DE4436173C1

DE4436173C1 - Hydrophob modifizierte Matrixoberflächen zur Immobilisierung von Proteinen und Lipiden

Info

Publication number: DE4436173C1
Application number: DE19944436173
Authority: DE
Inventors: Thomas Stein
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1994-10-10
Filing date: 1994-10-10
Publication date: 1996-09-05
Anticipated expiration: 2014-10-11

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine hydrophob modifizierte Matrixoberfläche, die sich zur Immobilisierung von Proteinen und Lipiden eignet, sowie ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Matrixoberfläche.

Auf dem Gebiet der Untersuchung von Protein-Protein-, Protein-DNA- oder Lipid- Protein-Wechselwirkungen kommt es oft darauf an, die zu untersuchenden Molekü le an eine Oberfläche zu immobilisieren. Dabei handelt es sich z. B. um die Ober fläche von Biosensoren oder um Gele. Die Immobilisierung kann durch chemische Modifikation der Moleküle oder durch Bindung an einen geeigneten Antikörper geschehen. Nachteilig daran ist, daß die chemischen Immobilisierungsmethoden meist harte Reaktionsbedingungen erfordert und im allgemeinen zu einer wahllosen Orientierung der zu untersuchenden Moleküle auf der Oberfläche führen. Die Immo bilisierungsmethode durch Antikörper erfordert das Vorhandensein eines geeigne ten Epitops auf dem zu untersuchenden Molekül. Dabei hat die chemische Modifi kation den Nachteil, daß sie zu einer nicht mehr rückgängig zu machenden In aktivierung des zu untersuchenden Moleküls führt, indem z. B. bei Proteinen die aktiven Stellen blockiert oder modifiziert werden. Andere bekannte Verfahren zum Binden der zu untersuchenden Moleküle an Oberflächen werden z. B. von der Firma PHARMACIA angeboten. Dabei sind zu nennen:

- direkte Carbodiimid/N-Hydroxysuccinimid-Kopplung
- Biotin-Avidin-Kopplung
- Kopplung über Sulfhydrylreste mittels 2(2-Pyridinyldithio)ethanamin
- Kopplung über Aldehydgruppen an Zuckerresten mittels Hydrazin oder Carbohydrazid.

Auch diese Verfahren haben den Nachteil, daß teilweise Reaktionsbedingungen angewendet werden müssen, die das zu untersuchende Molekül irreversibel verändern und die Untersuchung beeinflussen.

BIOSIS-Referat 93: 117076 beschreibt Träger mit hydrophoben Liganden, wie aliphatische Ketten, aromatische oder alicyclische Komponenten, an die Lipase gebunden wird. Die Immobilisierung erfolgt zum Zwecke der Durchführung hydro phober Chromatographie.

WO 89/08257 beschreibt, daß Carrier (z. B. Agarosederivate) Liganden mit folgen den Strukturen kovalent gebunden enthalten: X-S, X-CH₂-S, X-CH₂-NR-, wobei X u. a. ein isocyclisches Ringsystem mit Π-Elektronen ist, oder -SO₂-CH₂-CH₂-Y, wobei Y u. a. eine Alkylgruppe ist.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, hydrophile Matrix oberflächen so zu modifizieren, daß daran Lipide oder Proteine unter schonenden Bedingungen immobilisiert werden können.

Erfindungsgemäß wird dies durch eine modifizierte Matrixoberfläche gemäß An spruch 1 erreicht.

Unter der Matrixoberfläche ist z. B. ein Gel aus einer gelbildenden hydrophilen Substanz oder eine hydrophile Biosensoroberfläche zu verstehen. Bevorzugt wird die Oberfläche aus aktiviertem Dextran, Cellulose oder Agarose, ganz bevorzugt Carboxymethyldextran, Carboxymethylcellulose, Adipinsäuredihydrazid-Agarose, m-Aminobenzyloxymethylcellulose, Aminoalkyldextran, Cyanbromid-aktivierter Sepharose oder Cyanbromid-aktivierter Agarose oder Epoxid-aktivierter Sepharose gebildet.

Die Modifikation der Matrixoberfläche erfolgt durch die kovalente Bindung mittel langer hydrophober Kohlenstoffketten mit C₄-C₁₂ oder von cycloaliphati schen bzw. cycloaromatischen Systemen, wie z. B. Phenylgruppen oder Cyclo hexylgruppen, in üblicher Weise, z. B. an aktivierte Gruppen (z. B. aktivierte Carbox ylgruppen) der Matrix. Ganz bevorzugt ist die Bindung von Alkylaminen, insbeson dere Hexyl-, Heptyl-, Octyl- oder Nonylaminen an die Matrixoberfläche. Bei der Matrixoberflächen-modifizierenden Verbindung handelt es sich um photochemi sche Crosslinker. Die Matrix-modifizierenden Verbindungen mit den zu bindenden Kohlenstoffketten werden in einem beliebigen Puffer mit pH 6-9 gelöst und in Konzentrationen von 10 mM bis 3 M, bevorzugt 500 mM bis 2 M, ganz bevorzugt 1 M eingesetzt.

An die modifizierte Oberfläche kann nun unter üblichen milden Bedingungen, wie neutraler pH-Wert und in Gegenwart von 100-500 mM Salz, ein zu untersuchen des Molekül, z. B. ein Protein oder ein Lipid, binden und wird dabei immobilisiert. Für die Bindung in Frage kommen bei z. B. Proteinen transmembrane Regionen und Lipid anker, und bei Lipiden aliphatische Reste.

Die Bindung des zu untersuchenden Moleküls ist kovalent, wenn als Matrixoberflächen-modifizierende Verbindung photochemische Crosslinker einge setzt wurden. Um das zu untersuchende Molekül kovalent an die modifizierte Matrixoberfläche zu binden, eignen sich alle photochemischen Crosslinker, die nach der lichtinduzierten Reaktion Nitrene oder Carbene bilden. Die kovalente Bindung des zu untersuchenden Moleküls kommt über zwei Schritte zustande, zuerst hydrophobe Wechselwirkung mit dem hydrophoben Teil des Crosslinkers, dann lichtinduzierte Verknüpfungsreaktion. Beispiele für den photochemischen Crosslinker sind:

Vorzugsweise können die Kohlenstoffketten an den Crosslinkern bis zu 3 Kohlen stoffatomen kürzer oder länger sein.

Hat die Immobilisierung des zu untersuchenden Moleküls über kovalente Bindung mittels eines Crosslinkers an die Matrixoberfläche stattgefunden, kann danach auch mit Detergenz-haltigen Puffersystemen gearbeitet werden, ohne daß es zu einer Loslö sung des immobilisierten Moleküls kommt.

Des weiteren kennt der Fachmann Prinzipien, um Reaktionspartner und -bedingun gen, wie Alkylkettenlänge, Alkylkettendichte, Puffer, pH und Konzentrationen von Lösungen, zu optimieren. Er wird hierzu z. B. auf das Wissen über die bekannte HIC (Hydrophobic Interaction Chromatography) zurückgreifen.

Erfindungsgemäße Matrixoberflächen zeichnen sich dadurch aus, daß Proteine oder Lipide unter milden Bedingungen gebunden werden können und dadurch an die Matrixoberfläche immobilisiert werden. Die Aktivität und Struktur der gebundenen Moleküle werden dabei nicht beeinträchtigt. Eine Untersuchung der Moleküle, ins besondere ihrer Wechselwirkungen mit anderen Stoffen, ist somit bestens möglich.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 (Referenz) Herstellung einer erfindungsgemäßen Matrixoberfläche und ihre Verwendung

Es wird ein BlAcore-Meßgerät eingesetzt und gemäß des BlAcore Betriebs-Manuals (Pharmacia) verfahren.

Des weiteren werden folgende Schritte durchgeführt:

1) Einsetzen und optisches Normalisieren des Carboxymethyldextran-Matrixchips von Pharmacia (Standard-Verfahren)
2) Aktivieren der Carboxylgruppen des Carboxymethyldextran-Matrixchips mit einem 7minütigen Puls eines EDC/NHS-[N′-3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbo diimid Hydrochlorid/N-Hydroxysuccinimid)-Gemisches bei einer Flußgeschwin digkeit von 5 µl/ml
3) Herstellen einer hydrophoben Matrix: Reaktion aktivierter Carboxylgruppen mit einem 7minütigen Puls von 1 M Heptylamin, pH 8,5
4) Regenerieren der Matrix: Waschen der hydrophob veränderten Matrix mit drei zweiminütigen Pulsen von 0,5% SDS
5) Durchspülen des Systems mit einem Puffer, enthaltend 10 mM HEPES (pH 7,4) und 3,4 mM EDTA
6) Immobilisieren des Lipid-verankerten Zelladhäsionsmoleküls CsA in einem 25 minütigen Puls bei einer Konzentration von 100 µg/ml in einem 10 mM HEPES- Puffer (pH 7,4), enthaltend 3,4 mM EDTA und 250 mM NaCl.
7) Nachweisen des immobilisierten Zelladhäsionsmoleküls CsA durch einen gegen CsA gerichteten Antikörper (Standard-Verfahren).

Eine Optimierung der Alkylkettendichte kann durch Verändern der EDC/NHS- Pulslänge gesteuert werden, und zwar im Bereich von 1-50 Minuten mit einem bis fünf Pulsen. Ferner kann das Regenerationsreagenz ionisch oder nicht-ionisch mit einer hohen oder niedrigen CMC (critical micelle concentration) sein. Desweiteren kann der Puffer von Schritt 5 auch stabilisierende Agentien (z. B. ATP) Inhibitoren oder Komplexbildner enthalten.

Beispiel 2

Das obige Beispiel 1 wird für die Modifikation der Oberfläche durch einen photo chemischen Crosslinker wie folgt abgeändert:

1) wie in Beispiel 1
2) wie in Beispiel 1
3) Herstellen einer hydrophoben Matrix: Reaktion aktivierter Carboxylgruppen mit einem 7minütigen Puls einer Lösung eines der oben gezeigten Crosslinker in einem Standardpuffer (10-100mM)
4) fällt weg
5) wie in Beispiel 1
6) wie in Beispiel 1
7) 5minütige Belichtung mit UV-Licht (250-370 nm)
8) wie Schritt 7 in Beispiel 1

Beispiel 3

Im folgenden Beispiel wird eine 8 mm × 8 mm × 100 nm große Carboxymethyl dextran-Oberfläche eines CM5-Biosensor-Chips (Pharmacia) mit einem photoakti vierbaren Crosslinker (Perfluorphenylamin mit einem Hexylspacer (PFPA)) modifi ziert. Das Membranprotein (CsA) wird in diesem Beispiel kovalent an PFPA über seinen Lipidanker gebunden. Alle Flüssigkeitsvolumina sind 50 bis 100 µl und alle Schritte bis zur Bestrahlung (Schritt 9) sollten in einem verdunkelten Raum statt finden.

1) Aktivieren der Carboxylgruppen der Carboxymethyldextranmatrix mit einem EDC/NHS-Gemisch (200 mM/50 mM) für 7 Minuten
2) 3-5maliges Waschen der Oberfläche mit Wasser
3) Herstellen der hydrophoben, photoaktiven Matrix: Reaktion der aktivierten Carboxylgruppen mit PFPA-Lösung für 7 Minuten. Die PFPA-Lösung wird herge stellt durch Mischen von 10 µl PFPA-Stammlösung (300 mM in DMSO), 20 µl Methanol und 70 µl Wasser.
4) 3-5maliges Waschen der Oberfläche mit 50% wäßrigem Methanol, dann 3-5 mal mit Wasser
5) Quenchen der verbliebenen aktivierten Carboxylgruppen mit 1 M Heptylamin, pH 8,5, für 7 Minuten
6) 3-5maliges Waschen mit einem Detergenz-freien Puffer (z. B. 10 mM HEPES, pH 7,4, enthaltend 100-500 mM NaCl)
7) Hydrophobes Immobilisieren von CsA: Inkubieren der hydrophob modifizierten Oberfläche mit CsA (10-100 µg/ml Puffer von Schritt 6) für 5 Minuten - 4 Stunden
8) 3-5maliges Waschen der Oberfläche mit Detergenz-freiem Puffer (gleicher wie in Schritt 6)
9) Kovalentes Binden von hydrophob gebundenem CsA: 5minütige Einwirkung von UV-Licht (250-370 nm) auf die Matrix
10) Falls die Oberfläche in einem Biosensor-Instrument verwendet werden soll, Einsetzen des Chips in das Instrument und Äquilibrieren der Oberfläche mit einem Standardpuffer (kann Detergenz enthalten, da das Protein inzwischen kovalent an die Matrix gebunden ist).
Durchführen von Regenerationsschritten: z. B. drei 1 Minuten Pulse von 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 11)

Die obige Modifikationsmethode ist auch für Gelmaterialien (z. B. Dextran, Cellulo se, Agarose) anwendbar. Es ist auch denkbar, andere Aktivierungsmethoden für die zu modifizierende Oberfläche anzuwenden.

Claims

1. Hydrophob modifizierte Matrixoberfläche mit kovalent daran gebundenen C₄- C₁₂-Kohlenstoffketten oder cycloaliphatischen bzw. cycloaromatischen Systemen, wobei zur hydrophoben Modifizierung der Matrixoberfläche photochemische Crosslinker eingesetzt werden, die bei Bestrahlung Carbene oder Nitrene bilden.

2. Matrixoberfläche nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Biosensoroberfläche handelt.

3. Matrixoberfläche nach Anspruch 1 der 2, dadurch gekennzeichnet, daß Hexyl-, Heptyl-, Octyl- oder Nonylamin eingesetzt werden, um die Matrix oberfläche hydrophob zu modifizieren.

4. Matrixoberfläche nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Cross linker folgende Struktur haben:

5. Verfahren zur Herstellung der Matrixoberfläche nach Anspruch 1, umfas send die kovalente Bindung von C₄-C₁₂-Kohlenstoffketten oder cycloaliphati schen bzw. cycloaromatischen Systemen an eine hydrophile Matrixober fläche unter Verwendung photochemischer Crosslinker in üblicher Weise.

6. Verwendung der Matrixoberfläche nach einem der Ansprüche 1-4 zur Immo bilisierung von Proteinen oder Lipiden.