KR101762894B1

KR101762894B1 - 지질 결합 헤파린이 코팅된 세포 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101762894B1
Application number: KR1020150069918A
Authority: KR
Inventors: 태기융; 김종철
Original assignee: 광주과학기술원
Priority date: 2015-05-19
Filing date: 2015-05-19
Publication date: 2017-07-28
Also published as: KR20160136132A

Abstract

본 발명의 지질 결합 헤파린은 세포의 표면에 가역적으로 코팅되어, 생체 내 특정 리간드 또는 다양한 성장인자와 결합하여 코팅된 세포를 특정 장기 혹은 병변 부위에 누적시키거나 세포의 성장에 도움을 준다. 세포 표면에 고정화된 헤파린은 헤파린의 높은 생체 활성에 따라 리간드와 성장인자 등 다양한 단백질과 상호작용하게 되고, 그에 따라 세포가 혈관으로 주입시 특정 부위에 누적되거나 배양 시 높은 성장률을 보인다.

Description

지질 결합 헤파린이 코팅된 세포 및 이의 제조방법{Cell coated with lipid-conjugated heparin and preparation method thereof}

본 발명은 지질 결합 헤파린(lipid-conjugated heparin), 지질-헤파린 코팅된 세포, 지질-헤파린 코팅된 염색 세포, 이들을 포함하는 표적 전달용 생체적합성 용액, 및 이들의 제조방법에 관한 것이다.

헤파린으로 세포표면을 개질하기 위해서는 헤파린에 소수성 분자를 결합시키는 방법이 있는데, 기존의 기술로는 합성방법이 복잡하거나 독성 용매의 사용, 헤파린 구조의 부분적 파괴 등의 문제점이 있었다.

1. 한국 공개특허 제1999-0087944호 2. 미국 특허 제5,733,892호 3. 미국 공개특허 제2011/0206740호

1. Control of cell attachment through polyDNA hybridization, Yuji Teramura, Hao Chen, Takuo Kawamoto, Hiroo Iwata, Biomaterials 31 (2010) 2229-2235, 2. Engineered mesenchymal stem cells with self-assembled vesicles for systemic cell targeting, Debanjan Sarkar, Praveen K. Vemula, Weian Zhao, Ashish Gupta, Rohit Karnik, Jeffrey M. Karp, Biomaterials 31 (2010) 5266-5274

종래 일반적인 화학물질로 치료가 불가능한 질병을 세포 치료를 통하여 치료하려는 시도가 계속되고 있으나, 세포 치료의 낮은 효율이 문제되고 있으며, 본 발명은 세포 치료의 효율을 높일 수 있는 발명을 제공하고자 한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, (A) (i) 헤파린, (ii) 지질 및 (iii) 상기 헤파린과 상기 지질의 생체적합성 공용매(co-solvent)를 포함하는 용액을 수득하는 단계를 포함하는 지질 결합 헤파린(lipid-conjugated heparin)의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 다른 측면은 (a) 세포, (b) 상기 세포를 코팅하고 있는 지질 결합 헤파린을 포함하는 지질-헤파린 코팅된 세포가 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면은 (A) 지질 결합 헤파린을 세포가 포함된 용액에 투입하는 단계를 포함하는 지질-헤파린 코팅된 세포의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면은 (a) 세포, (b) 지질 결합 헤파린, (c) 염료로 라벨링된 물질을 포함하고, 상기 지질 결합 헤파린은 상기 세포를 코팅하고 있고, 상기 물질은 상기 헤파린과 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 지질-헤파린 코팅된 염색 세포가 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면은 (A) 지질 결합 헤파린을 세포가 포함된 용액에 투입하여 지질-헤파린 코팅된 세포를 수득하는 단계, (B) 상기 지질-헤파린 코팅된 세포를 염색하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 지질-헤파린 코팅된 염색 세포의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면은 표적 전달용 지질-헤파린 코팅된 세포가 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면은 표적 전달용 지질-헤파린 코팅된 염색 세포가 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면은 지질-헤파린 코팅된 세포 또는 지질-헤파린 코팅된 염색 세포 또는 이들의 혼합물 중에서 선택된 1종을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 전달용 생체적합성 용액이 제공된다.

본 발명에서는 지질 결합 헤파린을 비교적 간단한 방법으로 합성하였고, 특히 반응 시 용매를 알콜과 물의 혼합용매로 사용함으로써 합성물의 독성을 최소화하여 생체적합성을 극대화하였다. 또한, 기존의 기술에서 적용하지 않은 용도로서, 지질 결합 헤파린을 세포의 표면에 코팅하여 코팅된 세포의 체내 표적 전달을 구현하였고, 지질 결합 헤파린이 코팅된 세포가 그렇지 않은 경우에 비하여 상대적으로 세포 성장이 촉진되는 효과를 보였다.

다양한 생체활성을 지니는 헤파린에 지질을 공유결합시킴으로써, 세포막의 지질 이중층과 소수성 상호작용이 가능하다. 세포의 표면을 헤파린으로 개질하여 새로운 생체 활성을 부여함으로써 체내 특정 장기 혹은 특정 부위의 수용체 또는 구조와 상호작용하여 세포의 체내 표적 전달 효과를 확인할 수 있으며, 또한 다양한 생체 활성 물질과 세포 표면의 헤파린이 상호작용함으로써, 세포 성장이 촉진되는 효과를 보일 수 있다.

도 1a와 1b는 종래 기술에 대한 개략도이다.
도 1c는 본 발명의 일 구현예에 따른 지질 결합 헤파린의 제조방법을 개략적으로 보여준다.
도 2a는 HPLC를 이용하여 지질 결합 헤파린을 분류한 결과와, 이러한 분류를 위한 시간과 메탄올 농도 조건을 보여준다.
도 2b는 합성 후 분류된 지질 결합 헤파린의 ¹H-NMR 스펙트럼 분석 결과이다.
도 3a는 종래 기술에 대한 개략도이다.
도 3b는 정제된 지질 결합 헤파린을 지방 유래 줄기세포에 코팅하는 방법과 이렇게 코팅된 헤파린의 분석방법을 개략적으로 보여준다. (a) 지질 결합 헤파린은 배양 중인 지방 유래 줄기세포의 배지에 첨가하여 코팅될 수 있다. (b) 코팅된 헤파린을 염색하기 위하여 정전기적 인력으로 헤파린과 결합할 수 있는 리소자임(lysozyme)을 형광 염료(cy5.5)로 레이블시킨다. (c) 지질 결합 헤파린에 코팅된 세포를 cy5.5-라벨링된(labeled) 리소자임으로 염색하여 분석하는 방법을 개략적으로 보여준다.
도 3c는 지질 결합 헤파린이 잘 코팅될 수 있는 조건을 실험에 대한 (a) 실험 개요와 (b) 유세포 분석 결과를 보여준다.
도 4a는 지질 결합 헤파린을 지방 유래 줄기세포에 코팅한 후, 염색된 헤파린의 존재를 공초점 레이져 주사현미경으로 관찰한 결과이다.
도 4b는 지질 결합 헤파린의 지방 유래 줄기세포 코팅 전/후의 Live/Dead 염색 이미지이다.
도 4c는 도 4b의 이미지를 정량 분석한 차트이다. 도 4d는 지질 결합 헤파린의 지방 유래 줄기세포 코팅 전/후의 dehydrogenase 활성도 측정 결과이다.
도 5a는 지질 결합 헤파린이 코팅된 지방유래 줄기세포를 지방세포로 22일 간 분화를 유도한 후, Oil red O로 염색하여 세포 내 지방 축적을 관찰한 이미지이다.
도 5b는 지질 결합 헤파린이 코팅된 지방유래 줄기세포의 biodistribution을 소동물(mouse)에서 관찰하기 위한 실험 개요와 준비된 세포를 분석한 결과이다. (a) 동물 실험 개요. 정상 상태의 mouse에 세포를 정맥주사하여 지질 결합 헤파린이 코팅된 경우와 코팅하지 않은 경우를 비교하였다. (b) 처리한 세포의 분석을 위하여 DiD 염료를 세포에 라벨링하였으며, 이때 형광 라벨링 정도를 세포 수에 따라 정량화하였다. 지질 결합 헤파린을 코팅한 경우와 코팅하지 않은 경우 간 형광 표지 차이는 관찰되지 않았다.
도 5c는 도 5b에 따른 실험 결과이다. 지질 결합 헤파린을 코팅한 세포가 폐에서의 비특이적인 축적이 감소하였으며 간과 비장에서 코팅하지 않은 경우보다 더 많은 세포의 축적을 보였다. (a) 동일한 형광 범위를 기준으로 정리한 각 장기의 이미지. (b) 각 장기의 형광값을 도표화한 결과. (c) 각 장기의 형광값을 세포 수로 변환한 결과. (d) 폐, 간, 비장의 형광 이미지를 각 장기의 형광 범위에 맞게 조절하여 제시한 결과.

이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.

종래, 발명의 명칭이 "혈전성이 있는 헤파린유도체, 그의 제조방법 및 용도", 한국 공개특허 제1999-0087944호에서는 DMF와 DMSO를 용매로 사용함으로써 소수성 분자의 COOH를 활성화하는 단계(제1 단계) 후에, 헤파린의 NH2에 결합시키는 단계(제2 단계)를 거치는 발명을 개시하고 있다(도 1a 참고). 또한, 미국 특허 제5,733,892호에서는 메탄올, DMF, 클로로포름을 용매로 사용함으로써, 헤파린을 요오딘(iodine)으로 산화시켜 개환반응(COOH 노출, 제1 단계)을 수행하고, 산처리로 C=O로 변환시키는 단계(제2 단계)를 거친 후, 이를 지질의 NH₂와 결합시키는 단계(제3 단계)를 거치는 발명을 개시하고 있다(도 1b). 반면, 본 발명의 일 측면은 헤파린과 지질의 공용매를 사용함으로써, 헤파린 COOH의 활성화와 지질 NH₂와의 결합을 하나의 단계로 달성할 수 있는 발명에 관한 것이다(도 1c).

일 구현예에 따르면, 상기 지질 결합 헤파린 제조방법은 (B) 상기 용액을 물에서 투석하는 단계, 및 (C) 상기 투석 결과물을 동결건조하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 지질 결합 헤파린의 제조방법이 제공된다.

더욱 바람직한 구현예에 따르면, 상기 지질 결합 헤파린 제조방법은 (A) 상기 용액을 반용매에 투입하여 침전물을 수득하는 단계, (C) 상기 침전물을 물에서 투석하는 단계, (D) 상기 투석 결과물 중 비결합 지질을 원심분리로 제거하는 단계, (E) 상기 원심분리 후 상등액을 동결건조하는 단계를 추가로 포함할 수도 있다.

투석하기 전 반용매 처리를 통해서 반응 부산물 제거를 위한 비용과 시간을 줄일 수 있다. 또한, 비결합 지질은 원심분리를 통해 제거할 수도 있지만 HPLC의 분리과정에서 정제할 수도 있다.

이때, 상기 투석을 통해 3.5 kDa 이하의 분자량을 갖는 지질 결합 헤파린을 제거하는 것이 바람직하며, 그 이유는 헤파린 또는 지질 결합 헤파린을 제외한 저분자량의 수용성 반응 부산물질을 제거하기 때문이다.

다른 구현예에 따르면, 상기 지질 결합 헤파린의 제조방법은 (F) HPLC를 이용하여 헤파린에 결합된 지질의 개수에 따라 상기 지질 결합 헤파린을 분류하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 지질 결합 헤파린의 제조방법이 제공된다.

또 다른 구현예에 따르면, 상기 생체적합성 공용매는 이소프로필 알코올, 물, 에탄올, 메탄올, 및 이들 2종 이상의 혼합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 지질 결합 헤파린의 제조방법이 제공된다.

또 다른 구현예에 따르면, 상기 생체적합성 공용매는 물과 이소프로필 알코올이 부피비 6:4 내지 4:6인 것을 특징으로 하는 지질 결합 헤파린의 제조방법이 제공된다.

또 다른 구현예에 따르면, 상기 용액은 (iv) 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보이미드(EDC), N,N-카보닐 다이이미다졸(CDI) 및 이들 2종 이상의 혼합물 중에서 선택된 제1 첨가제, (v) 하이드록실 벤조트리아졸(HOBt), 엔-하이드록실 숙신이미드(NHS), 설포 N-하이드록실 숙신이미드(S-NHS) 및 이들 2종 이상의 혼합물 중에서 선택된 제2 첨가제, (vi) 트리에틸아민(TEA), 피리딘 및 이들 2종 이상의 혼합물 중에서 선택된 제3 첨가제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 지질 결합 헤파린의 제조방법이 제공된다.

이때, EDC와 같은 제1 첨가제는 헤파린의 카르복실기를 활성화시키는 역할을 수행하며, 이렇게 활성화된 헤파린의 카르복시기는 지질의 아민과 용이하게 결합할 수 있게 된다. 구체적으로, 지질 결합 헤파린은 헤파린의 카르복실기를 EDC로 활성화시킨 후, 지질의 아민과 결합시키는 방법으로 간단하게 제조되며, 휘발성 알콜을 반응 용매로 사용하여 반응 부산물의 제거가 용이하다. 합성 후 분리, 정제된 지질 결합 헤파린은 세포에 처리되어 소수성 상호작용으로 세포의 지질 이중층에 지질부분이 끼어들어 고정화된다. HOBt와 같은 제2 첨가제는 제1 첨가제에 의해 활성화된 헤파린의 카르복실기가 지질의 아민과 결합하기 전까지 안정한 활성 상태를 유지하는데 도움을 줌으로써, 효율적인 결합반응을 진행하게 한다. TEA와 같은 제3 첨가제는 반응 용액의 산도를 조절해 줌으로써 헤파린의 카르복실기가 지질의 아민기와 용이하게 결합할 수 있도록 한다.

또 다른 구현예에 따르면, 상기 용액은 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보이미드, 하이드록실 벤조트리아졸, 트리에틸 아민을 추가로 포함하고, 상기 헤파린 : 상기 지질 : 상기 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보이미드 : 상기 하이드록실 벤조트리아졸 : 상기 트리에틸 아민의 몰비가 1 : 1-20 : 40-50 : 40-50 : 10-60인 것을 특징으로 하는 지질 결합 헤파린의 제조방법이 제공된다.

일 구현예에 따르면, 상기 세포는 지방유래 줄기세포(Adipose-Derived Stem Cell, ADSC), 섬유아세포(NIH3T3), 지방전구세포(3T3-L1), 마우스 간세포(FL83B), 골육종 세포(MG63) 중에서 선택된 1종 이상이고, 상기 지질은 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE) 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 지질-헤파린 코팅된 세포가 제공된다.

다른 구현예에 따르면, 상기 지질 결합 헤파린은 상기 헤파린 1개 당 상기 지질이 평균 0.5 내지 5개가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 지질-헤파린 코팅 세포(lipid-heparin coated cell)가 제공된다.

종래, "Biomaterials 31 (2010) 5266-5274"에서는 복잡한 여러 단계를 거쳐서 세포 표면을 테트라 사카라이드인 시알릴루이스엑스 (sLex)로 코팅하는 방법을 개시하고 있다(도 3a 참고). 반면, 본 발명에서는 세포 표면을 헤파린으로 코팅하는 단계가 단일 단계로 이루어져 매우 유리한 장점이 있다(도 3b).

일 구현예에 따르면, 상기 물질은 리소자임, 피브리노겐 중에서 선택된 1종 이상이고, 상기 염료는 Cy5.5, FITC 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 지질-헤파린 코팅된 염색 세포가 제공된다.

상기 염색은 헤파린과 결합 가능한 물질을 형광 염료로 라벨링한 후 이를 이용할 수 있는데, 예를 들어 Cy5.5로 라벨링된 리소자임을 이용하여 수행할 수 있다. 이때 리소자임은 헤파린과 정전기적 인력으로 결합할 수 있다.

일 구현예에 따르면, 상기 세포가 포함된 용액(예: 세포 배지) 내 혈청 농도는 0.5 내지 5 부피%인 것을 특징으로 하는 지질-헤파린 코팅된 세포의 제조방법이 제공된다.

상기 혈청으로는 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)을 사용할 수 있다.

일 구현예에 따르면, 상기 표적은 간 또는 비장인 것을 특징으로 하는 표적 전달용 지질-헤파린 코팅된 세포가 제공된다.

지질-헤파린으로 코팅되지 않는 지방 유래 줄기세포는 폐에서 비특이적 축적이 많이 관찰되었으나, 지질-헤파린으로 코팅된 지방 유래 줄기세포는 간 또는 비장에 비특이적 축적이 많도록 바뀌는 것으로 관찰되었다. 즉, 본 발명의 지질 결합 헤파린은 세포의 표면에 가역적으로 코팅되어, 생체 내 특정 리간드 또는 다양한 성장 인자와 결합하여 코팅된 세포를 특정 장기 혹은 병변 부위에 누적시키거나 세포의 성장에 도움을 주게 된다. 세포 표면에 고정화된 헤파린은 헤파린의 높은 생체 활성에 따라 리간드와 성장 인자 등 다양한 단백질과 상호작용하게 되고, 그에 따라 세포가 혈관으로 주입시 특정 부위에 누적되거나 배양 시 높은 성장률을 보이게 된다.

일 구현예에 따르면, 상기 표적은 간 또는 비장인 것을 특징으로 하는 표적 전달용 지질-헤파린 코팅된 염색 세포가 제공된다.

일 구현예에 따르면, 상기 표적은 간 또는 비장인 것을 특징으로 하는 표적 전달용 생체적합성 용액이 제공된다.

다른 구현예에 따르면, 상기 표적 전달용 생체적합성 용액은 주사 가능한(injectable) 것을 특징으로 하는 표적 전달용 생체적합성 용액이 제공된다.

이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.

실시예

실시예 1: 지질 결합 헤파린 제조

도 1c에 제시한 바와 같이, 친수성인 헤파린과 소수성 지질인 DPPE 간의 공유결합을 위하여 공용매를 사용하여, 지질 결합 헤파린을 제조하였다. 구체적인 제조방법은 아래 후술한다.

공용매는 3차 증류수와 아이소프로필 알코올을 부피비 1:1로 혼합하여 사용하였다. 먼저 헤파린은 30 mg/mL의 농도로 3차 증류수에 용해시킨 후, 헤파린의 45배 몰당량에 해당하는 EDC와 HOBt, 25 몰당량에 해당하는 TEA가 헤파린이 용해된 용액에 첨가되었다. 헤파린의 5배 몰당량에 해당하는 DPPE(지질)는 이소프로필 알콜에 용해되었으며, 이 지질 용액은 앞서 준비된 헤파린 용액에 65 ℃에서 섞어주고 20시간 반응하였다.

반응 종료 후, 지질이 결합된 헤파린과 그렇지 않은 헤파린 모두를 그 외의 반응부산물과 분리하기 위해서, 10배 부피에 해당하는 얼음으로 차갑게 한 아세톤에 천천히 떨어뜨렸다. 이때, 헤파린과 지질결합 헤파린은 아세톤에 녹지 못하므로 바닥에 침전되었다. 침전된 헤파린 및 지질결합 헤파린은 3000rpm (약 1700 xg) 5분 원심분리하여 반응부산물과 완전히 분리 후, 상등액은 버렸다. 이러한 헤파린 및 지질결합 헤파린의 침전과정은 생략될 수 있다. 침전 회수된 헤파린 및 지질결합 헤파린은 3차 증류수에 녹인 후, 분자량 컷오프가 3.5 kDa인 투석막을 이용하여 3차 증류수 투석함으로써 반응 부산물 및 잔여 아세톤을 완전히 제거하였다. 이때, 헤파린에 결합되지 못한 잔여 지질은 물에 녹지 못하고 침전되므로, 투석종료 후, 원심분리 (19000 xg, 10분)하여 제거하였다. 이러한 잔여 지질의 원심분리 과정은 생략될 수 있다. 상등액은 동결건조하여 다음 과정을 준비하였다.

또한 도 2a에 제시한 바와 같이, HPLC를 사용하여 합성된 지질 결합 헤파린을 헤파린 1분자에 결합된 지질 분자의 개수에 따라 분류하였다. HPLC 용매인 메탄올 비율이 커질수록 C18 컬럼과 합성물의 소수성 상호작용이 약해짐을 이용하여 분류하였다. 구체적인 제조방법은 아래 후술한다.

앞서 건조된 합성물에는 지질과 결합하지 않은 헤파린과 다양한 개수의 지질과 결합된 지질결합 헤파린이 공존한다. 지질과 결합하지 않은 헤파린은 C18 컬럼과 상호작용이 없으므로 물 100% 용리 조건에서 10분 이내에 컬럼을 통과하여 용리된다. 반면, 지질이 결합된 헤파린은 지질부분이 C18 컬럼과 소수성 상호작용하여 물 100% 용리 조건에서 용리되어 나오지 못하므로, 용리액에 유기용매인 메탄올을 단계적으로 전체부피의 30%, 50%, 90% 씩 증가시킴으로써 지질 결합 개수가 적은 합성물부터 많은 합성물까지 단계적으로 분리할 수 있다. 메탄올 30% 부피비에서 용리된 분액을 분액I, 50%의 용리액을 분액II, 90%의 용리액을 분액III으로 명명하였고, 이렇게 분리된 각각의 분액은 농축 및 동결건조하여 분석 및 응용적용 되어 사용된다.

각 분액의 헤파린에 결합된 지질의 개수를 정량하기 위해서 ¹H-NMR을 사용하였다. 동결건조된 각 분액을 D₂O에 녹인 후 75 ℃에서 ¹H-NMR 분석을 수행하였으며, 이러한 측정온도는 헤파린에 결합된 지질간의 소수성 상호작용으로 측정에 방해가 되지 않도록 하기 위함이다.

그 결과, 도 2b에 제시한 것과 같이, 분액(fraction) I, II, III은 각각 헤파린 1개 분자에 평균적으로 지질 분자 1.1개, 1.9개, 3.9개가 결합하고 있는 것으로 분석되었다.

실시예 2: 지질-헤파린으로 코팅된 세포의 제조 및 이에 대한 염색

도 3b의 (a)에 제시한 바와 같이, 지질-헤파린으로 코팅된 세포를 제조하였다. 구체적인 제조방법은 아래 후술한다. 특히, 도 3c의 (a)에 제시한 바와 같이, 지질 결합 헤파린이 잘 코팅될 수 있는 조건을 실험하였다. 또한 도 3b의 (b)와 (c)에 제시한 것과 같이, 이렇게 제조된 지질-헤파린 코팅 세포를 염색하였는데, 그 구체적인 방법은 아래 후술한다.

표면에 부착되어 생장하는 지방유래 줄기세포의 경우, 배양 배지에 파종 후 37 ℃, 5% 이산화탄소 환경에서 1일간 배양 후, 지질 결합 헤파린이 포함된 코팅 배지로 교체하였다. 지질결합 헤파린이 포함된 배지에서 1일간 추가적인 배양이 끝나면 세포의 표면에 지질결합 헤파린이 자연스럽게 코팅되었다. 이 과정에서, 세포표면의 헤파린 코팅을 확인하여 분석할 수 있는 방법이 필요하였다. 헤파린이 생리학적 조건에서 강한 음전하를 갖음을 이용하여 강한 양전하를 띄는 리소자임의 아민기에 Cy5.5-NHS를 결합시켜 형광표지를 하여 세포표면의 헤파린을 정전기적 인력으로 염색하고자 하였다. 형광표지 리소자임은 3차 증류수에서 Cy5.5-NHS의 30몰당량에 해당하는 리소자임과 실온, 15시간 반응 후, 3차 증류수에서 투석하여 정제하고 동결건조 하여 제조할 수 있었다. 이렇게 준비된 형광표지 리소자임은 지질결합 헤파린이 코팅된 지방유래 줄기세포와 37 ℃, 30분간, 8 rpm으로 섞어줌으로써, 헤파린 표면을 염색하는데 사용될 수 있었다. 염색과정 이후, 세포를 3분간 1500 rpm으로 원심분리하여 염색에 사용되지 않은 형광표지 리소자임을 제거 후, 형광활성유세포분석기(FACS)를 통하여 헤파린이 코팅된 세포를 정량할 수 있었다.

이와 같이 세포표면의 헤파린을 분석할 수 있는 분석방법을 확립 후, 지질결합 헤파린이 세포 표면에 잘 코팅될 수 있는 조건을 찾고자 하였다. 다양한 코팅과정의 변수 중에, 지질결합 헤파린이 포함된 배지의 FBS 함유량이 지질결합 헤파린의 코팅에 영향이 있음을 실험을 통해 알 수 있었다.

그 결과, 도 3c의 (b)에 제시한 것과 같이, 1%에서 3% 혈청 농도조건 모두에서 95% 이상의 세포가 잘 코팅 되었다. 특히, 세포에 코팅 시 배지 내의 혈청 농도(FBS)가 낮을수록 코팅이 상대적으로 잘 되었으며, 1% FBS 농도를 최적 추후 실험의 조건으로 결정하였다.

위에서 얻은 최적화된 코팅 조건으로 코팅된 지질 결합 헤파린(분액 II)을 지방 유래 줄기세포에 코팅한 후, 염색된 헤파린의 존재를 공초점 레이져 주사현미경으로 관찰하였다. 그 결과를 도 4a에 제시하였고, 여기서 주황색 이미지가 cy5.5-리소자임을 나타낸다(스케일바: 50 ㎛).

또한, 지질 결합 헤파린의 지방유래 줄기세포 코팅 전/후의 Live/Dead 염색 이미지를 촬영하여 그 결과를 도 4b에 제시하였다.

또한, 상기 이미지를 정량 분석한 차트를 도 4c에 제시하였고, 동일한 면적으로 중앙의 live 세포(녹색)을 정량해도 큰 차이가 없는 것으로 보아 지질 결합 헤파린의 독성 효과는 없는 것으로 확인되었다.

또한, 지질 결합 헤파린의 지방유래 줄기세포 코팅 전/후의 dehydrogenase 활성도를 측정하였고, 그 결과를 도 4d에 제시하였다. WST-8 시약을 이용한 dehydrogenase 활성도 측정 결과, 지질결합 헤파린이 적용된 세포와 그렇지 않은 세포(w/o coating, 대조군) 모두, 1일간 1% FBS 코팅 조건에서 활성도를 억제시키는 영향이 있었으며, 이러한 활성 억제는 코팅 완료 후 정상 성장조건(10% FBS)으로 전환시켜 주었을 때 급격히 회복되었다. 즉, 이러한 세포 활성감소는 지질결합 헤파린에 의한 독성효과가 아니라, 코팅을 위한 저영양 상태 (1% FBS)에 의한 일시적이고 가역적인 현상으로 보인다. 또한, 코팅을 하지 않은 조건에 비하여 지질 결합 헤파린을 코팅한 조건에서 더 빠르게 회복됨이 관찰되었다.

실시예 4: 지질-헤파린으로 코팅된 염색 세포의 표적 전달

지질 결합 헤파린이 코팅된 지방유래 줄기세포를 지방세포로 22일 간 분화를 유도한 후, Oil red O로 염색하여 세포 내 지방 축적을 관찰하였고, 그 결과를 도 5a에 제시하였다. 지질 결합 헤파린이 줄기세포의 분화능에 영향을 미치지 않았음을 확인하였다.

또한, 지질 결합 헤파린이 코팅된 지방유래 줄기세포의 biodistribution을 소동물(mouse)에서 관찰하였다. 실험 개요와 준비된 세포를 분석한 결과는 도 5b에 제시하였다. 정상 상태의 mouse에 세포를 정맥주사하여 지질 결합 헤파린이 코팅된 경우와 코팅하지 않은 경우를 비교하였다. 처리한 세포의 분석을 위하여 DiD 염료를 세포에 라벨링하였으며, 이때 형광 라벨링 정도를 세포 수에 따라 정량화하였다. 지질 결합 헤파린을 코팅한 경우와 코팅하지 않은 경우 간 형광 표지 차이는 관찰되지 않았다.

도 5b에 따라 실험한 결과는 도 5c에 제시하였다. 지질 결합 헤파린을 코팅한 세포가 폐에서의 비특이적인 축적이 감소하였으며 간과 비장에서 코팅하지 않은 경우보다 더 많은 세포의 축적을 보였다.

Claims

(A1) 헤파린 수용액을 수득하는 단계,
(A2) 지질 알코올 용액 수득하는 단계, 및
(A3) 상기 헤파린 수용액과 지질 알코올 용액을 혼합하여 반응시키는 단계를 포함하는 지질 결합 헤파린(lipid-conjugated heparin)의 제조방법으로서,
상기 알코올은 이소프로필 알코올, 에탄올, 메탄올 중에서 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 지질 결합 헤파린의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 지질 결합 헤파린 제조방법은 상기 (A3) 단계 후에 (B) 상기 용액을 물에서 투석하는 단계, 및 (C) 상기 투석 결과물을 동결건조하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 지질 결합 헤파린의 제조방법.
제2항에 있어서, 상기 지질 결합 헤파린 제조방법은 상기 (C) 단계 후에 (D) HPLC를 이용하여 헤파린에 결합된 지질의 개수에 따라 상기 지질 결합 헤파린을 분류하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 지질 결합 헤파린의 제조방법.
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제1항에 있어서, 상기 수용액에 포함된 물과 상기 이소프로필 알코올이 사용된 부피비가 6:4 내지 4:6인 것을 특징으로 하는 지질 결합 헤파린의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 수용액은 하기 제1 첨가제, 제2 첨가제, 제3 첨가제 중에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 지질 결합 헤파린의 제조방법:
(iv) 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보이미드(EDC), N,N-카보닐 다이이미다졸(CDI) 및 이들 2종 이상의 혼합물 중에서 선택된 제1 첨가제,
(v) 하이드록실 벤조트리아졸(HOBt), 엔-하이드록실 숙신이미드(NHS), 설포 N-하이드록실 숙신이미드(S-NHS) 및 이들 2종 이상의 혼합물 중에서 선택된 제2 첨가제,
(vi) 트리에틸아민(TEA), 피리딘 및 이들 2종 이상의 혼합물 중에서 선택된 제3 첨가제.
제1항에 있어서, 상기 용액은 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보이미드, 하이드록실 벤조트리아졸, 트리에틸아민을 추가로 포함하고,
상기 헤파린 : 상기 지질 : 상기 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보이미드 : 상기 하이드록실 벤조트리아졸 : 상기 트리에틸아민의 몰비가 1 : 1-20 : 40-50 : 40-50 : 10-60인 것을 특징으로 하는 지질 결합 헤파린의 제조방법.
(a) 세포, (b) 상기 세포를 코팅하고 있는 지질 결합 헤파린을 포함하는 지질-헤파린 코팅된 세포로서,
상기 지질 결합 헤파린은 제1항에 따라 제조된 것을 특징으로 하는 지질-헤파린 코팅된 세포.
제8항에 있어서, 상기 세포는 지방 유래 줄기 세포(Adipose-Derived Stem Cell, ADSC), 섬유아세포, 지방전구세포, 마우스 간세포, 골육종 세포 중에서 선택된 1종 이상이고,
상기 지질은 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE) 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 지질-헤파린 코팅된 세포.
제8항에 있어서, 상기 지질 결합 헤파린은 상기 헤파린 1개 당 상기 지질이 평균 0.5 내지 5개가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 지질-헤파린 코팅 세포(lipid-heparin coated cell).
(A) 지질 결합 헤파린을 세포가 포함된 용액에 투입하는 단계를 포함하는 지질-헤파린 코팅된 세포의 제조방법으로서,
상기 지질 결합 헤파린은 제1항에 따라 제조된 것을 특징으로 하는 지질-헤파린 코팅된 세포의 제조방법.
(a) 세포, (b) 지질 결합 헤파린, (c) 염료로 라벨링된 물질을 포함하고,
상기 지질 결합 헤파린은 상기 세포를 코팅하고 있고,
상기 물질은 상기 헤파린과 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 지질-헤파린 코팅된 염색 세포로서,
상기 지질 결합 헤파린은 제1항에 따라 제조된 것을 특징으로 하는 지질-헤파린 코팅된 염색 세포.
제12항에 있어서, 상기 물질은 리소자임, 피브리노겐 중에서 선택된 1종 이상이고,
상기 염료는 Cy5.5, FITC 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 지질-헤파린 코팅된 염색 세포.
(A) 지질 결합 헤파린을 세포가 포함된 용액에 투입하여 지질-헤파린 코팅된 세포를 수득하는 단계,
(B) 상기 지질-헤파린 코팅된 세포를 염색하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 지질-헤파린 코팅된 염색 세포의 제조방법으로서,
상기 지질 결합 헤파린은 제1항에 따라 제조된 것을 특징으로 하는 지질-헤파린 코팅된 염색 세포의 제조방법.
제14항에 있어서, 상기 세포가 포함된 용액 내 혈청 농도는 0.5 내지 5 부피%인 것을 특징으로 하는 지질-헤파린 코팅된 세포의 제조방법.
표적 전달용 지질-헤파린 코팅된 세포로서,
상기 지질-헤파린 코팅된 세포는 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 것임을 특징으로 하는 표적 전달용 지질-헤파린 코팅된 세포.
제16항에 있어서, 상기 표적은 간 또는 비장인 것을 특징으로 하는 표적 전달용 지질-헤파린 코팅된 세포.
표적 전달용 지질-헤파린 코팅된 염색 세포로서,
상기 지질-헤파린 코팅된 염색 세포는 제12항 또는 제13항에 따른 것임을 특징으로 하는 표적 전달용 지질-헤파린 코팅된 염색 세포.
제18항에 있어서, 상기 표적은 간 또는 비장인 것을 특징으로 하는 표적 전달용 지질-헤파린 코팅된 염색 세포.
지질-헤파린 코팅된 세포 또는 지질-헤파린 코팅된 염색 세포 또는 이들의 혼합물 중에서 선택된 1종을 포함하는 표적 전달용 생체적합성 용액으로서,
상기 지질-헤파린 코팅된 세포는 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 것이고,
상기 지질-헤파린 코팅된 염색 세포는 제12항 또는 제13항에 따른 것임을 특징으로 하는 표적 전달용 생체적합성 용액.
제20항에 있어서, 상기 표적은 간 또는 비장인 것을 특징으로 하는 표적 전달용 생체적합성 용액.
제20항에 있어서, 상기 표적 전달용 생체적합성 용액은 주사 가능한(injectable) 것을 특징으로 하는 표적 전달용 생체적합성 용액.