JP2003335801A - 脂質結合グリコサミノグリカンの製造法 - Google Patents
脂質結合グリコサミノグリカンの製造法Info
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- JP2003335801A JP2003335801A JP2002143898A JP2002143898A JP2003335801A JP 2003335801 A JP2003335801 A JP 2003335801A JP 2002143898 A JP2002143898 A JP 2002143898A JP 2002143898 A JP2002143898 A JP 2002143898A JP 2003335801 A JP2003335801 A JP 2003335801A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 グリコサミノグリカンの還元末端に脂質がア
ミノアルキル結合を介して共有結合した脂質結合グリコ
サミノグリカンを収率よく、高純度で得る製造法を提供
すること。 【解決手段】 グリコサミノグリカンの有機溶媒溶解性
塩と１級アミノ基を有する脂質とを、該グリコサミノグ
リカンの有機溶媒溶解性塩および該脂質の双方を溶解し
うる極性有機溶媒中、無水条件下、還元剤の存在下にお
いて反応させ、該グリコサミノグリカンの還元末端糖ア
ルデヒド基と該脂質の１級アミノ基とのアミノアルキル
型結合を形成させることを特徴とする、脂質結合グリコ
サミノグリカンの製造法。
ミノアルキル結合を介して共有結合した脂質結合グリコ
サミノグリカンを収率よく、高純度で得る製造法を提供
すること。 【解決手段】 グリコサミノグリカンの有機溶媒溶解性
塩と１級アミノ基を有する脂質とを、該グリコサミノグ
リカンの有機溶媒溶解性塩および該脂質の双方を溶解し
うる極性有機溶媒中、無水条件下、還元剤の存在下にお
いて反応させ、該グリコサミノグリカンの還元末端糖ア
ルデヒド基と該脂質の１級アミノ基とのアミノアルキル
型結合を形成させることを特徴とする、脂質結合グリコ
サミノグリカンの製造法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、脂質結合グリコサ
ミノグリカンの製造法に関する。
ミノグリカンの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】グリコサミノグリカンの還元末端に脂質
が共有結合した脂質結合グリコサミノグリカンの製造法
としては、例えば特許第2997018号公報、特許第2986519
号公報、特許第2986518号公報、特開平9-30979号公報及
び特開平6-72893号公報に開示された以下の方法が知ら
れている。
が共有結合した脂質結合グリコサミノグリカンの製造法
としては、例えば特許第2997018号公報、特許第2986519
号公報、特許第2986518号公報、特開平9-30979号公報及
び特開平6-72893号公報に開示された以下の方法が知ら
れている。
【０００３】（還元末端限定酸化法）この方法は、グリ
コサミノグリカンの還元末端の糖残基であるガラクトー
ス残基、ウロン酸残基またはヘキソサミン残基を還元
し、限定酸化（部分酸化）することにより、還元末端の
ピラノース環を特異的に開環（開裂）させるとともに、
該グリコサミノグリカンの還元末端にホルミル基を形成
させてアルデヒド化合物とし、このアルデヒド化合物の
ホルミル基（アルデヒド基）と脂質の１級アミノ基とを
反応させてシッフ塩基を形成させ、次いでシッフ塩基を
還元し、アミノアルキル結合（-CH2-NH-）を形成させ
て、グリコサミノグリカンと脂質とを共有結合させる方
法である（P.W. Tang et al., Biochem. Biophys. Res.
Comm. (1985) vol.132, 474-480参照）。
コサミノグリカンの還元末端の糖残基であるガラクトー
ス残基、ウロン酸残基またはヘキソサミン残基を還元
し、限定酸化（部分酸化）することにより、還元末端の
ピラノース環を特異的に開環（開裂）させるとともに、
該グリコサミノグリカンの還元末端にホルミル基を形成
させてアルデヒド化合物とし、このアルデヒド化合物の
ホルミル基（アルデヒド基）と脂質の１級アミノ基とを
反応させてシッフ塩基を形成させ、次いでシッフ塩基を
還元し、アミノアルキル結合（-CH2-NH-）を形成させ
て、グリコサミノグリカンと脂質とを共有結合させる方
法である（P.W. Tang et al., Biochem. Biophys. Res.
Comm. (1985) vol.132, 474-480参照）。
【０００４】（還元末端ラクトン化法）この方法は、グ
リコサミノグリカンの還元末端の糖残基であるガラクト
ース残基、ウロン酸残基またはヘキソサミン残基を酸化
することにより、還元末端のピラノース環を特異的に開
環（開裂）させて該グリコサミノグリカンの還元末端に
カルボキシル基を形成させて、次いでラクトン形成反応
に付すことによって該グリコサミノグリカンの還元末端
をラクトン構造とし、このラクトンと脂質の１級アミノ
基とを反応させて酸アミド結合（-CO-NH-）を形成させ
ることによって、グリコサミノグリカンと脂質とを共有
結合させる方法である（N. Sugiura et al., J. Biol.
Chem. (1993) vol.268, 15779-15787参照）。
リコサミノグリカンの還元末端の糖残基であるガラクト
ース残基、ウロン酸残基またはヘキソサミン残基を酸化
することにより、還元末端のピラノース環を特異的に開
環（開裂）させて該グリコサミノグリカンの還元末端に
カルボキシル基を形成させて、次いでラクトン形成反応
に付すことによって該グリコサミノグリカンの還元末端
をラクトン構造とし、このラクトンと脂質の１級アミノ
基とを反応させて酸アミド結合（-CO-NH-）を形成させ
ることによって、グリコサミノグリカンと脂質とを共有
結合させる方法である（N. Sugiura et al., J. Biol.
Chem. (1993) vol.268, 15779-15787参照）。
【０００５】一方、ラクトース等の中性のオリゴ糖とジ
パルミトイルホスファチジルエタノールアミンをクロロ
ホルムーメタノール混合溶媒中反応させ、シアノ水素化
ホウ素ナトリウム（NaCNBH３）還元剤の存在化さらに反
応させ、該オリゴ糖の還元末端に脂質が共有結合したネ
オグリコリピッドを得る方法が Biochem. J.(1988) 25
6, 661-664, Mark S. STOLL, Tsuguo MIZUOCHI, et. al
に開示されている。
パルミトイルホスファチジルエタノールアミンをクロロ
ホルムーメタノール混合溶媒中反応させ、シアノ水素化
ホウ素ナトリウム（NaCNBH３）還元剤の存在化さらに反
応させ、該オリゴ糖の還元末端に脂質が共有結合したネ
オグリコリピッドを得る方法が Biochem. J.(1988) 25
6, 661-664, Mark S. STOLL, Tsuguo MIZUOCHI, et. al
に開示されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、高分子の酸
性多糖であるグリコサミノグリカンの還元末端に脂質が
アミノアルキル結合を介して共有結合した脂質結合グリ
コサミノグリカンを従来法より収率よく、高純度で得る
製造法を提供することを目的とする。
性多糖であるグリコサミノグリカンの還元末端に脂質が
アミノアルキル結合を介して共有結合した脂質結合グリ
コサミノグリカンを従来法より収率よく、高純度で得る
製造法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明の発明者らは、上
記課題を鑑みて鋭意検討した結果、グリコサミノグリカ
ンの有機溶媒溶解性塩と１級アミノ基を有する脂質と
を、該グリコサミノグリカンの有機溶媒溶解性塩および
該脂質の双方を溶解しうる極性有機溶媒中、無水条件
化、還元剤の存在下において反応させることにより、グ
リコサミノグリカンの還元末端に脂質がアミノアルキル
結合を介して共有結合した脂質結合グリコサミノグリカ
ンが高純度、高収率で得られることを見出し、本発明を
完成するに至った。すなわち、本発明は、医薬等として
有用な脂質結合グリコサミノグリカンを従来法より収率
よく、高純度で得る製造法を提供することをその要旨と
する。
記課題を鑑みて鋭意検討した結果、グリコサミノグリカ
ンの有機溶媒溶解性塩と１級アミノ基を有する脂質と
を、該グリコサミノグリカンの有機溶媒溶解性塩および
該脂質の双方を溶解しうる極性有機溶媒中、無水条件
化、還元剤の存在下において反応させることにより、グ
リコサミノグリカンの還元末端に脂質がアミノアルキル
結合を介して共有結合した脂質結合グリコサミノグリカ
ンが高純度、高収率で得られることを見出し、本発明を
完成するに至った。すなわち、本発明は、医薬等として
有用な脂質結合グリコサミノグリカンを従来法より収率
よく、高純度で得る製造法を提供することをその要旨と
する。
【０００８】
【発明の実施の形態】以下、発明の実施の形態により本
発明を詳説する。本発明のグリコサミノグリカンは、D-
グルコサミン又はD-ガラクトサミンと、D-グルクロン
酸、L-イズロン酸及び／又はD-ガラクトースの2糖の繰
り返し単位を基本骨格として構成される多糖であり、動
物等の天然物から抽出されたもの、微生物を培養して得
られたもの、化学的もしくは酵素的に合成されたもの等
のいずれも使用することができる。具体的には例えばヒ
アルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸（コ
ンドロイチン硫酸A、コンドロイチン硫酸C、コンドロイ
チン硫酸D、コンドロイチン硫酸E、コンドロイチン硫酸
K、コンドロイチンポリ硫酸等）、デルマタン硫酸、ヘ
パリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸（ケラタンポリ硫
酸も含まれる）等が挙げられ、コンドロイチン硫酸、ヘ
パリン及びヒアルロン酸が好ましく、特にコンドロイチ
ン硫酸が好ましいが、これらに限定されるものではな
い。
発明を詳説する。本発明のグリコサミノグリカンは、D-
グルコサミン又はD-ガラクトサミンと、D-グルクロン
酸、L-イズロン酸及び／又はD-ガラクトースの2糖の繰
り返し単位を基本骨格として構成される多糖であり、動
物等の天然物から抽出されたもの、微生物を培養して得
られたもの、化学的もしくは酵素的に合成されたもの等
のいずれも使用することができる。具体的には例えばヒ
アルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸（コ
ンドロイチン硫酸A、コンドロイチン硫酸C、コンドロイ
チン硫酸D、コンドロイチン硫酸E、コンドロイチン硫酸
K、コンドロイチンポリ硫酸等）、デルマタン硫酸、ヘ
パリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸（ケラタンポリ硫
酸も含まれる）等が挙げられ、コンドロイチン硫酸、ヘ
パリン及びヒアルロン酸が好ましく、特にコンドロイチ
ン硫酸が好ましいが、これらに限定されるものではな
い。
【０００９】コンドロイチン硫酸の分子量は、一般に約
1,000〜100,000程度であるが、約2,000〜80,000程度が
好ましく、特に約3,000〜70,000が好ましい。ヘパリン
及びヘパラン硫酸の分子量は一般に約1,000〜60,000程
度であるが、約2,000〜18,000程度が好ましく、特に約
2,500〜17,000が好ましい。また、ヒアルロン酸の分子
量は一般に約1,000〜15,000,000程度であるが、約5,000
〜10,000,000程度が好ましく、特に約10,000〜1,000,00
0が好ましい。尚、グリコサミノグリカンの分子量と
は、通常平均分子量を意味し、一般的には極限粘度から
算出される重量平均分子量を指称する。
1,000〜100,000程度であるが、約2,000〜80,000程度が
好ましく、特に約3,000〜70,000が好ましい。ヘパリン
及びヘパラン硫酸の分子量は一般に約1,000〜60,000程
度であるが、約2,000〜18,000程度が好ましく、特に約
2,500〜17,000が好ましい。また、ヒアルロン酸の分子
量は一般に約1,000〜15,000,000程度であるが、約5,000
〜10,000,000程度が好ましく、特に約10,000〜1,000,00
0が好ましい。尚、グリコサミノグリカンの分子量と
は、通常平均分子量を意味し、一般的には極限粘度から
算出される重量平均分子量を指称する。
【００１０】また、上述のグリコサミノグリカンに結合
させる脂質としては、動物、植物、微生物などの天然物
由来、又は化学的もしくは酵素的に合成もしくは部分的
に分解された複合脂質又は単純脂質を使用することがで
き、リン脂質等のグリセロ脂質、長鎖の脂肪酸、長鎖の
脂肪族アミン、コレステロール類、スフィンゴ脂質、セ
ラミド等いずれも使用することができる。特にホスファ
チジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホス
ファチジルセリン、ホスファチジルトレオニン、エタノ
ールアミンプラスマロゲン、セリンプラスマロゲン、リ
ゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルイノシト
ール等のリン脂質、モノアシルグリセロール、ジアシル
グリセロール等の中性脂質等のグリセロ脂質が好まし
い。これらのうち、リン脂質が特に好ましく、ホスファ
チジルエタノールアミンがより好ましい。
させる脂質としては、動物、植物、微生物などの天然物
由来、又は化学的もしくは酵素的に合成もしくは部分的
に分解された複合脂質又は単純脂質を使用することがで
き、リン脂質等のグリセロ脂質、長鎖の脂肪酸、長鎖の
脂肪族アミン、コレステロール類、スフィンゴ脂質、セ
ラミド等いずれも使用することができる。特にホスファ
チジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホス
ファチジルセリン、ホスファチジルトレオニン、エタノ
ールアミンプラスマロゲン、セリンプラスマロゲン、リ
ゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルイノシト
ール等のリン脂質、モノアシルグリセロール、ジアシル
グリセロール等の中性脂質等のグリセロ脂質が好まし
い。これらのうち、リン脂質が特に好ましく、ホスファ
チジルエタノールアミンがより好ましい。
【００１１】アシル基を有する脂質中のアシル基の鎖長
及び不飽和度は特に限定されないが、炭素数6以上のも
のが好ましい。アシル基としては例えばパルミトイル
（ヘキサデカノイル）又はステアロイル（オクタデカノ
イル）などが例示される。また、これらの脂質は通常使
用される薬理学的に許容される塩であってもよい。以
下、本発明の脂質結合グリコサミノグリカンの製造法に
つき詳説する。
及び不飽和度は特に限定されないが、炭素数6以上のも
のが好ましい。アシル基としては例えばパルミトイル
（ヘキサデカノイル）又はステアロイル（オクタデカノ
イル）などが例示される。また、これらの脂質は通常使
用される薬理学的に許容される塩であってもよい。以
下、本発明の脂質結合グリコサミノグリカンの製造法に
つき詳説する。
【００１２】〈ヘミアセタール法〉通常、糖鎖の還元末
端糖は、環状構造と開環構造の平衡状態にあり、開環構
造ではアルデヒド基が生じ、そこにアミノ基を有する脂
質を加えるとシッフ塩基が形成される。この反応も平衡
反応であり、その割合は反応条件により大きく変わる。
ここに選択的還元剤を添加するとシッフ塩基が還元（水
素付加）され、アミノアルキル型結合体が形成される。
本発明の脂質結合グリコサミノグリカンの製造法は、こ
のヘミアセタール法を高分子の酸性多糖であるグリコサ
ミノグリカンと１級アミンを有する脂質との反応に利用
するに際し、グリコサミノグリカンに適した反応条件を
見出したことに基づくものである。本方法の反応式は以
下に示される。
端糖は、環状構造と開環構造の平衡状態にあり、開環構
造ではアルデヒド基が生じ、そこにアミノ基を有する脂
質を加えるとシッフ塩基が形成される。この反応も平衡
反応であり、その割合は反応条件により大きく変わる。
ここに選択的還元剤を添加するとシッフ塩基が還元（水
素付加）され、アミノアルキル型結合体が形成される。
本発明の脂質結合グリコサミノグリカンの製造法は、こ
のヘミアセタール法を高分子の酸性多糖であるグリコサ
ミノグリカンと１級アミンを有する脂質との反応に利用
するに際し、グリコサミノグリカンに適した反応条件を
見出したことに基づくものである。本方法の反応式は以
下に示される。
【００１３】
【化１】
【００１４】式中、Sは３位または４位にグリコシド結
合したグリコサミノグリカン糖鎖を示し；RはOH、OS
O3 -、NHCOCH3またはNHSO3 -を示し；XはH、COO-、CH2OH
またはCH 2OSO3 -を示し；Wは３位または４位のOHまたはO
SO3 -を示し；NH2-Yは１級アミノ基を有する脂質を示
し；Zは還元剤を示す。
合したグリコサミノグリカン糖鎖を示し；RはOH、OS
O3 -、NHCOCH3またはNHSO3 -を示し；XはH、COO-、CH2OH
またはCH 2OSO3 -を示し；Wは３位または４位のOHまたはO
SO3 -を示し；NH2-Yは１級アミノ基を有する脂質を示
し；Zは還元剤を示す。
【００１５】具体的には、グリコサミノグリカンがナト
リウム塩等のアルカリ金属塩である場合等、以下の方法
で有機溶媒溶解性塩とすることができる。すなわち、Do
wex50W-X8、Dowex 50W-X12、Dowex 50W-X4（いずれも室
町化学社製）、Amberlite IR-120、Amberlite IRC-50
（いずれもオルガノ社製）、Duolite 225、Duolite C26
C（いずれもダイアプロシム社製）、Bio-Rex 70、Chele
x 100、AG 50W-X8（いずれもバイオラド社製）、SE Cel
lulose（ワットマン社製）等のＨ＋型の陽イオン交換樹
脂に通して脱陽イオン化して遊離型とし、ただちにテト
ラブチルアンモニウム等の有機アミンあるいはその水溶
液を添加し、ｐＨを弱酸性から中性に調整する。この溶
液を減圧濃縮し、室温で約３日間凍結乾燥して有機溶媒
溶解性のグリコサミノグリカン有機アミン塩乾燥粉末を
得ることができる。
リウム塩等のアルカリ金属塩である場合等、以下の方法
で有機溶媒溶解性塩とすることができる。すなわち、Do
wex50W-X8、Dowex 50W-X12、Dowex 50W-X4（いずれも室
町化学社製）、Amberlite IR-120、Amberlite IRC-50
（いずれもオルガノ社製）、Duolite 225、Duolite C26
C（いずれもダイアプロシム社製）、Bio-Rex 70、Chele
x 100、AG 50W-X8（いずれもバイオラド社製）、SE Cel
lulose（ワットマン社製）等のＨ＋型の陽イオン交換樹
脂に通して脱陽イオン化して遊離型とし、ただちにテト
ラブチルアンモニウム等の有機アミンあるいはその水溶
液を添加し、ｐＨを弱酸性から中性に調整する。この溶
液を減圧濃縮し、室温で約３日間凍結乾燥して有機溶媒
溶解性のグリコサミノグリカン有機アミン塩乾燥粉末を
得ることができる。
【００１６】次いでグリコサミノグリカンの有機溶媒溶
解性塩と１級アミノ基を有する脂質とを、該グリコサミ
ノグリカンの有機溶媒溶解性塩および該脂質の双方を溶
解しうる極性有機溶媒中、無水条件下、還元剤の存在下
において反応させ、該グリコサミノグリカンの還元末端
糖アルデヒド基と該脂質の１級アミノ基とのアミノアル
キル型結合を形成させることにより脂質結合グリコサミ
ノグリカンを合成する。具体的には、例えば上記の有機
アミン塩乾燥粉末に無水極性有機溶媒を溶解し、その溶
液をホスファチジルエタノールアミン等脂質の無水極性
有機溶媒溶液に添加する。得られた混合液を窒素雰囲気
下、20℃〜120℃で1〜24時間撹拌後、還元剤を加え更に
20℃〜120℃で1〜24時間撹拌を続ける。上記還元剤を更
に約24時間おきに２回添加し、20℃〜120℃で1〜72時間
反応させ、シッフ塩基形成、還元アミノ化反応を完結さ
せる。
解性塩と１級アミノ基を有する脂質とを、該グリコサミ
ノグリカンの有機溶媒溶解性塩および該脂質の双方を溶
解しうる極性有機溶媒中、無水条件下、還元剤の存在下
において反応させ、該グリコサミノグリカンの還元末端
糖アルデヒド基と該脂質の１級アミノ基とのアミノアル
キル型結合を形成させることにより脂質結合グリコサミ
ノグリカンを合成する。具体的には、例えば上記の有機
アミン塩乾燥粉末に無水極性有機溶媒を溶解し、その溶
液をホスファチジルエタノールアミン等脂質の無水極性
有機溶媒溶液に添加する。得られた混合液を窒素雰囲気
下、20℃〜120℃で1〜24時間撹拌後、還元剤を加え更に
20℃〜120℃で1〜24時間撹拌を続ける。上記還元剤を更
に約24時間おきに２回添加し、20℃〜120℃で1〜72時間
反応させ、シッフ塩基形成、還元アミノ化反応を完結さ
せる。
【００１７】上記反応の反応生成物を反応液から精製す
る方法は特に限定されるものではないが、以下の方法に
より効率よく精製し、高純度の脂質結合グリコサミノグ
リカンを製造することができる。すなわち、例えば反応
液を濃縮した後、酢酸ナトリウム等の塩類を加え、精製
した不溶物を除去し、上清に酢酸ナトリウム等の塩類を
含む有機溶媒（エタノール等）を添加して粗精製物を沈
殿させ、粗精製物を疎水クロマトグラフィー担体（疎水
性担体）を用いて塩類存在下で疎水クロマトグラフィー
によって精製することができる。具体的には粗精製物の
水溶液又は含水有機溶媒溶液（水−メタノール、水−ア
セトニトリル、水−ジメチルホルムアミド（DMF）、水
−ジメチルスルホキサイド（DMSO）、水−アセトン等）
とブチルセルロファイン（生化学工業（株）製）ゲルな
どの疎水性担体を混合し、次いで塩化ナトリウム（NaC
l）、塩化カリウム（KCl）、塩化カルシウム（CaC
l2）、酢酸ナトリウム（NaOAc）、酢酸カリウム（KOA
c）、炭酸水素ナトリウム（NaHCO3）、炭酸ナトリウム
（Na2CO3）、クエン酸ナトリウム（Na3C6H5O7）等の塩
または塩溶液を加えて、該疎水性担体に粗精製物を吸着
させ、次いで脱塩水あるいは水−メタノール、水−アセ
トニトリル、水−DMF、水−DMSO、水−アセトン等の含
水有機溶媒で溶出を行うことにより目的の脂質結合グリ
コサミノグリカンを得ることができる。
る方法は特に限定されるものではないが、以下の方法に
より効率よく精製し、高純度の脂質結合グリコサミノグ
リカンを製造することができる。すなわち、例えば反応
液を濃縮した後、酢酸ナトリウム等の塩類を加え、精製
した不溶物を除去し、上清に酢酸ナトリウム等の塩類を
含む有機溶媒（エタノール等）を添加して粗精製物を沈
殿させ、粗精製物を疎水クロマトグラフィー担体（疎水
性担体）を用いて塩類存在下で疎水クロマトグラフィー
によって精製することができる。具体的には粗精製物の
水溶液又は含水有機溶媒溶液（水−メタノール、水−ア
セトニトリル、水−ジメチルホルムアミド（DMF）、水
−ジメチルスルホキサイド（DMSO）、水−アセトン等）
とブチルセルロファイン（生化学工業（株）製）ゲルな
どの疎水性担体を混合し、次いで塩化ナトリウム（NaC
l）、塩化カリウム（KCl）、塩化カルシウム（CaC
l2）、酢酸ナトリウム（NaOAc）、酢酸カリウム（KOA
c）、炭酸水素ナトリウム（NaHCO3）、炭酸ナトリウム
（Na2CO3）、クエン酸ナトリウム（Na3C6H5O7）等の塩
または塩溶液を加えて、該疎水性担体に粗精製物を吸着
させ、次いで脱塩水あるいは水−メタノール、水−アセ
トニトリル、水−DMF、水−DMSO、水−アセトン等の含
水有機溶媒で溶出を行うことにより目的の脂質結合グリ
コサミノグリカンを得ることができる。
【００１８】上記の粗精製物の疎水クロマトグラフィー
による精製時、例えば、粗精製物の水溶液（脱塩水）と
疎水性担体をまず混合させ、そこに塩（溶液）を加える
ことで脂質結合グリコサミノグリカンの自己会合（ミセ
ル化）を防いで効率よく該担体に吸着させ、次いで溶出
させることにより、高い収率で高純度の脂質結合グリコ
サミノグリカンを得ることができる。
による精製時、例えば、粗精製物の水溶液（脱塩水）と
疎水性担体をまず混合させ、そこに塩（溶液）を加える
ことで脂質結合グリコサミノグリカンの自己会合（ミセ
ル化）を防いで効率よく該担体に吸着させ、次いで溶出
させることにより、高い収率で高純度の脂質結合グリコ
サミノグリカンを得ることができる。
【００１９】ここにおいてグリコサミノグリカンを有機
溶媒可溶性にするために使用する有機アミンとしては、
テトラブチルアンモニウムの他、トリエチルアミン、ト
リエタノールアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミ
ン、テトラエチルアンモニウム、エタノールアミン、プ
トレシン等が挙げられる。シッフ塩基形成、還元アミノ
化反応を行う際に使用する極性有機溶媒としては、メタ
ノール、アセトニトリル、DMF、DMSO、ヘキサメチルホ
スホルアミド、Ｎ−メチルピロリドン等が例示される。
これら極性有機溶媒は単独であるいは混合物で用いられ
るが、好ましくは単独で、より好ましくはメタノール単
独で用いられる。還元剤としてはシアノ水素化ホウ素ナ
トリウム（NaCNBH３）、トリメチルアミンボラン複合体
（(CH3)3N・BH3）、ジメチルアミンボラン複合体（(CH3)
2NH・BH3）、トリエチルアミンボラン複合体（(C2H5)3N・
BH3）、ピリジンボラン複合体 (C6H5N・BH3) 等が例示さ
れ、好ましくはトリメチルアミンボラン複合体が用いら
れる。
溶媒可溶性にするために使用する有機アミンとしては、
テトラブチルアンモニウムの他、トリエチルアミン、ト
リエタノールアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミ
ン、テトラエチルアンモニウム、エタノールアミン、プ
トレシン等が挙げられる。シッフ塩基形成、還元アミノ
化反応を行う際に使用する極性有機溶媒としては、メタ
ノール、アセトニトリル、DMF、DMSO、ヘキサメチルホ
スホルアミド、Ｎ−メチルピロリドン等が例示される。
これら極性有機溶媒は単独であるいは混合物で用いられ
るが、好ましくは単独で、より好ましくはメタノール単
独で用いられる。還元剤としてはシアノ水素化ホウ素ナ
トリウム（NaCNBH３）、トリメチルアミンボラン複合体
（(CH3)3N・BH3）、ジメチルアミンボラン複合体（(CH3)
2NH・BH3）、トリエチルアミンボラン複合体（(C2H5)3N・
BH3）、ピリジンボラン複合体 (C6H5N・BH3) 等が例示さ
れ、好ましくはトリメチルアミンボラン複合体が用いら
れる。
【００２０】粗精製物の精製に用いられる疎水性担体と
しては、ブチルセルロファインの他フェニルセルロファ
イン、オクチルセルロファイン（いずれも生化学工業
（株）製）、フェニルセファロース、オクチルセファロ
ース、フェニルスーパーロース（いずれもファルマシア
社製）、フェニルトヨパール、 TSK gelスチレン 250、
TSK gel ODS-4PW（いずれも東ソー社製）、ODS シリカ
ゲル Cosmosil C18（コスモバイオ社製）等が挙げられ
る。
しては、ブチルセルロファインの他フェニルセルロファ
イン、オクチルセルロファイン（いずれも生化学工業
（株）製）、フェニルセファロース、オクチルセファロ
ース、フェニルスーパーロース（いずれもファルマシア
社製）、フェニルトヨパール、 TSK gelスチレン 250、
TSK gel ODS-4PW（いずれも東ソー社製）、ODS シリカ
ゲル Cosmosil C18（コスモバイオ社製）等が挙げられ
る。
【００２１】上記の方法で得られる脂質結合グリコサミ
ノグリカンの具体例としては、ジパルミトイル-L-(α-
ホスファチジル)エタノールアミン結合コンドロイチン
硫酸、ジパルミトイル-L-(α-ホスファチジル)エタノー
ルアミン結合デルマタン硫酸、ジパルミトイル-L-(α-
ホスファチジル)エタノールアミン結合ヒアルロン酸、
ジパルミトイル-L-(α-ホスファチジル)エタノールアミ
ン結合ヘパリン、ジパルミトイル-L-(α-ホスファチジ
ル)エタノールアミン結合ヘパラン硫酸、ステアロイル
パルミトイルホスファチジルセリン結合コンドロイチン
硫酸、モノステアロイルグリセロール・コハク酸エステ
ル結合コンドロイチン硫酸等が挙げられる。
ノグリカンの具体例としては、ジパルミトイル-L-(α-
ホスファチジル)エタノールアミン結合コンドロイチン
硫酸、ジパルミトイル-L-(α-ホスファチジル)エタノー
ルアミン結合デルマタン硫酸、ジパルミトイル-L-(α-
ホスファチジル)エタノールアミン結合ヒアルロン酸、
ジパルミトイル-L-(α-ホスファチジル)エタノールアミ
ン結合ヘパリン、ジパルミトイル-L-(α-ホスファチジ
ル)エタノールアミン結合ヘパラン硫酸、ステアロイル
パルミトイルホスファチジルセリン結合コンドロイチン
硫酸、モノステアロイルグリセロール・コハク酸エステ
ル結合コンドロイチン硫酸等が挙げられる。
【００２２】上記方法で得られる脂質結合グリコサミノ
グリカンの収率は、原料グリコサミノグリカンに対し
て、グリコサミノグリカンがコンドロイチン硫酸の場
合、約３１〜４４％、デルマタン硫酸の場合、約２９
％、ヒアルロン酸の場合、約３３％、ヘパリンの場合、
約７．５％、ヘパラン硫酸の場合、約２７〜３２％であ
り、得られる脂質結合グリコサミノグリカンの純度はほ
ぼ１００％である。
グリカンの収率は、原料グリコサミノグリカンに対し
て、グリコサミノグリカンがコンドロイチン硫酸の場
合、約３１〜４４％、デルマタン硫酸の場合、約２９
％、ヒアルロン酸の場合、約３３％、ヘパリンの場合、
約７．５％、ヘパラン硫酸の場合、約２７〜３２％であ
り、得られる脂質結合グリコサミノグリカンの純度はほ
ぼ１００％である。
【００２３】これら脂質結合グリコサミノグリカンは、
安定で低毒性であり、細胞接着阻害活性、滑膜細胞伸展
阻害活性、神経突起伸展作用、骨誘導促進作用、上皮細
胞伸展促進作用等を有することから癌転移抑制剤、抗リ
ウマチ剤、神経疾患治療剤、上皮細胞伸展促進剤等の医
薬としての用途が期待される。
安定で低毒性であり、細胞接着阻害活性、滑膜細胞伸展
阻害活性、神経突起伸展作用、骨誘導促進作用、上皮細
胞伸展促進作用等を有することから癌転移抑制剤、抗リ
ウマチ剤、神経疾患治療剤、上皮細胞伸展促進剤等の医
薬としての用途が期待される。
【００２４】
【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に詳説す
る。 実施例１ サメ由来コンドロイチン硫酸（ＣＳ）ナトリウム塩（生
化学工業（株）製、平均分子量：20,000）２．０ｇを蒸
留水１００ｍｌに溶解し、Dowex 50W-X8（室町化学社
製、H+form）カラム（2.5cmφ × 6.5cm）にアプライ
し、ナトリウム塩フリーとなった通過液を氷浴上で集
め、更に１００ｍｌの蒸留水を流し洗浄液として一緒に
集めた。通過液集積開始からｐＨをモニターし、テトラ
ブチルアンモニウム（But4N+）水溶液を添加し、ｐＨを
弱酸性から中性に調整した。その溶液（約２００ｍｌ）
をロータリーエバポレーターで約１００ｍｌまで減圧濃
縮し、室温で３日間凍結乾燥して、CS・But4N+ 塩を乾燥
粉末として得た。この時の収率はほぼ定量的であった。
る。 実施例１ サメ由来コンドロイチン硫酸（ＣＳ）ナトリウム塩（生
化学工業（株）製、平均分子量：20,000）２．０ｇを蒸
留水１００ｍｌに溶解し、Dowex 50W-X8（室町化学社
製、H+form）カラム（2.5cmφ × 6.5cm）にアプライ
し、ナトリウム塩フリーとなった通過液を氷浴上で集
め、更に１００ｍｌの蒸留水を流し洗浄液として一緒に
集めた。通過液集積開始からｐＨをモニターし、テトラ
ブチルアンモニウム（But4N+）水溶液を添加し、ｐＨを
弱酸性から中性に調整した。その溶液（約２００ｍｌ）
をロータリーエバポレーターで約１００ｍｌまで減圧濃
縮し、室温で３日間凍結乾燥して、CS・But4N+ 塩を乾燥
粉末として得た。この時の収率はほぼ定量的であった。
【００２５】その乾燥粉末を脱水メタノール５０ｍｌに
溶解し、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミ
ン（ＰＥ）２０８ｍｇ（３００μｍｏｌ）の脱水メタノ
ール溶液５０ｍｌを添加した。窒素雰囲気下、５０℃で
１時間撹拌した後、(CH3)3N・BH3７３．０ｍｇを加え、
更に５０℃で撹拌を続けた。(CH3)3N・BH3 を更に（７３
ｍｇずつ）２回（２４時間おき）添加し、５０℃で３日
間反応させた。反応液を少量（約２００μｌ）サンプリ
ングし、減圧濃縮後、０．２Ｍ NaCl水溶液（２００μ
ｌ）を加え、沈殿を除去し、その濾液（約５０μｌ）を
Superose6 HR 10/30 カラム（アマシャムファルマシア
製）にアプライし、クロマトグラフィーを行ったとこ
ろ、高分子側に移行した反応生成物は約４０％と見積も
られた。
溶解し、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミ
ン（ＰＥ）２０８ｍｇ（３００μｍｏｌ）の脱水メタノ
ール溶液５０ｍｌを添加した。窒素雰囲気下、５０℃で
１時間撹拌した後、(CH3)3N・BH3７３．０ｍｇを加え、
更に５０℃で撹拌を続けた。(CH3)3N・BH3 を更に（７３
ｍｇずつ）２回（２４時間おき）添加し、５０℃で３日
間反応させた。反応液を少量（約２００μｌ）サンプリ
ングし、減圧濃縮後、０．２Ｍ NaCl水溶液（２００μ
ｌ）を加え、沈殿を除去し、その濾液（約５０μｌ）を
Superose6 HR 10/30 カラム（アマシャムファルマシア
製）にアプライし、クロマトグラフィーを行ったとこ
ろ、高分子側に移行した反応生成物は約４０％と見積も
られた。
【００２６】反応液を減圧濃縮後、メタノールを加え減
圧濃縮を繰り返し、その残渣に０．２M 酢酸ナトリウ
ム（NaOAc） ４０ｍｌを加えた。室温で約２時間撹拌し
た後、遠心分離（６，０００ｒｐｍ、３０分以上）によ
り不溶物を除去し、その上清にNaOAc飽和エタノールを
３倍容（１２０ｍｌ）加えて４℃で２時間以上置き、生
成した沈殿を遠心分離（４℃、６，０００ｒｐｍ、３０
分以上）により集めた。その沈殿を乾燥させずに、水５
０ｍｌおよびメタノール５０ｍｌを加え、溶解させた。
その溶液にブチルセルロファイン type H（生化学工業
（株）製）ゲル５ｇを添加した。その懸濁液をゆっくり
と撹拌しながら、１Ｍ NaCl（２０ｍｌ）をゆっくり滴
下して、反応生成物を吸着させた。４℃で２時間撹拌
後、カラム（2.5cmφ× 8.0cm）に充填した。溶液を抜
き、０．２Ｍ NaCl２００ｍｌで洗浄した後、蒸留水５
０ｍｌおよび３０％（ｖ／ｖ）メタノール−蒸留水混液
２００ｍｌで溶出した。溶出液中のメタノールを留去
し、その残留液に飽和NaOAc−９５％（ｖ／ｖ）エタノ
ールを３倍容加え、生成した沈殿を遠心分離により集め
た。沈殿をエタノールで再洗浄して濾取、真空乾燥する
ことで、求めるコンドロイチン硫酸−リン脂質結合体
（ＣＳ−ＰＥ）が０．８ｇ（収率 ４０％）得られた。
この標品の純度はSuperose FPLCで１００％であった。
圧濃縮を繰り返し、その残渣に０．２M 酢酸ナトリウ
ム（NaOAc） ４０ｍｌを加えた。室温で約２時間撹拌し
た後、遠心分離（６，０００ｒｐｍ、３０分以上）によ
り不溶物を除去し、その上清にNaOAc飽和エタノールを
３倍容（１２０ｍｌ）加えて４℃で２時間以上置き、生
成した沈殿を遠心分離（４℃、６，０００ｒｐｍ、３０
分以上）により集めた。その沈殿を乾燥させずに、水５
０ｍｌおよびメタノール５０ｍｌを加え、溶解させた。
その溶液にブチルセルロファイン type H（生化学工業
（株）製）ゲル５ｇを添加した。その懸濁液をゆっくり
と撹拌しながら、１Ｍ NaCl（２０ｍｌ）をゆっくり滴
下して、反応生成物を吸着させた。４℃で２時間撹拌
後、カラム（2.5cmφ× 8.0cm）に充填した。溶液を抜
き、０．２Ｍ NaCl２００ｍｌで洗浄した後、蒸留水５
０ｍｌおよび３０％（ｖ／ｖ）メタノール−蒸留水混液
２００ｍｌで溶出した。溶出液中のメタノールを留去
し、その残留液に飽和NaOAc−９５％（ｖ／ｖ）エタノ
ールを３倍容加え、生成した沈殿を遠心分離により集め
た。沈殿をエタノールで再洗浄して濾取、真空乾燥する
ことで、求めるコンドロイチン硫酸−リン脂質結合体
（ＣＳ−ＰＥ）が０．８ｇ（収率 ４０％）得られた。
この標品の純度はSuperose FPLCで１００％であった。
【００２７】実施例２
ウシ気管軟骨由来コンドロイチン硫酸（ＣＳ（Ｔ），生
化学工業（株）製、平均分子量１２，０００）１．０ｇ
を実施例１と同様にして、塩交換をし、ジパルミトイル
ホスファチジルエタノールアミンと反応させて、疎水ク
ロマトグラフィーで精製して、目的のコンドロイチン硫
酸−脂質結合体（ＣＳ（Ｔ）−ＰＥ）を合成した。収量
０．４４ｇ、収率４４％。
化学工業（株）製、平均分子量１２，０００）１．０ｇ
を実施例１と同様にして、塩交換をし、ジパルミトイル
ホスファチジルエタノールアミンと反応させて、疎水ク
ロマトグラフィーで精製して、目的のコンドロイチン硫
酸−脂質結合体（ＣＳ（Ｔ）−ＰＥ）を合成した。収量
０．４４ｇ、収率４４％。
【００２８】実施例３
クジラ軟骨由来コンドロイチン硫酸（ＣＳ（Ｗ），生化
学工業（株）製、平均分子量１５，０００）１．０ｇを
実施例１と同様にして、塩交換をし、ジパルミトイルホ
スファチジルエタノールアミンと反応させて、疎水クロ
マトグラフィーで精製して、目的のコンドロイチン硫酸
−脂質結合体（ＣＳ（Ｗ）−ＰＥ）を合成した。収量
０．３１ｇ、収率３１％。
学工業（株）製、平均分子量１５，０００）１．０ｇを
実施例１と同様にして、塩交換をし、ジパルミトイルホ
スファチジルエタノールアミンと反応させて、疎水クロ
マトグラフィーで精製して、目的のコンドロイチン硫酸
−脂質結合体（ＣＳ（Ｗ）−ＰＥ）を合成した。収量
０．３１ｇ、収率３１％。
【００２９】実施例４
チョウザメ軟骨由来コンドロイチン硫酸（ＣＳＡ，生化
学工業（株）製、平均分子量１０，０００）０．５ｇを
実施例１と同様にして、塩交換をし、ジパルミトイルホ
スファチジルエタノールアミンと反応させて、疎水クロ
マトグラフィーで精製して、目的のコンドロイチン硫酸
−脂質結合体（ＣＳＡ−ＰＥ）を合成した。収量０．１
６ｇ、収率３２％。
学工業（株）製、平均分子量１０，０００）０．５ｇを
実施例１と同様にして、塩交換をし、ジパルミトイルホ
スファチジルエタノールアミンと反応させて、疎水クロ
マトグラフィーで精製して、目的のコンドロイチン硫酸
−脂質結合体（ＣＳＡ−ＰＥ）を合成した。収量０．１
６ｇ、収率３２％。
【００３０】実施例５
ニワトリ鶏冠由来デルマタン硫酸（ＤＳ，生化学工業
（株）製、平均分子量３２，０００）０．８ｇを実施例
１と同様にして、塩交換をし、ジパルミトイルホスファ
チジルエタノールアミンと反応させて、疎水クロマトグ
ラフィーで精製して、目的のデルマタン硫酸−脂質結合
体（ＤＳ−ＰＥ）を合成した。収量０．２３ｇ、収率２
９％。
（株）製、平均分子量３２，０００）０．８ｇを実施例
１と同様にして、塩交換をし、ジパルミトイルホスファ
チジルエタノールアミンと反応させて、疎水クロマトグ
ラフィーで精製して、目的のデルマタン硫酸−脂質結合
体（ＤＳ−ＰＥ）を合成した。収量０．２３ｇ、収率２
９％。
【００３１】実施例６
低分子化ニワトリ鶏冠由来ヒアルロン酸（ＨＡ、生化学
工業（株）製、平均分子量２３，０００）０．９ｇを実
施例１と同様にして、塩交換をし、ジパルミトイルホス
ファチジルエタノールアミンと反応させて、ヒアルロン
酸−脂質結合体（ＨＡ−ＰＥ）０．３ｇ（収率 ３３
％）を得た。
工業（株）製、平均分子量２３，０００）０．９ｇを実
施例１と同様にして、塩交換をし、ジパルミトイルホス
ファチジルエタノールアミンと反応させて、ヒアルロン
酸−脂質結合体（ＨＡ−ＰＥ）０．３ｇ（収率 ３３
％）を得た。
【００３２】実施例７
ウシ腸管由来ヘパリン（Ｈｅｐ、和光純薬工業社製、平
均分子量１０，０００）６．０ｇを実施例１と同様にし
て、塩交換をし、ジパルミトイルホスファチジルエタノ
ールアミンと反応させて、ヘパリン−脂質結合体（Ｈｅ
ｐ−ＰＥ）０．４５ｇ（収率 ７．５％）を得た。
均分子量１０，０００）６．０ｇを実施例１と同様にし
て、塩交換をし、ジパルミトイルホスファチジルエタノ
ールアミンと反応させて、ヘパリン−脂質結合体（Ｈｅ
ｐ−ＰＥ）０．４５ｇ（収率 ７．５％）を得た。
【００３３】実施例８
ブタ大動脈由来ヘパラン硫酸（ＨＳ（ＰＡ）、生化学工
業（株）製、平均分子量１０，０００）０．４４ｇを実
施例１と同様にして、塩交換をし、ジパルミトイルホス
ファチジルエタノールアミンと反応させて、ヘパラン硫
酸−脂質結合体（ＨＳ（ＰＡ）−ＰＥ）０．１４ｇ（収
率 ３２％）を得た。
業（株）製、平均分子量１０，０００）０．４４ｇを実
施例１と同様にして、塩交換をし、ジパルミトイルホス
ファチジルエタノールアミンと反応させて、ヘパラン硫
酸−脂質結合体（ＨＳ（ＰＡ）−ＰＥ）０．１４ｇ（収
率 ３２％）を得た。
【００３４】実施例９
ブタ腎臓由来ヘパラン硫酸（ＨＳ（ＰＫ）、生化学工業
（株）製、平均分子量１０，０００）０．４ｇを実施例
１と同様にして、塩交換をし、ジパルミトイルホスファ
チジルエタノールアミンと反応させて、ヘパラン硫酸−
脂質結合体（ＨＳ（ＰＫ）−ＰＥ）０．１２ｇ（収率
３０％）を得た。
（株）製、平均分子量１０，０００）０．４ｇを実施例
１と同様にして、塩交換をし、ジパルミトイルホスファ
チジルエタノールアミンと反応させて、ヘパラン硫酸−
脂質結合体（ＨＳ（ＰＫ）−ＰＥ）０．１２ｇ（収率
３０％）を得た。
【００３５】実施例１０
マウスＥＨＳ腫瘍由来ヘパラン硫酸（ＨＳ（ＥＨＳ）、
生化学工業（株）製、平均分子量１０，０００）０．３
ｇを実施例１と同様にして、塩交換をし、ジパルミトイ
ルホスファチジルエタノールアミンと反応させて、ヘパ
ラン硫酸−脂質結合体（ＨＳ（ＥＨＳ）−ＰＥ）０．０
８ｇ（収率 ２７％）を得た。
生化学工業（株）製、平均分子量１０，０００）０．３
ｇを実施例１と同様にして、塩交換をし、ジパルミトイ
ルホスファチジルエタノールアミンと反応させて、ヘパ
ラン硫酸−脂質結合体（ＨＳ（ＥＨＳ）−ＰＥ）０．０
８ｇ（収率 ２７％）を得た。
【００３６】比較例１（Biochem. J.(1988) 256, 661-6
64, Mark S. STOLL, Tsuguo MIZUOCHI, et. alの方法で
ＣＳ−ＰＥを製造） コンドロイチン硫酸 200 mg を実施例１と同様にテトラ
ブチルアンモニウム塩として、凍結乾燥品を得た。この
乾燥粉末とジパルミトイルホスファチジルエタノールア
ミン（70 mg）をメタノール・クロロホルム(1:1) 混合
溶媒（20 ml）に溶解し、(CH3)3N・BH3を２回に分けて添
加し、50℃で３日間反応させた。反応中にゲル状の沈殿
が生成してきた。反応液を減圧濃縮後、実施例１と同様
にNaOAc水溶液に溶解し、エタノール沈殿して粗精製物
を得た。この粗精製物を Superose 6 FPLCカラムで分析
したところ、求めるコンドロイチン硫酸−脂質結合体
（ＣＳ−ＰＥ）は 1% 程度の含量しかなかった。
64, Mark S. STOLL, Tsuguo MIZUOCHI, et. alの方法で
ＣＳ−ＰＥを製造） コンドロイチン硫酸 200 mg を実施例１と同様にテトラ
ブチルアンモニウム塩として、凍結乾燥品を得た。この
乾燥粉末とジパルミトイルホスファチジルエタノールア
ミン（70 mg）をメタノール・クロロホルム(1:1) 混合
溶媒（20 ml）に溶解し、(CH3)3N・BH3を２回に分けて添
加し、50℃で３日間反応させた。反応中にゲル状の沈殿
が生成してきた。反応液を減圧濃縮後、実施例１と同様
にNaOAc水溶液に溶解し、エタノール沈殿して粗精製物
を得た。この粗精製物を Superose 6 FPLCカラムで分析
したところ、求めるコンドロイチン硫酸−脂質結合体
（ＣＳ−ＰＥ）は 1% 程度の含量しかなかった。
【００３７】実施例１１：細胞接着阻害活性の測定
９６穴ポリスチレンプレート（MS-3496F；住友ベークラ
イト社製）にフィブロネクチン（0.5μg/0.1ml/well）
をコートし（４℃、１晩）、ハンクス液で３回洗浄した
後、実施例１から１０で得られた各種グリコサミノグリ
カン−脂質結合体標品を濃度を変えて（0および0.02〜5
μg/0.1ml/well）４℃、１日静置してコートし、更にハ
ンクス液で３回洗浄した。
イト社製）にフィブロネクチン（0.5μg/0.1ml/well）
をコートし（４℃、１晩）、ハンクス液で３回洗浄した
後、実施例１から１０で得られた各種グリコサミノグリ
カン−脂質結合体標品を濃度を変えて（0および0.02〜5
μg/0.1ml/well）４℃、１日静置してコートし、更にハ
ンクス液で３回洗浄した。
【００３８】１００ｍｍ径の細胞培養用培養皿でダルベ
ッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）−１０％ウシ胎児血
清を培地として３７℃で培養した、コンフルエント前の
ＢＨＫ細胞（若年性ハムスター腎由来線維芽細胞）をト
リプシンで単細胞化し、ハンクス液で洗浄した後の、懸
濁細胞（1.0×104cells/0.1ml/well）を上記前処理プレ
ートに撒き、３７℃で１時間静置培養した。
ッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）−１０％ウシ胎児血
清を培地として３７℃で培養した、コンフルエント前の
ＢＨＫ細胞（若年性ハムスター腎由来線維芽細胞）をト
リプシンで単細胞化し、ハンクス液で洗浄した後の、懸
濁細胞（1.0×104cells/0.1ml/well）を上記前処理プレ
ートに撒き、３７℃で１時間静置培養した。
【００３９】接着細胞を３％（ｗ／ｖ）パラフォルムア
ルデヒド／リン酸緩衝生理的食塩水（PBS）で固定し、
非接着細胞をPBSで洗い出した後、プレートの接着した
細胞数を顕微鏡下で計数した。フィブロネクチンのみの
コートで結合した細胞数を１００として相対的細胞接着
率を算出し、５０％接着を阻害するときの各種グリコサ
ミノグリカン−脂質結合体（ＧＡＧ−ＰＥ）の塗布濃度
をＩＣ５０とした。本発明の製造法で合成した標品のＩ
Ｃ５０値を表１に、特許第2997018号公報に記載の方法
（ラクトン法）で製造した標品のＩＣ５０値を表２に示
した。
ルデヒド／リン酸緩衝生理的食塩水（PBS）で固定し、
非接着細胞をPBSで洗い出した後、プレートの接着した
細胞数を顕微鏡下で計数した。フィブロネクチンのみの
コートで結合した細胞数を１００として相対的細胞接着
率を算出し、５０％接着を阻害するときの各種グリコサ
ミノグリカン−脂質結合体（ＧＡＧ−ＰＥ）の塗布濃度
をＩＣ５０とした。本発明の製造法で合成した標品のＩ
Ｃ５０値を表１に、特許第2997018号公報に記載の方法
（ラクトン法）で製造した標品のＩＣ５０値を表２に示
した。
【００４０】
【表１】表１：本発明品の細胞接着阻害活性
【００４１】
【表２】表２：特許第2997018号公報に記載の方法（ラ
クトン法）により得られた標品の細胞接着阻害活性
クトン法）により得られた標品の細胞接着阻害活性
【００４２】表１及び表２に示されるように、合成法に
関わらず各種ＧＡＧ−ＰＥの細胞接着阻害活性は、ＣＳ
−ＰＥで強く、Ｈｅｐ−ＰＥやＨＳ−ＰＥで弱いなど、
ＧＡＧの種類に応じて近い値を示し、本発明標品は従来
法で得られたＧＡＧ−ＰＥと同等の活性を持つことが証
明された。
関わらず各種ＧＡＧ−ＰＥの細胞接着阻害活性は、ＣＳ
−ＰＥで強く、Ｈｅｐ−ＰＥやＨＳ−ＰＥで弱いなど、
ＧＡＧの種類に応じて近い値を示し、本発明標品は従来
法で得られたＧＡＧ−ＰＥと同等の活性を持つことが証
明された。
【００４３】
【発明の効果】従来法による脂質結合グリコサミノグリ
カンの収率は、グリコサミノグリカンの種類にもよる
が、約１〜３％、高くても１０％前後であったが、グリ
コサミノグリカンの有機溶媒溶解性塩と１級アミノ基を
有する脂質とを、該グリコサミノグリカンの有機溶媒溶
解性塩および該脂質の双方を溶解しうる極性有機溶媒
中、無水条件化、還元剤の存在下において反応させるこ
とにより、約７．５％〜４４％の高い収率で、従来法で
得られる物質と同等の活性をもつ脂質結合グリコサミノ
グリカンが得られる。また、上記反応後、粗精製物を疎
水クロマトグラフィーを用いて精製することにより、よ
り効率よく脂質結合グリコサミノグリカンを得ることが
できる。例えば、粗精製物の水溶液（脱塩水）と疎水性
担体をまず混合させ、そこに塩（溶液）を加えることで
脂質結合グリコサミノグリカンの自己会合（ミセル化）
を防いで効率よく該担体に吸着させ、次いで溶出させる
ことにより、高い収率で高純度の脂質結合グリコサミノ
グリカンが得られる。
カンの収率は、グリコサミノグリカンの種類にもよる
が、約１〜３％、高くても１０％前後であったが、グリ
コサミノグリカンの有機溶媒溶解性塩と１級アミノ基を
有する脂質とを、該グリコサミノグリカンの有機溶媒溶
解性塩および該脂質の双方を溶解しうる極性有機溶媒
中、無水条件化、還元剤の存在下において反応させるこ
とにより、約７．５％〜４４％の高い収率で、従来法で
得られる物質と同等の活性をもつ脂質結合グリコサミノ
グリカンが得られる。また、上記反応後、粗精製物を疎
水クロマトグラフィーを用いて精製することにより、よ
り効率よく脂質結合グリコサミノグリカンを得ることが
できる。例えば、粗精製物の水溶液（脱塩水）と疎水性
担体をまず混合させ、そこに塩（溶液）を加えることで
脂質結合グリコサミノグリカンの自己会合（ミセル化）
を防いで効率よく該担体に吸着させ、次いで溶出させる
ことにより、高い収率で高純度の脂質結合グリコサミノ
グリカンが得られる。
Claims (8)
- 【請求項１】 グリコサミノグリカンの有機溶媒溶解性
塩と１級アミノ基を有する脂質とを、該グリコサミノグ
リカンの有機溶媒溶解性塩および該脂質の双方を溶解し
うる極性有機溶媒中、無水条件下、還元剤の存在下にお
いて反応させ、該グリコサミノグリカンの還元末端糖ア
ルデヒド基と該脂質の１級アミノ基とのアミノアルキル
型結合を形成させることを特徴とする、脂質結合グリコ
サミノグリカンの製造法。 - 【請求項２】 グリコサミノグリカンが、ヒアルロン
酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン
硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、及びケラタン硫酸から
なる群から選択される物質であることを特徴とする請求
項１に記載の脂質結合グリコサミノグリカンの製造法。 - 【請求項３】 脂質がグリセロ脂質であることを特徴と
する請求項１または２に記載の脂質結合グリコサミノグ
リカンの製造法。 - 【請求項４】 グリセロ脂質がリン脂質であることを特
徴とする請求項３に記載の脂質結合グリコサミノグリカ
ンの製造法。 - 【請求項５】 リン脂質がホスファチジルエタノールア
ミンであることを特徴とする請求項４に記載の脂質結合
グリコサミノグリカンの製造法。 - 【請求項６】 グリコサミノグリカンがコンドロイチン
硫酸であり、脂質がホスファチジルエタノールアミンで
あることを特徴とする請求項１に記載の脂質結合グリコ
サミノグリカンの製造法。 - 【請求項７】 極性有機溶媒が、メタノール、アセトニ
トリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキサイ
ド、ヘキサメチルホスホルアミド及びＮ−メチルピロリ
ドンから選ばれる少なくとも１種の溶媒であることを特
徴とする請求項１から６いずれか１項に記載の脂質結合
グリコサミノグリカンの製造法。 - 【請求項８】 極性有機溶媒がメタノール単独であるこ
とを特徴とする請求項１から６いずれか１項に記載の脂
質結合グリコサミノグリカンの製造法。
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| JP2002143898A JP4266571B2 (ja) | 2002-05-17 | 2002-05-17 | 脂質結合グリコサミノグリカンの製造法 |
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| JP2003335801A true JP2003335801A (ja) | 2003-11-28 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006348071A (ja) * | 2005-06-13 | 2006-12-28 | Teijin Ltd | グリコサミノグリカン誘導体の製造法 |
| JP2008150441A (ja) * | 2006-12-15 | 2008-07-03 | Oyo Toshitsu Kagaku Kenkyusho:Kk | 親脂質性ヘパリン修飾体、その製造方法及び毛髪成長促進剤 |
| JP2010053259A (ja) * | 2008-08-28 | 2010-03-11 | Denki Kagaku Kogyo Kk | ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法 |
| US7893226B2 (en) | 2004-09-29 | 2011-02-22 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. | Use of lipid conjugates in the treatment of diseases |
| US8076312B2 (en) | 2000-01-10 | 2011-12-13 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd | Use of lipid conjugates in the treatment of disease |
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| US8372815B2 (en) | 2000-01-10 | 2013-02-12 | Yissum Research Development Company | Use of lipid conjugates in the treatment of conjunctivitis |
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| US8859524B2 (en) | 2005-11-17 | 2014-10-14 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Lipid conjugates in the treatment of chronic rhinosinusitis |
| US8865681B2 (en) | 2004-03-02 | 2014-10-21 | Yissum Research Development Company of the Hebrew Unitersity of Jerusalem | Use of lipid conjugates in the treatment of diseases or disorders of the eye |
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| US8906882B2 (en) | 2005-11-17 | 2014-12-09 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Lipid conjugates in the treatment of allergic rhinitis |
| US8916539B2 (en) | 2000-01-10 | 2014-12-23 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Use of lipid conjugates in the treatment of disease |
| US9040078B2 (en) | 2000-01-10 | 2015-05-26 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Use of lipid conjugates in the treatment of diseases of the nervous system |
| JP2016529362A (ja) * | 2013-08-29 | 2016-09-23 | ホーリー ストーン バイオテック カンパニー リミテッド | グリコサミノグリカン化合物、その調製方法および使用 |
| KR101762894B1 (ko) * | 2015-05-19 | 2017-07-28 | 광주과학기술원 | 지질 결합 헤파린이 코팅된 세포 및 이의 제조방법 |
| WO2020222914A1 (en) * | 2019-04-29 | 2020-11-05 | Bausch & Lomb Incorporated | Glycophospholipid polymeric network and use thereof |
| US11013811B2 (en) | 2009-05-11 | 2021-05-25 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. | Lipid-polymer conjugates, their preparation and uses thereof |
-
2002
- 2002-05-17 JP JP2002143898A patent/JP4266571B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8865878B2 (en) | 2000-01-10 | 2014-10-21 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Use of lipid conjugates in the treatment of diseases |
| US9012396B2 (en) | 2000-01-10 | 2015-04-21 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Use of lipid conjugates in the treatment of conjunctivitis |
| US9040078B2 (en) | 2000-01-10 | 2015-05-26 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Use of lipid conjugates in the treatment of diseases of the nervous system |
| US8916539B2 (en) | 2000-01-10 | 2014-12-23 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Use of lipid conjugates in the treatment of disease |
| US8076312B2 (en) | 2000-01-10 | 2011-12-13 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd | Use of lipid conjugates in the treatment of disease |
| US8304395B2 (en) | 2000-01-10 | 2012-11-06 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. | Lipid conjugates in the treatment of disease |
| US8372815B2 (en) | 2000-01-10 | 2013-02-12 | Yissum Research Development Company | Use of lipid conjugates in the treatment of conjunctivitis |
| US8383787B2 (en) | 2000-01-10 | 2013-02-26 | Yissum Research Development Company | Use of lipid conjugates in the treatment of diseases |
| US8501701B2 (en) | 2000-01-10 | 2013-08-06 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. | Use of lipid conjugates in the treatment of disease |
| US8901103B2 (en) | 2000-01-10 | 2014-12-02 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Use of lipid conjugates in the treatment of diseases |
| US8883761B2 (en) | 2001-01-10 | 2014-11-11 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Use of lipid conjugates in the treatment of diseases associated with vasculature |
| US8865681B2 (en) | 2004-03-02 | 2014-10-21 | Yissum Research Development Company of the Hebrew Unitersity of Jerusalem | Use of lipid conjugates in the treatment of diseases or disorders of the eye |
| US7893226B2 (en) | 2004-09-29 | 2011-02-22 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. | Use of lipid conjugates in the treatment of diseases |
| JP2006348071A (ja) * | 2005-06-13 | 2006-12-28 | Teijin Ltd | グリコサミノグリカン誘導体の製造法 |
| US8859524B2 (en) | 2005-11-17 | 2014-10-14 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Lipid conjugates in the treatment of chronic rhinosinusitis |
| US8906882B2 (en) | 2005-11-17 | 2014-12-09 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Lipid conjugates in the treatment of allergic rhinitis |
| JP2008150441A (ja) * | 2006-12-15 | 2008-07-03 | Oyo Toshitsu Kagaku Kenkyusho:Kk | 親脂質性ヘパリン修飾体、その製造方法及び毛髪成長促進剤 |
| JP2010053259A (ja) * | 2008-08-28 | 2010-03-11 | Denki Kagaku Kogyo Kk | ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法 |
| US11013811B2 (en) | 2009-05-11 | 2021-05-25 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. | Lipid-polymer conjugates, their preparation and uses thereof |
| JP2016529362A (ja) * | 2013-08-29 | 2016-09-23 | ホーリー ストーン バイオテック カンパニー リミテッド | グリコサミノグリカン化合物、その調製方法および使用 |
| KR101762894B1 (ko) * | 2015-05-19 | 2017-07-28 | 광주과학기술원 | 지질 결합 헤파린이 코팅된 세포 및 이의 제조방법 |
| WO2020222914A1 (en) * | 2019-04-29 | 2020-11-05 | Bausch & Lomb Incorporated | Glycophospholipid polymeric network and use thereof |
| US11673974B2 (en) | 2019-04-29 | 2023-06-13 | Bausch & Lomb Incorporated | Glycophospholipid polymeric network and use thereof |
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