DE19839538A1 - Herstellung von maßgeschneiderten Chromatografiematerialien über intelligenten Oberflächen - Google Patents

Herstellung von maßgeschneiderten Chromatografiematerialien über intelligenten Oberflächen

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DE19839538A1
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von maßgeschneiderten Chromatografieoberflächen, wobei Dendrimer-Verbindungen auf Cellulose-Oberflächen kovalent gekoppelt werden, eine Templat-Verbindung mit Aminogruppen des Dendrimer-Restes anschließend kovalent verbunden wird, bicyclische Anhydride mit Anhydridfunktionalität und einer Kopplungsgruppe zur Kopplung an Endgruppen von dem Dendrimer-Rest sowie Substituenten mit der Reaktivität beeinflussenden Substitutenten über eine Seitenkette mit einer Aminogruppe des Dendrimer-Restes verbunden werden, polymere Verbindungen zugegeben werden und reversible mit Anhydridfunktionalitäten zu Carboxyamiden umgesetzt werden, DOLLAR A dann nach Bildung eines Supramoleküls bei alkalischem pH eine irreversible Imidbildung durchgeführt wird sowie schließlich die Templat-Verbindung durch Zugabe von disulfidspaltenden Reagenzien von dem Dendrimer-Rest abgelöst werden.

Description

Die zunehmende Komplexität und Interdisziplinität vieler wissenschaftlicher Problemstellungen lassen sich mit der partikulären Denkweise einzelner Disziplinen nicht mehr lösen. Aus diesem Grund sind wissenschaftliche Kooperationen mit Hochschulen und Industrie unerlässlich und somit Schwerpunkte unserer unternehmerischen Tätigkeit.
Das im Folgenden dargestellte neue chemische Konzept zur Erzeugung intelligenter Oberflächen ist in enger Kooperation mit Herrn Prof. Dr. Günter von Kiedrowski, Lehrstuhl Organische Chemie I der Universität Bochum, entwickelt worden.
Unser neuer Ansatz zur Herstellung effizienter chromatografischer Trenntechniken birgt das Potential, sich zu einem sehr kostengünstigen, analytischen und präparativen Instrument für die Medizin, für das Bio- und Umweltmonitoring und für die Biotechnologie zu entwickeln. Diese neuen Chromatografiematerialien sollen vor allem für biotechnologische Fragestellungen maßgeschneidert werden. Kulturüberstände von Bioreaktoren oder auch Aufschlüsse von Biomaterialien bestehen aus komplexen Substanzgemischen. Diese wässrigen Lösungen enthalten in vielen Fällen kommerziell wertvolle Metabolite, wie z. B. FADH2, NADH2, ATP, seltene Kohlenhydrate oder Coenzyme. Sehr häufig konzentriert man sich auf die Isolierung einer Verbindung oder Stoffgruppe während alle anderen Substanzklassen in vielen Fällen wegen fehlender Trenntechniken verworfen werden. Auch für die Isolierung von pharmazeutisch relevanten Molekülen, wie z. B. Taxol-Derivate aus Zellaufschlüssen von Eibenmaterial, sehen wir ein grosses Einsatzgebiet.
Die Nutzung von z. B. monoklonalen Antikörpern, Mikroorganismen, Enzymen, Rezeptoren als Erkennungsprinzip für Chromatografiematerialien ist aufgrund ungenügender Stabilität und begrenzter Verfügbarkeit sehr häufig limitiert. Darüber hinaus ist der Zeitaufwand zur Gewinnung eines spezifischen monoklonalen Antikörpers oft beträchtlich und kann mehr als ein Jahr betragen.
In der Literatur sind chemische Verfahren zur Herstellung von künstlichen Membranen bekannt, die zu molekularer Erkennung von verschiedenen organischen Molekülen, wie z. B. DNS-Bausteine, befähigt sind. Bereits 1972 wurde von G. Wulff erstmalig eine Polymerisationsmethode in Gegenwart von Templat-Molekülen entwickelt und der Begriff "Molekulares Prägen" erschaffen. Geeignete monomere reaktive Moleküleinheiten werden mit Templaten vermischt (auch kovalent verknüpft) und eine Polymerisationsreaktion mit den entsprechenden "crosslinkern" wird eingeleitet. Nach Auswaschen der Templat-Moleküle erhält man so Membranen oder Oberflächen, die Bindestellen (Hohlräume) für die Templat- Moleküle aufweisen. Inzwischen sind eine Vielzahl von Publikationen zu diesem Thema erschienen. Wir verweisen in diesem Zusammenhang auf einen sehr schönen Übersichtsartikel von G. Wulff /1/.
Unser neues Konzept unterscheidet sich grundlegend von dieser Vorgehensweise. Während die oben beschriebene "Imprinting-Methode" nur irreversible Reaktionsschritte (Ausbildung der verschiedenen Bindestellen) enthält, erlaubt unser System reversible chemische Prozesse, die, im Gegensatz zur bekannten Methode, unter milden physiologischen Bedingungen ablaufen können. Es handelt sich hier also um ein "Reversibles Imprinting". Auch werden keine reaktiven monomeren Bausteine, wie z. B. Methacrylsäure, verwendet, sondern es steht ein unerschöpflicher Pool von natürlichen oder synthetischen chemischen Verbindungen, wie z. B. Aminosäuren, Oligopeptide oder Nukleotide, als potentielle Liganden zur Verfügung.
Das besondere hierbei ist, dass es sich um selbstoptimierende, supramolekulare Erkennungssysteme handelt. Die molekularen Wechselwirkungen zwischen den interagierenden Spezies sind zunächst grundsätzlich reversibel und treten in Konkurrenz zueinander. Erst durch diese essentielle Randbedingung kann sich das gesamte supramolekulare Erkennungssystem den strukturellen Gegebenheiten anpassen und sich ständig weiter verbessern. Nach einer (beliebig langen) Optimierungsphase werden dann durch einen sehr schonenden chemischen Prozess die supramolekularen Netzwerke fixiert. Auf diese Weise können höher organisierte chemische Systeme mit - vom Wissenschaftler vorgegebenen - spezifischen Erkennungseigenschaften gebildet werden.
Das im Folgenden dargestellte chemische Konzept zur Erzeugung intelligenter Oberflächen ist ein neuer Ansatz zur Herstellung effizienter chromatografischer Trenntechniken. Er birgt das Potential, sich zu einem sehr kostengünstigen, analytischen und präparativen Instrument für die Medizin, für das Bio- und Umweltmonitoring und für die Biotechnologie zu entwickeln. Diese neuen maßgeschneiderten Chromatografiematerialien sollen vor allem zur Isolierung von wertvollen Metaboliten und Wirkstoffen aus komplexen Substanzgemischen eingesetzt werden.
Dieses "TAO"-Verfahren beinhaltet folgende Kernpunkte (TAO = Template-Assisted Optimization):
  • - Verwendung von Oberflächen als Kompartimente für die supramolekularen Systeme.
  • - Design und kontrollierte chemische Immobilisierung von Templat-Molekülen.
  • - Belegung der Oberfläche mit reaktiven funktionellen Gruppen, die reversible kovalente Fixierung von geeigneten Liganden unter physiologischen Bedingungen ermöglichen. Unterschiedliche Liganden können so um eine geeignete Bindestelle konkurrieren.
  • - Zugabe von monomeren oder oligomeren Bausteinen (z. B. Aminosäuren oder deren Derivate), die reversible chemische Reaktionen mit den zuvor fixierten reaktiven funktionellen Gruppen eingehen können. Einstellung der Ordnungsparameter pH, Temperatur und Zeit zur optimalen konkurrierenden Besiedlung der mit ausgewählten Templaten dotierten Oberfläche. Jetzt beginnt die Optimierungsphase zur Ausbildung der nicht-kovalenten Netzwerke zur optimalen Anordnung um die Template: Ausbildung höher organisierter Systeme. Je stärker die Interaktion zwischen den Templaten und Liganden ausgebildet wird, desto länger ist ihre Verweildauer im supramolekularen Verband. Die reversiblen chemischen Reaktionen können so gewählt werden, dass kooperative Effekte (nicht kovalente Wechselwirkungen) einen starken Einfluss auf die reaktionskinetischen Parameter ausüben können. Die Bindungs- und Abspaltungsgeschwindigkeiten der Liganden werden durch das supramolekulare Netzwerk gesteuert.
  • - Chemische Fixierung der Liganden durch einen gezielten und schonenden chemischen Reaktionsschritt.
  • - Ablösung der Template durch einen weiteren chemoselektiven Schritt liefert künstliche, auf der Oberfläche verteilte Rezeptoren.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von maßgeschneiderten Chromatografieoberflächen, wobei Dendrimer-Verbindungen auf Cellulose-Oberflächen kovalent gekoppelt werden, eine Templat-Verbindung mit Aminogruppen des Dendrimer- Restes anschließend kovalent verbunden wird, bicyclische Anhydride mit Anhydridfunktionalität und einer Kopplungsgruppe zur Kopplung an Endgruppen von dem Dendrimer-Rest sowie Substituenten mit die Reaktivität beeinflussenden Substitutenten über eine Seitenkette mit einer Aminogruppe des Dendrimer-Restes verbunden werden, polymere Verbindungen zugegeben werden und reversibel mit Anhydridfunktionalitäten zu Carboxyamiden umgesetzt werden,
dann nach Bildung eines Supramoleküls bei alkalischem pH eine irreversible Imidbildung durchgeführt wird sowie schließlich die Templat-Verbindung durch Zugabe von disulfidspaltenden Reagenzien von dem Dendrimer-Rest abgelöst werden.
Das folgende Schaubild (Abb. 1) soll schematisch und daher in sehr vereinfachter Form das "TAO"-Prinzip verdeutlichen:
Stufe A: Gezielte Fixierung der Templat-Moleküle an der Oberfläche.
Stufe B: Zugabe unterschiedlicher Liganden, die sich unter den Inkubationsbedingungen reversibel kovalent um die Templat-Moleküle anordnen können. Diese Immobilisierungsschritte sind streng reversibel und somit wird eine wichtige Konkurrenzsituation geschaffen. Diese Stufe kann man als Optimierungsphase bezeichnen. Die hervorgehobenen Striche symbolisieren die optimierte, supramolekulare Interaktion. Je optimaler die nicht-kovalente Interaktion, desto länger ist die Verweildauer der entsprechenden Liganden an der Oberfläche. Es kann durchaus die Situation entstehen, dass eine bestehende optimale Interaktion durch die Bindung eines weiteren Liganden suboptimal wird und dieser Ligand dann durch einen anderen ersetzt werden muss, um eine stärkere Wechselwirkung im Verband zu schaffen. Hier wird deutlich, dass die Ligandenpopulation individuelle Wechselwirkungen beeinflusst oder determiniert.
Stufe C: Nach abgeschlossener Optimierung erfolgt eine chemische Stabilisierung der Liganden. Mit diesem Schritt wird der dynamische Prozess irreversibel gestaltet. Diese chemische Fixierung des Ligandenarrangements ist eine wesentliche Vorbedingung für die Konstruktion künstlicher Rezeptoren.
Stufe D: Nach der chemischen Fixierung der Liganden werden die Template gezielt entfernt und man erhält eine Oberfläche, in der künstliche Rezeptoren eingebettet sind. Diese maßgeschneiderte Oberfläche ist als ein optimiertes Supramolekül aufzufassen, in dem einzelne Rezeptoren verteilt sind.
Im Gegensatz zur "Imprinting Methode" von G. Wulff wird bei unserem Verfahren eine Oberfläche als Anker für den dynamischen Imprintingprozess benutzt. Es kommen alle Oberflächen in Frage, die eine Funktionalisierungschemie gestatten, wie z. B. Zellulosemembranen, Glas, funktionalisierte Kunststoffe oder Goldoberflächen. Auch der Auswahl von Größe und Form der Oberflächenstrukturen sind keine Grenzen gesetzt. Es können planare Oberflächen, Beads, kolloidales Gold, Nanopartikel oder Oberflächen von Dendrimerstrukturen als Kompartiment benutzt werden. Wir vermuten, dass Mikrostrukturen mit konkaven oder konvexen Kavitäten an Oberflächen eine besondere Bedeutung bei dieser Methode erlangen können. Es muss betont werden, dass die benutzte Oberfläche für das "reversible Imprinting" mehr als nur eine Trägerfunktion besitzen kann. Es ist denkbar, diese Methode auf (in) Lipidmembranen, wie z. B. Liposomen, einzusetzen. Hier üben die hydrophoben Einflüsse sicherlich eine dominierende Rolle bei einem dynamischen Imprintingprozess aus.
Wege zur chemischen Realisierung 1. Oberflächenchemie
Für die gezielte Verankerung von Matritzenmolekülen, sowie von reaktiven zu reversiblen chemischen Reaktionen befähigten Gruppen, an Oberflächen, wie z. B. Zellulose, sind inzwischen geeignete, sehr schonende Verfahren entwickelt worden. Mit Hilfe dieser neuen Methoden ist es zunächst möglich, Aminofunktionalitäten in kontrollierter Weise auf (Zellulose)oberflächen zu erzeugen /2/.
Für die gezielte Verankerung von Funktionalitäten, Liganden und Biomolekülen mit den vorher eingeführten Aminogruppen ist ein sehr schonendes und bisher nicht bekanntes Kopplungsverfahren erarbeitet worden. Diese Methode erlaubt, neben einer stabilen Verankerung von Proteinen und Liganden auf Membranen, auch die chemische Veränderung der Oberflächeneigenschaften der Membranen mit geeigneten chemischen Verbindungen. Auf diese Weise ist es möglich, die biochemischen, immunchemischen oder enzymatischen Reaktionen oder Aktivitäten zu modulieren und so maßgeschneiderte Membranen herzustellen /3-5/.
Diese erarbeitete Methode erlaubt auch in schonender Weise Dendrimere /6/ auf Oberflächen zu immobilisieren. Wir haben diese hochverzweigten Moleküle als Oberfläche für den dynamischen Imprintingprozess ausgewählt, da Verzweigungsgrad und Generation dieser inzwischen kommerziell erhältlichen Makromoleküle die Anzahl und Dichte der funktionellen Gruppen an der Oberfläche des Dendrimers bestimmen. Abb. 2 zeigt beispielhaft irrmobilisierte Dendrimere auf Oberflächen. Das "D" repräsentiert das Dendrimermolekül, auf dem 63 Aminogruppen verteilt sind. Diese noch verbleibenden Aminogruppen (eine Aminogruppe wird für die Verküpfung mit der Oberfläche benutzt) können für die Immobilisierung der Templatmoleküle bzw. der funktionellen Gruppen für die reversible Ligandenanbindung eingesetzt werden. Wir synthetisieren z.Zt. auf Zellulose immobilisierte Dendrimere, die an den Aminogruppen mit ionenspezifischen Liganden funktionalisiert sind, um hochkapazitive, ionenselektive Membranen herzustellen /7/.
2. Reversible chemische Ligandenaustauschreaktionen und irreversibler Reaktionsschritt zur Fixierung des Ligandenarrangements
Eine essentielle Bedingung zur Verwirklichung unseres Konzeptes zu selbstoptimierenden supramolekularen Strukturen ist die Möglichkeit zur kontrollierten, reversiblen chemischen Reaktionsführung. Wir halten schon seit geraumer Zeit neuartige reaktive Schutzgruppen für Amine in Händen, die dazu entwickelt wurden, um neue Prodrugs für die Chemotherapie maligner Tumoren herzustellen /8-10/. Das besondere an diesen Strukturen ist die Möglichkeit, durch Auswahl von Schlüsselsubstituenten die Reaktionsfähigkeit zu modulieren /11/. Die Abb. 3 zeigt diese neue Verbindungsklasse hochsubstituierter bicyclischer Anhydride. Für Einzelheiten sei auf die Publikation verwiesen /11/. Diese bicyclischen, rigiden chemischen Strukturen bestehen aus drei wichtigen Strukturelementen:
  • 1. aus einer Anhydridfunktionalität,
  • 2. aus ausgewählten Substituenten, die einen kontrollierten Einfluss auf die Reaktivität ausüben,
  • 3. aus einer Kopplungsgruppe, die eine chemoselektive Verknüpfung mit den Endgruppen des Dendrimers erlaubt.
Wir konnten zeigen /9, 11/, dass diese neuartigen Anhydride mit Aminen unter physiologischen Bedingungen reversibel zu Carboxyamiden umgesetzt werden können. Überraschenderweise stellten wir fest, dass bei pH 6-7 das Anhydrid und nicht die Dicarbonsäure als reaktive chemische Spezies in Wasser dominiert. Es ist bekannt /12/, dass Amide unter physiologischen Bedingungen Hydrolysehalbwertszeiten im Bereich von 7 Jahren aufweisen. Wir können durch systematische Variation der Molekülarchitektur, nach Art eines Baukastensystems, ein grosses Spektrum von Halbwertszeiten maßschneidern, die von wenigen Sekunden bis hin zu Tagen reichen /11/. Diese große Reaktivitätsvielfalt der unterschiedlichen substituierten bicyclischen Carboxyamide ermöglicht die Auswahl geeigneter Funktionalitäten. für ein reversibles Imprintingverfahren. Wir konnten inzwischen mit einfachen kinetischen Experimenten zeigen, dass die Reaktion zum Carboxyamid unter physiologischen Bedingungen reversibel verläuft /7/. Die Lage des Gleichgewichtes kann durch die Temperatur, Konzentration der Liganden und pH-Wert beeinflusst werden.
Die Möglichkeit der gezielt reversiblen Reaktionsführung ist eine notwendige, aber nicht hinreichende Bedingung für die Realisierung unseres Konzeptes. Ein weiterer Schritt, nämlich die chemische Fixierung des Ligandenarrangements, ist notwendig, um physikalisch-chemisch stabile Rezeptoren zu generieren. Erst in jüngster Zeit /7/ entdeckten wir einen weiteren Reaktionsweg der bicyclischen Carboxyamide. Wird der pH-Wert der wässrigen Lösung auf 8.5 bis 9.5 angehoben, setzt eine irreversible Imidbildung ein. Ausserdem wird unter diesen Bedingungen die Rückreaktion zum Anhydrid gestoppt und es können keine Liganden mehr abgespalten werden. In Abb. 4 ist diese Reaktionsfolge beschrieben. Diese so gebildeten Imide sind unter physiologischen Bedingungen stabil.
3. Zusammenfügen aller Komponenten
Abb. 5 soll zusammenfassend das Prinzip des reversiblen Imprintings an einem möglichen chemischen Konstrukt deutlich machen. Das Templatmolekul wird zunächst unter kontrollierten Bedingungen mit dem Dendrimer kovalent verknüpft. Die Chemie ist so gewählt, dass nach erfolgter Fixierung des Ligandenarrangements eine gezielte Abspaltung, z. B. durch Mercaptoethanol, möglich wird. Die bicyclischen Anhydride werden über eine Seitenkette gezielt mit den noch verbleibenden Aminogruppen stabil verknüpft. Dann können Liganden z. B. Aminosäuren, Oligopeptide und Peptidfragmente) mit den Anhydridfunktionalitäten reversibel zu Carboxyamiden reagieren. Die Reaktionsbedingungen hierfür sind so zu wählen, dass kooperative Effekte zwischen Liganden und Templaten (und zwischen den verschiedenen Liganden) das reaktionskinetische Netzwerk zur Bildung des thermodynamisch stabilsten Ligandenarrangements veranlassen können. Nach erfolgter Formierung des Supramoleküls wird dann durch einen pH-Schift auf 8.5-9.5 die Imidbildung eingeleitet (s. Abb. 4). Schließlich können mit disulfidspaltenden Reagenzien die Template von der Dendrimeroberfläche abgelöst werden.
Das neue Verfahren ist in mehrere Abschnitte zu unterteilt und umfaßt
Arbeitspaket 1: Nachweis, dass dieses neue Verfahren für komplexe Moleküle prinzipiell geeignet ist. Es soll an den zwei unterschiedlichen Substanzklassen Taxol und Coenzym A getestet werden.
Zeitbedarf: ca. 12 mm
Arbeitspaket 2: Erprobung und Optimierung dieses Erkennungssystems mit Zellkulturüberständen bzw. Zellaufschlüssen.
Zeitbedarf ca. 6 mm
Arbeitspaket 3: Erstellung eines Prototyps zur Isolierung von Coenzym A bzw. Taxol im Millimolmaßstab und Stabilitätsuntersuchungen
Zeitbedarf ca. 6 mm
Arbeitspaket 4: Übertragung auf industrielle Maßstäbe zur Isolierung der Metabolite im Molmengenbereich.
Zeitbedarf ca. 12 mm
Literaturverzeichnis
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/12/ D. Kahne, W. C. Still. Hydrolysis of a Peptide Bond in Neutral Water. J. Am. Chem. Soc. 110, 1988, 7529.

Claims (1)

  1. Verfahren zur Herstellung von maßgeschneiderten Chromatografieoberflächen,
    wobei Dendrimer-Verbindungen auf Cellulose-Oberflächen kovalent gekoppelt werden, eine Templat-Verbindung mit Aminogruppen des Dendrimer-Restes anschließend kovalent verbunden wird,
    bicyclische Anhydride mit Anhydridfunktionalität und einer Kopplungsgruppe zur Kopplung an Endgruppen von dem Dendrimer-Rest sowie Substituenten mit die Reaktivität beeinflussenden Substitutenten über eine Seitenkette mit einer Aminogruppe des Dendrimer-Restes verbunden werden,
    polymere Verbindungen zugegeben werden und reversibel mit Anhydridfunktionalitäten zu Carboxyamiden umgesetzt werden,
    dann nach Bildung eines Supramoleküls bei alkalischem pH eine irreversible Imidbildung durchgeführt wird sowie
    schließlich die Templat-Verbindung durch Zugabe von disulfidspaltenden Reagenzien von dem Dendrimer-Rest abgelöst werden.
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