JPH0482836A

JPH0482836A - 癌転移抑制剤

Info

Publication number: JPH0482836A
Application number: JP2193816A
Authority: JP
Inventors: Katsukiyo Sakurai; 桜井　勝清; Nobuo Sugiura; 信夫杉浦; Hiroharu Kimata; 弘治木全; Akira Suzuki; 鈴木　旺
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1990-07-24
Filing date: 1990-07-24
Publication date: 1992-03-16
Anticipated expiration: 2014-12-06
Also published as: JP2986518B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリカンを
含有する癌転移抑制剤に関する。

［従来の技術］癌転移は、血管内やリンパ管内に流出した癌細胞が、血
管内皮細胞やその下の基底膜と呼ばれる血管内皮細胞の
細胞外マｌ−ＩＪツク又と接着し接着した癌細胞が細胞
外マトリックス内に浸潤、透過して新しい組織内に転移
巣を作ることが知られている。例えばＳ、Ｋｏｒａｃｔ
＋らは（ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｌ＋　４６．３６
２４−３６２９．　　（１９８６１１癌細胞のクローニ
ングで高転移性細胞と低転移性細胞の群に分け、培養内
皮細胞に対するｉｎ　ｖｉｔｒｏでの接触試験で、高転
移性の癌細胞は高い接着率を示し、低転移性のものは低
い接着率を示すことから、血管内皮細胞やその細胞外マ
トリックスに対する接着性が癌の転移と深くかかわって
いることを報告している。

また、細胞外マトリックス成分であるフィブロネクチン
の細胞接着部位にあるペプチド・ＧＲＧＤＳは、拮抗的
に細胞と細胞外マトリックスとの結合を阻害する。山田
らは（Ｓｃｊｅｎｃｅ　２３３゜４６７〜４７０．　　
＋１９８６＋＋このペプチド・ＧＲＧＤＳがＢ１６Ｆ１
０細胞のマウスにおける肺転移を抑制することを示して
いる。このことから、非常に微量で細胞接着阻害活性を
持つ物質は癌転移抑制剤として利用し得ることを示唆し
ている。

［発明が解決しようとする課題］本発明は、燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリカンが
、上記の癌細胞の血管内皮細胞や細胞外マトリックスへ
の接着を阻害することにより、癌の転移を抑制する知見
を得て本発明をなした。

［課題を解決するための手段］本発明は、燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリカン又
はその塩を含有する癌転移抑制剤である。

グリコサミノグリカンは表１に示すように、Ｄ−グルコ
サミン又はＤ−ガラクトサミンと、Ｄ−グルクロン酸、
Ｌ−イズロン酸及び／又はＤ−ガラクトースの２糖又は
４糖の繰り返し単位より構成されている長い鎖状の多糖
であり、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチ
ン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸
Ｄ、コンドロイチン硫酸Ｅ、コンドロイチン硫酸Ｋ、コ
ンドロイチンポリ硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘ
パラン硫酸及びケラタン硫酸、ケラタンポリ硫酸が知ら
れている。

表１本発明の燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリカンは、
その塩であることができ、好ましくはナトリウム、カリ
ウムのようなアルカリ金属塩：カルシウム、マグネシウ
ムのようなアルカリ土類金属塩、トリアルキルアミン、
ピリジンのようなアミン塩であることができる。

本発明の燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリカンは、
吹のものを包含する。

一般式を有する燐脂質結合グリコサミノグリカン又はその塩を
含有する癌転移抑制剤。

上記式中、ＧＡＧはヒアルロン酸、コンドロイチン、コ
ンドロイチン硫酸Ａ、Ｃ，ＥもしくはＩく、コンドロイ
チンポリ硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫
酸、ケラクン硫酸又はケラタンポリ硫酸から還元性末端
のへキソザミン部分を除いたグリコサミノグリカン残基
を示し、Ｐは１級アミン基を有する燐脂質を示す。

毅式を有する燐脂質結合グリコサミノグリカン又はその塩を
含有する癌転移抑制剤。

上記式中、Ｒ’　ハＯＨ又はＮＨＣＯＣＨ３を示し、Ｒ
３は水素又はＳＯ，Ｈを示し、ＧＡＧはヒアルロン酸、
コンドロイチン、コンドロイチン硫酸ＡもしくはＫ又は
デルマタン硫酸から還元性末端のへキソザミン部分を除
いたグリコサミノグリカン残基、或いはケラタン硫酸又
はケラタンポリ硫酸から還元性末端のガラクトース部分
を除いたグリコサミノグリカン残基を示し、ｐｌは１級
アミン基を有する燐脂質を示す。

上記式中、ＧＡＧはケラタン硫酸又はケラタンポリ硫酸
から還元性末端のガラクトース部分を除いたグリコサミ
ノグリカン残基を示し、Ｐｌは１級アミン基を有する燐
脂質を示す。

−船人を有する燐脂質結合グリコザミノグリヵン又はその塩を
含有する癌転移抑制剤。

上記式中、Ｒ１はＯＨ１Ｏ３Ｏ，Ｈ１ＮＨＣＯＣＨ３又はＮＨ３０ａＨを示し、Ｒ２はＣ０Ｏ
Ｈ，ＣＨ２０Ｈ又はＣＨ２０ｓ０３Ｈを示し、Ｒ３は水
素又はＳ　Ｏ３Ｈを示し、ＧＡＧはヒアルロン酸、コン
ドロイチン、コンドロイチン硫酸Ａ、Ｃ，Ｄ、Ｅもしく
はＫ、コンドロイチンポリ硫酸、デルマタン硫酸、ヘパ
リン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸又はケラクン硫酸か
ら還元性末端のへキソサミン部分又はウロン酸部分もし
くはガラクトース部分を除いたグリコサミノグリカン残
基な示し、ＰＩは１級アミノ基を有する燐脂質を示す。

一般式を有する燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリカン又は
その塩を含有する癌転移抑制剤。

上記式中、Ｒ１、Ｒ８及びＧＡＧは式（１■）に記載と
同じであり、ｍ、β及びＲ２は式（Ｖ）に記載と同じで
ある。

上記式中、ＧＡＧは式（Ｉ）に記載と同じである。ｍは
１〜８を示し、βは１〜】０を示し、Ｒ２は燐脂質又は
脂質を示す。

上記式中、Ｒ’、Ｒ２，Ｒ”及びＧＡＧは式（Ｖ）に記
載と同じであり、ｍ、　ｆ２及びＲ２は式（Ｖ）に記載
と同じである。

一般式］式　　　ＣＨ２−０−Ｒ’ を有する燐脂質結合グリコサミノグリカン又はその塩を
含有する癌転移抑制剤。

上記式中、Ｒ３は水素又はｓｏａ　Ｈを不し、ＧＡＧは
ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、Ｃ，Ｄ、Ｅもし
くはＫ、コンドロイチンポリ硫酸、デルマタン硫酸、ヘ
パリン又はヘパラン硫酸中のグリコサミノグリカン鎖を
示し、Ｐｌは１級アミノ基を有する燐脂質を示し、ｎは
グリコサミノグリカンに存在するカルボキシ基の数以下
の数を示す。

グリコサミノグリカンの分子量は好ましくは表１に記載
のものが用いられる。

上記式（Ｉ）、（ＩＩ　）、（ＩＩＩ　）、（ＩＶ　）
及び（■）のＰｌで示される１級アミノ基を有する燐脂
質としては、ＣＨ（式中、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ水素、−ＣＨ＝　ＣＨ
Ｒ６又は−ＣＯＲ’　　（Ｒ６及びＲ７はＣ６〜２４の
アルキル基）であり、ＹはＣＨ２Ｃ１（２ＮＨ−又は−
Ｃ８２Ｃ）ＩＮＩ−１−でＯＯＨある）て示されるものが用いられる。特にＲ′及びＲ６がとも
にヘキサデカノイル又はオクタデカノイルのような−Ｃ
ＯＲ７であるか、Ｒ４がＣＨ＝　ＣＨＲ６てＲ５が−Ｃ
ＯＲ’であるものが好ましい。

また、上記式（Ｖ）、（Ｖｌ）及び（■旧（７）Ｒ２で
示される燐脂質又は脂質としては、式Ｃ）１２−０−Ｒ８Ｃ）１２−０−Ｒ８ＣＨ−０−Ｒ
９（Ｘ　）　　　ＣＨ−０−（ＸＩ　）ＣＨ２−０−、
ＣＨ２−０−Ｒ９ＣＨ２−０ＣＨＣＨ２−０−Ｒ” ＣＨ−０ＣＨ２−０−Ｐ−０−Ｗ　　　（ＸＩ［ｔ）ＣＨ（式中、Ｒ８，Ｒ９及びＲ１０はそれぞれ水素、アルキ
ル基、−ＣＨ＝ＣＨＲ６又は−ＣＯＲ’（Ｒ６及びＲ７
は前記と同し）であり、Ｗは−ＣＨ２Ｃ８２Ｎ４　（Ｃ
Ｈ３）　　３又はイノシトル残基である）て示されるものが用いられる。特にＲ８及びＲ９がとも
にヘキサデカノイル又はオクタデカノイルのような−Ｃ
ＯＲ７であるか、Ｒ８が水素で、Ｒ９が−ＣＯＲ７であ
る式（Ｘ）又は（ＸＩ）の脂質、或いはＲ１０が−ＣＯ
Ｒ７である式（罰）又は（Ｘｌｌｌ）の燐脂質が好まし
い。

以下に、本発明の燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリ
カンの製造法について詳しく説明する。

還一端　　　ヒ法この方法は、グリコサミノグリカンの還元性末端のウロ
ン酸部分もしくはガラクトース部分又はヘキソサミン部
分を還元及び部分酸化することにより開裂させてアルデ
ヒドを形成させ、このアルデヒドと燐脂質の１級アミノ
基との間の還元的アルキル化反応により、燐脂質結合グ
リコサミノグリカンを製造する方法である。この方法を
反応式で示せば次のとおりである。

（Ａ）還元性末端糖のグルクロン酸又はイズロン酸に反
応する場合（Ｐ’は１級アミン基を有する燐脂質を示す）還元性末
端がＣ−２にＯＨを有するＤ−グルクロン酸又はＬ−イ
ズロン酸である式（１）のヒアルロン酸、コンドロイチ
ン、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コ
ンドロイチン硫酸Ｅ、コンドロイチン硫酸Ｋ、コンドロ
イチンポリ硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン又はヘパラ
ン硫酸を原料として使用したとき、上記反応式に従い、
式（Ｉ）の燐脂質結合グリコサミノグリカンが製造でき
る。

（Ｂ）還元性末端糖のグルコサミン又はガラクトサミン
に反応する場合（ＩＩ）（式中、Ｒ３は前述と同じ、Ｐｌは１級アミノ基を有す
る燐脂質を示す）還元性末端のＣ−５にＣＨ２０Ｈを有するグルコサミン
又はガラクトサミンである式（４）のヒアルロン酸、コ
ンドロイチン、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン
硫酸Ｋ、コンドロイチンポリ硫酸又はデルマタン硫酸を
原料として使用したとき、上記反応式に従い、式（ＩＩ
）の燐脂質結合グリコサミノグリカンが製造できる。

（Ｃ）還元性末端糖のガラクトースに反応する場合（式中、Ｐｌは１級アミン基を有する燐脂質を示す）還元性末端糖がガラクトースである式（７）のケラタン
硫酸又はケラタンポリ硫酸を原料として使用したとき、
上記反応式に従い、式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）
の燐脂質結合グリコサミノグリカンが製造できる。

上記（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の方法においては、先ず
、上記式（１）、（４）及び（７）で示されるグリコサ
ミノグリカンを還元して還元性末端糖部分を開裂させて
式（２）、（５）及び（８）の化合物とする。

この還元に使用しつる還元剤としては、水素化ホウ素ナ
トリウム、シアン水素化ホウ素ナトリウムなどの水素化
ホウ素アルカリ塩等を用いることができる。

また、上記還元反応における溶媒は、水又は０．０５Ｍ
ホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８、３）等を用いることができる
。

また還元反応温度は、通常１０〜３０’Ｃ１好ましくは
１５〜２５℃で行うことができる。

還元剤の使用量は、その種類等によっても異なるが、一
般には式（１）、（４）又は（７）の化合物１モルに対
して５〜５０当量、好ましくは２５〜３０当量の範囲で
ある。

得られる式（２）、（５）及び（８）の化合物を次いて
部分的に酸化すると、式（３）、（６）、（９）、（１
０）及び（１１）のアルデヒド化合物が生成する。

この酸化反応に使用しうる酸化剤としては、過ヨウ素酸
ナトリウム、過ヨウ素酸カリウムなどの過ヨウ素酸アル
カリ塩等を用いることができる。

酸化剤の使用量は、式（２）、（５）又は（８）の化合
物１モルに対して１〜１０当量、好ましくは３〜６当量
の範囲である。

酸化反応温度は、０〜１０°Ｃ５好ましくは０〜４°Ｃ
の範囲で行うことができる。

生成した（３）、（６）、（９）、（１０）及び（１１
）のアルデヒド化合物は、それ自体既知の還元的アルキ
ル化法に従い、燐脂質の１級アミノ基と反応させること
ができ、これによって本発明が目的とする一般式（Ｉ）
、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ　）て示される燐脂質結合グリ
コサミノグリカンを得ることができる。

上記反応に用いることのできる燐脂質としては、Ｌ−（
α−ホスファチジル）エタノールアミン、ＤＬ−ホスフ
ァチジル−し−セリン、エタノールアミンプラスマロゲ
ン、セリンプラスマロゲン等を挙げることができる。

上記還元的アルキル化反応は、水、０．０５Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，０）又はジメチルホルムアミドのような
溶媒中において、式（３）、（６）、（９）、（１０）
又は（１１）のアルデヒド化合物とクロロホルム等に溶
解した燐脂質とを混合して均一な溶液にし、通常１５〜
６０°Ｃの温度で反応させ、それと同時に又はその後に
、例えばシアノ水素化ホウ素ナトリウム等の還元剤を用
いて還元することにより一般式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（
ＩＩＩ）の化合物を製造することができる。

還−く端ラクトン化法この方法は、グリコサミノグリカンの還元性末端ウロン
酸部分もしくはガラクトース部分又はへキソサミン部分
を酸化することにより該末端糖部分を開裂させ、更にラ
クトンを形成させて、このラクトンと燐脂質の１級アミ
ノ基との反応により燐脂質結合グリコサミノグリカンを
製造する方法である。この方法を反応式で示せば次のと
おりである。

（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は前述と同じ、Ｐは１級ア
ミン基を有する燐脂質を示す）本方法において、先ず、
式（１２）で示されるグリコサミノグリカンを酸化して
還元性末端部分を開裂させ、式（１３）のカルボキシ化
合物とする。

式（１２）のヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロ
イチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン
硫酸Ｄ、コンドロイチン硫酸Ｅ、コンドロイチン硫酸Ｋ
、コンドロイチンポリ硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン
、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸又はケラクンポリ硫酸を
原料として使用することができる。

この酸化に使用しつる酸化剤としては、ヨウ素、臭素等
を用いることができる。

酸化剤の使用量は、式（１２）の化合物１モルに対して
２〜２０当量、好ましくは５〜１５当量の範囲である。

酸化反応における溶媒は、水又は０．０５Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７，０）等を用いることができる。

酸化反応温度は、０〜４０℃、好ましくは１５〜２０°
Ｃで行うことができる。

生成する式（１３）の化合物は、次いで酸で処理するこ
とにより式（１４）のラクトン化合物にすることができ
る。

ここで用いることのできる酸としては、強酸性陽イオン
交換樹脂、例えばダウエックス５０、アンバーライトｌ
Ｒ１２０等を挙げることができる。

得られる式（１４）のラクトン化合物は、次いで燐脂質
と反応させることにより、前記−船人（ＩＶ　）の燐脂
質結合グリコサミノグリカンを製造することができる。

上記反応に用いることのできる燐脂質としては、前記還
元末端限定酸化法において例示したものを用いることが
できる。

式（１４）のラクトン化合物と燐脂質との反応は、水、
０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）又はジメチルホ
ルムアミド等に溶解した式（１４）のラクトン化合物と
、クロロホルム等に溶解した燐脂質とを混合して灼−な
溶液にし、５〜８０°Ｃ１好ましくは３０〜６０℃の温
度で反応させることにより一般式（ＩＶ）の化合物を製
造することができる。

還況］」Ｌ乙もＺ迭この方法は、前記式（３）、（６）、（９）、（１０）
及び（１４）のアルデヒド化合物にアルキレンジアミン
を反応させ、末端に１級アミノ基をもつグリコサミノグ
リカン誘導体とし、次にこの１級アミノ基をもつグリコ
サミノグリカン誘導体とカルボキシ基をもつ燐脂質又は
脂質誘導体とを反応させ、アミノ基とカルボキシ基との
結合により、燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリカン
な製造する方法である。

この方法を反応式で示せば次のとおりである。

（式中、Ｒ１，Ｒ２及びＲ３は前述と同じ、Ｒ２は燐脂
質又は脂質を示す）還元末端に１級アミノ基をもつグリコサミノグリカン誘
導体式（１５）、（１６）及び（１７）は、前記還元末
端限定酸化法又は還元末端ラクトン化法によって製造さ
れる式（３）、（９）、（６）、（１０）及び（１４）
の化合物とアルキレンジアミンとを還元剤の存在下で反
応させることによって得られる。

この反応に使用できるアルキレンジアミンとしては一般
式％式％（式中、ｍは１〜８の整数）で示される化合物を用いるができる。

還元剤としては、シアン水素化ホウ素ナトリウム等を用
いることができる。

還元剤の使用量は、上記反応に使用するグリコサミノグ
リカンのモル数の１０〜１００倍モル量である。

反応溶媒は、水又は０．０５Ｍリン酸緩衝液等を用いる
ことができる。

反応温度は、０〜６０℃、好ましくは４〜２５°Ｃて行
う。

また、カルボキシ基をもつ燐脂質又は脂質誘導体は、グ
リ七ロール骨格に水酸基をもつ燐脂質又は脂質ジカルボ
ン酸又はジカルボン酸の無水物とを反応させて得られる
。

この反応に使用できる燐脂質又は脂質としては、モノア
シルグリセロール、ジアシルグリセロール、リゾホスフ
ァチジルコリン又はリゾホスファデジルイノシトール、
エーテル脂質又はエテル燐脂質等を用いることができる
。

ジカルボン酸としては、コハク酸、グルタル酸、アジピ
ン酸等を用いることができる。

無水ジカルボン酸としては、無水マレイン酸、無水コハ
ク酸、無水フマル酸等を用いることができる。

縮合剤としては、１−エチル−３−（ジメチルアミノプ
ロピル）−カルボジイミド、ジシクロへキシルカルボジ
イミド等を用いることができる。

反応溶媒としては、クロロホルム、アセトアニリド、ジ
メチルホルムアミド等を用いることができる。

反応温度は、縮合剤の存在下でジカルボン酸を使用する
ときは０〜６０°Ｃを、また無水ジカルボン酸を使用す
るときは２０〜８０°Ｃで行うことができる。

還元末端に１級アミン基をもつグリコサミノグツカン誘
導体とカルボキシ基をもつ燐脂質又は脂質誘導体とを反
応させる方法は、先ず該燐脂質又は脂質誘導体をペプチ
ド化学の分野でよく知られている方法に従って該燐脂質
又は脂質誘導体のカルボキシ基を活性化し、次いで該グ
リコサミノグリカン誘導体と反応させる方法で行うこと
ができる。

上記燐脂質又は脂質誘導体のカルボキシ基を活性化する
方法としては、上記燐脂質又は脂質誘導体とＮ−ヒドロ
キシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェノール、Ｎ−ヒド
ロキシベンゾトリアゾル、Ｎ−ヒドロキシピペリジン、
Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド、２，４．５−トリクロ
ロフェノール等とを縮合剤の存在下で反応させ、該カル
ボキシ基を活性エステルに変える方法で行うことができ
る。

反応溶媒としては、クロロホルム、アセトニトリル、ジ
メチルホルムアミド又は該溶媒の混合液を用いることが
できる。

反応温度は、０〜６０°Ｃて行う。

上記方法によって得られたカルボキシ基が活性化された
上記燐脂質誘導体と、１級アミノ基をもつグリコサミノ
グツカン誘導体（１５）（１６）又は（１７）とを反応
させれば、燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリカン（
Ｖ）、（Ｖｌ）及び（ｖｎ）を得ることができる。

上記反応溶媒としては、クロロホルム、アセトニトリル
、ジメチルホルムアミド又は該溶媒の混合液を用いるこ
とができる。

また反応温度は、０〜６０℃で行う。

楡會剋便里殊ケラタン硫酸及びケラクンポリ硫酸以外のグリコサミノ
グリカンはＤ−グルクロン酸又はＬ−イズロン酸を含有
し、これらのウロン酸はＣ−５にカルボキシ基を有する
。

この方法は、ウロン酸のカルボキシ基と燐脂質の１級ア
ミン基とを縮合剤の存在下で反応させ、燐脂質結合グリ
コサミノグリカンな製造する方法である。

この方法を反応式で示せば次のとおりである。

（式中、Ｒ３及びＰＩは前述と同じ）本方法で原料として用いることのできるグリコサミノグ
リカン（１８）は、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コ
ンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロ
イチン硫酸Ｄ、コンドロイチン硫酸Ｅ、コンドロイチン
硫酸Ｋ、コンドロイチンポリ硫酸、デルマタン硫酸、ヘ
パリン又はヘパラン硫酸である。

燐脂質としては、前記還元末端限定酸化法において例示
したものを用いることができる。

縮合剤としては、ジエチルカルボジイミド、ジイソプロ
ピルカルボジイミド、メチルプロピルカルボジイミド、
ジシクロへキシルカルボジイミド、ヘキサメチレンカル
ボジイミド、ヘプタメチレンカルボジイミド、１−エチ
ル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ
ド、１−シクロへキシル−３−（２−モルホリノエチル
）カルボジイミドメソ−ｐ−１−ルエンスルホネート、
１−ｔ−ブチル−３−（３−ジメチルアミンプロピル）
カルボジイミド、ジフェニルカルボジイミド、４．４′
−ジニトロジフェニルカルボジイミド、ジ−ｐ−トリル
カルボジイミド又はビス（トリメチルシリル）カルボジ
イミド等を挙げることができる。

縮合剤の使用量は、燐脂質又は脂質の使用モル量の１０
〜１００倍モル量を用いることができる。

溶媒としては、ジメチルホルムアミド、クロロホルム又
は該溶媒の混合液等を用いることができる。

反応温度は、４〜６０″Ｃ１好ましくは１５〜２５°Ｃ
で行う。

グリコサミノグリカン活性法この方法は、上記縮合剤使用法と同様に、ウロン酸のカ
ルボキシ基を活性化し、燐脂質の１級アミノ基と結合さ
せることにより、燐脂質結合グリコサミノグリカン（■
）を製造する方法である。

本方法で使用することのできるグリコサミノグツカン及
び燐脂質としては、上記縮合剤使用法と同様のものを用
いることができる。

カルボキシ基を活性化する方法としては、ペプチド化学
の分野でよく知られている方法に従って、グリコサミノ
グリカンのウロン酸部分のカルポキシ基を活性化するこ
とができる。

活性化する方法としては、例えばグリコサミノグツカン
にＮ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェノー
ル、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキ
シピペリジン、Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド、２．４
．５−トリクロロフェノール等を縮合剤の存在下で反応
させて、該カルボキシ基を活性エステルに変えることが
できる。

ウロン酸部分のカルボキシ基はそのアミン塩として反応
させることもできる。

アミン塩のアミンの種類としては、トリ（ｎブチル）ア
ミン、トリエチルアミン、ピリジン等を挙げることがで
きる。

反応溶媒としては、ジメチルホルムアミド、ピリジン、
ジメチルスルホキシド等を用いることができる。

反応温度は、０〜６０℃、好ましくは４〜２０°Ｃで行
う。

上記方法によって得られた、カルボキシ基が活性化され
たグリコサミノグリカンを燐脂質と反応させれば、−８
式（■）の燐脂質結合グリコサミノグリカンを得ること
ができる。

上記反応は、ジメチルホルムアミド、クロロホルム又は
該溶媒の混合液の溶液において、上記活性化グリコサミ
ノグリカンと燐脂質とを０〜９０°Ｃ１好ましくは２５
〜６０で反応させる。

また、本発明の一般式（Ｉ）〜（■）で示される燐脂質
又は脂質結合グリコサミノグリカンの燐脂質又は脂質の
含有量は、０００５〜５０％、好ましくは２〜１０％の
範囲である。

以上に述べた各種の方法で製造される燐脂質又は脂質結
合グリコサミノグリカンの分離、精製方法としては、反
応液に酢酸ナトリウム飽和エタノールを加えて生じた沈
澱物を炉取することで未反応の燐脂質又は脂質を除き、
さらに該沈澱物を疎水クロマトに負荷し、酢酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、塩化ナトリウム等の塩の水溶
液で洗浄することで未反応のグリコサミノグリカンを除
去する。この後、該疎水クロマトに吸着した燐脂質又は
脂質結合グリコサミノグリカンを１０〜５０％メタノー
ル水溶液で溶出する方法で行うことができる。

本発明の癌転移抑制剤は、燐脂質又は脂質結合グリコサ
ミノグリカン又はその薬学的に許容される塩を、固体又
は液体の医薬用担体又は希釈剤、即ち、賦形剤、安定剤
等の添加剤とともに含む製剤とすることが好ましい。

燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリカンの塩は水溶性
であるため、注射剤として用いる場合に最適である。該
医薬製剤において、前記有効成分の担体成分に対する割
合は、１〜９０重量％の間で変動させつる。

剤形及び投与形態としては、顆粒剤、細粒剤、散剤、錠
剤、カプセル剤、丸剤もしくは液剤等の剤形にして、又
は原末のまま経口投与してもよいし、注射剤として静脈
内投与、筋肉内投与又は皮下投与してもよい。また、坐
剤、軟膏剤、パップ剤、貼付剤、リニメント剤、ローシ
ョン剤等の剤形にして、外用剤として用いることもでき
る。また、注射用の粉末にして、用時調製して使用して
もよい。

経口、経腸、非経口もしくは局所投与に適した医薬用の
有機又は無機の、固体又は液体の担体もしくは希釈剤を
、本発明の燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリカン又
はその塩を含む医薬製剤を調製するために用いることが
できる。水、ゼラチン、乳糖、デンプン、ステアリン酸
マグネシウム、タルク、動植物油脂、ベンジルアルコー
ル、ガム、ポリアルキレンゲルコール、石油樹脂、やし
油、ラノリン又は医薬に用いられる他のキャリアー（担
体）は全て、本発明品の担体として用いることができる
。また、安定剤、湿潤剤、乳化剤や、浸透圧を変えたり
、製剤の適切なｐｎを維持するための塩類を補助薬剤と
して適宜用いることもできる。

顆粒剤、細粒剤、散剤、錠剤又はカプセル剤の場合には
、該医薬製剤は本発明品を５〜８０重量％含有している
ことが好ましく、液剤の場合には、１〜３０重量％含有
していることが好ましい。また、注射剤の場合は１〜ｌ
Ｏ重量％、坐剤の場合は１〜５０重量％が好ましい。局
所投与用である軟膏剤又はパップ剤等として用いる場合
は、０．１〜１０重量％含有していることが好ましい。

臨床投与量は、経口投与の場合、成人に対し有効成分と
して、１日量１００〜２０００ｍｇを内服することが好
ましいが、年令、症状により適宜増減することも可能で
ある。前記１日量を１回、又は適当な間隔をおいて２も
しくは３回に分けて投与することが好ましい。

また、注射剤として用いる場合には、成人に対し有効成
分として、１同量１０〜１０００ｍｇを投与することが
好ましく、軟膏剤又はパップ剤等として用いる場合は、
前記含有割合のものを適当量患部に塗布することが好ま
しい。

本有効成分の急性毒性は、４週齢の５ｉｃ−ｄｄｙ系雌
雄マウスを１週間の予備飼育の後、雄２３〜３０ｇ、雌
２０〜２５ｇの体重になった時点で、後記ＨＡＩ−ＰＰ
ＥＡＤＰ　　（ロット番号３００）、Ｃ３（Ｓ３１−Ｐ
ＰＥＡＤＰ　　（ロット番号３０２−２）を投与し、投
与方法は、最も毒性の症状がでやすい腹腔内投与で、検
体は各々５％の濃度になるように局方生理食塩液に溶解
して投与した。雌雄それぞれ１群１０匹を用いた。その
結果ＬＤ５ｏはいずれも２０００ｍｇ／ｋｇ以上であり
、医薬として完全性に問題はない。

［発明の効果］本発明品の燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリカン又
はその塩は、細胞接着阻害作用を有し、かつ毒性もない
ので癌転移抑制剤として有用である。

［実施例１次に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本
発明は、実施例に限定されるものではない。

以下の実施例において、燐脂質又は脂質結合グツコサミ
ノグリカンのリン含量、燐脂質又は脂質含量、及びグリ
コサミノグリカン（ＧＡＧ）含量は、以下の方法で測定
した。

搬足迭１、ＧＡＧの定量（１）ウロン酸を含有するＧＡＧ　　カルバゾール硫酸
法（Ｂｉｔｔｅｒ−Ｍｕｉｒ法）　ＡＮＡＬＹＴＩＣＡ
ＬＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ　４．３３０−３３４　（
１９６２）（２）ガラクトースを含有するケラタン硫酸
又はケラタンポリ硫酸、アンスロン法　Ｂｉｏｃｈｅｍ
、Ｊ５０、２９８−３０３　（１９５２）２　燐脂質又は脂質の定量（１）リンの定量　モリブデンブルー法、無機応用比色
分析、４、共立出版株式会社、編集代表　平野四藏　１
３０〜１３５頁（２）脂肪酸の定量：１０〜５０ｍｇのＧＡＧ脂質を１
０ｉのＩＮ−水酸化すトリウム水溶液に溶解し、１００
°Ｃて１時間加水分解する。反応液をＩＮ＝塩酸水溶液
で酸性にした後、クロロホルムで抽出し、クロロホルム
化を水で洗浄する。脱水ボウ硝で乾燥後、減圧下で溶媒
を除去。残渣に３％塩酸（ガス）５有メタノールを加え
、封管中、１００℃で３時間加熱後、石油エーテルで３
回抽出する。石油エーテルを３回水洗し、混入した塩酸
を除き、脱水ボウ硝で乾燥後、減圧濃縮し、次の（ＧＬ
Ｃ）用試料とする。

気相液相クロマトグラフィー（ＧＬＣ）ＧＯ−１５Ａ（
島津製作所）充填剤：　ＰＥＧ−ＨＴ　　５％　Ｕｎｉｐｏｒｔ　Ｈ
Ｐ　６０／８０ガスクロ工業■ 運転条件：試料気化室温度　３５０　’Ｃカラム温度：
１９０〜２００℃ カラム　３φＸ２ｍ流速　Ｎ　２４５　ｍＡ’／ｍｉｎ実施例１還元末端限定酸化法による燐脂質結合グリコサミノグリ
カンの製造（１）還元末端限定酸化グリコサミノグリカンの製造１）還元末端残基開環ヒアルロン酸の製造ヒアルロン酸
（鶏冠由来、ＭＷ　１万　ＨＡ　］、　）２２０００ｍ
を２００−の００５Ｍホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８，３）に
溶解し、１８２ｍｇの水素化ホウ酸ナトリウムを加えて
室温で５時間反応させた。

酢酸でｐＨ４，５にしてエタノールを加えて生成物を沈
澱させ、次いで生成物をエタノールで洗浄した。これに
よりロット番号１００の還元末端残基開環ヒアルロン酸
（Ｒ−ＨＡＩ）を１８００ｍｇ得た。

２）還元末端限定酸化ヒアルロン酸の製造１７００ｍｇ
のＲ−ＩＡＩ　（ロット番号１００）を２５０ｄの４０
ｍＭイミダゾール（ｐＨ６、５）に溶解し、０℃で１３
９．９６ｍｇの過ヨウ素酸ナトリウムを加え、１時間反
応させた。反応液にエタノールを加えて生成物を沈澱さ
せ、次いでエタノールで洗浄した。これによりロット番
号２００の還元末端限定酸化ヒアルロン酸ｔｏ−）ＩＡ
）　１６００ｍｇを得た。

３）他のグリコサミノグリカンの還元末端限定酸化物（
０−ＧＡＧ）の製造ヒアルロン酸（鶏冠由来、ＭＷ　５万：　ＩＡ５．　Ｍ
Ｗ１５万＋　ＨＡＩ５）、コンドロイチン（コンドロイチン硫酸Ａから酸性メタノ
ール溶液で脱硫酸したもの、ＭＷｌ、５万、：　ＣＨＩ
　、コンドロイチン硫酸Ｃ（鮫軟骨由来、ＭＷｌ万：Ｃ３（
Ｓｌ）、　ＭＷｌ３万：　Ｃ３（Ｓ３）、　ＩＡＶＩ６
万：　（１，５（３６））　　、コンドロイチン硫酸Ａ
（鮫軟骨由来、ＭＷ３万ＣＳ　（Ｗ）　）、デルマタン硫酸（豚皮由来、ＭＷｌ、５万：　ＤＳ）、
ヘパリン（豚小腸由来、ＭＷｌ、５万：　Ｈｅｐｌ、ヘ
パラン硫酸（牛腎由来、ＭＷｌ、５万：　Ｈ３）、グラ
タン硫酸（牛角膵由来、ＭＷｌ、５万：　ＫＳ）を原料
として上記の１）に準して表２の条件で還元末端残基開
環グリコサミノグリカン（Ｒ−ＧＡＧＩを製造した。ひ
きつづき、上記の２）の方法に準じて表３の条件で還元
末端限定酸化グリコサミノグリカン（０−ＧＡＧＩを製
造した。

表ミノ（ＧＡＧミノ・Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアジバルミトイ
ル結合グリコサミノグリカンＰＰＥＡＤＰ）の製造Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアジバルミトイ
ル結合ヒアルロン酸の製造１０００ｍｇのロット番号２
００の０−ＨＡを００５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，０
）１００ｍｌに溶解し、クロロホルム・メタノール＝２
１の溶媒で（１ｍｇ／　ｍｌ　）に溶解したＬ−（α−
ホスファチジル）エタノールアミン・ジパルミトイルｆ
ＰＰＥＡＤＰ）を６９．２−加えた。さらに、メタツル
を加えて均一な溶液にして、５０°Ｃで１時間反応させ
、その後、シアン水素化ホウ素ナトリウムを２５ｍｇを
加えた。２時間５０’Ｃで反応させ、減圧下濃縮し、酢
酸飽和のエタノールを５倍量加えて生じた沈澱を枦取し
た。沈澱を０．３Ｍ塩化アンモニウム塩で溶解し、疎水
クロマトカラム（ＴＳＫｇｅｌフェニルトヨパール６５
０Ｍ４００献）に吸着し、充分に０．３Ｍ塩化アンモニ
ウム水溶液で洗浄し、３０％メタノール水溶液で溶出し
た。素通り及び洗浄画分に未反応のＩＡＩが溶出され、
３０％メタノール水溶液の画分に目的とする水晶が溶出
した。３０％メタノール水溶液溶出画分を減圧下濃縮し
、透析て脱塩後、凍結乾燥してロット番号３００の白色
粉末を得た。

収量　４０ｍｇＰＰＥＡＤＰ含量：６２１％ヒアルロン酸含量：６２．１２％疎水クロマトグラフィ：図−１に示す。

疎水クロマトグラフィの条件カラム：　ＴＳＫ　ｇｅｌフェニル５ＰＷ（７，５φＸ
７．５ｃｍ１溶媒・０〜５分　　０．３Ｍ塩化アンモニウム水溶液５〜５０分　３０％メタノール水溶液溶出速度：０．５−／分圧：　７　ｋｇｌｏ、　５ｃｍ２分画容量；１−／管検出：　ＯＤ　２□。。１検体＋　１００ＰＩ　（１ｍｇ／ｍ１０．３Ｍ塩化アン
モニウム水溶液）２）その他の燐脂質結合ゲルコサミノグリカンの製造表３に示した０−ＧＡＧとＰＰＥＡＤＰとを表４に示し
た条件で、上記（２）−１＋の方法に準じて燐脂質結合
グリコサミノグリカンを製造した。得られた生・酸物の
分析値を表４に示した。

実施例２還元末端ラクトン化法による燐脂質結合グリコサミノグ
リカンの製造（１）還元末端酸化グリコサミノグリカンの製造ｌ）還元末端酸化ヒアルロン酸の製造５００ｍｇのヒアルロン酸Ｃ鶏冠由来、　ＭＷ１万ＨＡ
ＩＩを水１０ｙｄに溶解し、０．１Ｍヨウ素のメタノー
ル溶液５−を加えて室温で６時間反応させた。その後、
反応液に０．ＩＮ水酸化カリウムを約５ｉ加えて遊離の
ヨウ素の色を消失さセた。この溶液に酢酸カリウム飽和
エタノールを加えて生じた沈澱を炉取し、充分にエタノ
ニルで洗浄し、減圧乾燥した。

これによりロット番号４００の還元末端酸化ヒアルロン
酸４２３ｍｇを得た。

ソモジーネルソン法による還元糖の有無　無２）還元末
端ラクトンヒアルロン酸の製造４００ｍｇのロット番号
４００の還元末端酸化ヒアルロン酸を水１０ｄに溶解し
、強酸性イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ　５０（Ｈ”″）
）５０ｄに１時間を要して通過させ、還元末端ラクトン
ヒアルロン酸３９０ｍｇを含む水溶液を得た。

ソモジーネルソン法による還元糖の有無、無上記の水溶
液をトリーｎ−ブチルアミンで中和し、凍結乾燥して還
元末端ラクトンヒアルロン酸のトリーｎ−ブチルアミン
塩（ロット番号５００）４００ｍｇを得た。

３）他の還元末端ラクトングリコサミノグリカンの製造
方法コンドロイチン（ＭＷｌ、５万：ＣＨ）、コンドロイチ
ン硫酸Ｃ（ＭＷｌ万：Ｃ３（Ｓｌ）、　　ＭＷ３万：　
Ｃ：５ｆＳ３１及びＭＷ６万・Ｃ３（Ｓ６１　）、デル
マタン硫酸（ＭＷｌ、５万＋　ＤＳ）、ヘパリン（ＭＷ
ｌ、５万：　Ｈｅｐ）、及びヘパラン硫酸（ＭＷｌ、５
万・Ｈ３）を原料として、上記１）に準じて表５の条件で還元末端
酸化グリコサミノグリカンを製造した。ひきつづき、上
記２）に準じて表６の条件で還元末端ラクトングリコサ
ミノグリカンを製造した。

ミノ・（ＧＡＧミノ・Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアジバルミトイ
ル結合グリコサミノグリカンＰＰＥＡＤＰ）の製造Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアジバルミトイ
ル結合ヒアルロン酸の製造４００ｍｇの四ツｌ一番号５
００の還元末端ラクトンヒアルロン酸を２００−のジメ
チルホルムアミドに溶解し、２７．６ｍｇのＰＰＥＡ［
ＩＰのクロロホルム溶液を加えて、７０℃で２時間反応
させ、クロロホルムを溜去し、過剰の酢酸す１−リウム
水溶液を加えてすトリウム塩にしてから、酢酸す１−リ
ウム飽和エタノールを加えた。生じた沈澱を？戸数し、
０．３Ｍ酢酸アンモニウム溶液に溶解し、実施例１　（
２）に準じて精製し、ロット番号６００の目的物３６ｍ
ｇを得た。

リン含量　０．３０％ＰＩ”ＥＡＩＨ’含量・６．４４％ヒアルロン酸含量＋８２．３７％疎水クロマトグラフ、図−２に示す。

測定条件は前記と同じ。

２）その他のＬ−（α−ホスファチジル）エタノールア
ミン・ジパルミトイル結合グリコサミノグリカンの製造表６に示した還元末端ラクトングリコザミノグノカンと
ＰＰＥＡＤＰとを表７に示した条件で、上記（２）−１
１の方法に準して製造した。得られた生成物の分析値を
表８に示した。

表７弓　６表８４００ｍｇのロット番号５００−２の還元末端ラフ！・
ンコンドロイチン硫酸Ｃを２００−のジメチルポルムア
ミドに溶解し、９ｍｇのホスファチジルセリンステアレ
ートバルミテ＝１・のクロロホルム溶液を加えて、７０
’Ｃで２時間反応させた。クロロホルムを溜去し、過剰
の酢酸ナトリウム水溶液を加えてすトリウム塩にしてか
ら、酢酸すｌ・リウム飽和エタノールを加えて生じた沈
澱を？戸数した。沈澱を０１３Ｍ塩化アンモニウム溶液
で溶解し、実施例１−（２）に準じて処理した。これに
よりロット番号７００−２のホスファチジルセリンステ
アロイルバルミトイル結合コンドロイチン硫酸Ｃを２０
．８ｍｇ得た。

リン含量　０．１０％コンドロイチン硫酸Ｃ含量：８６．１５％疎水クロマト
グラフ・図−３に示す。

測定条件は前記と同じ。

実施例３還元末端アミン法による燐脂質又は脂質結合グリコサミ
ノグリカンの製造（１）還元末端アミノーグルコサミノグリカンの製造１）還元末端アミノ−コンドロイチン硫酸Ｃ（Ｃ３（Ｓ
３１　）の製造１００ｍｇのロット番号２０２−２の還元末端残基開環
コンドロイチン硫酸Ｃを５０ｍ１！の０．０５Ｍリン酸
塩緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、２４ｍｇのエチレン
ジアミン塩酸塩を加えて５０℃で３０分反応させた。そ
の後、２０ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを加え
て５０’Ｃで２時間反応させた。反応液に酢酸ナトリウ
ム飽和エタノールを加えて生じた沈澱を枦取した。沈澱
を水に溶解し、透析により脱塩し、５０−の１）ＥＡＥ
−イオン交換樹脂に吸着させ、０．１Ｍ食塩水溶液から
１Ｍ食塩水溶液のグラジェントで溶出した。０．４Ｍ食
塩濃度で還元末端アミノーコンドロイチ疏酸Ｃが溶出さ
れ、遊離のコンドロイチン硫酸Ｃは０．７５Ｍ食塩濃度
で溶出した。

０．４Ｍ食塩溶液画分を透析により脱塩し、凍結乾燥し
、ロット番号８０２−２の還元末端アミノ−コンドロイ
チン硫酸Ｃ８０ｍｇを得た。

２）還元末端アミノ−ヘパリン（ｌｌｅｐ　）の製造上
記の方法に準じて、１００ｍｇのロット番号２０５還元
末端限定酸化ヘパリンを使用し、ロット番号８０５の還
元末端アミノ−ヘパリン７７ｍｇを得た。

（２）脂質のコハク酸誘導体の製造１）グリセロールモノステアレートのコハク酸エステル
の製造１０．７４ｇのグリセロールモノステアレートを３−の
ピリジンを含む２００−のベンゼンに溶解し、６ｇの無
水コハク酸を加えて６時間還流した。反応液を減圧濃縮
し、生じた沈澱をアセトンで再結晶し、グリセロールモ
ノステアレートのコハク酸エステル８．２ｇを得た。

２）グリセロールモノステアレー］−のコハク酸エステ
ルをＮ−ヒドロキシコハク酸イミドによる活性エステル
の製造上記ｌ）のエステル８ｇをベンゼンに溶解して、２ｇの
Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドを加え、１０ｇのジシク
ロへキシルカルボジイミドを加えて室温で２０時間反応
させた。反応液を減圧濃縮して、沈澱をベンゼン／ｎ−
ヘキサンで再結晶し、ロット番号ＧＭＳ−１の標記活性
エステル７．４ｇを得た。

（３）グリセロールモノステアレー１・結合コンドロイ
チン硫酸Ｃの製造８０ｍｇ０ロツト番号８０２−２の還元末端アミノ−コ
ンドロイチン硫酸Ｃを５−の水に溶解し、６．９５ｍｇ
の四ツ１一番号ＧＭＳ−１の活性エステルのジメチルポ
ルムアミド溶液を加えて室温で２０時間反応させた。反
応液に酢酸す１−リウム飽和エタノールを加え、生じた
沈澱を炉取した。沈澱を０．３Ｍ塩化アンモニウム水溶
液に溶解し、実施例１−　（２）−１１に準じて精製し
、ロット番号９０２−２の標記目的物３８ｍｇを得た。

ステアリン酸含量＋０．８６％コンドロイチン硫酸Ｃ含量：９Ｂ、２％疎水クりマトグ
ラフィ二図−３に示す。

測定条件は前記と同じ。

（４）燐脂質のコハク酸誘導体の製造１）リゾレシチンのコハク酸エステルの製造次式のりゾ
レシチンＣｌ２０ＧＯ−（ｃｏ□）、４−Ｃ１１ｓ１０ＣＨＣ１１２０ＰＯ（ｏ−１０Ｃ１１２ＣＨ２Ｎ”　（Ｃｔ
ｌ−１５４９５ｍｇをクロロボルム２００−に溶解し、
無水コハク酸１００ｍｇと７９ｍｇのピリジンを加えて
室温で２０時間反応させた。反応液を減圧濃縮し、生じ
た沈澱をアセトンで再結晶し、リゾレシチンのコハク酸
エステルを得た。

２）リゾレシチンのコハク酸エステルのＮ−ヒドロキシ
コハク酸イミドによる活性エステルの製造上記エステル２８８．５ｍｇをジメチルホルムアミドに
溶解し、５７．５ｍｇのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド
と１０３ｍｇのジシクロへキシルカルボジイミドを加え
て室温で２０時間反応させた。沈澱を除去し、上記活性
エステルのジメチルホルムアミド溶液を得た。

（５）リゾレシチン結合グリコサミノグリカンの製造１）リゾレシチン結合コンドロイチン硫酸Ｃの製造上記（４）−２＋で得られた上記活性化エステルのジメ
チルホルムアミド溶液にロット番号８０２−２の還元末
端アミノ−コンドロイチン硫酸Ｃ１ｇの水溶液を加えて
室温で２０時間反応させた。精製は実施例１に準じて、
疎水クロマトグラフィーで精製した。

収量・０５２ｇリン含量：０．１０５％リゾレシチン含量＋１．９６％コンドロイチン硫酸含量：９８：０４％イ才つ含量：５
．７８％（６）グリセロールジステアレート結合コンドロイチン
硫酸Ｃの製造上記（１）−１１で得られたロット番号８０２２の還元
末端アミノ−コンドロイチン硫酸Ｃと上記（２）−２１
と同様な方法で得られたグリセロールジステアレートの
コハク酸エステルの活性エステル（ロット番号　ＧＤＳ
−２）　　とを、上記（３）に準じて反応させ、精製し
て、ロット番号９０４の標記化合物２１ｍｇを得た。

実施例４縮合剤使用法による燐脂質結合グリコサミノグリカンの
製造（１）Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン・
ジパルミトイル結合コンドロイチン硫酸Ｃの製造４００ｍｇのコンドロイチン硫酸Ｃ（Ｃ３（Ｓ３１）の
トリーｎ−ブチルアミン塩を１００−のジメチルボルム
アミドに溶解し、６．９２ｍｇのＰＰＥＡＤＰのクロロ
ホルム溶液を加えた。更に、３８．４．ｍｇの１−エヂ
ルー３−（３−ジメチルアミンプロピル）カルボジイミ
ド塩酸塩を加えて室温で２０時間反応させた。反応液を
減圧下で濃縮し、過剰の酢酸ナトリウム水溶液を加えて
ナトリウム塩にした。この水溶液にエタノールを加えて
生じた沈澱を枦取した。沈澱を０．３Ｍ塩化アンモニウ
ム水溶液に溶解し、実施例１−　（２）−］）に準じて
精製し、ロット番号１．００２−２の標記目的物を６３
ｍｇ得た。

リン含量＋０．０９９％ＰＰＥＡＤＰ含量：２．２５％フンドロイチン硫酸Ｃ含量・９６６１％疎水クロマトグ
ラフィ・図−４に示す測定条件は前記と同しく２）他のＬ−（α−ホスファチジル）エタノルアミン
・ジパルミトイル結合グリコサミノグリカン（ＧＡＧ−
ＰＰＥＡＤＰ）の製造各種のグリコサミノグリカンとＰＰＥＡＤＰとを表９に
示した条件で上記（１）の方法に準じて燐脂質結合グリ
コサミノグリカンを製造した。得られた生成物の分析値
を表１０に示した。

表＊１！−リｎ−ブチルアミン塩表１０実施例５グリコサミノグリカン活性化法による燐脂質結合グリコ
サミノグリカンの製造（１）Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン・
ジパルミトイル結合コンドロイチン硫酸Ｃの製造４００ｍｇのコンドロイチン硫酸Ｃ（Ｃ３（Ｓ３））の
トリーｎ−ブチルアミン塩を３００最のＤＭＦに溶解し
、９．９ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミドと２０．
６ｍｇのジシクロへキシルカルボジイミドを加えて室温
で２００時間反応せた。反応液に過剰の酢酸ナトリウム
水溶液を加えてナトリウム塩にしてからにエタノールを
加えて生した沈澱を枦取した。即座に３０−の水で溶解
し、６，９２ｍｇのＰＰＥＡＤＰのクロロホルム溶液を
加えて、更にジメチルホルムアミドを加えて均一な溶液
とした。

室温で６時間反応させ、反応液を減圧濃縮して、酢酸飽
和のエタノールを加えた。生した沈澱を０．３Ｍ酢酸ア
ンモニウム水溶液に溶解し、実施例１−（２）−１＋に
準じて精製し、ロット番号１１０２−２の標記の目的物
を２９．７ｍｇ得た。

リン含量・０．１００％ＰＰＥＡＤＰ含量・２．１６％コンドロイチン硫酸Ｃ含量＋９５．９８％疎水クロマト
グラフィ　図−５に示す測定条件は前記と同しく２）Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン・
ジパルミトイル結合コンドロイチンポリ硫酸の製造１ｇのコンドロイチンポリ硫酸（Ｃ３Ｐ（ＩＴＩＩのト
リーローブチルアミン塩（イオウ含量１３，０％、分子
量１００００）を５０−のジメチルホルムアミドに溶解
し、１７７０ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミドと３
１．８ｍｇのジシクロへキシルカルボジイミドを加えて
４°Ｃで一晩反応させた。

反応液に１０−の水を加えて室温で１５分間反応させ、
生した沈澱を除去した後、この溶液に６９．２ｍｇのホ
スファグージルエタノールアミンシバルミトイル（ＰＰ
ＥＡＤＰ）のクロロホルム溶液を加えて室温で６時間反
応させた。反応液を減圧濃縮し、酢酸ナトリウム飽和の
エタノールを加えて生じた沈澱を集めた。沈澱を０．３
Ｍの酢酸アンモニウム水溶液に溶解し、実施例１−（２
）■）に準して精製し、ロット番号１１０８の標記の目
的物６７ｍｇを得た。

リン含量：０．２９１％ＰＰＥＡＤＰ含量・６５％コンドロイチンポリ硫酸含量・９２．８％イオウ含量　
１２０５％疎水クロマトグラフィ：図−６に示す測定条件は前記と同じ実施例６フィブロネクチンを予め塗布した培養皿に塗布した燐脂
質又は脂質結合グリコサミノグリカンのＢＨＫ細胞の接
着に対する効果９６穴培養皿を５　ｒＪｇ　／耐つシ血漿フィブロネク
チン１００１ｄで塗布した後、洗浄し、実施例１〜５で
得た各種燐脂質又は脂質結合グリコサミノグルカン１０
０ｕ／穴を表７に示す各濃度で塗布した。

別に、１００ｍｍ径の培養皿に培養したＢＨＫ細胞（新
生ハムスター腎細胞）を０．１ｍｇ／−の濃度のトリプ
シン溶液５−を加え、３７°Ｃで５分間処理した。次い
て、１　ｍｇ／−の大豆トリプシンインヒビクー溶液５
−を加え、トリプシンを不活性化した後、遊離した細胞
を遠心により集めた。細胞は２回洗浄後、１−あたり１
×１０ｒ′個細胞となるように単一細胞懸濁液とした。

得られた単一細胞懸濁液１００ｕ（ＩＸＩＯ。

個細胞）を、上記フィブロネクチンと燐脂質又は脂質結
合グリコサミノグリカンを塗布した培養皿に加え、３７
°Ｃで１時間処理した。接着しなかった細胞を洗浄した
後、接着した細胞を２％ホルムアルデヒドで固定し、直
接位相差顕微鏡で観察して、その細胞数をカウントした
。

結果を表１１に示す。表１１は、各濃度における細胞接
着の変動を示す。値は３回ないし４回の測定の平均を示
し、誤差（標準偏差）もあわせて表した。

なおそれぞれの遊離グリコサミノグリカンおよび未結合
の脂質のみでは高濃度にしても全く細胞接着阻害効果を
示さなかった。

実施例７各種培養細胞の細胞接着物質に対する燐脂質又は脂質結
合グリコサミノグリカンの接着阻害効果実施例１〜５て
得た燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリカンについて
、ＢＨＫ２１細胞（新生ハムスター腎細胞）、ＣＥＦに
ワトリ胚線維芽細胞）、Ｂ１６Ｆ１０　（高転移性マウ
スメラノマ細胞）、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵
巣細胞）、及びｂａＥＣ（ウシ大動脈内皮細胞）の各種
細胞群に対しての、フィブロネクチン（ＦＮ）、ラミニ
ン（ＬＮ）、Ｉ型コラーゲン（Ｃｏｉｌ）及びビトロネ
クチン（ＶＮ）による接着に対する阻害効果を検討した
。

各５μｇ／ｍｌのウシ血漿フィブロネクチン、マウスＥ
Ｈ３腫瘍細胞由来ラミノン、ラット腿由来■型コラーゲ
ン、及びウシ血清ビトロネクチンをそれぞれ９６穴培養
皿に塗布し、実施例６と同様にして、実施例１〜５で得
た燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリカンを塗布した
後、それぞれＢＨＫ２１細胞、ＣＥＦ細胞、８１６Ｆ１
０細胞、ＣＨＯ細胞、及びｂａＥＣ細胞の単一細胞懸濁
液１００ｕ（ＩＸＩＯ’個細胞）を加え細胞接着の変動
を見た。対照として燐脂質又は脂質結合グリコサミノグ
リカンを添加せず、接着物質のみの細胞接着を１００％
とした。結果を表１２に示す。

なお、表１２中で相対接着細胞数として、全くあるいは
殆ど細胞接着しなかった場合（０〜ｌＯ％未満）な−、
１０〜３０％未満を＋、３０〜５０％未満を＋＋、５０
〜７０％未満を＋＋＋、７０〜９０％未満を＋＋＋＋、
そして９０〜１００％の細胞が接着した場合を＋＋＋＋
＋と半定量的に表した。

実施例８血管内皮培養細胞の細胞外マトリックスにおける高転移
性癌細胞の接着に対する燐脂質結合コンドロイチン硫酸
Ｃの抑制効果マウス由来血管皮細胞を２４穴の■型コラーゲンでコー
トした培養皿で集密状態になるまで培養し、細胞単層に
０５％トリトンＸ−１００で室温３０分間処理し、破壊
された細胞片をグルベツコの緩衝液　（Ｄｕｌｂｅｃｃ
ｏ’ｓ　ＰＢＳ　（＋））で洗浄して内皮細胞の細胞外
マトリックスを得た。

一方、１００ｍｍ径の培養皿に培養したマウス由来高転
移性癌細胞Ｂ１６Ｆ１０に５ｍｌリブシン溶液（０，１
ｍｇ／−ＰＢＳ　（１）を加え、３７°Ｃで５分間処理
した。次いで、大豆トリプシン阻害剤５ｍ／　（１ｍｇ
／Ｊ）を加え、トリプシンを不活性化した後、遊離した
細胞を遠心により集めた。さらに細胞をリン酸塩緩衝液
（ＰＢＳ（−＋＋で２回洗浄後、１−あたり２％１０６
個の細胞数になるように単一細胞懸濁液（Ｈａｎｋｓ’
　Ｂ５Ｓ−２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，４）を調製
した。

ロット番号６０２−２　ｆｃｓ（Ｓ３）−ＰＰＥＡＤＰ
）の燐脂質結合コンドロイチン硫酸Ｃと、Ｂ１６Ｆ１０
の単一細胞懸濁液５００ｐＪ！（ｌ×１０５個細胞を、
前述した細胞外マトリックスを調製した２４穴培養皿に
加え、３７°Ｃて１時間、５％炭酸ガス培養器内で静置
した。

上清を静かに集め、さらにハンクス緩衝液で１同種やか
に洗った。その上清と洗液を合わせて、細胞外マトリッ
クスに接着しなかった細胞としてその細胞数をコールタ
−カウンター（コールタ−・エレクトロニクス社製）で
計数した。対照としてロット番号６０２−２　（Ｃ３（
Ｓ３］　−ＰＰＥＡＤＰＩ　を含まない緩衝液のみのも
の（無添加）と、遊離のコンドロイチン硫酸Ｃを添加し
たものを比較した。

細胞の接着率は、最初に添加した全細胞数から計数した
非接着細胞数を引き、その値を全細胞数で割った値を百
分率で表した。その結果を表１３に示す。

表　　１３無添加　　　　　−８２８％遊離コンドロイチン硫酸Ｃ５０＋Ｊｇ　　　８２．６％
６０２−２　（Ｃ３（Ｓ３１−ＰＰＥＡＤＰＩ　　　　
　　５０νｇ　　　５０．７％この結果から、本発明の
燐脂質結合グリコリミノグリカンは血管内皮細胞の細胞
外マ］・リックスに対する高転移性癌細胞の接着を抑制
することがわかる。遊離のコンドロイチン硫酸Ｃではそ
のような作用は全く認められなかった。

【図面の簡単な説明】

図１〜６は、燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリカン
の疎水クロマトグラフィーを示し、図１は実施例１−　
（２）　−１１の目的物、図２は実施例２−　（２）−
１１の目的物、図３は実施例２−（３）の目的物、図４
は実施例４−　（１）の目的物、図５は実施例５−　（
１）の目的物、図６は実施例５−　（２）の目的物であ
る。手続補正書

Claims

【特許請求の範囲】１、燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリカン又はその
塩を含有する癌転移抑制剤。２、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ）を有する燐脂質結合グリコサミノグリカン又はその塩を
含有する癌転移抑制剤。上記式中、ＧＡＧはヒアルロン酸、コンドロイチン、コ
ンドロイチン硫酸Ａ、Ｃ、ＥもしくはＫ、コンドロイチ
ンポリ硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸
、ケラタン硫酸又はケラタンポリ硫酸から還元性末端の
ヘキソサミン部分を除いたグリコサミノグリカン残基を
示し、Ｐ＾１は１級アミノ基を有する燐脂質を示す。３、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（II）を有する燐脂質結合グリコサミノグリカン又はその塩を
含有する癌転移抑制剤。上記式中、Ｒ＾１はＯＨ又はＮＨＣＯＣＨ＿３を示し、
Ｒ＾３は水素又はＳＯ＿３Ｈを示し、ＧＡＧはヒアルロ
ン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸Ａもしくは
Ｋ又はデルマタン硫酸から還元性末端のヘキソサミン部
分を除いたグリコサミノグリカン残基、或いはケラタン
硫酸又はケラタンポリ硫酸から還元性末端のガラクトー
ス部分を除いたグリコサミノグリカン残基を示し、Ｐ＾
１は１級アミノ基を有する燐脂質を示す。４、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（III）を有する燐脂質結合グリコサミノグリカン又はその塩を
含有する癌転移抑制剤。上記式中、ＧＡＧはケラタン硫酸又はケラタンポリ硫酸
から還元性末端のガラクトース部分を除いたグリコサミ
ノグリカン残基を示し、Ｐ＾１は１級アミノ基を有する
燐脂質を示す。５、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（IV）を有する燐脂質結合グリコサミノグリカン又はその塩を
含有する癌転移抑制剤。上記式中、Ｒ＾１はＯＨ、ＯＳＯ＿３Ｈ、ＮＨＣＯＣＨ＿３又はＮＨＳＯ＿３Ｈを示し、Ｒ＾２は
ＣＯＯＨ、ＣＨ＿２ＯＨ又はＣＨ＿２ＯＳＯ＿３Ｈを示
し、Ｒ＾３は水素又はＳＯ＿３Ｈを示し、ＧＡＧはヒア
ルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸Ａ、Ｃ
、Ｄ、ＥもしくはＫ、コンドロイチンポリ硫酸、デルマ
タン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸又は
ケラタン硫酸から還元性末端のヘキソサミン部分又はウ
ロン酸部分もしくはガラクトース部分を除いたグリコサ
ミノグリカン残基を示し、Ｐ＾１は１級アミノ基を有す
る燐脂質を示す。６、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｖ）を有する燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリカン又は
その塩を有する癌転移抑制剤。上記式中、ＧＡＧは請求項２に記載と同じである。ｍは
１〜８を示し、ｌは１〜１０を示し、Ｐ＾２は燐脂質又
は脂質を示す。７、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（VI）を有する燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリカン又は
その塩を含有する癌転移抑制剤。上記式中、Ｒ＾１、Ｒ＾３及びＧＡＧは請求項３に記載
と同じであり、ｍ、ｌ及びＰ＾２は請求項６に記載と同
じである。８、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（VII）を有する燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリカン又は
その塩を含有する癌転移抑制剤。上記式中、Ｒ＾１、Ｒ＾２、Ｒ＾３及びＧＡＧは請求項
５に記載と同じであり、ｍ、ｌ及びＰ＾２は請求項６に
記載と同じである。９、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（VIII）を有する燐脂質結合グリコサミノグリカン又はその塩を
含有する癌転移抑制剤。上記式中、Ｒ＾３は水素又はＳＯ＿３Ｈを示し、ＧＡＧ
はヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸
Ａ、Ｃ、Ｄ、ＥもしくはＫ、コンドロイチンポリ硫酸、
デルマタン硫酸、ヘパリン又はヘパラン硫酸中のグリコ
サミノグリカン鎖を示し、Ｐ＾１は１級アミノ基を有す
る燐脂質を示し、ｎはグリコサミノグリカンに存在する
カルボキシ基の数以下の数を示す。