DE4341524A1 - Verfahren zur Immobilisierung von Biomolekülen und Affinitätsliganden an polymere Träger - Google Patents

Verfahren zur Immobilisierung von Biomolekülen und Affinitätsliganden an polymere Träger

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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Immobilisierung von Biomolekülen wie z. B. Enzymen, monoklonalen und polyklonalen Antikörpern, Zellen, Zellorganellen und Gewe­ beschnitten sowie Affinitätsliganden an eine Vielzahl von verschiedenen polymeren Trägern. Die chemischen Bindungen zwi­ schen den Trägern und den Liganden sind amidähnliche Bindungen mit einer überraschend hohen Stabilität. Eine Voraussetzung für diese Verknüpfung ist, daß sowohl der polymere Träger als auch der Ligand primäre oder sekundäre aliphatische Aminogruppen bzw. aromatische Aminogruppen enthält. Ein weiterer, neben der hohen Stabilität der Bindung hervorzuhebender Vorteil gegenüber gän­ gigen Immobilisierungsmethoden ist die sehr schonende Kopplungs­ chemie, die es überraschenderweise erlaubt, gezielt z. B. nur periphere Aminogruppen von Proteinen für die Verknüpfung einzu­ setzen. Im Vergleich zu bisher bekannten Techniken führt die erfindungsgemäß angewandte neue Immobilisierung auch z. B. zu einer wesentlichen Stabilisierung vieler immobilisierter Makro­ moleküle wie Immunglobuline oder Enzyme, so daß diese vor Denaturierung zum Teil geschützt sind. Die chemischen "Linker", die zwei Aminogruppen miteinander verbinden, sind Derivate der Quadratsäure (Formel (I)). Es ist bekannt (A.H. Schmidt, Synthesis, 1980, 961, K.-H. Glüsenkamp et al., Z. Naturforsch. C 1991, 46, 498, L.F. Tietze et al., Chem. Ber. 1991, 124, 1215.), daß z. B. Quadratsäurediethylester in einer Zweistufenreaktion mit Aminen zu Diamiden umgesetzt werden kann. Völlig neu ist aber der Einsatz dieses Reagenz zur Immobilisierung von aminogruppen-tragenden Molekülen an polymere, Matrices, die ebenfalls mit Aminogruppen versehen sein müssen, wobei die Reste der allgemeinen Formel (I) R¹, R², A, B, PL und PM die in der Beschreibung angegebene Bedeutung haben.
Die Erfindung betrifft Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
wo
R¹ und R² gleich oder verschieden sind und für Wasserstoff, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen oder für geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 8 Kohlen­ stoffatomen stehen, das gegebenenfalls durch Halogen, oder geradkettiges oder verzweigtes Alkoxy mit bis zu 6 Kohlenstoff­ atomen oder Hydroxy substituiert ist,
für Phenyl oder Benzyl steht, das gegebenenfalls durch Halogen, Nitro, Cyano, Carboxy, geradkettiges oder verzweigtes Alkyl, Alkoxy, Acyl oder Alkoxycarbonyl mit jeweils bis zu 6 Kohlen­ stoffatomen oder durch eine Gruppe der Formel -NR³R⁴ substituiert ist,
worin
R³ und R⁴ gleich oder verschieden sind und Wasserstoff oder geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoff­ atomen bedeuten,
A für Sauerstoff oder für Schwefel steht,
B für Sauerstoff oder für Schwefel steht,
PL
in Abhängigkeit von der jeweiligen Bedeutung von PM
für ein
Enzym steht, wie z. B. alkalische Phosphatase, β-Galactosidase, T4 PN Kinase, Horseradish Peroxidase, Phospholipase C oder z. B. Proteinasen wie Papain, Pepsin, Proteinase K, Carboxypeptidase, Endoproteinase Arg-C, Bromelain, Collagenase, Dipeptidyl Pepti­ dase IV, oder Nucleasen wie z. B. RNase A, RNase T1, RNase T2, DNase I, Bal 31, oder Oxidasen wie z. B. Alkohol Oxidase, Glucose Qxidase, oder Esterasen wie z. B. Phosphodiesterase I und II, oder Glucosidasen wie z. B. β-Glucoronidase, Heparinase I, oder Lektine wie z. B. Concanavalin A
oder
für Protein A
oder Protein G steht
oder für Immunglobuline vom Typ IgM, IgG, IgE, IgA und deren Fragmente steht
oder für andere mit Aminogruppen funktionalisierte Verbindungen wie z. B. verschiedene Aminocyclodextrine steht,
PM
für eine mit kovalent gebundenen primären oder sekundären Aminogruppen tragende beliebige natürliche oder synthetische wasserlösliche oder wasserunlösliche Matrix in verschiedenen Ausführungsformen (Teströhrchen, Microtiterplatten, Objektträ­ ger, Beads), die z. B. aus Cellulose, Polystyrol, Polypropylen, Polycarbonat oder Glas bestehen kann,
oder auch für verschiedene Zellen, Zellorganellen und Gewebe­ schnitte stehen kann.
Die Erfindung betrifft bevorzugt Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
wo
R¹ und R² gleich oder verschieden sind und für Wasserstoff, Cycloalkyl mit 3 bis 4 Kohlenstoffatomen oder für geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlen­ stoffatomen stehen, das gegebenenfalls durch Halogen, oder geradkettiges oder verzweigtes Alkoxy mit bis zu 4 Kohlenstoff­ atomen oder Hydroxy substituiert ist,
für Phenyl oder Benzyl steht, das gegebenenfalls durch Halogen, Nitro, Cyano, Carboxy, geradkettiges oder verzweigtes Alkyl, Alkoxy, Acyl oder Alkoxycarbonyl mit jeweils bis zu 4 Kohlen­ stoffatomen oder durch eine Gruppe der Formel -NR³R⁴ substituiert ist,
worin
R³ und R⁴ gleich oder verschieden sind und Wasserstoff oder geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 4 Kohlenstoff­ atomen bedeuten,
A für Sauerstoff oder für Schwefel steht,
B für Sauerstoff oder für Schwefel steht,
PL
in Abhängigkeit von der jeweiligen Bedeutung von PM
für ein
Enzym steht, wie z. B. alkalische Phosphatase, β-Galactosidase, T4 PN Kinase, Horseradish Peroxidase, Phospholipase C oder z. B. Proteinasen wie Papain, Pepsin, Proteinase K, Carboxypeptidase, Endoproteinase Arg-C, Bromelain, Collagenase, Dipeptidyl Pepti­ dase IV, oder Nucleasen wie z. B. RNase A, RNase T1, RNase T2, DNase I, Bal 31, oder Oxidasen wie z. B. Alkohol Oxidase, Glucose Oxidase, oder Esterasen wie z. B. Phosphodiesterase I und II, oder Glucosidasen wie z. B. β-Glucoronidase, Heparinase I, oder Lektine wie z. B. Concanavalin A
oder
für Protein A
oder für Protein G steht,
oder für Immunglobuline vom Typ IgM, IgG, IgE, IgA und deren Fragmente steht,
oder für andere mit Aminogruppen funktionalisierten Verbindungen wie z.B verschiedene Aminocyclodextrine,
PM
für eine mit kovalent gebundenen primären oder sekundären Aminogruppen tragende beliebige natürliche oder synthetische wasserlösliche oder wasserunlösliche Matrix in verschiedenen Ausführungsformen (Teströhrchen, Microtiterplatten, Objektträ­ ger, Beads), die z. B. aus Cellulose, Polystyrol, Polypropylen, Polycarbonat oder Glas bestehen kann,
oder auch für verschiedene Zellen, Zellorganellen und Gewebe­ schnitte stehen kann.
Die Erfindung betrifft besonders bevorzugt Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
wo
R¹ und R² gleich oder verschieden sind und für Wasserstoff, für geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen stehen, das gegebenenfalls durch Halogen, oder geradkettiges oder verzweigtes Alkoxy mit bis zu 3 Kohlenstoffatomen oder Hydroxy substituiert ist,
für Benzyl steht, das gegebenenfalls durch Halogen, Nitro, Cyano, Carboxy, geradkettiges oder verzweigtes Alkyl, Alkoxy, Acyl oder Alkoxycarbonyl mit jeweils bis zu 4 Kohlenstoffatomen oder durch eine Gruppe der Formel -NR³R⁴ substituiert ist,
worin
R³ und R⁴ gleich oder verschieden sind und Wasserstoff oder geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 4 Kohlenstoff­ atomen bedeuten,
A, B für Sauerstoff steht
PL
in Abhängigkeit von der jeweiligen Bedeutung von PM
für ein
Enzym steht, wie z. B. alkalische Phosphatase, β-Galactosidase, T4 PN Kinase, Horseradish Peroxidase, Phospholipase C oder z. B. Proteinasen wie Papain, Pepsin, Proteinase K, Carboxypeptidase, Endoproteinase Arg-C, Bromelain, Collagenase, Dipeptidyl Pepti­ dase IV, oder Nucleasen wie z. B. RNase A, RNase T1, RNase T2, DNase I, Bal 31, oder Oxidasen wie z. B. Alkohol Oxidase, Glucose Oxidase, oder Esterasen wie z. B. Phosphodiesterase I und II, oder Glucosidasen wie z. B. β-Glucoronidase, Heparinase I, oder Lektine wie z. B. Concanavalin A
oder
für Protein A,
oder für Protein G steht,
oder für Immunglobuline vom Typ IgM, IgG, IgE, IgA und deren Fragmente steht,
für eine mit kovalent gebundenen primären oder sekundären Aminogruppen tragende beliebige natürliche oder synthetische wasserlösliche oder wasserunlösliche Matrix in verschiedenen Ausführungsformen (Teströhrchen, Microtiterplatten, Objektträ­ ger, Beads), die z. B. aus Cellulose, Polystyrol, Polypropylen, Polycarbonat oder Glas bestehen kann,
oder auch für verschiedene Zellen, Zellorganellen und Gewebe­ schnitte stehen kann.
Es zeigt Abb. 1 die Immobilisierung von Biomolekülen.
Das erfindungsgemäße Verfahren soll durch folgendes Formelschema (Abb. 1) beispielhaft, ohne daß dadurch eine Beschränkung ihres Umfanges erfolgen soll, erläutert werden. Das Verfahren zur Immobilisierung erfolgt insgesamt in drei Schritten:
I. Aktivierung
Eine aminogruppen-tragende Matrix - PM-NH₂ - wird in einem inerten Lösungsmittel mit einem beliebigen Quadratsäuredialkoxyester (wie z. B. Dimethylester, Diethylester oder auch Dibutylester) oder auch mit Quadratsäurehalogeniden gegebenenfalls in Gegenwart einer organischen Base zu einer aktivierten Matrix umgesetzt (Abb. 1).
Der Quadratsäuredialkoxyester oder das Quadratsäurehalogenid kann je nach gewünschtem Aktivierungsgrad im molaren Unterschuß bis zu einem großen Überschuß zu den zu aktivierenden Aminogruppen der Matrix zugesetzt werden (z. B. 0.1 bis 100). Im letzteren Falle erreicht man eine vollständige Umsetzung. Als besonders vorteilhaft erweist sich nun bei dieser Aktivierungsmethode, daß eine vollständige Rückgewinnung des nicht reagierten Quadratsäu­ rederivates leicht möglich ist.
Als inerte Lösemittel eignen sich hierbei die üblichen organischen Lösemittel, die sich unter den oben beschriebenen Reaktionsbe­ dingungen nicht verändern. In Abhängigkeit von dem eingesetzten Quadratsäurederivat gehören hierzu bevorzugt Alkohole wie Etha­ nol, Methanol, Propanol, Butanol, oder Ether wie Diethylether, Butylmethylether, Dioxan oder Tetrahydrofuran, oder Kohlenwas­ serstoffe wie Benzol, Toluol, Xylol oder Hexan, oder Amide wie Dimethylformamid, oder Hexamethylphosphorsäuretriamid, oder Ni­ trile wie Acetonitril, oder Ketone wie Aceton oder halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform oder Dichloromethan. Ebenso ist es möglich, Gemische der genannten Lösemittel einzusetzen. Besonders bevorzugt sind Ethanol oder Diethylether.
Als Basen werden im allgemeinen organische Basen wie z. B. Triethylamin, Tripropylamin, Pyridin, Piperidin, N,N-Dimethy­ laminopyridin, N-Methylimidazol oder Picolin verwendet. Bevor­ zugt ist Triethylamin.
Die Base wird im allgemeinen in einer Menge von 1 mol bis 100 mol, bevorzugt von 1 mol bis 10 mol bezogen auf 1 mol der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) eingesetzt.
Die Umsetzung erfolgt in einem Temperaturbereich von 0°C bis +100°C, bevorzugt von +4°C bis +60°C.
Die Umsetzung wird im allgemeinen bei Normaldruck durchgeführt. Es ist ebenso möglich, die Umsetzung bei erhöhtem oder ernied­ rigtem Druck durchzuführen (z. B. von 0.5 bis 5 bar).
Die Reaktionszeit schwankt in Abhängigkeit von den ausgewählten Reaktionskomponenten und der Reaktionstemperatur.
II. Immobilisierung
Die so mit Quadratsäureresten aktivierte Matrix wird anschließend im wäßrigen Puffersystem, das gegebenenfalls auch mit organi­ schen Lösungsmitteln versetzt werden kann, mit aminogruppen-tra­ genden, z. B. polymeren Verbindungen zu stabilen Konjugaten gekoppelt, wobei sich eine oder mehrere stabile kovalente Bindungen ausbilden können.
Als Reaktionsmedium eignen sich alle wäßrigen Puffersysteme, sofern sie frei von primären und sekundären Aminen sind, wie z. B. Phosphat, Citrat, Borat, Carbonat, Tris oder auch Gemische. Die Konzentration kann in weiten Bereichen variieren, wie z. B. von 0.01 bis 5 molar, bevorzugt ist 0.1 molar.
Die Konzentrationen der zu konjugierenden Moleküle kann in weiten Bereichen variieren und liegt z. B. für die zu koppelnden Proteine zwischen 0.01 und 50 mg/ml. Die Umsetzung erfolgt in einem Temperaturbereich von +4 °C bis +60°C, bevorzugt von +4°C bis +40°C.
Die Umsetzung wird im allgemeinen bei Normaldruck durchgeführt. Es ist ebenso möglich, die Umsetzung bei erhöhtem oder ernied­ rigtem Druck durchzuführen (z. B. von 0,5 bis 5 bar).
Der pH-Wert der Kopplungsreaktion kann zwischen pH 7-10 liegen, bevorzugt ist pH 9.
Die Reaktionszeit schwankt in Abhängigkeit von den ausgewählten Reaktionskomponenten, der Reaktionstemperatur und dem pH-Wert und liegt normalerweise bei 0.1-50 h.
III. Abblocken der restlichen reaktiven Gruppen der aktivierten polymeren Träger
Als besonders vorteilhaft gegenüber anderen Immobi­ lisierungsmethoden erweist sich nun das erfindungsgemäß schonende Verfahren, da es möglich ist, die restlichen, nicht reagierten aktiven Gruppen gezielt zu desaktivieren. Zum Abblocken der restlichen aktiven Gruppen eignen sich niedermolekulare Verbin­ dungen mit aktiven Aminogruppen wie z. B. monomere oder oligomere Aminosäuren, Aminoalkohole wie z. B. Ethanolamin oder Diethano­ lamin, Aminoether wie z. B. Polyethylenglycolamin, oder Aminozuc­ ker wie z. B. Glucosamin. Auf diese Weise ist es möglich, positive, negative, hydrophile, hydrophobe oder amphiphatische Gruppen unterschiedlicher Größe gezielt zusätzlich an die polymere Matrix kovalent zu binden. Es ist so möglich, die biochemischen, immunchemischen oder enzymatischen Reaktionen oder Aktivitäten zu modulieren bzw. zu stabilisieren.
Als Abblockmedium eignen sich alle wässrigen Puffersysteme, sofern sie frei von primären und sekundären Aminen sind, wie z. B. Phosphat, Citrat, Borat, Carbonat, Tris oder auch Gemische der genannten Systeme. Die Konzentration kann in weiten Bereichen variieren, wie z. B. von 0.01 bis 5 molar, bevorzugt ist 0.1 molar.
Die Konzentration der zu konjugierenden Gruppen kann in weiten Bereichen variieren und liegt z. B. für Aminosäuren zwischen 0.01 und 100 mg/ml.
Die Umsetzung erfolgt in einem Temperaturbereich von +4°C bis +60°C, bevorzugt von +4°C bis +40°C.
Die Umsetzung wird im allgemeinen bei Normaldruck durchgeführt. Es ist ebenso möglich, die Umsetzung bei erhöhtem oder ernied­ rigtem Druck durchzuführen (z. B. von 0.5 bis 5 bar).
Der pH-Wert der Abblockreaktion kann zwischen pH 7-10 liegen, bevorzugt ist pH 9.
Die Reaktionszeit schwankt in Abhängigkeit von den ausgewählten Reaktionskomponenten, der Reaktionstemperatur und dem pH-Wert und liegt normalerweise bei 0.1-50 h.
Die sehr selektive Kopplungschemie macht es auch überraschender­ weise möglich, nach Aktivierung der Matrix mit Quadratsäuregrup­ pen beliebige Polyamine mit der aktivierten Matrix reagieren zu lassen. Die so gezielt eingeführten weiteren Aminogruppen können dann anschließend mit Quadratsäuregruppen wiederum aktiviert werden. Auf diese Weise ist es möglich, extrem chemisch aktive Oberflächen zu generieren, die z. B. in der Lage sind, sehr große Moleküle oder auch Zellen durch viele kovalente Bindungen zu stabilisieren. Diese Vorgehensweise wird beispielhaft, ohne daß dadurch eine Beschränkung ihres Umfanges erfolgen soll, in Beispiel 1 beschrieben.
Beispiele: 1. Immobilisierung von Zellen und Gewebeschnitten auf Objektträ­ gern
  • a) Aktivierung der Objektträger
    Nach Standardmethoden aminopropylierte Objektträger werden in 10%ige Quadratsäurediethylester(Fa. Aldrich)/Ethanol Lösung (1% Triethylamin) gegeben und bei Raumtemperatur 10 h inkubiert. Danach wird intensiv mit Ethanol gewaschen, zum Schluß mit Phosphatpuffer pH 6.0 erneut gewaschen und anschließend luftge­ trocknet. Die so aktivierten Glasoberflächen können unbegrenzt bei +4°C und in einer ges. Ethanolatmosphäre aufbewahrt werden.
  • b) Immobilisierung von Poly-D-Lysin
    In eine Lösung von Poly-D-Lysin (Sigma, Mol.Wt. 1000-4000, 5 mg/ml), in 150 mM Borat (pH 9.0) werden die zuvor aktivierten Objektträger für 24 h inkubiert. Danach wird sehr intensiv mit Borat pH 9, Phosphat pH 7 und anschließend mit steigenden Mengen Ethanol bis 100% gespült und luftgetrocknet.
  • c) 2. Aktivierung mit Quadratsäurediester (Aktivierung der Aminogruppen des Lysins)
    Die zuvor mit Poly-D-Lysin behandelten Objektträger werden in 10 %ige Quadratsäurediethylester/Ethanol Lösung (1% Triethylamin) gegeben und erneut bei Raumtemperatur 10 h inkubiert. Danach wird intensiv mit Ethanol gewaschen, zum Schluß mit Phosphatpuffer pH 6.0 erneut gewaschen und anschließend luftgetrocknet.
  • d) Fixierung von Zellen auf aktivierte Objektträger
    Serumfreie Zellen (z. B. Maus-Myelomzellen) werden in möglichst wenig isotonischem Puffer (Borat, pH 8.0) auf die Objektträger aufgegeben (Abstrich), evtl. leicht zentrifugiert und an­ schließend für eine Stunde bei +37°C inkubiert. Danach werden die Objektträger für eine weitere Stunde mit 200 mM Lysin (pH 8-8.5) behandelt und danach mit PBS (pH 7.4) intensiv gespült. Die so immobilisierten Zellen bilden eine lückenlose, sehr stabile Zellschicht auf dem Objektträger.
2. Immobilisierung von Protein A auf AF-Amino TOYOPEARL 650 N (Fa. TOSOHAAS)
  • a) Aktivierung des Gels mit Quadratsäurediester
    25 g Af-Amino-650 M (Partikel-Größe: 65 µ, 100 µmol/ml Amin) wird mit dest. Wasser intensiv gewaschen und anschließend mit Ethanol (abs.) behandelt. 2 g (0.018 mol) Quadratsäurediethylester (Fa. Aldrich) wird in 4 ml Ethanol (abs.) gelöst, zu 25 g vorbehandeltem Af-Amino-650 M gegeben und mit 1.000 g (0.068 mol) Triethylamin versetzt. Nach 10 h wird abfiltriert und mit Ethanol intensiv gewaschen. 1 g des aktivierten, farblosen Gels wird mit 16 mg Protein A (Fa. Sigma) in 1.5 ml Boratpuffer (pH 9.2) bei Raumtemperatur für 12 h inkubiert. Mit Hilfe der UV-Spektroskopie und der Gelfiltration wird die Kinetik der Immobi­ lisierungsreaktion bestimmt. Nach 12 h ist kein Protein mehr im Überstand nachweisbar. Danach wird das Gel mit Boratpuffer (pH 9.2) gewaschen und mit 200 mM Ethanolamin (pH 9.2) für 5 h inkubiert, um die restlichen reaktiven Gruppen abzublocken. Anschließend wird das Gel erneut mit Puffer (PBS, pH 7.4) gewaschen und kann danach zum Aufreinigen von Antikörpern verwendet werden (Bindungskapazität: etwa 30 mg IgG /ml Gel).

Claims (20)

1. Immobilisierte Biomoleküle dadurch gekennzeichnet, daß die Immobilisierungsmittel Quadratsäure-Derivate sind, die kovalent Biomoleküle mit einer polymeren Matrix verbinden.
2. Immobilisierte Biomoleküle dadurch gekennzeichnet, daß das Immobilisierungsmittel ein Quadratsäure-Derivat (I) ist, das eine allgemeine chemische Strukturformel wie folgt besitzt: wo
R¹ und R² gleich oder verschieden sind und für Wasserstoff, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen oder für geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 8 Kohlen­ stoffatomen stehen, das gegebenenfalls durch Halogen, oder geradkettiges oder verzweigtes Alkoxy mit bis zu 6 Kohlenstoff­ atomen oder Hydroxy substituiert ist,
für Phenyl oder Benzyl steht, das gegebenenfalls durch Halogen, Nitro, Cyano, Carboxy, geradkettiges oder verzweigtes Alkyl, Alkoxy, Acyl oder Alkoxycarbonyl mit jeweils bis zu 6 Kohlen­ stoffatomen oder durch eine Gruppe der Formel -NR³R⁴ substituiert ist,
worin
R³ und R⁴ gleich oder verschieden sind und Wasserstoff oder geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoff­ atomen bedeuten,
A für Sauerstoff oder für Schwefel steht,
B für Sauerstoff oder für Schwefel steht,
PL
in Abhängigkeit von der jeweiligen Bedeutung von PM
für ein
Enzym steht, wie z. B. alkalische Phosphatase, β-Galactosidase, T4 PN Kinase, Horseradish Peroxidase, Phospholipase C oder z. B. Proteinasen wie Papain, Pepsin, Proteinase K, Carboxypeptidase, Endoproteinase Arg-C, Bromelain, Collagenase, Dipeptidyl Pepti­ dase IV, oder Nucleasen wie z. B. RNase A, RNase T1, RNase T2, DNase I, Bal 31, oder Oxidasen wie z. B. Alkohol Oxidase, Glucose Oxidase, oder Esterasen wie z. B. Phosphodiesterase I und II, oder Glucosidasen wie z. B. β-Glucoronidase, Heparinase I, oder Lektine wie z. B. Concanavalin A
oder
für Protein A
oder Protein G steht
oder für Immunglobuline vom Typ IgM, IgG, IgE, IgA und deren Fragmente steht
oder für andere mit Aminogruppen funktionalisierte Verbindungen wie z. B. verschiedene Aminocyclodextrine steht,
PM
für eine mit kovalent gebundenen primären oder sekundären Aminogruppen tragende beliebige natürliche oder synthetische wasserlösliche oder wasserunlösliche Matrix in verschiedenen Ausführungsformen (Teströhrchen, Microtiterplatten, Objektträger, Beads), die z. B. aus Cellulose, Polystyrol, Polypropylen, Polycarbonat oder Glas bestehen kann,
oder auch für verschiedene Zellen, Zellorganellen und Gewebe­ schnitten stehen kann.
3. Verfahren zur Herstellung von aktivierten Matrices dadurch gekennzeichnet, daß man polymere Matrices, die primäre oder sekundäre Aminogruppen enthalten, mit Quadratsäurediester, Quadratsäurehalogeniden oder Quadratsäureesterhalogeniden als Aktivierungsmittel unter Ausbildung aktiver Gruppen zu aktivierten Matrices umsetzt.
4. Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Biomolekülen nach Anspruch 3 dadurch gekennzeichnet, daß man Biomoleküle, die mindestens eine primäre oder sekundäre Aminogruppe enthalten müssen, mit einer beliebigen aktivierten Matrix unter Ausbildung einer kovalenten Verknüpfung oder mehrerer stabiler kovalenter Verknüpfungen umsetzt.
5. Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Biomolekülen nach Ansprüchen 3 und 4 dadurch gekennzeichnet, daß man die nach Immobilisierung noch vorhandenen restlichen aktiven Quadratsäuregruppen mit niedermolekularen Verbindungen, die mindestens eine primäre oder sekundäre Aminogruppe enthalten müssen, desaktiviert.
6. Verfahren zur Herstellung von aktivierten Matrices nach Anspruch 3 dadurch gekennzeichnet, daß man eine polymere Matrix, die primäre oder sekundäre Aminogruppen enthalten, mit Quadratsäurediester, Quadratsäure­ halogeniden oder Quadratsäureesterhalogeniden bei 0°C bis +100 °C umsetzt, bevorzugt sind +10 °C bis +60 °C.
7. Verfahren zur Herstellung von aktivierten Matrices nach Anspruch 3 dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung in einem üblichen organischen Lösungsmittel, daß sich während der Umsetzung nicht verändert, im molaren Unterschuß als auch im großen molaren Überschuß bezogen auf die Aminogruppen eingesetzt werden kann.
8. Verfahren zur Herstellung von aktivierten Matrices nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivierung in Gegenwart einer organischen Base, wie z. B. Triethylamin oder Pyridin ablaufen kann, und diese wird in einer Menge von 1 mol bis 100 mol, bevorzugt von 1 mol bis 10 mol bezogen auf 1 mol der Verbindung der allgemeinen Formel (I) eingesetzt.
9. Verfahren zur Herstellung von aktivierten Matrices nach Anspruch 3 dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionszeit in Abhängigkeit von den ausgewählten Reaktionskomponenten und der Reaktionstemperatur schwankt, be­ vorzugt sind Zeiten zwischen 0.1 und 10 h.
10. Verfahren zur Herstellung von aktivierten Matrices nach Anspruch 3 dadurch gekennzeichnet, daß als polymere Matrix alle synthetischen als auch natürlichen Polymere geeignet sind, die kovalent primäre oder sekundäre Aminogruppen enthalten.
11. Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Biomolekülen nach Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet, daß sich als Reaktionsmedium alle wässrigen Puffersysteme eignen, wie z. B. Phosphat, Citrat, Borat, Carbonat oder auch Gemische.
12. Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Biomolekülen nach Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentrationen der zu konjugierenden Moleküle in weiten Bereichen variieren kann und liegt z. B. für zu koppelnde Proteine zwischen 0.01 und 50 mg/ml.
13. Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Biomolekülen nach Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung in einem Temperaturbereich von +4 °C bis +60°C erfolgen kann.
14. Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Biomolekülen nach Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert während der Kopplungsreaktion zwischen 7 und 10 liegen kann.
15. Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Biomolekülen nach Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionszeit in Abhängigkeit von den ausgewählten Reaktionskomponenten, der Reaktionstemperatur und dem pH-Wert schwankt und liegt normalerweise bei 0.1 und 50 h.
16. Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Biomolekülen nach Anspruch 5 dadurch gekennzeichnet, daß sich als Abblockmedium sich alle wässrigen Puffersysteme eignen.
17. Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Biomolekülen nach Anspruch 5 dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der reaktiven Gruppen zum Abblocken in weiten Bereichen variieren kann und liegt z. B. für Aminosäuren zwischen 0.01 und 100 mg /ml.
18. Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Biomolekülen nach Anspruch 5 dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionstemperatur zum Abblocken in einem Temperatur­ bereich von +4°C bis +60°C liegt.
19. Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Biomolekülen nach Anspruch 5 dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert während der Abblockreaktion zwischen pH 7 und 10 liegen kann.
20. Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Biomolekülen nach Anspruch 5 dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionszeit in Abhängigkeit von den ausgewählten Abblock-Verbindungen, der Reaktionstemperatur und dem pH-Wert zwischen 0.1 und 50 h liegt.
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