 3. Figur 3 zeigt, dass die Beschichtung zellresistent ist, denn die Zellen sind abgestorben und als kleine, runde Zellhaufen auf der Oberfläche zu erkennen. Die Oberfläche zeigt auch nach 120 h keinen Zellbewuchs, was die Langzeitwirkung und Stabilität der Beschichtung belegt. Ähnliche Ergebnisse findet man auch bei dünneren Beschichtungen, die eine Dicke von etwa 5 nm aufweisen.
Als Substrat diente in Versuch 2 und 2a jeweils Glasplättchen die durch Spincoating nach der in II-2.2 angegebenen Vorschrift mit einer Lösung des Präpolymeren aus Herstellungsbeispiel 3 (5,0 mg/ml bzw. 1 mg/ml) beschichtet worden waren (d = 15 nm bzw. d = 5 nm). Anschließend wurde eine Hälfte mittels Dipcoating mit Polystyrol (1 ,0 mg/ml bzw. 2,5 mg/ml in THF) beschichtet. Die Probe wurde anschließend in der oben beschriebenen Weise mit der Zellsuspension behandelt und im Lichtmikroskop untersucht. Die Ergebnisse der Untersuchung zeigen die Figuren 4a und 4b.
Aus den Figuren 4a und 4b geht hervor, dass die Zellen auf der mit Polystyrol behandelten Oberfläche kolonialisieren und auf der erfindungsgemäß beschichteten Oberfläche absterben.
Als Substrat diente in Versuch 3 Glasplättchen das auf der einen Hälfte durch Dipcoating nach der in 11-2.1 b angegebenen Vorschrift mit einer Mischung aus Präpolymeren aus Herstellungsbeispiel 3 (5,0 mg/ml) und Dextran gelöst in Wasser (20 mg/ml, d = 30 nm) beschichtet worden war. Die Probe wurde anschließend in der oben beschriebenen Weise mit der Zellsuspension behandelt und im Lichtmikroskop untersucht. Die Ergebnisse der Untersuchung zeigt Figur 5.
Aus Figur 5 geht hervor, dass die Zellen auf der unbehandelten Oberfläche kolonialisieren und auf der erfindungsgemäß beschichteten Oberfläche absterben.

Claims

Patentansprüche:
1. Verwendung von sternförmigen Präpolymeren, die im Mittel wenigstens vier Polymerarme A aufweisen, welche für sich gesehen in Wasser löslich sind und an ihren freien Enden eine reaktive funktionelle Gruppe R tragen, die mit hierzu komplementär reaktiven funktionellen Gruppen R' oder mit sich selber unter Bindungsbildung reagieren können, zur Herstellung ultradünner, Hydrogel-bildender Beschichtungen.
2. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die reaktive Gruppe R ausgewählt ist unter Isocyanat-Gruppen, (Meth)acrylgruppen, Oxiran-Gruppen, Carbonsäureestergruppen und die reaktive Gruppe R' ausgewählt ist unter primären und sekundären Aminogruppen, Thiolgruppen, Car- boxylgruppen und Hydroxylgruppen.
3. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die reaktive Gruppe R ausgewählt ist unter ethylenisch ungesättigten, radikalisch polyme- risierbaren Doppelbindungen.
4. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das sternförmige Präpolymer im Mittel 6 bis 8 Polymerarme aufweist.
5. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das sternförmige Präpolymer ein zahlenmittleres Molekulargewicht im Bereich von 2000 bis 20000 g/mol aufweist.
6. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Polymerarme ein zahlenmittleres Molekulargewicht im Bereich von 300 bis 3000 g/mol aufweisen.
7. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Polymerarme A ausgewählt sind unter Poly-C2-C4-alkylenoxiden, Polyoxazolido- nen, Polyvinylalkoholen, Homo- und Copolymeren, die wenigstens 50 Gew.- % N-Vinylpyrrolidon einpolymerisiert enthalten, Homo- und Copolymeren, die wenigstens 30 Gew.-% Acrylamid und/oder Methacrylamid einpolymerisiert enthalten, Homo- und Copolymeren, die wenigstens 30 Gew.-% Acrylsäure und/oder Methacrylsäure einpolymerisiert enthalten.
8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Polymerarme A ausgewählt sind unter Polyethylenoxid, Polypropylenoxid und Polyethylen- oxid/Polypropylenoxid-Blockcopolymeren.
9. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das sternförmige Präpolymer in Form einer wässrigen Zubereitung vorliegt.
10. Verfahren zur Herstellung ultradünner, Hydrogel-bildender Beschichtungen, dadurch gekennzeichnet, dass man
i. eine Lösung eines sternförmigen Präpolymers, das im Mittel wenigstens vier Polymerarme A aufweist, die für sich gesehen in Wasser löslich sind und an ihren freien Enden eine reaktive funktionelle Gruppe R tragen, auf die zu beschichtende Oberfläche aufbringt und ii. anschließend eine Verknüpfungsreaktion der reaktiven Gruppen untereinander durchführt.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die auf die O- berfläche aufgebrachte Menge an Präpolymer so gewählt ist, dass eine Beschichtung in einer Stärke von weniger als 50 nm resultiert.
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11 , dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration an Präpolymer in der Lösung 0,001 mg/ml bis 100 mg/ml beträgt.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die zu beschichtende Oberfläche in einer Weise vorbehandelt wurde, dass eine erhöhte Anzahl funktioneller Gruppen R' aufweist.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche in einem Sauerstoff-haltigen Plasma behandelt wurde.
15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche mit einer Silanverbindung, die eine funktionelle Gruppe R' aufweist, vorbehandelt wurde.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass man die Verknüpfung der reaktiven Gruppen R durch Zugabe einer Verbindung V1 auslöst, die wenigstens zwei reaktive Gruppen R' pro Molekül aufweist, die mit den reaktiven Gruppen R des sternförmigen Polymers unter Bindungsbildung reagiert.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass man die Verknüpfung der reaktiven Gruppen R auslöst, indem man eine ausreichende Menge einer Verbindung V2 zugibt, die mit einem Teil der reaktiven Gruppen R unter Bildung reaktiver Gruppen R' reagiert, welche mit den verbliebenen reaktiven Gruppen R unter Bindungsbildung reagieren.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die reaktiven Gruppen R Isocyanat-Gruppen sind und Verbindung V2 Wasser.
19. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Gruppe R ausgewählt ist unter ethylenisch ungesättigten, radikalisch polymerisierba- ren Doppelbindungen und die Vernetzung thermisch oder photochemisch ausgelöst wird.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass man a) zunächst ein sternförmiges Präpolymer 1 , das wenigstens vier Polymerarme A aufweist, die für sich gesehen in Wasser löslich sind und an ihren freien Enden eine reaktive funktionelle Gruppe R aufweisen, auf der zu beschichtenden Oberfläche aufbringt, gegebenenfalls eine partielle Vernetzung der reaktiven Gruppen R durchführt, wobei man eine Beschichtung erhält, die an ihrer Oberfläche noch reaktive Gruppen R aufweist, b) anschließend wenigstens ein weiteres sternförmiges Präpolymer 2, das wenigstens vier Polymerarme A aufweist, die für sich gesehen in Wasser löslich sind und an ihren freien Enden eine reaktive funktionelle Gruppe R' aufweisen, die mit den reaktiven Gruppen R des sternförmigen Polymers unter Bindungsbildung reagieren, auf die so behandelte Oberfläche aufbringt, gegebenenfalls eine Vernetzung der Gruppen R' auslöst und gegebenenfalls die die Schritte a) und b) ein oder mehrfach wiederholt.
21. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass man a) ein sternförmiges Präpolymer 1 , das wenigstens vier Polymerarme A aufweist, die für sich gesehen in Wasser löslich sind und an ihren freien Enden eine reaktive funktionelle Gruppe R aufweisen, auf der zu beschichtenden Oberfläche aufbringt, b) eine ausreichende Menge einer Verbindung V2 zugibt, die mit einem Teil der reaktiven Gruppen R unter Bildung reaktiver Gruppen R' reagiert, welche mit den verbliebenen reaktiven Gruppen R unter Bindungsbildung reagieren, wobei man eine Beschichtung erhält, die an ihrer Oberfläche funktionelle Gruppen R' aufweist, c) anschließend wenigstens ein weiteres sternförmiges Präpolymer 1 auf die so behandelte Oberfläche aufbringt und erneut eine Vernetzung der Gruppen R durch Zugabe einer Verbindung V2 auslöst und gegebenenfalls die Schritte b) und c) ein- oder mehrfach wiederholt.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, dass man in die Beschichtung ein biologisch aktives Material und/oder Zellmaterial inkorporiert.
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