WO2000013016A2 - Verfahren zur bereitstellung von künstlichen rezeptoren - Google Patents

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Gluesenkamp Karl Heinz
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Frank Seiler
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Definitions

  • the invention relates to a method for providing artificial receptors on a polymeric compound, preferably on a stabilized surface thereof, with binding sites for binding biologically or pharmacologically active substances by template-assisted optimization as a new way of producing customized chromatography materials via or on intelligent Surfaces
  • the object of the invention is to provide a method by which the template, which at least partially corresponds to a biologically or pharmacologically active compound in terms of conformation and configuration, binds the template to a polymer compound by binding the template to the Controlling the polymer connection to the ligands to be coupled
  • the configuration and conformation of the template as a so-called negative image should be shaped by the ligands coupled to the polymer compound, for example by the coupling of certain ligands whose molecular size and conformation should also the negative image as information about the conformation and configuration of the template can be shaped permanently or briefly as a so-called short-term or long-term memory on the polymer compound by the ligands bound to the polymer compound.
  • the receptors formed by the ligands should serve as information stores
  • the invention relates to a method for providing artificial receptors on a polymeric compound, preferably on a stabilized surface thereof, with binding sites for binding biologically or pharmacologically active substances by a) immobilizing template molecules which are biologically or pharmacologically active compounds the polymeric compound, b) coupling reactive functional groups to the polymeric compound to bind ligands under physiological conditions, c) binding of compounds as ligands to the reactive groups, d) preferably stabilizing the adjacent compounds bound to the reactive groups with one another for chemical stabilization of the ligands on the polymeric compound and e) detaching the template molecules.
  • the process I according to the invention can preferably be used to provide artificial receptors on a polymer compound for binding biologically or pharmacologically active substances which are a template, preferably on stabilized surfaces of a polymeric compound, which is characterized in that a) a polymer compound for aminopropylation with a chloropropylamine dissolved in MeOH in one heating step, preferably in a microwave reactor with 600 watts irradiated for 1 to 4 minutes, preferably irradiated for a further 4 minutes, and then dried after washing with aqueous acetic acid and aqua bidest, b ) the polymer compound with aminopropyl groups to produce activated polymer compound with a square acid ester compound and triethylamine dissolved in MeOH at RT for 1 to 24 hours, incubated and air-dried after washing with ETOH, c) the polymer Connection to represent a polymer dendrime r- compound with a dendritic polymer and triethylamine dissolved in MeOH
  • the method according to the invention enables the immobilization of template molecules by means of covalent bonding or non-covalent bonding such as electrostatic interaction e.g. ion binding, hydrophobic binding or the like can be carried out on the surface of the polymeric compound.
  • the method II according to the invention for providing artificial receptors on a polymer compound for binding biologically or pharmacologically active substances which are a template, preferably on stabilized surfaces of a polymer compound can be characterized in that a) the polymer compound for the preparation of activated polymer compound with a squaresate compound and triethylamine dissolved in MeOH at RT for 1 to 2 hours and air-dried after washing with MeOH, b) the activated polymer compound to increase the the polymer compound-bound amino groups are incubated with polyethyleneimine in MeOH and air-dried after washing with MeOH, c) then the polymer compound to prepare highly activated polymer compound with a squarate ester compound and triethylamine dissolved in MeOH at RT 1 to Incubated for 24 hours and air-dried after washing with MeOH, d) the highly activated polymer compound for the preparation of polymer compound containing a glucose-nototated surface with glucosamine dissolved in MeOH at
  • Cellulose membrane, glass, plastic surface, preferably microtiter plates, a dendrimeric compounds, or dendritic polymers or a lipid membrane with OH groups can preferably be used as the polymer compound.
  • Amino acids, nucleotides, nucleosides are suitable for the processes I and II according to the invention.
  • the compound can be a cellulose compound, such as a cellulose membrane filter (Schleicher-Schull). Any small-molecule compounds or high-molecular compounds such as coenzyme A, dyes (see exemplary embodiments) are suitable as the template compound
  • step a) of process II the polymer compound for aminopropylation after heating to 70-90 ° C. with methanolic bromopropyl phthalimide solution in the presence of NaOH is incubated for 60 to 120 minutes and then after washing with aqueous acetic acid and be dried aqua bidest
  • the method according to the invention for providing artificial receptors is also intended to enable adequate stabilization thereof without loss of time due to the transfer of the polymer compound substituted by methods I and II into hermetically sealed vessels in order to avoid hydrolysis and oxidation, which is achieved in that the polymer compound activated with step b of process I in order to check the activity of the activated polymer dendrimer compound for 1 to 104 weeks at pH 5.5 to 6.5 without cyclodextrins and even more than 104 weeks in the presence of cyclodextrin compound as Stabilizer can be left at RT.
  • Stage B addition of different ligands which can be reversibly covalently arranged around the template molecules under the incubation conditions. These immobilization steps are strictly reversible and thus create an important competitive situation.
  • This stage can be called the optimization phase.
  • the highlighted lines symbolize the optimized, supramolecular interaction .
  • the more optimal the non-covalent interaction the longer the corresponding ligands stay on the surface.
  • the situation may well arise that an existing optimal interaction becomes suboptimal due to the binding of a further ligand and this ligand must then be replaced by another, to create a stronger interaction in the dressing
  • the ligand population influences or determines individual interactions
  • Step C After optimization has been completed, the ligands are chemically stabilized. This step irreversibly shapes the dynamic process chemical fixation of the ligand arrangement is an essential prerequisite for the construction of artificial receptors.
  • Step D After the ligands have been chemically fixed, the templates are removed in a targeted manner and a surface is obtained in which artificial receptors are embedded. This customized surface should be seen as an optimized supramolecule in which individual receptors are distributed.
  • a surface is used as an anchor for the dynamic imprinting process. All surfaces that allow functionalization chemistry are possible, e.g. Cellulose membranes, glass, functionalized plastics or gold surfaces. There are also no limits to the size and shape of the surface structures. Planar surfaces, beads, colloidal gold, nanoparticles, fullerenes or surfaces of dendrimer structures can be used as a compartment. We suspect that microstructures with concave cavities on surfaces can be particularly important with this method.
  • the surface used for "reversible imprinting" has more than just a carrier function. It is conceivable to use this method on (in) lipid membranes, such as liposomes or other interfaces. Here, these influences can play a dominant role in the formation of the supramolecular
  • the particular advantage of this new technology is that it can be used in very small compartments as well as on very large surfaces.
  • the imprinting processes should take place under physiological conditions, that is to say in watery systems.
  • Knowledge of the reactivity with respect to the ligands and about possible undesirable competitive reactions of the active components during the imprinting processes is of great importance.
  • This reactivity is of great importance is used to fix the ligands around a template molecule chemically via amide bonds after the supramolecular optimization phase has taken place.
  • the undesirable competitive reaction for ligand fixation is the hydrolysis of the squares esters to squares acid.
  • the cyclodextrins can be detached by competition with, for example, p-toluenesulfonic acid or other hosts and thus simply removed and reactivated for the imprinting process
  • sterile components While solutions can easily be sterile filtered, this is not possible with solid phases such as cellulose membranes.
  • Figure 3 shows an example of immobilized dendrimers on surfaces.
  • the "D” represents the dendrimer molecule on which 63 amino groups are distributed in a radial symmetry. These remaining amino groups (an amino group is used for coupling with the surface) can be used for the immobilization of the template molecules or the functional groups Groups are used for the reversible ligand binding.
  • This reduplication strategy for functional groups can be used for any polyamines, such as, for example, polyethyleneimine, polyvinilimmin, chitosan, polylysine, etc.
  • any embodiments of surfaces such as, for example, amino-functionalized microtiter plates, amino-functionalized gold surfaces, amino-functionalized glass, amino-functionalized carbon (electrodes, nanoparticles), amino-functionalized magnetic particles etc.
  • amino groups on surfaces Reduplication is an important prerequisite for the production of artificial receptors with high ligand densities.
  • Figure 4 shows an example of a section of a surface with a high density of chemically reactive squarester groups. This reactive surface is surprisingly well suited for producing membranes with a high density of artificial receptors using the imprinting process described above.
  • Figure 5 shows this class of compounds of highly substituted bicyclic anhydrides. These bicyclic, rigid chemical structures consist of three important structural elements (see Figure 5):
  • Figure 7 is intended to summarize, without a limitation making the principle of reversible imprinting clear using a specific chemical example.
  • the template molecule is first covalently linked to the dendrimer under controlled conditions.
  • the chemistry is selected so that once the ligand arrangement has been fixed, one is fixed targeted cleavage, for example with mercaptoethanol, is possible
  • the bicyclic anhydrides are stably linked with the remaining amino groups via a side chain.
  • ligands e.g. amino acids, oligopeptides and peptide fragments
  • reaction conditions for this are too choose that cooperative effects between ligands and templates (and between the different ligands) can cause the reaction kinetic network to form the most thermodynamically stable ligand arrangement after the formation of the supramolecule the imide formation is then initiated by a pH shift to 8 5-9 5 (see Figure 6).
  • the templates can be detached from the dendrimer surface using disulfide-cleaving reagents
  • the process I according to the invention makes it possible, by coupling a bicyclic anhydride compound to the polymer dendrimer compound connected to the template and activating the anhydride functionality, that the z. B.
  • the template coupled to the polymer compound which at least partially corresponds to a biologically or pharmacologically active compound in terms of conformation and configuration, determines the extent of the binding, the binding site of the Ligands and the ligands as such.
  • the template also serves as the template for the reversible connection of the ligands
  • the ligands coupled to the anhydride-dendmer compound as a negative image of the template indicate the configuration and conformation of the template.
  • This information can be briefly at pH 7 as short-term memory or, if the pH is increased to 8.5, an irreversible imide bond, also called called chemical fixation step or stabilization step, cause the irreversible imide bond is permanent and is equivalent to long-term secured information about the template as long-term memory.
  • the information can be controlled by varying the incubation conditions with ligands, such as time, incubation duration, temperature, pH Change in temperature of ligands L 4 already coupled, which led to a coupling of L5, displaced by ligands L9 at pH 7 and these enable the coupling of the L10, so that, as with an electronic data storage device or data storage, the information to be stored is quasi-scanned can be written and thereby changed
  • a deletion - as a partial deletion - of the information provided as a reversible binding of the ligands is carried out by lowering the pH of the incubation with ligands to, for example, 5.0 in order to recycle the dedrimer coupled to the polymer-dendrimer compound.
  • a complete deletion - complete deletion- of the information is carried out by detaching the template from the polymer-dendrimer compound, in that the bond based on, for example, electrostatic interaction, such as ionic bond, hydro- phobic binding or the like, the template is changed by changing the composition and / or concentration of the incubation batch.
  • methods I and II according to the invention provide a chemical data store which is also able to record information, also in digitized form.
  • method II relates to the irreversible coupling of ligands to polymer dendrimer compounds as a function of the template, cyclodextrins, pH, concentrations, temperature, incubation duration, composition of incubations as protective groups being able to control reactions as well.
  • 500 discs 595 round filters (diameter 6 mm, Schleicher & Schuell) are mixed in a methanol bath with 0 5 g (0 002 mol) polyethylene glycol diamine (average molecular weight 230 g / mol) and 0 156 g (0 002 mol) triethylamine and the bath Gently agitated on a shaker for 10 hours at room temperature. The filters are then washed with alcohol and air-dried. C) Activation of the resulting amino groups with diethyl squarate. 500 discs.
  • Round filters (diameter 6 mm, Schleicher & Schuell) are placed in a methanol bath (100 ml) with 0 17 g (0 001 mol) of squared diethyl ester and 0 156 g (0 002 mol) of triethylamine are added and the bath is gently agitated on a shaker for 10 hours at room temperature. The filters are then washed with alcohol and air-dried using fluorescein-labeled serum albumin (BSA) the loading capacity of the activated membranes was determined.
  • BSA fluorescein-labeled serum albumin
  • the loading capacity of the activated membranes was determined using fluorescein-labeled serum albumin (BSA) entation of 3 mg / ml per round membrane up to 500 ⁇ g protein at pH 8 5 borate buffer could be immobilized within 24 hours.
  • BSA fluorescein-labeled serum albumin
  • a cocktail of the 20 natural amino acids (each 10 mmolar, pH 7.5, 0.2% azide) was then applied for 24 h in order to induce a templated ligand binding. After ligand binding had ended, the pH was then adjusted to 9.5 for 10 h in order to fix the ligands as an imide (see Figure 6).
  • cellulose membranes on which coenzyme A had not been immobilized were treated.
  • the template molecules were removed quantitatively by treatment with DTT or mercaptoethanol and removed by selection with buffer.
  • the binding capacity of the individual membranes was uniform at 1 nmol / disk and was determined by UV spectroscopy using a coenzyme AN-ethyl-maleimide adduct as ligand.
  • the control disks showed no uniform binding properties.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bereitstellung von künstlichen Rezeptoren an einer polymeren Verbindung, vorzugsweise an einer stabilisierten Oberfläche derselben, mit Bindungsstellen zur Bindung von biologisch oder pharmakologisch aktiven Substanzen durch a) Immobilisierung von Templat-Molekülen, welche biologisch oder pharmakologisch wirksame Verbindungen sind, an der polymeren Verbindung; b) Koppeln von reaktiven funktionellen Gruppen an die polymere Verbindung zur Bindung von Liganden unter physiologischen bedingungen; c) Bindung von Verbindungen als Liganden an die reaktiven Gruppen; d) vorzugsweise Stabilisierung der an den reaktiven Gruppen gebundenen benachbarten Verbindungen miteinander zur chemischen Stabilisierung der Liganden an der polymeren Verbindung und; e) Ablösen der Templat-Moleküle.

Description

Beschreibung Verfahren zur Bereitstellung von künstlichen Rezeptoren
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bereitstellung von kunstlichen Rezeptoren an einer polymeren Verbindung, vorzugsweise an einer stabilisierten Oberfläche derselben, mit Bindungsstellen zur Bindung von biologisch oder pharmakologisch aktiven Substanzen durch Template-Assisted Optimization als ein neuer Weg zur Herstellung von maßgeschneiderten Chromatografiematerialien über oder an intelligente Oberflachen
Unsere neuen Ansätze zur Herstellung intelligenter Oberflachen bergen das Potential, sich zu sehr kostengünstige, analytische und praparative Instrumente für die Medizin, für das Bio- und Umweltmonitoring und für die Biotechnologie zu entwickeln Es können mit Hilfe dieser Methoden kostengünstig neuartige Sensoren (kunstliche Rezeptoren) hergestellt werden, die auf (in) Mikrochips (Biochips), als auch im herkömmlichen Format (Mikrotiterplatten) zum Einsatz kommen können Auch neuartige Chromatografiematerialien können vor allem für biotechnologische Fragestellungen maßgeschneidert werden Kulturuberstande von Bioreaktoren oder auch Aufschlüsse von Biomaterialien bestehen aus komplexen Substanzgeniischen Diese wassrigen Losungen enthalten in vielen Fallen kommerziell wertvolle Metabolite, wie z B FADH2, NADH2, ATP, seltene Kohlenhydrate oder Coenzyme Sehr häufig konzentriert man sich auf die Isolierung einer Verbindung oder Stoffgruppe wahrend alle anderen Substanzklassen in vielen Fallen wegen fehlender Trenntechniken verworfen werden Auch für die Isolierung von pharmazeutisch relevanten Molekülen, wie z B Taxol-Derivate aus Zellaufschlussen von Eibenmaterial, sehen wir ein grosses Einsatzgebiet
Die Nutzung von z B monoklonalen Antikörpern, Mikroorganismen, Enzymen, Rezeptoren als Erkennungsprinzip für Sensoren und Chromatografiematerialien ist aufgrund ungenügender Stabilität und begrenzter Verfügbarkeit sehr häufig limitiert Darüber hinaus ist der Zeitaufwand zur Gewinnung eines spezifischen monoklonalen Antikörpers oft betrachtlich und kann mehr als ein Jahr betragen Unser Verfahren zielt auch darauf ab, Antikörper durch synthetische Rezeptoren zu ersetzen
In der Literatur sind chemische Verfahren zur Herstellung von kunstlichen Membra- nen bekannt, die zu molekularer Erkennung von verschiedenen organischen Molekülen, wie z B DNS-Bausteine, befähigt sind Bereits 1972 wurde von G Wulff (G Wulff, An- gew Chem 1995, 107, 1958) erstmalig eine Polymerisationsmethode in Gegenwart von Templat-Molekulen entwickelt und der Begriff „Molekulares Prägen" erschaffen Geeignete monomere reaktive Molekuleinheiten werden mit Templaten vermischt (auch kova- lent verknüpft) und eine Polymerisationsreaktion mit den entsprechenden „crosslinkern" wird eingeleitet Nach Auswaschen der Templat-Molekule erhalt man so Membranen oder Oberflachen, die Bindestellen (Hohlräume) für die Templat-Molekule aufweisen Inzwischen sind eine Vielzahl von Publikationen zu diesem Thema erschienen
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen, mit welchem das Tem- plat, welches einer biologisch oder pharmakologisch wirksamen Verbindung zumindest teilweise in Bezug auf Konformation und Konfiguration entspricht, bei Bindung des Tem- plats an eine Polymer- Verbindung die Bindung der an die Polymer- Verbindung zu koppelnden Liganden zu steuern vermag Zudem soll die Konfiguration und Konformation des Templat als sogenannte Negativabbildung von den an die Polymer- Verbindung ge- koppelten Liganden geprägt sein, z B durch die Kopplung von bestimmten Liganden, deren molekulare Große und Konformation Zudem soll die Negativabbildung als Information über die Konformation und Konfiguration des Templat dauerhaft oder kurzzeitig als sogenanntes Kurzzeit oder Langzeitgedächtnis an der Polymer- Verbindung von den an der Polymer- Verbindung gebundenen Liganden geprägt sein Ebenso sollen die von den Li- ganden ausgebildeten Rezeptoren als Informationspreicher dienen
Die Aufgabe wird gelost durch den Hauptanspruch und den Nebenanspruch Die Unteranspruche betreffen bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bereitstellung von kunstlichen Rezeptoren an einer polymeren Verbindung, vorzugsweise an einer stabilisierten Oberflache derselben, mit Bindungsstellen zur Bindung von biologisch oder pharmakologisch aktiven Substanzen durch a) Immobilisierung von Templat-Molekulen, welche biologisch oder pharmakologisch wirksame Verbindungen sind, an der polymeren Verbindung, b) Koppeln von reaktiven fünktionellen Gruppen an die polymere Verbindung zur Bindung von Liganden unter physiologischen Bedingungen, c) Bindung von Verbindungen als Liganden an die reaktiven Gruppen, d) vorzugsweise Stabilisierung der an den reaktiven Gruppen gebundenen benachbarten Verbindungen miteinander zur chemischen Stabilisierung der Liganden an der polymeren Verbindung und e) Ablösen der Templat-Molekule.
Bevorzugterweise kann das erfindungsgemäße Verfahren I zur Bereitstellung von künstlichen Rezeptoren an einer Polymer- Verbindung zur Bindung von biologisch oder pharmakologisch aktiven Substanzen, die ein Templat sind, vorzugsweise an stabilisierten Oberflächen einer polymeren Verbindung, das dadurch gekennzeichnet ist, dass a) eine Polymer- Verbindung zur Aminopropylierung mit einer Chlorpropyla- min gelöst in MeOH in einem Wärmeschritt, vorzugsweise in einem Mikrowellenreaktor mit 600 Watt 1 bis 4 min lang bestrahlt, bevorzugterweise weitere 4 min lang bestrahlt wird, und dann nach Waschung mit wäßriger Essigsäure und aqua bidest getrocknet wird, b) die Polymer- Verbindung mit Aminopropyl-Gruppen zu Darstellung akti- vierten Polymer- Verbindung mit einer Quadratsäureester- Verbindung und Triethylamin gelöst in MeOH bei RT 1 bis 24 stunden lang, inkubiert und nach einer Waschung mit ETOH luftgetrocknet wird, c) die Polymer- Verbindung zur Darstellung einer Polymer-Dendrimer- Verbindung mit einem dendritischen Polymer und Triethylamin gelöst in MeOH bei RT 1 bis 24 Stunden lang inkubiert und nach einer Waschung mit EtOH luftgetrocknet, d) die Polymer-Dendrimer- Verbindung zur Darstellung aktivierter Polymer- Dendrimer- Verbindung und quantitativer Umsetzung von Aminen in Quadratsäureester- Derivate mit einer Quadratsäureester- Verbindung und Triethylamin gelöst in MeOH bei RT 48 Stunden lang inkubiert und nach Waschung in EtOH luftgetrocknet, e) die aktivierte Polymer-Dendrimer- Verbindung zur Darstellung von Cy- steamin-Gruppen tragender Polymer-Dendrimer- Verbindung mit Cysteaminhydrochlorid und Triethylamin bei RT 24 Stunden inkubiert und nach einer Waschung mit EtOH luftgetrocknet, f) die Cysteamin-Gruppen tragende Polymer-Dendrimer- Verbindung zur Darstellung von mit dem Templat verbundener Polymer-Dendrimer- Verbindung mit der Templat- Verbindung 60 min lang in Phosphatpuffer pH 6,5 bis 7,0 inkubiert, g) dann die mit dem Templat verbundene Polymer-Dendrimer- Verbindung zur Substitution noch vorhandener Quadratsäure-Gruppen an der Verbindung mit einer bicy- clischen Anhydrid- Verbindung in MeOH 1 bis 10 Stunden lang inkubiert, h) dann zur Abspaltung von N-Methylethanolamin und Aktivierung der An- hydridfünktionalitäten der Ansatz auf einen pH- Wert von 5,0 eingestellt wird, i) dann eine Amino-Gruppen tragende Verbindung in den Ansatz zugegeben und 1 bis 24 Stunden lang bei pH-7,5 zur Darstellung einer Templat-abhängigen Ligandenanbin- dung an die anhydridfünktionelle Gruppen enthaltende mit einem Templat verbundene Polymer-Dendrimer- Verbindung inkubiert wird, j) der Ansatz zur Fixierung der Liganden unter Imidbildung zwischen der Anhydrid-
Gruppe und der Liganden auf pH-Wert 9,5 eingestellt und 10 Stunden lang stehengelassen wird, k) nach einer Waschung des Ansatzes mit aqua bidest Zugabe von Mercap- toethanol im Überschuß zur quantitaven Enfernung von Templat- Verbindungen und eine Waschung des Ansatzes mit aqua bidest.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht, dass die Immobilisierung von Tem- plat-Molekülen mittels kovalenter Bindung oder nicht-kovalenter Bindung wie elektrostatischer Wechselwirkung z.B. ionen-Bindung, hydrophobe Bindung oder dergleichen,an der Oberfläche der polymeren Verbindung durchgeführt werden kann.
Ebenso ist es möglich, die Polymer-Dendrimer- Verbindungen bzw. deren Abkömmlinge mittels der erfindungsgemäßen Verfahren I und / oder Verfahren II zu herzustellen bzw. zu modifizieren.
Hinzutretend kann das erfindungsgemäße Verfahren II zur Bereitstellung von künstlichen Rezeptoren an einer Polymer- Verbindung zur Bindung von biologisch oder pharmakologisch aktiven Substanzen, die ein Templat sind, vorzugsweise an stabilisierten Oberflächen einer polymeren Verbindung dadurch gekennzeichnet sein, dass a) die Polymer- Verbindung zur Darstellung aktivierter Polymer- Verbindung mit einer Quadratsaureester- Verbindung und Triethylamin gelost in MeOH bei RT 1 bis 2 Stunden lang inkubiert und nach einer Waschung mit MeOH luftgetrocknet wird, b) die aktivierte Polymer- Verbindung zur Erhöhung der an der Polymer- Verbindung gebundenen Amino-Gruppen mit Polyethylenimin in MeOH inkubiert und nach einer Waschung mit MeOH luftgetrocknet wird, c) dann die Polymer- Verbindung zur Darstellung hoch aktivierter Polymer- Verbindung mit einer Quadratsaureester- Verbindung und Triethylamin gelost in MeOH bei RT 1 bis 24 Stunden lang inkubiert und nach einer Waschung mit MeOH luftgetrock- net wird, d) die hoch aktivierte Polymer- Verbindung zur Darstellung von mit glucosa- mindotierter Oberflache enthaltende Polymer- Verbindung mit Glukosamin gelost in MeOH bei RT 2 bis 12 Stunden lang inkubiert und nach einer Waschung mit EtOH luftgetrocknet wird, e) die mit glucosamindotierter Oberflache enthaltende Polymer- Verbindung mit Cyclodextrin in Phosphatpuffer pH 6,5 bis 7,5 5 bis 10 min lang inkubiert, danach mit Phosphatpuffer pH 6,5 bis 7,5 gewaschen, dann f) die mit glucosamindotierter Oberflache enthaltende Polymer- Verbindung zur Darstellung von Boronsauretemplate-Polymer- Verbindung mit einer Boronsaureester- Verbindung, an welche ein Templat gekoppelt ist, in Carbonat-Puffer pH 8,0 bis 9,0 5 Stunden lang inkubiert und überschussiges Boronsaureester- Verbindung durch Waschen mit Carbonat-Puffer entfernt wird, g) anschließend die Boronsauretemplate-Polymer- Verbindung zur kompetiti- ven Entfernung von Cyclodextrin- Schutzgruppen mit p-Toluolsulfonsaure in aqua bidest/ EtOH in einer Mischung von 90/10 (V/V) gewaschen wird, h) anschließend wird Boronsauretemplate-Polymer- Verbindung zur Templat gesteuerten Ligandenbindung mit einer Mischung mit einer oder mehreren Verbindungen als Liganden bei pH 7,5 10 bis 24 Stunden lang bei RT inkubiert, danach mit Phosphatpuffer pH 6,5 bis 7,5 gewaschen, dann die Boronsauretemplate-Polymer-Liganden- Verbindung zur Darstellung Polymer- Liganden- Verbindung mit einem Bindungsort als kunstlicher Rezeptor für Templat entsprechende biologisch oder pharmakologisch wirksame Verbindungen bei pH-Wert auf 4,0 bis 5,5 die Boronsauretemplat entfernt, danach mit Citratpuffer pH 6,5 bis 7,5 gewa- sehen
Bevorzugterweise können als Polymer- Verbindung Cellulosemembran, Glas, Kunststoffoberflache, vorzugsweise Mikrotiterplatten, eine dendrimere Verbindungen, oder dendritische Polymere oder eine Lipidmembran mit OH-Gruppen verwendet werden Als Verbindung eignen sich Aminosäuren, Nukleotide, Nukleoside bei den erfindungsgemäßen Verfahren I und II Die Polymer- Verbindung kann eine Cellulose- Verbindung, wie ein Cellulosemembranfilter (Schleicher-Schull), sein Als Templat-Verbindung eignen sich jegliche kleinmolekulare Verbindungen oder hochmolekulare wie Coenzym A, Farbstoffe (siehe Ausführungsbeispiele) verwendet wird
Es zeigt sich, daß statt Schritt a) des Verfahrens II die Polymer- Verbindung zur Aminopropylierung nach Erhitzung auf 70 - 90 C mit methanolischer Brompropylphtha- limid-Losung in Gegenwart von NaOH 60 bis 120 min lang inkubiert und dann nach Waschung mit wäßriger Essigsaure und aqua bidest getrocknet werden
Das erfindungsgemaße Verfahren zur Bereitstellung von kunstlichen Rezeptoren soll auch ohne Zeitverlust bedingt durch das Umfüllen der durch Verfahren I und II substitu- ierten Polymer- Verbindung in hermetisch verschlossene Gefäßen zwecks Vermeidung von Hydrolyse und Oxidation eine hinreichende Stabilisierung derselben ermöglichen, was dadurch verwirklicht wird, dass die mit Schritt b des Verfahrens I aktivierte Polymer- Verbindung zwecks Überprüfung der Aktivität der aktivierten Polymer-Dendrimer- Verbindung 1 bis 104 Wochen bei pH 5,5 bis 6,5 ohne Cyclodextrine und gar mehr als 104 Wochen in Gegenwart von Cyclodextrin- Verbindung als Stabilisator bei RT stehengelassen werden kann Ebenso ist eine Lagerung der aktivierten Polymer-Dendrimer- Verbindung von bis zu 104 Wochen und mehr Wochen bei einem pH-Wert gleich oder größer 8 bis 9,0 bis 9,5 ohne Cyclodextrine ohne Auftreten von Hydrolyse der aktivierten Polymer-Dendrimer- Verbindung oder ohne deren Aktivitatsverlust möglich Unser neues Konzept unterscheidet sich grundlegend von dieser Vorgehensweise Wahrend die oben beschriebene „Imprinting-Methode" nur irreversible Reaktionsschritte (Ausbildung der verschiedenen Bindestellen) enthalt, erlaubt unser System reversible chemische Prozesse, die, im Gegensatz zur bekannten Methode, unter milden physiologi- sehen Bedingungen ablaufen können Es handelt sich hier also um ein „Reversibles Im- printing" Auch werden keine reaktiven monomeren Bausteine, wie z.B Methacrylsaure, verwendet, sondern es steht ein unerschöpflicher Pool von naturlichen oder synthetischen chemischen Verbindungen, wie z B Aminosäuren, Oligopeptide, Nukleotide, als potentielle Liganden zur Verfügung Das besondere hierbei ist, dass es sich um selbstoptimierende, supramolekulare Erkennungssysteme handelt Die molekularen Wechselwirkungen zwischen den mteragieren- den Spezies sind zunächst grundsatzlich reversibel und treten in Konkurrenz zueinander Erst durch diese essentielle Randbedingung kann sich das gesamte supramolekulare Erkennungssystem den strukturellen Gegebenheiten anpassen und sich standig weiter ver- bessern Nach einer (beliebig langen) Optimierungsphase werden dann durch einen sehr schonenden chemischen Prozess die supramolekularen Netzwerke fixiert Auf diese Weise können hoher organisierte chemische Systeme mit - vom Wissenschaftler vorgegebenen - spezifischen Erkennungseigenschaften gebildet werden
Dieses neue Verfahren beinhaltet folgende Kernpunkte • Verwendung von Oberflachen als Kompartimente für die supramolekularen Systeme
• Design und kontrollierte chemische Immobilisierung von Templat-Molekulen
• Belegung der Oberflache mit reaktiven fünktionellen Gruppen, die reversible oder kovalente Fixierung von geeigneten Liganden unter physiologischen Bedingungen ermog- liehen Unterschiedliche Liganden müssen um eine geeignete Bindestelle konkurrieren können
• Zugabe von monomeren oder oligomeren Bausteinen (z B Aminosäuren oder deren Derivate), die reversible chemische Reaktionen oder reversible supramolekulare Reaktionen mit den zuvor fixierten reaktiven fünktionellen Gruppen oder Templaten einge- hen können Einstellung der Ordnungsparameter pH, Temperatur und Zeit zur optimalen konkurrierenden Besiedlung der mit ausgewählten Templaten dotierten Oberflache Jetzt beginnt die Optimierungsphase zur Ausbildung der nicht-kovalenten Netzwerke zur optimalen Anordnung um die Template Ausbildung hoher organisierter Systeme Je starker die Interaktion zwischen den Templaten und Liganden ausgebildet wird, desto langer ist ihre Verweildauer im supramolekularen Verband Die reversiblen chemischen Reaktionen können so gewählt werden, dass kooperative Effekte (nicht kovalente Wechselwirkungen) einen starken Einfluss auf die reaktionskinetischen Parameter ausüben können Die Bin- dungs- und Abspaltungsgeschwindigkeiten der Liganden werden durch das supramolekulare Netzwerk gesteuert. • Gegenbenenfalls eine chemische Fixierung der Liganden durch einen gezielten und schonenden chemischen Reaktionsschritt
• Ablösung der Template durch einen weiteren chemoselektiven Schritt setzt kunstliche, auf der Oberflache verteilte Rezeptoren frei
Das folgende Schaubild (Abbildung 1) soll zunächst schematisch und daher in sehr vereinfachter Form das neue Verfahren verdeutlichen
Abbildung 1
Stufe A Gezielte Fixierung der Templat-Molekule an der Oberflache
Stufe B Zugabe unterschiedlicher Liganden, die sich unter den Inkubationsbedingungen reversibel kovalent um die Templat-Molekule anordnen können Diese Immobili- sierungsschritte sind streng reversibel und somit wird eine wichtige Konkurrenzsituation geschaffen Diese Stufe kann man als Optimierungsphase bezeichnen Die hervorgehobenen Striche symbolisieren die optimierte, supramolekulare Interaktion. Je optimaler die nicht-kovalente Interaktion, desto langer ist die Verweildauer der entsprechenden Liganden an der Oberflache Es kann durchaus die Situation entstehen, dass eine bestehende optimale Interaktion durch die Bindung eines weiteren Liganden suboptimal wird und dieser Ligand dann durch einen anderen ersetzt werden muss, um eine stärkere Wechselwirkung im Verband zu schaffen Hier wird deutlich, dass die Ligandenpopulation individuelle Wechselwirkungen beeinflusst oder determiniert
Stufe C Nach abgeschlossener Optimierung erfolgt eine chemische Stabilisierung der Liganden Mit diesem Schritt wird der dynamische Prozess irreversibel gestaltet Diese chemische Fixierung des Ligandenarrangements ist eine wesentliche Vorbedingung für die Konstruktion künstlicher Rezeptoren.
Stufe D: Nach der chemischen Fixierung der Liganden werden die Template gezielt entfernt und man erhält eine Oberfläche, in der künstliche Rezeptoren eingebettet sind. Diese maßgeschneiderte Oberfläche ist als ein optimiertes Supramolekül aufzufassen, in dem einzelne Rezeptoren verteilt sind.
Bei unserem Verfahren wird eine Oberfläche als Anker für den dynamischen Im- printingprozess benutzt. Es kommen alle Oberflächen in Frage, die eine Funktionalisie- rungschemie gestatten, wie z.B. Zellulosemembranen, Glas, fünktionalisierte Kunststoffe oder Goldoberflächen. Auch der Auswahl von Größe und Form der Oberflächenstrukturen sind keine Grenzen gesetzt. Es können planare Oberflächen, Beads, kolloidales Gold, Nanopartikel, Fullerene oder Oberflächen von Dendrimerstrukturen als Kompartiment benutzt werden. Wir vermuten, dass MikroStrukturen mit konkaven Kavitäten an Oberflächen eine besondere Bedeutung bei dieser Methode erlangen können. Die benutzte Ober- fläche für das „reversible Imprinting" besitzt mehr als nur eine Trägerfünktion. Es ist denkbar, diese Methode auf (in) Lipidmembranen, wie z.B. Liposomen oder anderen Grenzflächen einzusetzen. Hier können diese Einflüsse eine dominierende Rolle bei der Ausbildung des supramolekularen Erkennungssystems ausüben. Der besondere Vorteil dieser neuen Technik liegt darin, dass sie in sehr kleinen Kompartimenten als auch auf sehr großen Oberflächen anwendbar ist.
A) Preparation von Oberflächen zur gezielten Verankerung von Templat- oder Matrizenmolekülen
Für die gezielte Verankerung von Matritzenmolekülen, sowie von reaktiven zu reversiblen chemischen Reaktionen befähigten Gruppen, an Oberflächen, wie z.B. Zellulose, sind inzwischen geeignete, sehr schonende Verfahren entwickelt worden. Mit Hilfe dieser neuen Methoden ist es zunächst möglich, Aminofünktionalitäten in kontrollierter Weise auf (Zellulose)oberflächen zu erzeugen (K.-H. Glüsenkamp, Patentanmeldung 1996 „Verfahren zur chemischen kontrollierten Modifizierung von Oberflächen sowie von Acyl- und/oder Hydroxyl-Gruppen tragenden Polymeren" DE 196 24 990.2). Für die gezielte Verankerung von Funktionalitaten, Liganden und Biomolekulen mit den vorher eingeführten Aminogruppen ist ein sehr schonendes und bisher nicht bekanntes Kopplungsverfahren erarbeitet worden (K H Glusenkamp and G Eberle-Adamkiewicz, Patent Immobilising of Biomolecules and Affinity Ligands on Polymer Carriers with Quadratic Acid Derivatives Ger Offen , DE 4341524 C2, 931206 (Priority Date), 970116 (International Date)") Aus diesen Druckschriften geht hervor, dass diese Methode eine stabilen Verankerung von Proteinen und Liganden auf Oberflachen, wie z B Membranen erlaubt
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden weitergehende Eigenschaften dieser Methode gefunden, die einen weiteren überraschend einfachen Weg zu neuartigen reaktiven Oberflachenstrukturen ermöglicht Diese so aktivierten Oberflachen führen überraschenderweise zu einer weiteren Weg, um kunstliche Rezeptoren zu generieren
Die Imprinting-Prozesse sollen, wie oben beschrieben, unter physiologischen Bedingungen, also in wasserigen Systemen stattfinden Somit ist die Kenntnis über die Reakti- vitat gegenüber den Liganden und über mögliche unerwünschte Konkurrenzreaktionen der aktiven Komponenten wahrend der Imprinting-Prozesse von großer Wichtigkeit ist Diese Reaktivität wird ausgenutzt, um die Liganden um ein Templatmolekul, nach erfolgter supramolekularer Optimierungsphase, chemisch über Amidbindungen zu fixieren Die unerwünschte Konkurrenzreaktion zur Ligandenfixierung ist die Hydrolyse der Quadratsauree- ster zu Quadratsaure Diese Untersuchungen zur chemische Stabilität der aktivierten Gruppen in wasserigen Systemen in Abhängigkeit vom pH- Wert ergaben nun ein überraschendes Reaktionsverhalten Bei pH 9 0 hydrolisierten in 24 h etwa 50 % der aktiven Gruppen Nach Extrapolation der Hydrolysedaten bei pH 5 5-6 0 hydrolisierten in 3 Jahren nur 25 % der aktivierten Quadratsaureestergruppen (S Tabelle 1, Abschnitt Ausfüh- rungsbeispiele) Diese Daten wurden bei 37°C ermittelt Bei Raumtemperatur oder bei 4° C ist die Hydrolyse noch entsprechend langsamer Die gewünschte Ligandenfixierung ist per se (ohne supramolekulare Wechselwirkung) 10-100 mal schneller als die Hydrolyse (bei gleichen experimentellen Bedingungen) Durch supramolekulare Wechselwirkung von entsprechenden Liganden ( z B arom Aminosäuren aus einem Cocktail der 20 naturlichen Aminosäuren) wird die Bereitschaft zur Fixierung der Liganden (Amidbindung) weiter be- schleunigt Die Reaktionsgeschwindigkeit ist um so schneller, je optimaler die supramolekulare Liganden-Assoziation sich ausgeprägt hat Es handelt sich hier um einen extrem nicht-linearen kinetischen Fixierungsprozess, bei der Nachbargruppeneffekte eine bedeutende Rolle spielen Durch die induzierte raumliche Nahe von Aminogruppen der entspre- chenden Liganden mit den reaktiven Gruppen wird ihre chemische Reaktion stark beschleunigt Diese neue Vorgehensweise eröffnet die Möglichkeit, kombinatorische Techniken zur Generierung und Optimierung von kunstlichen Rezeptoren heranzuziehen Durch die große Zahl von möglichen Ordnungsparametern (pH, Temperatur, Art und Struktur der Oberflache und Zusammensetzung des Ligandencocktails, Anwendung von Parameter-Zeit Gradienten usw ) bieten sich z B mikrotiterplatten-gestutze Optimierungsverfahren an
Eine weitere Vorbedingung für den Imprinting-Prozess ist eine Fixierung von Tem- platmolekulen, wie z B Nukleoside, Hormone etc Diese Fixierung kann eine physikalische Adsorption als auch eine kovalente Fixierung sein Die Kopplungschemie bzw Ad- Sorptionsprozesse müssen so gewählt werden, daß nach erfolgter Imprinting-Reaktion die Template schonend und chemoselektiv abgespalten werden können Es sind verschiedene Varianten erarbeitet worden, um Template auf der Oberflache zu fixieren Als überraschend positiv erwiesen sich Boronsaure-Derivate (Abbildung 2) Allerdings war es in einigen Fallen notig, eine Schutzgruppenstrategie für die aminreaktiven Gruppen auf der Oberflache zu entwickeln, da z B die Fixierung eines Arylboronsauretemplates mit z B einer Zellulosemembran einen pH von mindestens 8 5 erfordert (Abbildung 2)
Dieser pH- Wert führt schon zu einer nicht gewünschten Hydrolyse der aktivierten Quadratsauregruppen Die Losung dieses Problems konnte durch Applikation von Cyclo- dextrinen im Reaktionsmedium gelost werden Überraschenderweise bildeten sich Qua- dratsaureester-Cyclodextrin Wirt-Gast- Systeme aus, die eine ausreichende Schutzfünktion gegenüber Hydrolysereaktion ausübten Selbst bei Applikation von 1 0 Molarer NaOH wurden die reaktiven Gruppen vor Hydrolyse geschützt Nach erfolgter Fixierung der Bo- ronsaureester können die Cyclodextrine durch Kompetition mit z B p-Toluosulfonsaure oder anderen Wirten abgelost und somit einfach entfernt und für den Imprinting-Prozess reaktiviert werden Für Imprintingprozesse unter physiologischen Bedingungen ist es von Vorteil sterile Komponenten einzusetzen Wahrend Losungen ohne weiteres sterilfiltriert werden können, ist dies bei festen Phasen, wie z B Zellulosemembranen nicht möglich Überraschenderweise war es möglich, Quadratsaureaktivierte Oberflachen wie z B fünktionalisierte Glasoberflachen zu erhitzen, ohne dass dabei ein Aktivitatsverlust zu beob- achten war Dieses eröffnet die nicht vorherzusehende Möglichkeit, aktivierte Oberflachen beliebig lange chemisch zu konservieren (lange Lagerzeiten in wassrigen Systemen) Die Schutzfünktion der Cyclodextrine ist aber nicht nur auf Quadratsauregruppen, sondern auch auf Maleinimide, Azlactone, SPDP-Gruppe , Vinylsulfone, Immidester wie z B Succinimide etc anwendbar, wenn entsprechende modifizierte Cyclodextrine eingesetzt werden, die optimale Wirt-Gast- Systeme ausbilden
B) Reduplizierung von aktiven Gruppen zur Erhöhung der Kapazität und Ligan- dendichte, sowie Veränderungen von Oberflachengeometrien
Diese erarbeitete Methode erlaubt auch in schonender Weise Dendrimere auf Ober- flachen zu immobilisieren Wir haben diese hochverzweigten Moleküle als Oberflache für den dynamischen Imprintingprozess ausgewählt, da Verzweigungsgrad und Generation dieser inzwischen kommerziell erhaltlichen Makromoleküle (Dendritec, USA) die Anzahl und Dichte der fünktionellen Gruppen an der Oberflache des Dendrimers bestimmen
Abbildung 3 zeigt beispielhaft immobilisierte Dendrimere auf Oberflachen Das „D" repräsentiert das Dendrimermolekul, auf dem 63 Aminogruppen radialsymmetπsch verteilt sind Diese noch verbleibenden Aminogruppen (eine Aminogruppe wird für die Ver- kupfüng mit der Oberflache benutzt) können für die Immobilisierung der Templatmolekule bzw der fünktionellen Gruppen für die reversible Ligandenanbindung eingesetzt werden Diese Reduplizierungsstrategie für funktioneile Gruppen ist für beliebige Polyamine, wie z B Polyethylenimin, Polyvinilimmin, Chitosan, Polylysin etc anwendbar
Außerdem können beliebige Ausführungsformen von Oberflachen wie z B amino- fünktionalisierte Mikrotiterplatten, aminofünktionalisierte Goldoberflachen, aminofünktio- nalisiertes Glas, aminofünktionalisierte Kohlenstoff (Elektroden, Nanopartikel), aminofünktionalisierte Magnetpartikel etc Diese Möglichkeit, Aminogruppen auf Oberflachen zu reduplizieren, ist eine wichtige Voraussetzung zur Herstellung von künstlichen Rezeptoren mit hohen Ligandendichten.
So ist es möglich, bisher nicht bekannte aktivierte Oberflächenstrukturen herzustellen. Abbildung 4 zeigt beispielhaft einen Ausschnitt von einer Oberfläche, mit einer hohen Dichte an chemisch reaktiven Quadratsäuresterguppen. Diese reaktive Oberfläche eignet sich überraschenderweise gut, um Membranen mit hoher Dichte an künstlichen Rezeptoren, nach dem oben beschriebenen Imprintingverfahren zu erzeugen.
C) Reversible Ligandenaustauschreaktionen und irreversibler Reaktionsschritt zur Fixierung des Ligandenarrangements Eine wichtige Bedingung zur Verwirklichung des neuen Konzeptes zu selbstoptimierenden supramolekularen Strukturen ist Fähigkeit zur kontrollierten, reversiblen chemischen Reaktionsführung. Diese neuartige reaktive Schutzgruppen sind entwickelt worden, um neue Prodrugs für die Chemotherapie maligner Tumoren herzustellen (K.-H. Glü- senkamp. Neue bicyclische Anhydride, Verfahren zu ihrer Herstellung, ihre Verwendung als pH-labiles sowie enzymatisch induziert abspaltbares Maskierungsmittel, Immobilisie- rungs- und Transportmittel für aktive Wirkstoffe. Deutsche Patentanmeldung, 1993.).
Das besondere an diesen Strukturen ist die Möglichkeit, durch Auswahl von Schlüs- selsubstituenten die Reaktionsfähigkeit zu modulieren Die Abbildung 5 zeigt diese Verbindungsklasse hochsubstituierter bicyclischer Anhydride. Diese bicyclischen, rigiden chemischen Strukturen bestehen aus drei wichtigen Strukturelementen (sihe Abbildung 5):
1. aus einer Anhydridfünktionalität,
2. aus ausgewählten Substituenten, die einen kontrollierten Einfluss auf die Reaktivität ausüben,
3. aus einer Kopplungsgruppe, die eine chemoselektive Verknüpfung z.B. mit den Endgruppen des Dendrimers erlaubt.
Überraschenderweise stellten wir fest, dass bei pH 6-7 das Anhydrid und nicht die Dicarbonsäure als reaktive chemische Spezies in Wasser dominiert. Unter physiologischen Bedingungen reagieren Amine wie z.B Aminosäuren zu Carboxyamide und es stellt sich eine chemisches Gleichgewicht zwischen Anhydrid und Carboxyamid ein. Reaktions- kinetische Experimente zeigen, dass die Reaktion zum Carboxyamid unter physiologischen Bedingungen reversibel verlauft Durch Veränderung der fünktionellen Gruppen kann die Lage des Gleichgewichtes und die Reaktionsgeschwindigkeit beeinflusst werden Diese große Reaktivitatsvielfalt der unterschiedlichen substituierten bicyclischen Carboxyamide ermöglicht die Auswahl geeigneter Funktionalitaten für ein reversibles Imprintingverfah- ren Die Lage des Gleichgewichtes kann durch die Temperatur, Konzentration der Liganden und pH- Wert beinflusst werden
Die Möglichkeit der gezielt reversiblen Reaktionsführung ist eine notwendige, aber nicht hinreichende Bedingung für die Realisierung unseres Konzeptes Ein weiterer Schritt, nämlich die chemische Fixierung des Ligandenarrangements, ist notwendig, um physikalisch-chemisch stabile Rezeptoren zu generieren Überraschenderweise entdeckten wir einen weiteren Reaktionsweg der bicyclischen Carboxyamide Wird der pH- Wert der wassrigen Losung auf 8 5 bis 9 5 angehoben, setzt eine irreversible Imidbildung ein Au- sserdem wird unter diesen Bedingungen die Ruckreaktion zum Anhydrid gestoppt und es können keine Liganden mehr abgespalten werden In Abbildung 5 ist diese Reaktionsfolge beschrieben Diese so gebildeten Imide sind unter physiologischen Bedingungen stabil
Abbildung 7 soll zusammenfassend, ohne dass eine Beschrankung das Prinzip des reversiblen Imprintings an einem konkreten chemischen Beispiel deutlich machen Das Templatmolekul wird zunächst unter kontrollierten Bedingungen mit dem Dendrimer ko- valent verknüpft Die Chemie ist so gewählt, dass nach erfolgter Fixierung des Liganden- arrangements eine gezielte Abspaltung, z B durch Mercaptoethanol, möglich wird Die bicyclischen Anhydride werden über eine Seitenkette gezielt mit den noch verbleibenden Aminogruppen stabil verknüpft Dann können Liganden ( z B Aminosäuren, Oligopeptide und Peptidfragmente) mit den Anhydridfünktionalitaten reversibel zu Carboxyamiden reagieren Die Reaktionsbedingungen hierfür sind so zu wählen, dass kooperative Effekte zwischen Liganden und Templaten (und zwischen den verschiedenen Liganden) das reaktionskinetische Netzwerk zur Bildung des thermodynamisch stabilsten Ligandenarrangements veranlassen können Nach erfolgter Formierung des Supramolekuls wird dann durch einen pH-Schift auf 8 5-9 5 die Imidbildung eingeleitet (s Abbildung 6) Schließlich können mit disulfidspaltenden Reagenzien die Template von der Dendrimeroberflache ab- gelost werden Das erfindungsgemaße Verfahren I ermöglicht durch die Kopplung einer bicyclischen Anhydrid- Verbindung an die mit dem Templat verbundene Polymer-Dendrimer- Verbindung und Aktivierung der Anhydridfünktionalitat, daß die z B Aminosäuren als Liganden an das an die mit dem Templat verbundene Polymer-Dendrimer- Verbindung ge- koppelte Anhydrid-Derivat reversibel physiologischen Bedingungen wie pH- Wert 7 gebunden wird Das an die Polymer- Verbindung gekoppelte Templat, welches einer biologisch oder pharmakologisch wirksamen Verbindung zumindest teilweise in Bezug auf Konformation und Konfiguration entspricht, bestimmt das Ausmaß der Bindung, den Bindungsort des Liganden und die Liganden als solche Zudem dient das Templat ist also die Vorlage für die reversible Verbindung der Liganden
Die als Negativabbildung des Templat an Anhydrid- Dendπmer- Verbindung gekoppelten Liganden geben die Konfiguration und Konformation des Templats an Diese Information kann kurzzeitig bei pH 7als Kurzzeitgedächtnis sein oder, falls der pH- Wert auf 8,5 gesteigert wird, eine irreversible Imidbindung, auch genannt chemisch Fixierungs- schritt oder Stabilisierungschritt genannt, hervorrufen Die irreversible Imidbindung ist dauerhaft und steht einer langzeitig gesicherten Information über das Templat als Langzeitgedächtnis gleich Die Informationsteuerung kann erfolgen mittels Variation der Inkubationsbedingungen mit Liganden, wie Zeit, Inkubationsdauer, Temperatur, pH So können zum Beispiel bei Änderung der Temperatur bereits gekoppelte Liganden L 4, die zu einer Kopplung von L5 führten, durch Liganden L9 bei pH 7 verdrangt und diese das Koppeln der L10 ermöglichen, so daß wie bei einem elektronischen Datenspeichergerat bzw Datenspeicher die zu speichernde Information quasi überschrieben und hierdurch geändert werden kann
Eine Loschung -als Teilloschung- der als reversible Bindung der Liganden bereitge- stellten Information erfolgt durch Senken des pH der Inkubation mit Liganden auf zum Beispiel 5,0 zu Rezyclisierung des an Polymer-Dendrimer-Verbindung gekoppelten Dedrimers Ebenso kann eine vollständige Loschung - Vollloschung- der Information erfolgen, durch Losen des Templat von der Polymer-Dendrimer-Verbindung, indem die auf z B elektrostatischer Wechselwirkung beruhenden Bindung wie Ionen-Bindung, hydro- phobe Bindung oder dergleichen, des Templat durch Änderung von Zusammensetzung und / oder Konzentration des Inkubatinsansatzes geändert wird.
Durch die Möglichkeit der Kurzzeit-, Langzeitspeicherung, der Teil- und Voll- Löschung von Informationen werden durch die erfindungsgemäßen Verfahren I und II ein chemischer Datenspeicher bereitgestellt, welcher ebenso Informationen, auch in digitalisierter Form, zu erfassen vermag.
Das erfindungsgemäßen Verfahren II betrifft vielmehr die irreversible in Abhängigkeit von dem Templat erfolgende Kopplung von Liganden an Polymer-Dendrimer- Verbindungen, wobei Cyclodextrine, pH, Konzentrationen, Temperatur, Inkubationsdau- er, Zusammensetzung von Inkubationen als Schutzgruppen ebenso Reaktionen zu steuern vermögen.
Ausführungsbeispiele
Beispielhaft sollen Imprintingexperimente auf Zellulosemembranen und aminofünk- tionalisierten Mikrotiterplatten- Wells dargelegt werden, ohne dass eine Beschränkung der Erfindung erfolgen soll. Als vorteilhaft haben sich Papiermembranen der Firma Schlei- cher&Schüll (Durchmesser 6 mm, Einzelgewicht 2 mg) bewährt, da diese in Mikrotiterplatten eingelegt werden können. Für die Experimente von aminofünktionalisierten Mikrotiterplatten sind die Produkte der Firma Costar benutzt worden.
I.Herstellung von fünktionalisierten Oberflächen aus Voraussetzung zur kontrollierten Verankerung von Templat- und Ligandenmolekülen
1. Herstellung von aminofünktionalisierten Zellulosemembranen a) Aminopropylierung von Zellulosemembranen
500 Scheiben 595 Membranfilter (Schleicher&Schuell), Durchmesser 6 mm, werden in einem entsprechenden flachen Glasreaktor in 3 % NaOH (H2O:MeOH = 4: 1) innerhalb von 15 min auf 70° - 90° C erhitzt und anschließend 2.0 g (0.007 Mol) 3- Brompropylphthalimid, gelöst in 20 ml MeOH in 3 Portionen über einen Gesamtzeitraum von 60 Min dazugegeben. Nach weiteren 30 min wird 5 g Ammoniumsulfat hinzugefügt und für weitere 30 min erhitzt. Danach wird die Membran zuerst in 2 % Essigsäure/Wasser und dann mit Wasser gewaschen und getrocknet. b) Mikrowellen-gesteuerte Aminopropylierung von RC-55-Membranen 500 Scheiben 595 Membranfilter (Schleicher&Schuell), Durchmesser 6 mm, werden in einem entsprechenden flachen Glasreaktor m 3 % NaOH (H2O MeOH = 4 1) 1 min unter einer Argonatmosphare in einem Mikroprozessor-gesteuerten Mikrowellenreaktor (MLS-1200 mega) mit 600 W und einer Frequenz von 2,45 Ghz bestrahlt und anschlie- ßend 2 0 g (0 015 Mol) 3-Chlorpropylamin, gelost in 20 ml MeOH dazugegeben und weitere 4 min bestrahlt Danach wird die Membran zuerst in 2 % Essigsaure/Wasser und dann mit Wasser gewaschen und getrocknet
2 Herstellung von quadratsaureaktivierten Zellulosemembranen a) Aktivierung von Aminopropylzellulose 500 Scheiben 595 3-Aminopropyl-Membranfilter (Schleicher&Schuell), werden in einem Methanolbad (flacher Glasbehalter) mit 0 17 g (0 001 Mol) Quadratsauredimethyle- ster und 0 156 g (0 002 Mol) Triethylamin versetzt und das Bad 10 h bei Raumtemperatur leicht auf ein Schuttler bewegt Danach werden die Membranen mit Alkohol gewaschen und luftgetrocknet Kapazität 80 nMol Quadratsauregruppen/Scheibe b) Einführung von Polyethylenglycol-"spacer"
500 Scheiben 595 Rundfilter (Durchmesser 6 mm, Schleicher&Schuell), werden in einem Methanolbad mit 0 5 g (0 002 Mol) Polyethylenglycol-diamin (mittleres Molekulargewicht 230 g/Mol) und 0 156 g (0 002 Mol) Triethylamin versetzt und das Bad 10 h bei Raumtemperatur leicht auf ein Schuttler bewegt Danach werden die Filter mit Alko- hol gewaschen und luftgetrocknet c) Aktivierung der entstandigen Aminogruppen mit Quadratsaurediethylester 500 Scheiben Rundfilter (Durchmesser 6 mm, Schleicher&Schuell), werden in einem Methanolbad (100 ml) mit 0 17 g (0 001 Mol) Quadratsaurediethylester und 0 156 g (0 002 Mol) Triethylamin versetzt und das Bad 10 h bei Raumtemperatur leicht auf ein Schuttler bewegt Danach werden die Filter mit Alkohol gewaschen und luftgetrocknet Mit Hilfe von Fluorescein-markiertem Serumalbumin (BSA) wurde die Beladungskapazi- tat der aktivierten Membranen bestimmt Bei einer Proteinkonzentration von 3 mg/ml konnte pro Rundmembran bis 50 μg Protein bei pH 8 5 Borat-Puffer innerhalb von 10h immobilisiert werden 3 Herstellung von dendrimerfünktionalisierten Zellulosemembranen a) Immobilisierung von Starburst Dendrimer Generation 4 (Fa Aldrich) 300 3-Aminopropyl-Membranfilter (unter 2 a hergestellt) (Schleicher&Schuell), werden in einem Methanolbad (flacher Gasbehälter) mit 0 3 g (0 02 mMol) Dendrimer Generation 4 (MG 1425 g/Mol) und 0 156 g (0 002 Mol) Triethylamin versetzt und das Bad 24 h bei Raumtemperatur leicht auf ein Schuttler bewegt Danach werden die Membranen mit Alkohol gewaschen und luftgetrocknet b) Aktivierung der entstandigen Aminogruppen mit Quadratsaurediethylester 200 Rundfilter (unter 3 a hergestellt, Durchmesser 6 mm, Schleicher&Schuell), werden in einem Methanolbad (100 ml) mit 0 17 g (0 001 Mol) Quadratsaurediethylester und 0 156 g (0 002 Mol) Triethylamin versetzt und das Bad 48 h bei Raumtemperatur leicht auf ein Schuttler bewegt Danach werden die Filter mit Alkohol gewaschen und luftgetrocknet Mit Hilfe von Fluorescein-markiertem Serumalbumin (BSA) wurde die Beladungskapazitat der aktivierten Membranen bestimmt Bei einer Proteinkonzentration von 3 mg/ml konnte pro Rundmembran bis 500 μg Protein bei pH 8 5 Borat-Puffer inner- halb von 24h immobilisiert werden Dies ergibt eine Kapazitatserhohung (Proteinimmoili- sieung) gegenüber den unter 2c hergestellten Membranen um den Faktor von 10 Die Beladungsdichte an Quadratsaureendgruppen betragt 3 2μMol/Scheibe b) Dotierung der Dendrimeroberflache mit Cysteamingruppen zur reversiblen kovalenten Verknüpfung von Templat-Molekulen über Disulfidgruppen 100 Scheiben Rundfilter (unter 3 b hergestellt, Durchmesser 6 mm, Schleicher&Schuell), werden in einem Methanolbad (100 ml) mit (0 003 mMol) Cysteaminhy- drochlorid und 0 05 g Triethylamin versetzt und das Bad 48 h bei Raumtemperatur leicht auf ein Schuttler bewegt Danach werden die Filter mit Alkohol gewaschen und luftgetrocknet Die Reagenzien sind so bemessen, daß nicht mehr als 1/10 der möglichen Qua- dratsauregruppen reagieren können
4 Funktionalisierung von Mikrotiterplatten-Oberflachen a) Quadratsaurefünktionalisierung der Oberflache 10 Platten (980 Wells) der Fa Costar werden mit einer 0 05%igen Losung von Quadratsaurediethylester und Trietylamin in MeOH (100 μl/Well) für 2 h versetzt Danach wird intensiv mit MeOH gewaschen und luftgetrocknet b) Kapazitatserhoung der Kunststoffoberflache durch Reduplizierung der fünktionellen Gruppen
5 Platten (unter 4 a hergestellt) werden mit einer 0 05%igen Losung von Polyethylenimin (Fa Sigma, Mg 10000) in MeOH (lOOμl/Well) für 24 bei Raumtemperatur inku- biert Danach wird intensiv mit MeOH gewaschen und luftgetrocknet Durch diese Vorgehensweise konnte die Konzentration der verfügbaren Aminogruppen /Well um den Faktor 20 gesteigert werden c) Quadratsaurefünktionalisierung der mit Polyethylenimin kovalenten dotierten Oberflache 3 Platten (unter 4 b hergestellt) werden mit einer 0 05%igen Losung von Quadratsaurediethylester (Fa Aldrich) in MeOH (lOOμl/Well) für 24 bei Raumtemperatur inkubiert Danach wird intensiv mit MeOH gewaschen und luftgetrocknet Durch diese Vorgehensweise konnte die Konzentration der verfügbaren Quadratsauregruppen /Well um den Faktor 20 gesteigert werden d) Dotierung der Oberflache mit Glukosamin zur reversiblen kovalenten Verankerung von Boronsauretemplaten 2 Platten (unter 4 c hergestellt) werden mit einer 0 01%igen Losung von Glukosamin in MeOH versetzt (100 μl/Well) Nach 12 h wird intensiv mit Alkohol gewaschen und luftgetrocknet Die Reagenzien sind so bemessen, daß nicht mehr als 1/10 der mogli- chen Quadratsauregruppen reagieren können
5 Stabilitatsuntersuchungen (Hydrolyseexperimente) von reaktiven Quadratsauregruppen auf Zellulose-Oberflächen in 20% Ethanol/Wasser (37°C) bei pH 5 5 bis pH 9 5
Für diese Experimente wurden jeweils 100 Membranen (unter 2a hergestellt) in 20 ml Puffer (100 mM Citrat/20% Ethanol pH 5 5, 20 mM Phosphat/20% Ethanol pH 6 5, PBS/20 %Ethanol pH 7 0, Cabonat/20% Ethanol pH 8 5 und 30 mM Borat 20% Ethanol pH 9 3) gegeben und bei 37° inkubiert
Für eine Woche jeden Tag, danach wochenweise wurden jeweils etwa 20 Membranen entnommen und die Puffer durch Filtration entfernt Die Membranen wurden jeweils mit 2 ml Cytochrom C-Losung (lmg/ml, 100 mM Borat, pH 9 3) für 6 h versetzt und so die Kopplungsgeschwindigkeit bzw Kapazität ermittelt Die Membranen in 30mM Borat/20% Ethanol zeigten nach 72 h Inkubation einen Aktivitatsverlust gegenüber den Kontrollen von etwa 50% Die Membranen, die in Carbo- nat pH 8 5 inkubiert wurden, zeigen diesen Aktivitatsverlust erst in etwa 2 Wochen Die Inkubation bei pH 7 0 führte erst nach 6 Monaten zu einem messbaren Aktivitatsverlust von etwa 30-50 % Dagegen führten die Inkubation bei 6 5 und pH 5 5 in der Zeitspanne zu keinem messbaren Aktivitatsverlust
6 Imprintingexperimente mit Phenylboronsaure in Mikrotiterplatten Eine Platte mit (Hergestellt unter 4 d) glucosamindotierter Oberflache wurde zunächst mit einer Losung von 0 01 % von ß-Cyclodextrin in PBS für 10 min inkubiert Danach wurde intensiv mit PBS gewaschen und dann eine 0 1 %ιge Losung von Fluo- rescein-Boronsaure (s Abb 2, Beschreibung) in Carbonat pH 8 6 für 5 h appliziert Danach wurde der nicht gebundene Farbstoff durch Waschen mit Carbonat-Puffer entfernt und anschließend eine 0 l%ige Losung von p-Toluolsulfonsaure in Wasser/Ethanol (90 10) dazugegeben, um die Cyclodextrinschutzgruppen kompetitiv zu verdrangen Ein Cocktail der 20 naturlichen Aminosäuren (jeweils 10 mMolar, pH 7 5, 0 2 %
Azid) wurde dann für 24 h appliziert, um eine templatgesteuerte Ligandenanbindung zu induzieren Nach beendeter Ligandenfixierung wurde intensiv mit PBS gewaschen und dann der pH auf 4-5 (citratpuffer) gestellt, um die Boronsaure-Template abzulösen Dieser Vorgang ist mit Hilfe der UV-Spektroskopie zu beobachten und erforderte in diesem Fall 8 h Als Kontrollexpenment wurde eine Platte behandelt, die nicht mit fluoresceinboron- saure behandelt war Die Bindungskapazitat der einzelnen Wells war mit 2 nMol/Well sehr einheitlich und wurde mit Carboxyfluorescein als Ligand UV-spektroskopisch bestimmt Die Kontrollplatte zeigte keine einheitlichen Bindungseigenschaften
7 Imprintingexperimente mit dendrimerfünktionalisierten Zellulosemembranen 10 Rundfilter der cysteamindotierten Zellulosemembranen (unter 3b hergestellt) wurden mit 200nM Coenzym A (Fa Aldrich) in PBS für 1 h behandelt Diese Prozedur führte zur quantitativen Immobilisierung von Coenzym A via Disulfidgruppen Das bicy- clische Anhydrid-Derivat (s Abbildung 8) wird dann (50 mM in MeOH) für 10 h auf die Rundfilter gegeben Die noch verbliebenen Quadratsauregruppen wurden so quantitativ substituiert. Danach wurde für 1 h der pH- Wert auf 5.0 abgesenkt, um N-Methylethanolamin abzuspalten. Dadurch wurden die Anhydridfünktionalitäten reaktiviert. Ein Cocktail der 20 natürlichen Aminosäuren (jeweils 10 mMolar, pH 7.5, 0.2 % Azid) wurde dann für 24 h appli- ziert, um eine templatgesteuerte Ligandenanbindung zu induzieren. Nach beendeter Ligandenbindung wurde dann der pH für 10 h auf 9.5 gestellt, um die Liganden als Imid zu fixieren (s. Abbildung 6). Als Kontrollexperiment wurden Zellulosemembranen behandelt, auf die nicht Coenzym A immobilsiert worden ist. Durch behandlung mit DTT oder Mercaptoethanol wurden quantitativ die Templat-Molekule abgespalten und durch Auswa- sehen mit Puffer entfernt. Die Bindungskapazität der einzelnen Membranen war mit 1 nMol/Scheibe einheitlich und wurde mit einem Coenzym A-N-Ethyl-Maleinimid-Addukt als Ligand UV-spektroskopisch bestimmt. Die Kontrollscheiben zeigten keine einheitlichen Bindungseigenschaften.

Claims

Patentansprüche
1 Verfahren zur Bereitstellung von kunstlichen Rezeptoren an einer polymeren Verbindung, vorzugsweise an einer stabilisierten Oberflache derselben, mit Bindungsstellen zur Bindung von biologisch oder pharmakologisch aktiven Substanzen durch c) Immobilisierung von Templat-Molekulen, welche biologisch oder pharmakologisch wirksame Verbindungen sind, an der polymeren Verbindung, d) Koppeln von reaktiven fünktionellen Gruppen an die polymere Verbindung zur Bindung von Liganden unter physiologischen Bedingungen, c) Bindung von Verbindungen als Liganden an die reaktiven Gruppen, d) vorzugsweise Stabilisierung der an den reaktiven Gruppen gebundenen benachbarten Verbindungen miteinander zur chemischen Stabilisierung der Liganden an der polymeren Verbindung und e) Ablosen der Templat-Molekule
2 Verfahren zur Bereitstellung von kunstlichen Rezeptoren an einer polymeren Verbin- düng nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Immobilisierung von Templat-Molekulen mittels kovalenter Bindung oder elektrostatischer Wechselwirkung an der Oberflache der polymeren Verbindung durchgeführt wird
3 Verfahren I zur Bereitstellung von kunstlichen Rezeptoren an einer Polymer- Verbindung zur Bindung von biologisch oder pharmakologisch aktiven Substanzen, die ein Templat sind, vorzugsweise an stabilisierten Oberflachen einer polymeren Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass a) eine Polymer-Verbindung zur Aminopropylierung mit einer Chlorpropylamin- Verbindung gelost in MeOH in einem Warmeschritt, vorzugsweise in einem Mikrowellenreaktor mit 600 Watt 1 bis 4 min lang bestrahlt, bevorzugterweise weitere 4 min lang bestrahlt wird, und dann nach Waschung mit wäßriger Essigsaure und aqua bidest getrocknet wird, b) die Polymer- Verbindung mit Aminopropyl-Gruppen zu Darstellung aktivierten Polymer-Verbindung mit einer Quadratsaureester- Verbindung und Triethylamin gelost in MeOH bei RT 1 bis 24 stunden lang, inkubiert und nach einer Waschung mit ETOH luftgetrocknet wird, c) die Polymer- Verbindung zur Darstellung einer Polymer-Dendrimer-Verbindung mit einem dendritischen Polymer und Triethylamin gelost in MeOH bei RT 1 bis 24 Stunden lang inkubiert und nach einer Waschung mit EtOH luftgetrocknet, d) die Polymer-Dendrimer-Verbindung zur Darstellung aktivierter Polymer-Dendrimer- Verbindung und quantitativer Umsetzung von Aminen in Quadratsaureester-Derivate mit einer Quadratsaureester- Verbindung und Triethylamin gelost in MeOH bei RT 48 Stunden lang inkubiert und nach Waschung in EtOH luftgetrocknet, e) die aktivierte Polymer-Dendrimer-Verbindung zur Darstellung von Cysteamin- Gruppen tragender Polymer-Dendrimer-Verbindung mit Cysteaminhydrochlorid und Triethylamin bei RT 24 Stunden inkubiert und nach einer Waschung mit EtOH luftgetrocknet, f) die Cysteamin-Gruppen tragende Polymer-Dendrimer-Verbindung zur Darstellung von mit dem Templat verbundener Polymer-Dendrimer-Verbindung mit der Templat- Verbindung 60 min lang in Phosphatpuffer pH 6,5 bis 7,0 inkubiert, g) dann die mit dem Templat verbundene Polymer-Dendrimer-Verbindung zur Substitution noch vorhandener Quadratsaure-Gruppen an der Verbindung mit einer bicyclischen Anhydrid- Verbindung in MeOH 1 bis 10 Stunden lang inkubiert, h) dann zur Abspaltung von N-Methylethanolamin und Aktivierung der Anhydridfünk- tionalitaten der Ansatz auf einen pH- Wert von 5,0 eingestellt wird, i) dann eine Amino-Gruppen tragende Verbindung in den Ansatz zugegeben und 1 bis 24 Stunden lang bei pH-7,5 zur Darstellung einer Templat-abhängigen Ligandenanbindung an die anhydridfünktionelle Gruppen enthaltende mit einem Templat verbundene Polymer-Dendrimer-Verbindung inkubiert wird, j) der Ansatz zur Fixierung der Liganden unter Imidbildung zwischen der Anhydrid- Gruppe und der Liganden auf pH- Wert 9,5 eingestellt und 10 Stunden lang stehengelassen wird, k) nach einer Waschung des Ansatzes mit aqua bidest Zugabe von Mercaptoethanol im Überschuß zur quantitaven Enfernung von Templat-Verbindungen und eine Waschung des Ansatzes mit aqua bidest 4 Verfahren zur Bereitstellung von kunstlichen Rezeptoren an einer polymeren Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als bicyclischen Anhydrid- Verbindung die Anhydrid- Verbindung VIII der Abb VIII verwendet wird
5 Verfahren II zur Bereitstellung von kunstlichen Rezeptoren an einer Polymer- Verbindung zur Bindung von biologisch oder pharmakologisch aktiven Substanzen, die ein Templat sind, vorzugsweise an stabilisierten Oberflachen einer polymeren Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass a) die Polymer- Verbindung zur Darstellung aktivierter Polymer- Verbindung mit einer Quadratsaureester- Verbindung und Triethylamin gelost in MeOH bei RT 1 bis 2 Stun- den lang inkubiert und nach einer Waschung mit MeOH luftgetrocknet wird, b) die aktivierte Polymer- Verbindung zur Erhöhung der an der Polymer- Verbindung gebundenen Amino-Gruppen mit Polyethylenimin in MeOH inkubiert und nach einer Waschung mit MeOH luftgetrocknet wird, c) dann die Polymer- Verbindung zur Darstellung hoch aktivierter Polymer- Verbindung mit einer Quadratsaureester- Verbindung und Triethylamin gelost in MeOH bei RT 1 bis 24 Stunden lang inkubiert und nach einer Waschung mit MeOH luftgetrocknet wird, d) die hoch aktivierte Polymer- Verbindung zur Darstellung von mit glucosamindotierter Oberflache enthaltende Polymer- Verbindung mit Glukosamin gelost in MeOH bei RT 2 bis 12 Stunden lang inkubiert und nach einer Waschung mit EtOH luftgetrocknet wird, e) die mit glucosamindotierter Oberflache enthaltende Polymer- Verbindung mit Cyclodextrin in Phosphatpuffer pH 6,5 bis 7,5 5 bis 10 min lang inkubiert, danach mit Phosphatpuffer pH 6,5 bis 7,5 gewaschen, dann f) die mit glucosamindotierter Oberflache enthaltende Polymer- Verbindung zur Darstellung von Boronsauretemplate-Polymer-Verbindung mit einer Boronsaureester- Verbindung, an welche ein Templat gekoppelt ist, in Carbonat-Puffer pH 8,0 bis 9,0 5 Stunden lang inkubiert und überschüssiges Boronsaureester- Verbindung durch Waschen mit Carbonat-Puffer entfernt wird, g) anschließend die Boronsauretemplate-Polymer- Verbindung zur kompetitiven Entfernung von Cyclodextπn-Schutzgruppen mit p-Toluolsulfonsaure in aqua bidest/ EtOH in einer Mischung von 90/10 (V/V) gewaschen wird, h) anschließend wird Boronsauretemplate-Polymer- Verbindung zur Templat gesteuerten Ligandenbindung mit einer Mischung mit einer oder mehreren Verbindungen als Liganden bei pH 7,5 10 bis 24 Stunden lang bei RT inkubiert, danach mit Phosphatpuffer pH 6,5 bis 7,5 gewaschen, dann i) die Boronsauretemplate-Polymer-Liganden-Verbindung zur Darstellung Polymer- Liganden- Verbindung mit einem Bindungsort als kunstlicher Rezeptor für Templat entsprechende biologisch oder pharmakologisch wirksame Verbindungen bei pH- Wert auf 4,0 bis 5,5 die Boronsauretemplate entfernt, danach mit Citratpuffer pH 6,5 bis 7,5 gewaschen
6 Verfahren zur Bereitstellung von kunstlichen Rezeptoren an einer polymeren Verbindung nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Poly- mer- Verbindung Cellulosemembran, Glas, Kunststoffbberflache, vorzugsweise Mi- krotiterplatten, eine dendrimere Verbindung oder eine Lipidmembran verwendet wird
7 Verfahren zur Bereitstellung von kunstlichen Rezeptoren an einer polymeren Verbindung nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Verbin- düng Aminosäuren, Nukleotide, Nukleoside verwendet werden
8 Verfahren zur Bereitstellung von kunstlichen Rezeptoren an einer polymeren Verbindung nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass als Polymer-Verbindung ein Cellulosemembranfilter (Schleicher-Schull) verwendet wird
9 Verfahren zur Bereitstellung von kunstlichen Rezeptoren an einer polymeren Verbin- düng nach einem der Ansprüche 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass als Templat- Verbindung Coenzym A verwendet wird
10 Verfahren zur Bereitstellung von kunstlichen Rezeptoren an einer polymeren Verbindung nach einem der Ansprüche 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass statt
Schritt a) die Polymer- Verbindung zur Aminopropylierung nach Erhitzung auf 70 - 90° C mit methanolischer Brompropylphthalimid-Losung in Gegenwart von NaOH 60 bis 120 min lang inkubiert und dann nach Waschung mit wäßriger Essigsaure und aqua bidest getrocknet wird Verfahren zur Bereitstellung von kunstlichen Rezeptoren an einer polymeren Verbindung nach einem der Ansprüche 2 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die mit Schritt b) des Verfahrens I aktivierte Polymer- Verbindung zwecks Überprüfung der Aktivität der aktivierten Polymer-Dendrimer-Verbindung 1 bis 52 Wochen bei pH 5,5 bis 6,5 in Gegenwart von Cyclodextrin- Verbindung als Stabilisator bei RT stehengelassen wird
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