WO2005002722A1 - Verfahren zum aufbringen von substanzen auf unporöse kieselgel-partikel - Google Patents

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    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier

Definitions

  • the invention relates to non-porous silica gel particles with an adjustable uniform particle size of less than 15 ⁇ m, on the surface of which biologically and / or chemically active substances are immobilized or applied, a process for their preparation and their use preferably for carrying out molecular separations, chromatography, catalysis , Analytics, sample enrichment, binding or other chemical reactions.
  • Proteins and fragments are usually only of advantage for small analyte molecules. Proteins and fragments
  • the present invention is therefore based on the object of circumventing the disadvantages of the known methods for applying substances to inorganic material supports and of providing a method for immobilizing or applying substances onto non-porous silica gel particles with an adjustable uniform particle size of less than 15 ⁇ m , This process is intended to enable a significantly higher number of immobilized molecules, a denser loading of the columns and a considerable acceleration of physical, chemical or biochemical processes on the carrier surfaces.
  • the invention primarily proposes a method with the features mentioned in claim 1. Further developments of the invention are the subject of the remaining dependent and independent claims 2 to 21, the wording of which, like the wording of the summary, is made the content of the description by reference.
  • the above-mentioned aim is achieved according to the invention in that in a first process step silica gel particles with an average particle size smaller than 15 ⁇ m, in particular with the size of 0.2 to 1.2 ⁇ m are produced, in the second step the surface - This silica gel particle is pretreated for immobilization of molecules, and finally in the third step the molecules to be immobilized are bound to the particle surface either directly or via previously attached spacers.
  • a sol of primary particles is first produced.
  • a process for the production of spherical SiO 2 particles by hydrolytic polycondensation of tetraalkoxysilanes is known from the prior art (W. Stöber et al., J. Colloid and Interface Science 26, 62 (1968) and 30, 568 (1969)). While maintaining basic reaction conditions, this method is modified in the first step of the present invention to produce uniform, non-porous silica gel particles as follows.
  • the tetraalkoxysilane is placed in a preheated aqueous-alcoholic-ammoniacal hydrolysis mixture and mixed well. After an hour of reaction, the synthesis is usually complete and the spherical silica gel material can be separated from the remaining solvent.
  • silica gel particles of different average particle sizes can be obtained.
  • the silica gel particles advantageously have an average particle size of less than 15 ⁇ m, but preferably between 0.2 ⁇ m and 5 ⁇ m, in particular between 0.2 ⁇ m and 1.2 ⁇ m, with a standard deviation of not more than 10%.
  • the specific surface area is 2 m 2 / g to 20 m 2 / g.
  • ethanol is used for the production of particles with medium sizes between 0.2 ⁇ m and 0.3 ⁇ m, and isopropanol for larger particles.
  • TEOS tetraethoxysilane
  • a modification of the particle surface necessary for the immobilization of molecules takes place according to the invention. Since silica gel naturally does not contain any functional groups for binding molecules, the surface is modified by treatment with suitable substances to such an extent that the molecules to be immobilized can be bound to the support material in a further step either directly or via a spacer. In particular, amino, epoxy, thio, phospho or carboxyl groups are introduced onto the carrier surface in this step.
  • the particle surface is treated with aminoalkylalkoxysilanes, in particular with 3-aminopropyltriethoxysilane or / and with N- (2-aminoethyl) -3-aminopropyltrimethoxysilane, in order to introduce amino groups to the support surface.
  • aminoalkylalkoxysilanes in particular with 3-aminopropyltriethoxysilane or / and with N- (2-aminoethyl) -3-aminopropyltrimethoxysilane, in order to introduce amino groups to the support surface.
  • these can be linked with a carboxyl group e.g. a protein (e.g. in a carbodiimide process) or with the carbonyl group of a spacer such as e.g. Glutaraldehyde react.
  • the binding of substances to the surface can e.g. via already existing (as with proteins) or specially introduced amino groups (oxirane method) or also thionyl groups.
  • the substances to be applied are bound via bifunctional spacers.
  • the suitable, preferably bifunctional, spacers are covalently bound to the functional groups introduced beforehand.
  • Bifunctional spacers with amino, thio, phospho, carboxyl, hydroxyl or epoxy groups are advantageous End used with which the molecules to be immobilized should react in the next step.
  • the use of spacers which can react with the amino groups located on the surface has proven particularly advantageous.
  • glutaraldehyde or glutaraldehyde is used for this. It is also possible to use numerous other spacers, such as, for example, alkyl chains, divinyl sulfone or other spacers known from the prior art.
  • the silica gel particles according to the invention which are loaded with molecules, can be used for many purposes much more effectively than porous carrier materials, since the pores are inaccessible for many larger molecules, such as proteins. Finally, a better packing bed is possible due to the small size dispersion and a small average particle size.
  • the invention comprises non-porous spherical silica gel particles with a particle size, in particular an average particle size, of less than 15 ⁇ m, which are loaded with biologically and / or chemically active substances.
  • the silica gel particles can preferably be produced by the process described above.
  • the invention comprises the use of the silica gel particles loaded with biologically and / or chemically active molecules when carrying out physical, chemical or biochemical processes on their surface.
  • the silica gel particles described in the present invention can be used in a molecular separation such as a nucleic acid, protein or other separation, for example on a Hybridization or a ligand-receptor principle is used.
  • Another possible use is to carry out enzymatic or catalytic reactions, for example in different production processes, enzyme or catalyst molecules being applied to the surface of the silica gel particles.
  • Molecular separations, chromatography or sample enrichment can also be carried out on the particles described.
  • silica gel particles which can be used, for example, in the field of analysis or diagnostics.
  • organic macromolecules eg proteins, peptides, enzymes
  • silica gel particles are also suitable for attaching various metal complexes, for example for selective hydrogenation or also for attaching pieces of DNA for nucleic acid synthesis.
  • the chemical industry, medical laboratory diagnostics, drug or crop protection agent development, quality control and research and development are among the sectors in which the silica gel particles according to the invention can be used particularly advantageously.
  • FIG. 2 Course of the UV absorption of nitrophenolate during the cleavage (saponification) of p-nitrophenyl caprylate for determining the activity of the lipase on various materials;
  • Figure 3 Diagram of the 29 Si-CP / MAS-NMR spectrum of silica gel particles with an average particle diameter of 0.7 ⁇ m.
  • the signal of the surface species Q 2 can hardly be seen (92 ppm) due to the much smaller surface area.
  • a clearly recognizable signal would have to appear here.
  • Uniformly spherical silica gel particles with different diameters in the range from 0.2 to 1.2 ⁇ m can be produced by the hydrolysis of tetraethoxysilane (TEOS) in the presence of ammonium hydroxide in an alcoholic medium under strictly defined concentration ratios of the starting materials used.
  • TEOS tetraethoxysilane
  • the size of the silica gel obtained can be gradually changed from 0.2 to 1.2 ⁇ m (see Table 1):
  • Table 1 Amounts of the educts used to synthesize the spherical silica gel particles with different diameters: a) ethanol, b) isopropanol, c) two-step reaction
  • the alcohol is mixed with water and ammonia solution and warmed up with gentle stirring. After the reaction temperature is reached, the tetraethoxysilane is added all at once in one step. After about an hour of reaction, the synthesis is complete and the spherical silica gel material can be separated from the remaining solvent. Ethanol is used to produce particles with diameters between 0.2 ⁇ m and 0.3 ⁇ m. The more viscous isopropanol is used to display larger particles. From a size of 1 ⁇ m, the display takes place in 2 stages and the TEOS is added at intervals of approx. 30 min.
  • the uniform shape and a uniform particle size can already be seen from the SEM images shown in FIG. 1.
  • silica gel particles with a particle diameter of 0.7 ⁇ m is activated at 180-200 ° C. After the silica gel has cooled to 70 ° C., it is suspended in 100 ml of toluene. 510 ⁇ l of aminopropyltriethoxysilane (triple excess) are added to the suspension, and the reaction mixture is heated under reflux for 20 h. Finally, the silica gel is filtered off with a glass frit and washed twice with toluene, acetone and pentane.
  • 100 mg of the aminopropyl silica gel from step b) are reacted with 1 ml of an aqueous 5% glutardialdehyde solution.
  • the solution is shaken for 4 hours, then the imine bond formed is reduced for 2 hours by 1 ml of NaCNBH 3 (5 mg / ml).
  • the resulting material is washed with water and loading buffer (150 mM NaCl, 10 mM Phos- phat buffer, pH 7.4) washed several times and stored in loading buffer.
  • 1 ml of an enzyme solution (lipase, 1 mg / ml) is mixed with 0.5 ml of a high salt buffer (1, 5 M Na 2 S0 4 in 100 mM phosphate buffer, pH 7.4) and the silica gel from step c) given.
  • the suspension is shaken for 1 minute and then 1 ml of the same buffer is added. After 5 more minutes, 1 ml of the buffer is added and the solution is shaken for 24 hours. The suspension is then centrifuged and the supernatant separated. The precipitate is mixed with capping buffer and shaken for 2 h.
  • the modified silica gel is washed three times with loading buffer (150 mM NaCl, 10 mM phosphate buffer, pH 7.4), three times with 1 M NaCI solution and three times with loading buffer and stored therein.
  • the cleavage (saponification) of p-nitrophenyl caprylate is selected. Since nitrophenol has a significant shift in the UV absorption maximum depending on the pH value, the activity of the lipase at the concentration of the nitrophenolate can be monitored by UV spectrometry.
  • the results for the lipase (FIG. 2, NPS) bound to the non-porous silica gel particles show a significantly increased activity compared to the free lipase in glycol (FIG. 2, lipase in glycol) and the bare silica gel (FIG. 2, blank) , The reduced activity of the free lipase can be explained by its agglomeration in solution.
  • a reference material without lipase immobilization is also tested to rule out that the saponification of the ester takes place on the silica gel surface instead of the lipase. For this purpose, all steps of the covalent binding with the exception of lipase addition. There is a curve similar to that for the bare silica gel (FIG. 2, comparative material).

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung unporöser Kieselgel-Partikel mit einer einstellbaren einheitlichen Teilchengröße kleiner als 15 µm, auf deren Oberfläche biologisch und/oder chemisch aktive Substanzen immobilisiert oder aufgebracht sind, sowie ihre Verwendung bevorzugt zur Durchführung von Molekülseparationen, Chromatographie, Katalyse, Analytik, Probenanreicherung, Bindungs- oder sonstigen chemischen Reaktionen.

Description

Verfahren zum Aufbringen von Substanzen auf unporöse Kieselqel- Partikel
Beschreibung
Die Erfindung betrifft unporöse Kieselgel-Partikel mit einer einstellbaren einheitlichen Teilchengröße kleiner als 15 μm, auf deren Oberfläche biologisch und/oder chemisch aktive Substanzen immobilisiert oder aufgebracht sind, ein Verfahren zu ihrer Herstellung, sowie ihre Verwendung bevorzugt zur Durchführung von Molekülseparationen, Chromatographie, Katalyse, Analytik, Probenanreicherung, Bindungs- oder sonstigen chemischen Reaktionen.
Der Vorteil einer Immobilisierung von Biomolekülen auf einem Träger- material wurde schon vor Jahren erkannt und liegt in einer vereinfachten Aufreinigung des Produkts z.B. bei einer Molekülseparation sowie vor allem in der Möglichkeit ihrer mehrfachen Wiederverwendung. Außerdem zeigen die auf einem Trägermaterial immobilisierten Moleküle wie Enzyme eine stärkere Aktivität und Stabilität als in Lösung. Für eine Im- mobilisierung von Biomolekülen auf Trägeroberflächen sind unterschiedliche Trägermaterialien sowie Verfahren bekannt.
Als Trägermaterialien kommen hierfür unterschiedliche organische Polymere (Polysacharide wie Sepharose, Sephadex, synthetische Polyme- re wie Polyacrylamide, Phenol-Formaldehyde) sowie anorganische Materialien (Glas, Aluminiumoxide oder Silikate) in Frage. Ein großer Nachteil organischer Trägermaterialien ist die Empfindlichkeit gegenüber organischen Lösungsmitteln und hohen Temperaturen, geringe Druckstabilität sowie relativ hohe Produktionskosten. Aus diesem Grunde wurden mehrere Verfahren zum Aufbringen von Biomolekülen auf anorganische Substrate entwickelt, denen die oben genannten Nachteile organischer Träger nicht anhaften. Die bekannten Verfahren zur Immobilisierung biologisch aktiver Substanzen auf einem anorganischen Träger reichen von einer einfachen physikalischen Adsorption bis zur kovalenten Bindung an die Trägeroberfläche. Vor allem für Proteine wie Antikörper und Enzyme hat sich eine Fixierung mittels kovalenter Bindungen als besonders vorteilhaft erwiesen. Das Patent US3, 652,761 beschreibt beispielsweise ein Verfahren zur Kopplung von Antikörpern oder Antigenen an Oberflächen über Amino-Gruppen, wobei die Oberflächen vorher mit 3- Aminopropyltriethoxysilanen oder N-(2-aminoethyl)-3- Aminopropyltrimethoxysilanen behandelt wurden. Eine Kopplung von Enzymen an anorganische Träger mittels bifunktionaler Spacer ist aus EP0158909 bekannt. Eine Immobilisierung physiologisch aktiver Substanzen auf den mit Aminoalkylalkoxysilanen vorbehandelten anorganischen Trägern wird in EP0325404 beschrieben.
Im Vergleich zu organischen Polymeren weisen die bei den bekannten Verfahren eingesetzten anorganischen Trägermaterialien wie Glas oder Silikate eine relativ geringe reaktive Oberfläche auf, so dass sie nur eine kleine Menge von Molekülen aufnehmen können und somit für viele Fragestellungen nur begrenzt einsetzbar sind. Ein verbessertes Verfahren wird in EP0158909 vorgeschlagen, wobei hier als Träger sphärische Si02-Partikel verwendet werden, deren mittlere Teilchengröße zwischen 15 und 80 μ und die spezifische Oberfläche zwischen 250 und 800 m2/g liegt. Zwar wird in diesem Dokument nicht explizit beschrieben, ob es sich hierbei um poröse oder unporöse Teilchen handelt, aus den Angaben zur spezifischen Oberfläche lässt sich jedoch auf poröse Partikel schließen.
Aus der Literatur sind einige Verfahren zur Herstellung poröser Kiesel- gel-Partikel bekannt, wie z.B. aus US4,983,369. Jedoch sind poröse
Teilchen meist nur für kleine Analytmoleküle von Vorteil. Proteine und
Enzyme weisen meist Durchmesser auf, die zu groß sind, um in die Po- ren des Trägermaterials hineinzupassen. Für diese Analyte wird die effektiv nutzbare Oberfläche um die Gesamtfläche der Poren verkleinert, so daß der Vorteil gegenüber unporösen Teilchen verschwindet. Aber auch für Analyten, die klein genug sind, um in die Poren zu gelangen, kann die Verwendung poröser gegenüber unporösen Teilchen Nachteile haben. Da in den Poren nur noch Stofftransport durch Diffusion stattfindet, muß eine wesentlich geringere Fließgeschwindigkeit bei Trennverfahren eingestellt werden, um eine Peakverbreiterung der Eluenten auf Grund des schlechteren Massentransfers zu vermeiden (Van-Deemter Kurve). Dies kann zu langsameren Trennungen führen, was insbesondere bei Routineverfahren von Nachteil ist. Außerdem sind bei vielen Fragestellungen, wie beispielsweise in der Umweltanalytik, die Analytmengen so gering, dass die hohe Beladungsdichte und somit die Verwendung poröser Materialien gar nicht benötigt wird.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, die Nachteile der bekannten Methoden zum Aufbringen von Substanzen auf anorganische Materialträger zu umgehen und ein Verfahren zur Immobilisierung bzw. zum Aufbringen von Substanzen auf unporöse Kieselgel- Partikel mit einer einstellbaren einheitlichen Teilchengröße kleiner als 15 μπ\ bereitzustellen. Dieses Verfahren soll eine wesentlich höhere Anzahl von immobilisierten Molekülen, eine dichtere Beladung der Säulen sowie eine erhebliche Beschleunigung von physikalischen, chemischen oder biochemischen Prozessen an den Trägeroberflächen ermöglichen.
Zur Lösung dieser Aufgabe schlägt die Erfindung in erster Linie ein Verfahren mit den im Anspruch 1 genannten Merkmalen vor. Weiterbildungen der Erfindung sind Gegenstand der übrigen abhängigen und unabhängigen Ansprüche 2 bis 21 , deren Wortlaut ebenso wie der Wortlaut der Zusammenfassung durch Bezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht wird. Das oben genannte Ziel wird gemäß der Erfindung dadurch erreicht, dass in einem ersten Verfahrensschritt Kieselgel-Partikel mit einer mittleren Teilchengröße kleiner als 15 μm, insbesondere mit der Größe von 0,2 bis 1 ,2 μm hergestellt werden, im zweiten Schritt die Oberfläche die- ser Kieselgel-Partikel für eine Immobilisierung von Molekülen vorbehandelt wird, und schließlich im dritten Schritt die zu immobilisierenden Moleküle an die Teilchen-Oberfläche entweder direkt oder über vorher angebrachte Spacer gebunden werden.
Es wird zunächst ein Sol von Primärteilchen hergestellt. Aus dem Stand der Technik ist ein Verfahren zur Herstellung kugelförmiger Si02-Partikel durch hydrolytische Polykondensation von Tetraalkoxysilanen bekannt (W. Stöber et al., J. Colloid and Interface Science 26, 62 (1968) und 30, 568 (1969)). Unter Beibehaltung grundlegender Reaktionsbedingungen wird dieses Verfahren im ersten Schritt der vorliegenden Erfindung zur Herstellung einheitlicher unporöser Kieselgel-Partikel wie folgt modifiziert.
Erfindungsgemäß wird dazu das Tetraalkoxysilan in ein vorgewärmtes wässrig-alkoholisch-ammoniakalisches Hydrolysegemisch gebracht und gut durchmischt. Nach einer Stunde Reaktionszeit ist die Synthese meist abgeschlossen und das sphärische Kieselgelmaterial kann vom restlichen Lösungsmittel abgetrennt werden. Je nach Wahl der experimentellen Parameter lassen sich dabei Kieselgel-Partikel unterschiedlicher mittlerer Teilchengröße erhalten. Erfindungsgemäß weisen die Kieselgel-Partikel vorteilhaft die mittlere Teilchengröße von kleiner als 15 μm, bevorzugt jedoch zwischen 0,2 μm und 5 μm, insbesondere zwischen 0,2 μm und 1 ,2 μm auf, bei einer Standardabweichung von nicht mehr als 10%. Die spezifische Oberfläche beträgt 2 m2/g bis 20 m2/g. Dabei wird beispielsweise für die Herstellung von Partikeln mit mittleren Größen zwischen 0,2 μm und 0,3 μm Ethanol, bei größeren Partikel Isopro- panol verwendet. Für Partikel ab einer Größe von 1 μ wird Vorzugs- weise Tetraethoxysilan (TEOS) zugegeben, insbesondere in zwei Stufen im Abstand von ca. 30 min.
Im zweiten Schritt des Verfahrens erfolgt erfindungsgemäß eine für die Immobilisierung von Molekülen notwendige Modifikation der Teilchen- Oberfläche. Da Kieselgel von Natur aus keine funktioneilen Gruppen zur Anbindung von Molekülen enthält, wird die Oberfläche durch Behandlung mit geeigneten Substanzen soweit modifiziert, dass die zu immobilisierenden Moleküle in einem weiteren Schritt entweder direkt oder über einen Spacer an das Trägermaterial gebunden werden können. Insbesondere werden in diesem Schritt Amino-, Epoxy-, Thio-, Phospho- oder Carboxyl-Gruppen an die Träger-Oberfläche eingeführt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsvariante wird die Teilchen- Oberfläche mit Aminoalkylalkoxysilanen, insbesondere mit 3- Aminopropyltriethoxysilan oder/und mit N-(2-aminoethyl)-3- Aminopropyltrimethoxysilan behandelt, um Amino-Gruppen an der Träger-Oberfläche einzuführen. Diese können im nächsten Schritt mit einer Carboxyl-Gruppe z.B. eines Proteins (z.B. in einem Carbodiimid- Verfahren) oder mit der Carbonyl-Gruppe eines Spacers wie z.B. Gluta- raldehyd reagieren.
Im Falle einer Epoxid-funktionalisierten Partikel-Oberfläche beispielsweise kann die Anbindung von Substanzen an die Oberfläche z.B. über bereits vorhandene (wie bei Proteinen) oder extra eingeführte Ami- nogruppen (Oxiran-Methode) oder auch Thionylgruppen erfolgen.
In einer bevorzugten Ausführung erfolgt die Bindung der aufzubringenden Substanzen über bifunktionale Spacer. Dazu werden die geeigneten bevorzugt bifunktionalen Spacer an die davor eingeführten funktioneilen Gruppen kovalent gebunden. Vorteilhaft werden bifunktionale Spacer mit Amino-, Thio-, Phospho-, Carboxyl-, Hydroxyl- oder Epoxid-Gruppen am Ende verwendet, mit denen im nächsten Schritt die zu immobilisierenden Moleküle reagieren sollen. Besonders vorteilhaft erweist sich dabei die Verwendung von Spacern, die mit den auf der Oberfläche lokalisierten Aminogruppen reagieren können. In einer besonders bevorzugten Variante wird hierfür Glutaraldehyd oder Glutardialdehyd eingesetzt. E- benso ist die Verwendung zahlreicher weiterer Spacer möglich, wie beispielsweise Alkylketten, Divinylsulfon oder anderer aus dem Stand der Technik bekannter Spacer.
Die Verwendung multivalenter Bausteine ist ebenfalls denkbar. In diesem Fall kann eine Vervielfältigung der Oberflächenfunktionalität erreicht werden, die vorteilhafterweise zur Steigerung der Beladungsdichte führen kann. Als ein nicht einschränkendes Beispiel kann hier der trifunktio- nelle Linker 3,5-Dicarbomethoxyphenoxyessigsäure-p-nitrophenylester genannt werden, der nach einer kovalenten Anbindung an aminofunktio- nalisiertes Trägermaterial die Oberflächenfunktionalität annähernd verdoppeln kann.
Schließlich werden im dritten Schritt die aufzubringenden Moleküle an die Träger-Oberfläche gebunden. In einer bevorzugten Ausführung werden die Moleküle an die Träger-Oberfläche kovalent gekoppelt. Dabei können die aufzubringenden Substanzen entweder direkt mit den funkti- onellen Gruppen der Oberfläche (z.B. Hydroxyl-, Carboxyl-, Thiol- oder Amino-Gruppe des Moleküls an Hydroxyl-, Amino-, Carboxyl- oder sonst aktiviertes Trägermaterial) oder mit dem zuvor aufgebrachten Spacer reagieren. In einer besonders bevorzugten Variante werden die Moleküle mittels einer Reaktion zwischen einer Amino-Gruppe des Moleküls und einer Carbonyl-Gruppe des Glutaraldehyd-Spacers an die Oberfläche kovalent gebunden. Der eigentlichen Kopplung kann eine Aktivie- rungsreaktion der entsprechenden funktioneilen Gruppen einer der Komponenten, Festphase oder der aufzubringenden Substanz, vorausgehen. Im Allgemeinen erweist es sich als vorteilhaft, die an der Ober- fläche eingeführten funktioneilen Gruppen zu aktivieren, da die Aktivierung der gelösten Komponente zu inter- oder intramolekularen Vernetzung als Nebenreaktion führen kann. Hierfür werden die üblichen, dem Fachmann bekannten Verfahren eingesetzt.
Alternativ können die anzukoppelnden Substanzen über eine nicht- kovalente Bindung an die Partikel-Oberfläche fixiert werden. So können beispielsweise biotinylierte Moleküle an eine zuvor mit Streptavidin oder Avidin beschichtete Oberfläche angekoppelt werden. Auch eine nicht kovalenten Bindung zwischen einem Rezeptor und seinem Liganden oder einem Antikörper und seinem Antigen oder ähnliches kann zur An- kopplung von Substanzen an die Partikel-Oberfläche ausgenutzt werden. Solche nicht-kovalenten Kopplungen gehören zum Stand der Technik und können vom Fachmann ausgeführt werden (s. z.B. J. Cai und J. Henion, J. Chromatogr., 1997, 691 (2), 357-370; T.M. Phillips und J.M. Krum, J. Chromatogr. B, 1998, 715(1), 55-63.) Eine solche nicht- kovalente Bindung ist zwar unter physiologischen Bedingungen sehr stabil, kann aber leicht durch pH-Veränderungen oder organische Lösungsmittel gebrochen werden. Bei einer mehrfachen Verwendung der mit Substanzen beschichteten Kieselgel-Partikeln ist deswegen eine wie oben beschriebene kovalente Bindung zu bevorzugen.
Erfindungsgemäß können die aufzubringenden Moleküle beliebige biologisch oder chemisch aktive Substanzen sein. Als Beispiel für biolo- gisch aktive Moleküle, jedoch nicht einschränkend, sind hier Proteine oder Peptide (wie Antikörper, Enzyme, Rezeptoren oder Liganden), Polymere oder Oligomere der Nukleinklasse (DNA, RNA, PNA, thioRNA sowie ihre Derivate), Kohlenhydrate oder Stoffwechselmetabolite zu nennen. Als chemisch aktive Substanzen können beispielsweise Kataly- satoren (z.B. Rhodium-Diphosphindiamin Komplexe) auf der Partikel- Oberfläche immobilisiert werden. Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt gegenüber den bekannten Verfahren den Vorteil, dass zum einen durch die Verwendung sehr kleiner Partikel (mittlere Teilchengröße kleiner als 15 μm, vorteilhaft zwischen 0,2 und 1 ,5 μm, insbesondere zwischen 0,2 und 1 ,2 μm) eine größere effektive Oberfläche für eine Immobilisierung zur Verfügung steht, so dass eine wesentlich höhere Beladbarkeit als bei einer Verwendung größerer unporöser Partikel möglich ist. Dadurch können viele an der Partikel-Oberfläche ablaufende physikalische (z.B. Separation) oder chemische (Katalyse, Bindung) oder biochemische (enzymatische Reaktionen, Rezeptor-Ligand-, Antikörper-Antigen-Bindungsreaktionen) Prozesse um das Vielfache beschleunigt werden. Außerdem können bei der Beladung Molekülgemische wie z.B. gering aufgereinigte Enzyme wegen der hohen Bindungskapazität verwendet werden. Ferner lassen sich die erfindungsgemäßen mit Molekülen beladenen Kieselgel-Partikel wegen ihrer Unporosität und damit einer größeren effektiven Oberfläche für viele Zwecke wesentlich effektiver als poröse Trägermaterialien einsetzen, da für viele größere Moleküle, wie Proteine, die Poren unzugänglich sind. Schließlich ist durch die geringe Größendispersion sowie eine kleine mittlere Teilchengröße ein besseres Packungsbett möglich.
Weiterhin umfasst die Erfindung unporöse sphärische Kieselgel-Partikel mit einer Teilchengröße, insbesondere einer mittleren Teilchengröße, von kleiner als 15 μm, die mit biologisch und/oder chemisch aktiven Substanzen beladen sind. Vorzugsweise sind die Kieselgel-Partikel nach dem oben beschriebenen Verfahren herstellbar.
Ferner umfasst die Erfindung die Verwendung der mit biologisch und/oder chemisch aktiven Molekülen beladenen Kieselgel-Partikel bei der Durchführung physikalischer, chemischer oder biochemischer Pro- zesse an ihrer Oberfläche. So können die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Kieselgel-Partikel bei einer Molekülseparation wie einer Nukleinsäure-, Protein- oder sonstigen Separation, die z.B. auf einem Hybridisierungs- oder einem Ligand-Rezeptor-Prinzip beruht, eingesetzt werden. Eine andere Verwendungsmöglichkeit ist die Durchführung en- zymatischer oder katalytischer Reaktionen z.B. in unterschiedlichen Produktionsverfahren, wobei Enzym- bzw. Katalysator-Moleküle auf der Oberfläche der Kieselgel-Teilchen aufgebracht sind. Auch Molekülseparationen, Chromatographie oder Probenanreicherung können an den beschriebenen Partikeln erfolgen. Ferner können mit den beschriebenen Kieselgel-Partikeln Bindungs-Reaktionen allerart (Antikörper-Antigen, Rezeptor-Ligand, Enzym-Substrat, etc.) vorgenommen werden, die bei- spielsweise im Bereich der Analytik oder Diagnostik Einsatz finden können. Durch Anbinden von organischen Makromolekülen (z.B. Proteine, Peptide, Enzyme) können diese immobilisiert und so Untersuchungen zu Strukturfunktionsbeziehungen vorgenommen werden. Auch zum Anbinden diverser Metallkomplexe beispielsweise zur selektiven Hydrierung oder auch der Anbindung von DNA-Stücken zur Nukleinsäurensynthese sind solche Kieselgel-Partikel geeignet. Chemische Industrie, medizinische Labordiagnostik, Arznei- oder Pflanzenschutzmittel-Entwicklung, Qualitätskontrolle sowie Forschung und Entwicklung gehören zu den Branchen, in denen die erfindungsgemäßen Kieselgelpartikel besonders vorteilhaft eingesetzt werden können.
Weitere Vorteile, Merkmale und Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung sollen nachstehend anhand der Ausführungsbeispiele mit Bezug auf die Zeichnungen näher erläutert werden. Auch ohne weitere Ausfüh- rungen wird davon ausgegangen, dass ein Fachmann die obige Beschreibung im weitesten Umfang nutzen kann. Die bevorzugten Ausführungsformen und Beispiele für das erfindungsgemäße Verfahren sind deswegen lediglich als beschreibende, keineswegs als in irgendeiner Weise limitierende Offenbarung aufzufassen. In den Zeichnungen zei- gen: Figur 1: Eine elektronmikroskopische Aufnahme von Kieselgel- Partikeln mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 0,7 μm;
Figur 2: Verlauf der UV-Absorption von Nitrophenolat während der Spaltung (Verseifung) von p-Nitrophenylcaprylat zur Aktivitätsbestimmung der Lipase an verschiedenen Materialien;
Figur 3: Diagramm des 29Si-CP/MAS-NMR-Spektrums von Kieselgel-Partikeln mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 0,7 μm. Im Gegensatz zu porösem Kieselgel ist aufgrund der wesentlich geringeren Oberfläche das Signal der Oberflächenspezies Q2 kaum zu sehen (92 ppm). Bei porösen Materialien mit einer vielfach höheren Oberfläche würde hier ein deutlich erkennbares Signal erscheinen müssen.
Ausführungsbeispiele
Herstellung von Kieselgel-Partikeln mit einem immobilisiertem Enzym
a) Herstellung von unporösen Kieselgel-Partikeln mit einheitlicher einstellbarer Teilchengroße
Einheitlich sphärische Kieselgelpartikel mit verschiedenen Durchmessern im Bereich von 0,2 bis 1 ,2 μm lassen sich durch die Hydrolyse von Tetraethoxysilan (TEOS) in der Gegenwart von Ammoniumhydroxid im alkoholischen Medium unter streng definierten Konzentrationsverhältnissen der eingesetzten Edukte herstellen.
Durch die veränderte Mengenzugabe der Edukte (Wasser, Ammoniak, TEOS) und des Lösungsmittels (Ethanol bzw. Isopropanol) kann die Größe des erhaltenen Kieselgels von 0,2 bis 1 ,2 μm stufenweise verändert werden (siehe Tabelle 1):
Figure imgf000012_0001
Tabelle 1: Eingesetzte Mengen der Edukte zur Synthese der sphärischen Kieselgelpartikel mit unterschiedlichen Durchmessern: a) Ethanol, b) Isopropanol, c) Zwei-Stufen-Reaktion
Zuerst wird der Alkohol zusammen mit Wasser und Ammoniaklösung vermischt und unter mildem Rühren erwärmt. Nachdem die Reaktionstemperatur erreicht ist, wird das Tetraethoxysilan auf einmal in einem Schritt zugegeben. Nach etwa einer Stunde Reaktionszeit ist die Synthese abgeschlossen und das sphärische Kieselgel-Material kann vom restlichen Lösungsmittel abgetrennt werden. Ethanol wird zur Herstellung von Partikeln mit Durchmessern zwischen 0,2 μm und 0,3 μm verwendet. Für die Darstellung größerer Partikel wird das viskosere Isopro- panol eingesetzt. Ab einer Größe von 1 μm erfolgt die Darstellung in 2 Stufen und das TEOS wird im Abstand von ca. 30 min zugegeben.
Der Sol-Gel-Prozess sieht demnach folgendermaßen aus:
Si(OC2H5)4 + 4 H20 Hydrolyse ^ Si(0H)4 + 4 C2H5OH
Cofeondensation n Si(OH)4 — - [SiOx(OH)4-2x] + xn H20
Dehydratisierung [SiOx(OH)4.2x] *- (Si04/2)n + n(4-2x)/2 H20
Aus den in Figur 1 gezeigten SEM-Aufnahmen kann man bereits die uniforme Gestalt und eine einheitliche Partikel-Größe (mittlerer Teilchendurchmesser 0,7 μm) entnehmen. Für die beispielhaft abgebildeten Partikel ergibt sich eine mittlere Oberfläche von 2,9 m2/g.
b) Funktionalisierung der Teilchenoberfläche mit Aminopropyltriethoxysi- lan
1 g Kieselgel-Partikel mit einem Teilchendurchmesser von 0,7 μm wird bei 180-200°C aktiviert. Nachdem das Kieselgel auf 70°C abkühlt, wird es in 100 ml Toluol aufgeschlemmt. Zur Suspension werden 510 μl Ami- nopropyltriethoxysilan (dreifacher Überschuß) gegeben, und die Reaktionsmischung für 20 h unter Rückfluss erhitzt. Schließlich wird das Kieselgel mit einer Glasfritte abfiltriert und zweimal mit Toluol, Aceton und Pentan gewaschen.
c) Anbindung des bifunktionalen Spacers Glutardialdehyd
100 mg des Aminopropylkieselgels aus dem Schritt b) werden mit 1 ml einer wässrigen Glutardialdehyd-Lösung 5% umgesetzt. Die Lösung wird 4 Stunden geschüttelt, danach die entstandene Iminbindung 2 Stunden durch 1 ml NaCNBH3 (5 mg/ml) reduziert. Das entstandene Material wird mit Wasser und Loading Buffer (150 mM NaCI, 10 mM Phos- phat-Puffer, pH 7,4) mehrfach gewaschen und in Loading Buffer aufbewahrt.
d) Immobilisierung eines Enzyms
1 ml einer Enzymlösung (Lipase, 1 mg/ml) wird mit 0,5 ml eines High Salt Buffers (1 ,5 M Na2S04 in 100 mM Phosphatpuffer, pH 7,4) vermischt und zum Kieselgel aus dem Schritt c) gegeben. Die Suspension wird 1 Minute geschüttelt und anschließend mit 1 ml desselben Puffers versetzt. Nach 5 weiteren Minuten wird noch 1 ml des Puffers zugegeben und die Lösung wird 24 h geschüttelt. Im Anschluss wird die Suspension zentrifugiert und der Überstand abgetrennt. Der Niederschlag wird mit Capping Buffer versetzt und für 2 h geschüttelt. Am Ende wird das modifizierte Kieselgel dreimal mit Loading Buffer (150 mM NaCI, 10 mM Phosphat-Puffer, pH 7,4), dreimal mit 1 M NaCI-Lösung und dreimal mit Loading Buffer gewaschen und darin aufbewahrt.
e) Überprüfung der Aktivität des immobilisierten Enzyms
Zur Prüfung der enzymatischen Aktivität des Materials wird die Spaltung (Verseifung) von p-Nitrophenylcaprylat gewählt. Da Nitrophenol eine deutliche Verschiebung des UV-Absorptionsmaximums in Abhängigkeit vom pH-Wert besitzt, kann die Aktivität der Lipase an der Konzentration des Nitrophenolats UV-spektrometrisch verfolgt werden. Die Ergebnisse für die an die unporösen Kieselgel-Partikel gebundene Lipase (Fig. 2, NPS) zeigt eine deutlich erhöhte Aktivität gegenüber der freien Lipase in Glykol (Fig. 2, Lipase in Glykol) und dem blanken Kieselgel (Fig. 2, blank). Die verringerte Aktivität der freien Lipase kann durch ihre Agglomerierung in Lösung erklärt werden. Ein Vergleichsmaterial ohne Lipa- se-lmmobilisierung wird ebenso getestet, um auszuschließen, dass die Verseifung des Esters an der Kieselgel-Oberfläche anstatt der Lipase stattfindet. Dazu werden am Kieselgel alle Schritte der kovalenten An- bindung mit Ausnahme der Lipasezugabe durchgeführt. Es ergibt sich eine ähnliche Kurve wie für das blanke Kieselgel (Fig. 2, Vergleichsmaterial).
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die beschriebenen Ausführungsbeispiele beschränkt. Vielmehr sind viele Abwandlungen möglich, die durch Fachleute erzielbar sind, und damit im Bereich dieser Erfindung eingeschlossen sind.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von mit biologisch und/oder chemisch aktiven Substanzen beladenen unporösen sphärischen Kieselgel- Partikeln mit Teilchengröße von kleiner als 15 μm, dadurch gekennzeichnet, dass a) die Kieselgel-Partikel durch hydrolytische Polykondensation von Tetraalkoxysilanen erzeugt werden, b) die Oberfläche der Kieselgel-Partikel vor dem Aufbringen von biologisch und/oder chemisch aktiven Substanzen durch eine Behandlung mit geeigneten Substanzen funktionalisiert wird, c) die Bindung von biologisch und/oder chemisch aktiven Sub- stanzen an die Oberfläche der Kieselgel-Partikel entweder direkt oder über geeignete molekulare Abstandhalter (Spacer) erfolgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Kieselgel-Partikel eine annähernd einheitliche Größe bei einer Standardabweichung von nicht mehr als 10% aufweisen.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Kieselgel-Partikel eine mittlere Teilchengröße zwischen 0,2 μm und 5 μm, insbesondere zwischen 0,2 μm und 1 ,2 μm, aufweisen.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kieselgel-Partikel bevorzugt eine spezi- fische Oberfläche zwischen 1 m2/g und 100 m2/g, insbesondere zwischen 2 m2/g und 20 m2/g aufweisen.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Herstellung von Kieselgel-Partikeln mit mittleren Teilchengrößen zwischen 0,2 μm und 0,3 μm Ethanol verwendet wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Herstellung von Kieselgel-Partikeln mit mittleren Teilchengrößen zwischen 0,3 μm und 1 μm Isopropanol verwendet wird.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Herstellung von Kieselgel-Partikeln mit mittleren Teilchengrößen zwischen 1 μm und 15 μm Tetraethoxysilan in zwei Stufen zeitlich versetzt zugesetzt wird.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass auf die Oberfläche der Kieselgel-Partikel vor der Beladung mit biologisch und/oder chemisch aktiven Substanzen Amino-, Epoxy-, Thio-, Phospho-, und/oder Carboxyl-Gruppen eingeführt werden.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kieselgel-Partikel vor der Beladung mit biologisch und/oder chemisch aktiven Substanzen mit Amino- alkylalkoxysilanen, insbesondere mit 3-Aminopropyltriethoxysilan und/oder mit N-(2-aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilan zur Einführung von Amino-Gruppen behandelt werden.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Spacer bifunktional ist und eine Amino-, Thio-, Phospho-, Carboxyl-, Hydroxyl- oder Epoxid-Gruppe am Ende aufweist.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Spacer Glutaraldehyd, Glutardialdehyd und/oder Divinylsulfon ist.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Spacer multifunktional ist.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindung der zu beladenden Substanzen direkt an die funktionalisierte Oberfläche der Kieselgel-Partikel erfolgt.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindung der zu beladenden Substanzen an die funktionalisierte Oberfläche der Kieselgel-Partikel oder an die darauf aufgebrachten Spacer über eine kovalente Ankopplung erfolgt.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Bindung der zu beladenden Substanzen an die funktionalisierte Oberfläche der Kieselgel-Partikel eine Aktivierung der funktioneilen Gruppen an der Oberfläche der Kieselgel-Partikel und/oder der zu beladenden Substanzen vorausgeht.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindung der zu beladenden Substanzen an die funktionalisierte Oberfläche der Kieselgel-Partikel oder an die darauf aufgebrachten Spacern eine nicht kovalente Bindung ist.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zu beladenden biologisch und/oder chemisch aktiven Substanzen Proteine, insbesondere Antikörper, Enzyme, Rezeptoren oder Liganden, Peptide, Polymere oder Oli- gomere der Nukleinklasse, insbesondere DNA, RNA, PNA, thioR- NA sowie ihre Derivate, Kohlenhydrate, Stoffwechselmetabolite und/oder sonstige biochemische oder chemische Moleküle sind.
18. Unporöse sphärische Kieselgel-Partikel mit Teilchengröße von kleiner als 15 μm, die mit biologisch und/oder chemisch aktiven Substanzen beladen sind.
19. Unporöse sphärische Kieselgel-Partikel nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17 herstellbar sind.
20. Verwendung von unporösen sphärischen Kieselgel-Partikel gemäß Anspruch 18 oder Anspruch 19 zur Durchführung von Molekülseparationen, Chromatographie, Katalyse, Analytik, Probenanreicherung, Bindungs- oder sonstigen chemischen Reaktionen.
21. Verwendung von unporösen sphärischen Kieselgel-Partikel gemäß Anspruch 18 oder Anspruch 19 in der chemischen Industrie, medizinischen Labordiagnostik, der Arznei- oder Pflanzenschutzmittel-Entwicklung, der Qualitätskontrolle und/oder der Forschung und Entwicklung.
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