WO2009040460A1 - Compuesto de silica-vinilsulfona, síntesis y usos del mismo - Google Patents

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Fernando HERNÁNDEZ MATEO
Javier LÓPEZ JARAMILLO
Mariano ORTEGA MUÑOZ
Julia Morales Sanfrutos
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Definitions

  • the present invention relates to a silica compound containing vinyl sulfone groups of the general formula (I), its method of production and its uses. More particularly, the use of silica compounds in biotechnological applications.
  • activation to promote such immobilization.
  • the first of the methodologies activation of the macromolecule to be immobilized has been widely disseminated and used. In this sense, by means of Molecular Biology techniques the proteins can be "activated” via fusion to tails or peptides / protein domains that confer affinity for the support. This strategy has led to the development of different commercial systems among which are: (a) Histidine tails ("His-Tag”) (cf. Hengen, P., 1995, Trends Biochem Sci. Vol. 20, pp.
  • Another option for the activation of the macromolecule to be immobilized is the introduction into its structure of chemical groups that confer reactivity or on which subsequent chemical transformations can be carried out.
  • the group of choice is the thiol group (-SH) and the experimental approach used is directed mutagenesis or fusion to an intein (cf. Girish, A., et al., 2005 Bioorg. Med. Chem. Lett .. vol. 15, pp. 2447 -2451).
  • the second of the methodologies involves the preparation of solid supports containing reactive functional groups so that they react and form a covalent bond with the macromolecules to be immobilized.
  • the supports that are traditionally being used are agarose and polystyrene.
  • the classic methods of activating the support are: (a) the reductive amination method (Pierce: agarose and polystyrene functionalized with tosyl, tresyl, epoxy, alkylamine, aldehyde, hydrazide groups); (b) the method of carbonyldiimidazole (Quiagen: activated polystyrene to react with SH, carboxy to be activated with succinimide or carbodiimide groups); (c) the N-hydroxysuccinimide ester method (Hispanagar: agarose functionalized with glyoxal or aminoethyl groups); (d) the maleimide method (Polygenetics: polystyrene functionalized with amine or CN groups); (e) the hydrazide method (Bangs Laboratories: polystyrene functionalized with carboxy groups to be activated with carbodiimide or amino groups).
  • the target groups of the macromolecule are the amines
  • silica / glass as a support for the immobilization of macromolecules has recently gained interest.
  • silica with Concanavalin A Biotech Support Group
  • silica with fatty acids Nimbus Biotechnology
  • silica with human serum albumin Nimbus Biotechnology
  • the immobilization strategies for this solid support are the same as those indicated for the other supports: (a) fusion of the protein to be immobilized with Histidine tails (HisLink Resin from Promega in combination with silica with Ni from Biotech Support Group), with GST (glutathione silica from Biotech Support Group) with peptides that interact with streptavidin (silicas with streptavidin from Bangs Laboratories and Polysciences), with peptides that interacts directly with the silica (Arg-Tag14, Si-Tag15) b) use of functionalized supports that allow its easy activation and reaction with the macromolecule.
  • ⁇ , ⁇ -unsaturated sulfones are recognized as very useful synthetic intermediates due mainly to their ability to participate in addition reactions 1, 4 (Michael acceptors) and in cycloaddition reactions (such as donors 2 ⁇ ). Additionally, vinyl sulfones are easy to prepare, through a wide variety of synthetic processes, and to manipulate (Simphinks, NS, 1990, Tetrahedron vol. 282, pp. 6951-6984; Meadows, D. C, et al., 2006, Med. Res. Rev. vol. 26 (&) pp. 793-814).
  • the vinyl sulfone group is used in the preparation of synthesis intermediates for the subsequent obtaining of more elaborate materials, which contain silica supports.
  • These materials are often referred to as thiophilic resins or "T-GeI, (cf. Schwarz A. et al., 1994 Reactive Polvmers vol. 22, pp. 256-266; GB 2 230 003 A; US 4,696,980; DE 10330204 A1).
  • T-GeI thiophilic resins
  • the key concept is that of thiophilic adsorption described by Porath (cf. Porath et al., 1984, Phvsical Chemistrv of Colloids and Macromolecules. Pp 137-142; Porath J.
  • the strategy used involves the reaction of divinylsulfone, as a difunctional reagent, with a silica compound containing hydroxyl groups, silica coated with dextran or thiol groups, thus obtaining an activated material that is normally reacted in situ with thiol simple derivatives.
  • a new compound comprising silica functionalized with vinyl sulfone groups is provided through a chain containing a thiol or amine functional group.
  • a new compound comprising silica functionalized with vinyl sulfone groups is provided through a chain containing a thiol or amine functional group.
  • the new compound provides an immobilization technique that does not require any activation strategy and that combines the properties of the silica as support with the reactivity of the vinylsulfone with groups naturally present in the biomolecules under mild reaction conditions compatible with its biological nature .
  • silica as a material to support vinyl sulfone groups involves a number of important advantages over other polymeric materials such as, for example, polysaccharides or polystyrene:
  • the material can be shaken mechanical without suffering alterations in its size which allows to carry out processes in "bat".
  • Another important aspect is the high pressure stability of the silica that allows its use in HPLC.
  • the material is not susceptible to degradation by the action of microorganisms and chemical agents (for example acids).
  • the material suffers neither shrinkage nor swelling as a result of the action of the solvents. In addition, it is not soluble in any solvent which facilitates the operability.
  • thiophilic resins T-GeI
  • T-GeI affinity chromatography supports exploiting the reversible thiophilic interactions of this type of materials with biomolecules.
  • the vinyl sulfone function in these materials, is used to enable the formation of ether or thioether groups in the construction of chains of type 0-CH 2 - CH 2 -SO 2 -CH 2 -CH 2 -SR attached to the supports.
  • the vinyl sulfone function has been used so that the materials they contain can carry out the non-covalent bonding in the immobilization of biomolecules. While in the invention covalent binding occurs in the immobilization of biomolecules with the use of the silica-vinyl sulfone compound.
  • the incorporation of the vinyl sulfone function into the silica can be carried out in more than one stage using bisvinylsulfones from commercial silica.
  • a functionalized silica compound with groups having a nucleophilic character, preferably thiol groups or amines, with the ability to react easily with bisvinylsulfones is required. These thiol groups or aminos may be attached to the inorganic support through a spacer of variable length and nature.
  • the use of functionalized silicas containing primary amines is not feasible since in the reaction of these compounds with bisvinylsulfones a second intramolecular delation occurs with the formation of cyclic compounds.
  • the solution to this drawback involves the preparation of a silica compound containing secondary amines that, in reaction with bisvinylsulfones, allow obtaining the silica compounds of the invention.
  • a first aspect of the present invention refers to a compound of general formula (I):
  • n represents the union between Si and X by an alkyl group, substituted or unsubstituted, where the number of carbons will depend on the value of n.
  • n has values between 0 and 15, preferably 2, 3 or 11 and more preferably 3.
  • X is a sulfur (S) or nitrogen (N) atom.
  • S sulfur
  • N nitrogen
  • R is a group selected from an alkyl (Ci-Cio), substituted or unsubstituted, or an alkenyl (Ci-Cio), substituted or unsubstituted.
  • R 1 is a methyl group.
  • R 2 is an alkyl (CrCio) or a dialkylaryl ((Ci-Cio) Ar (Ci-Cio)).
  • Y does not exist.
  • alkyl refers in the present invention to aliphatic, linear or branched chains, having 1 to 10 carbon atoms, for example, methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, t-butyl , n-pentyl, etc.
  • alkenyl refers in the present invention to an alkyl radical having between 1 and 10 carbon atoms and having one or more unsaturated bonds.
  • Alkenyl radicals may be optionally substituted by one or more substituents such as an aryl, halogen, hydroxyl, alkoxy, carboxyl, cyano, carbonyl, acyl, alkoxycarbonyl, amino, nitro, mercapto, etc.
  • substituents such as an aryl, halogen, hydroxyl, alkoxy, carboxyl, cyano, carbonyl, acyl, alkoxycarbonyl, amino, nitro, mercapto, etc.
  • the compound of the invention can be:
  • Another aspect of the present invention relates to the process for obtaining the compound of general formula (I) comprising: a. Obtaining functionalized silica with thiol or amine groups. b. Reaction of the silica compound obtained in step (a) with divinylsulfone in the presence of an organic base.
  • a preferred embodiment of the process of the invention comprises a tertiary amine as an organic base that can be selected from the group comprising, without being limited to, triethylamine or diisopropylethylamine
  • Another more preferred embodiment of the process of the invention comprises in the reaction of step (b) the use of solvents that can be selected from mixtures of THF with an alcohol such as, for example, isopropanol or tert-butanol, preferably isopropanol.
  • solvents that can be selected from mixtures of THF with an alcohol such as, for example, isopropanol or tert-butanol, preferably isopropanol.
  • Another aspect of the present invention relates to the compound N-alkyl or alkenyl-aminopropyl-silica (V), obtained in step (a) of the process for obtaining the silica compound of the invention and whose formula is:
  • the compound may have the formula (Vl)
  • Still another aspect of the present invention refers to the use of the compound of general formula (I) to immobilize biomolecules.
  • This immobilization is produced by the covalent union between the biomolecule and the vinyl sulfone group present in the compound of the invention.
  • This method of covalent immobilization is carried out under mild reaction conditions that are compatible with the biological nature of the biomolecules through functional groups already present in the same macromolecules in a considerable and accessible number, so there is no need to make modifications chemical or directed mutagenesis to functionalize them.
  • the high reactivity of the vinyl sulfone function, in the compound of the invention allows to immobilize a wide variety of biomolecules.
  • the compound of the general formula (I) can immobilize any biomolecule having amine groups and / or thiols and be used as chromatographic supports for affinity chromatography according to the need at all times.
  • the results are extrapolated to lipids and carbohydrates and other systems that react with vinyl sulfone.
  • FIG 1. Shows the variation of the concentration of invertase in solution (not immobilized) as a function of the reaction time with the silica-vinyl sulfone compound at two temperatures.
  • FIG 2. Shows the enzymatic activity of the immobilized invertase. Variation of the rotational power (product of the catalytic activity of the immobilized enzyme) of a sucrose solution in contact with the invertase immobilized at two temperatures.
  • FIG 3. Shows a study of the feasibility of immobilizing lactase on previously packed silica-vinyl sulfone compound columns. Specific rotational power (alpha) of the sample at different time intervals. The hydrolysis of lactose in glucose and galactose causes an increase in alpha.
  • FIG 4. Shows a chromatogram of the "pull-down" experiment with immobilized nitrosoglutathione
  • FIG 5. Shows the two-dimensional electrophoresis of the fractions collected in the "pull-down” experiment carried out with pea thioredoxin h-1, immobilized on the silica-vinylsulfone compound.
  • silica was transformed into the mercaptopropyl-silica derivative (IV).
  • This derivative is a known compound (cf. Howard, A. G et al., (1987), Analvst vol. 112, pp. 159) which is obtained by reacting silica with 3-mercaptopropyltrimethoxysilane and which can also be obtained commercially ( Silicycle)
  • the compound of formula (II) was obtained by reacting compound (IV) with divinylsulfone according to the following procedure: Mercaptopropyl silica (1 g) was suspended in a mixture of THF-isopropanol (1: 2, 10 ml_) which was bubble with argon to subsequently add DVS (0.515 ml_, 5 eq) and triethylamine (0.028 ml_, 0.2 eq). The reaction mixture was maintained at room temperature for 16 h. After that time, the resulting compound of formula (II) which was washed with acetone and dried in a vacuum oven at 50 ° C was filtered.
  • the immobilization of a biomolecule can be carried out directly on silica-vinylsulfone packed in a column by recirculating a solution of the biomolecule of interest in a buffer that does not contain free amines, such as phosphate or HEPES, of moderate ionic strength (50 - 200 mM) and basic pH (7.5 -8.7) for a sufficient time (depending on the flow of the column and the volume of the macromolecule solution. As an example, for 49 ml of macromolecule solution and a flow of 0.5 ml / min, the reaction time was 14 hours).
  • free amines such as phosphate or HEPES
  • the packing was carried out by suspending the vinyl sulfone silica in the aforementioned buffer and in general 3 g of vinyl sulfone silica / micromole biomolecule were used. To block the unreacted vinyl sulfone groups, the material was treated with a solution of ⁇ -mercaptoethanol (16 micromoles per gram of packed vinyl silica) for sufficient time (depending on the flow of the column and the volume of the solution) to room temperature. This protocol allows the direct transformation of vinyl-silica previously packed in a chromatographic column and / or enzymatic reactor based on the macromolecule that is immobilized.
  • the invertase (beta-fructofuranosidase [EC3.2.1.26]), an enzyme that catalyzes the hydrolysis of sucrose in fructose and glucose, is chosen as a model enzyme taking into account that (a) the protein is commercial, (b) the substrate is cheap, (c) the activity can be easily measured in the laboratory and (d) has an industrial application in the food sector, where fructose is preferred over glucose because it is sweeter and does not crystallize so easily.
  • Lactase (glycosidase hydrolase [EC3.2.1.23]), an enzyme that catalyzes the hydrolysis of lactose in glucose and galactose, is chosen as an enzyme to be immobilized taking into account the high interest that this has in both the food industry, given that Lactose is poorly soluble and its sweetening capacity is insufficient, as in medicine, due to intolerance to this disaccharide.
  • Lactase immobilization of Kluyveromyces lactis was carried out in a column, following the general protocol indicated above, packing the silica-vinyl sulfone (2.5 g) and recirculating a lactase solution (49 mL) at temperature ambient at a flow of 0.5 mL / min.
  • the specific rotational power of the lactose sample was measured at different time intervals on the basis that the hydrolysis of lactose in glucose and galactose causes an increase in rotational power (FIG. 3). The study shows that the immobilization of lactase on silica-vinyl sulfone previously packaged is feasible and that the material thus obtained maintains the activity of the enzyme.
  • Peroxidases [EC1.11.1.x] are enzymes that catalyze the reduction of hydrogen peroxide with the help of a substrate that loses two hydrogen atoms. Enzymes with redox capacity are capable of causing the polymerization of phenolic compounds in the presence of hydrogen peroxide. These phenolic polymers are harmless or less toxic and insoluble in water, facilitating their elimination. In this context, peroxidase immobilization is interesting. In addition, being a glycoprotein is a good model to demonstrate the ability of vinyl sulfone silica in the immobilization of this type of biomolecules. Specifically, horseradish and artichoke horseradish peroxidases were selected.
  • the peroxidase immobilization (10.9 mg) was carried out using the general protocol by means of a batch reaction.
  • Glutathione is a tripeptide of interest in biotechnology as an element present in commercial resins for use in purification of fusion proteins with glutathione-S-transferase (GST) based on the affinity of GST for immobilized glutathione (cfr Smith, DB and Johnson , KS, 1988, Gene vol. 67, pp. 31-40).
  • GST glutathione-S-transferase
  • the target proteins are purified almost homogeneously in one step and the conditions of elution with glutathione Reduced are soft, avoiding denaturation of the protein.
  • the silica-glutathione was packed in a column and used to purify a fusion protein with GSH.
  • a lysate of a culture of bacteria that expressed the fusion protein was passed through the silica-glutathione column.
  • the column was washed with 200 ml of 100 mM HEPES pH 7.5 and 200 mM NaCI. Elution was performed with 50 mM glutathione in 50 mM Tris-HCI pH 7.5.
  • S-nitrosoglutathione is a tripeptide that transfers NO to proteins with thiol groups.
  • the immobilization of GSNO was carried out in order to obtain a chromatographic affinity support based on this peptide and to perform experiments of " pull-down "to identify proteins likely to be nitrosated (target proteins).
  • This material was carried out in a three-stage process: a) Immobilization of commercial oxidized L-glutathione (GSSG) (2.5 mg Sigma G4501). It is carried out according to the general protocol in "bat” using 1 g of resin. Vinyl sulfone groups that have not reacted are blocked by treatment with ⁇ -mercaptoethanol (563 ⁇ L). b) Reduction of GSSG and deprotection of the -SH group of immobilized L-glutathione (GSH). It is carried out by treating the material obtained in the previous stage with DTT (14 mg) for 2 h. at 20 0 C c) Nitrosation of immobilized GSH and obtaining silica-GSNO.
  • GSSG commercial oxidized L-glutathione
  • the thioredoxins redox enzymes that act as switches that modulate the activity of numerous proteins via the exchange of disulfide bridges, have been chosen as proteins of interest to demonstrate the efficacy of the vinyl sulfone silica for protein immobilization.
  • the immobilization of the pea thioredoxin h1 is not known and "pull-down" experiments are a viable strategy to identify it.
  • the immobilization of the recombinant pea thioredoxin h1 with His tail expressed in E. coli (6.08 mg) was carried out using the general protocol by means of a batch reaction and the high reactivity of the histidine residues present in the tail. of that protein towards vinyl sulfone groups is used to favor the orientation of the molecule (the molecule will react preferentially with the tail of polyhistidine, which is on the opposite side of the active center, so that it is accessible).
  • the commercial aminobiotin immobilization (0.1 g of Merck biotin) was carried out using the general protocol by a "baten” reaction with the following modifications: 1.25 g of resin, a mixture of THF-isopropanol (2: 1, 10 ml ) as solvent and triethyl amine (38 mg) as base. After a reaction period of 14 h, it was filtered and washed with methylene chloride: methanol (1: 1).
  • affinity chromatography was performed for the isolation and purification of avidin.

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Abstract

Compuesto que comprende un soporte de silica funcionalizada con grupos vinilsulfona. Además, se refiere a su procedimiento de obtención y sus usos como inmovilizador de biomoléculas, y más concretamente de enzimas tales como invertasa, lactasa, peroxidasa ó tiorredoxina h1 y de otras biomoléculas tales como glutatión, nitrosoglutation ó biotina.

Description

COMPUESTO DE SILICA-VINILSULFONA, SÍNTESIS Y USOS DEL
MISMO
La presente invención se refiere a un compuesto de silica conteniendo grupos vinilsulfona de fórmula general (I), a su procedimiento de obtención y a sus usos. Más particularmente, el uso de los compuestos de silica en aplicaciones biotecnológicas.
Figure imgf000002_0001
(i)
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
La inmovilización de macromoléculas a soportes sólidos se remonta a comienzos del siglo XX con los trabajos de Nelson y Griffin (cfr. Nelson, J. M. et al., 1916 J. Am. Chem. Soc. vol. 38, pp. 1109-1115) sobre inmovilización de invertasa. El interés inicial por los enzimas inmovilizados y su actividad catalítica se ha ido extendiendo a otras macromoléculas. En Ia actualidad, Ia inmovilización de macromoléculas sobre un soporte sólido y el concepto de afinidad entre moléculas juegan un papel central en Io que se ha dado en denominar Ia era de las "omics" (cfr. Sheldon, R. A., 2007, Adv. Synth. CataL vol. 349, pp.1289-1307). En este contexto se han descrito numerosas aproximaciones para inmovilizar macromoléculas a soportes con el objetivo de fabricación de microarrays (cfr. Sun, H. et al., 2006, Anal. Bioanal. Chem. vol. 386, pp. 416-426; Sun, X-L, Stabler, C. L., Cazalis, CS. , Chaikif, E. L., 2006. Bioconiuαate Chem. vol. 17, pp. 52-57).
A pesar de los avances, aún persiste Ia necesidad de efectuar una "activación" para promover dicha inmovilización. Básicamente, existen dos métodos para llevar a cabo Ia mencionada activación: (a) activación de Ia macromolécula a inmovilizar; ó (b) activación del soporte. La primera de las metodologías (activación de Ia macromolécula a inmovilizar) ha tenido una amplia difusión y uso. En este sentido, mediante técnicas de Biología Molecular las proteínas pueden ser "activadas" vía fusión a colas o péptidos/dominios proteicos que Ie confieren afinidad por el soporte. Esta estrategia ha dado lugar al desarrollo de distintos sistemas comerciales entre los que se encuentran: (a) Colas de histidina ("His-Tag") (cfr. Hengen, P., 1995, Trends Biochem Sci. vol. 20, pp. 285-286.) en combinación con soportes conteniendo Ni (Quiagen, IBA, Amershem- Bioscience, Clontech); (b) Fragmento de Ia haloalcano deshalogenasa ("Halo-Tag") en combinación con soportes con haloalcano (Promega); (c) SNAP: O6-alquilguanina- ADN alquiltransferasa (cfr. Keppler, A..et al. 2004 Methods vol. 32, pp. 337-344) en combinación con soportes conteniendo O6-bencilguanina (Covalys); (d) Colas conteniendo péptidos con afinidad por estreptavidina ("Strep-tag") (cfr. Schmidt, TGM, et al., 1996 J. Mol. Biol. vol. 255, pp. 753-766) en combinación con soportes conteniendo estreptavidina (Novagen, IBA, Quiagen, Stratagene); (e) Glutatión transferasa en combinación con soportes conteniendo glutatión (Novagen, Clontech o Amershan-Biosciences); (f) Proteína de unión a maltosa en combinación con soportes con maltosa, (New England Biolab); (g) Péptido de unión a calmodulina en combinación con soportes conteniendo calmodulina (Stratagene); (h) Dominio de unión a celulosa en combinación con soportes conteniendo celulosa (Novagen); (i) Péptido biotinilado in vivo (cfr. Cronan, J. E., 1990, J. Biol. Chem vol. 265, pp. 10327-10333) en combinación con soportes conteniendo avidina (Promega); (j) IMPACT Inteina en combinación con soportes conteniendo quitina (New Englad Biolabs). Esta aproximación está limitada a proteínas recombinantes y generalmente conduce a una inmovilización no covalente de Ia macromolécula, hecho que determina su aplicación en purificación de proteínas mediante cromatografía de afinidad.
Otra opción para Ia activación de Ia macromolécula a inmovilizar es Ia introducción en su estructura de grupos químicos que Ie confieran reactividad o sobre los que se pueda llevar a cabo posteriores transformaciones químicas. Para proteínas, el grupo de elección es el grupo tiol (-SH) y Ia aproximación experimental usada es Ia mutagénesis dirigida o Ia fusión a una inteina (cfr. Girish, A., et al., 2005 Bioorg. Med. Chem. Lett.. vol. 15, pp. 2447-2451 ).
La segunda de las metodologías ("activación" de los soportes) supone Ia preparación de soportes sólidos conteniendo grupos funcionales reactivos para que reaccionen y formen un enlace covalente con las macromoléculas a inmovilizar. Los soportes que tradicionalmente se vienen empleando son Ia agarosa y el poliestireno. Los procedimientos clásicos de activación del soporte son: (a) el método de aminación reductiva (Pierce: agarosa y poliestireno funcionalizados con grupos tosil, tresil, epoxi, alquilamina, aldehido, hidrazida); (b) el método de cabonildiimidazol (Quiagen: poliestireno activado para reaccionar con SH, carboxi para ser activado con grupos succinimida o carbodiimida); (c) el método de Ia N-hidroxisuccinimida éster (Hispanagar: agarosa funcionalizada con grupos glioxal ó aminoetil); (d) el método de Ia maleimida (Polygenetics: poliestireno funcionalizado con grupos amina ó CN); (e) el método de Ia hidrazida (Bangs Laboratories: poliestireno funcionalizado con grupos carboxi para ser activado con carbodiimida ó grupos amino). Los grupos diana de Ia macromolécula son las aminas para los métodos (a), (b) y (c), los grupos tiol para el método (d) y los grupos aldehido, obtenidos por oxidación de carbohidratos, para el método (e).
El uso de Ia silica/vidrio como soporte para Ia inmovilización de macromoléculas ha cobrado recientemente interés. En Ia actualidad existen en el mercado (a) silica con Concanavalina A (Biotech Support Group) que interacciona con carbohidratos, (b) silica con ácidos grasos (Nimbus Biotechnology) para incorporación de proteínas de membrana y (c) silica con albúmina sérica humana (Nimbus Biotechnology). Las estrategias de inmovilización para este soporte sólido son las mismas que las indicadas para los otros soportes: (a) fusión de Ia proteína a inmovilizar con colas de Histidina (HisLink Resin de Promega en combinación con silica con Ni de Biotech Support Group), con GST (silica con glutatión de Biotech Support Group) con péptidos que interaccionan con estreptavidina (silicas con estreptavidina de Bangs Laboratories y de Polysciences), con péptidos que interacciona directamente con Ia silica (Arg-Tag14, Si-Tag15) b) empleo de soportes funcionalizados que permitan su fácil activación y reacción con Ia macromolécula.
Por otro lado, las sulfonas α,β-insaturadas (vinil sulfonas) son reconocidas como intermediarios sintéticos de gran utilidad debido fundamentalmente a su capacidad para participar en reacciones de adición 1 ,4 (aceptores de Michael) y en reacciones de cicloadición (como donores 2π). Adicionalmente, las vinilsulfonas son fáciles de preparar, a través de una amplia variedad de procesos sintéticos, y de manipular (Simphinks, N. S., 1990, Tetrahedron vol. 282, pp. 6951-6984; Meadows, D. C, et al., 2006, Med. Res. Rev. vol. 26(&) pp. 793-814). Estas características han encontrado recientemente utilidad en el diseño de fármacos y en química médica cuando se demostró su capacidad para inhibir de forma potente y reversible una variedad de procesos enzimáticos, fundamentalmente aquellos en los que están implicados cistein proteasas a las que se unen a través de reacciones de adición con el grupo tiol presente en el residuo de cisteína del sitio activo de estas enzimas, (cfr. Simphinks, N. S., 1990, Tetrahedron vol. 282, pp. 6951-6984; Meadows, D. C, et al., 2006 Med. Res. Rev. vol. 26(6), pp. 793-814)
La alta reactividad del grupo vinilsulfona ha sido explotada previamente en Ia preparación de distintos materiales conteniendo esta funcionalización: (i) poliestireno (comercializados por Aldrich) (ii) agarosa (comercializada por Gentaur) y (iii) sefarosa (comercializada por Affiland). Estos materiales han sido utilizados para el acoplamiento covalente con compuestos conteniendo grupos amina, tioles e hidroxilo habiendo encontrado aplicabilidad en Ia inmovilización de biomoléculas portadoras de estos grupos funcionales.
Además, el grupo vinilsulfona se usa en Ia preparación de intermedios de síntesis para Ia posterior obtención de materiales más elaborados, que contienen soportes de silica. Estos materiales se suelen denominar resinas tiofílicas o "T-GeI, (cfr. Schwarz A. et al., 1994 Reactive Polvmers vol. 22, pp. 256-266; GB 2 230 003 A; US 4,696,980; DE 10330204 A1 ). En este tipo de materiales el concepto clave es el de adsorción tiofílica descrito por Porath (cfr. Porath et al., 1984, Phvsical Chemistrv of Colloids and Macromolecules. pp 137-142; Porath J. et al., 1985, FEBS vol. 185 (2), pp. 306-310). La adsorción tiofílica se basa en Ia afinidad de macromoléculas por resinas del tipo SOPORTE-O-CH2-CH2-SO2-CH2-CH2-S-R (R= un residuo alifático pequeño) y en Ia actualidad es usada como una técnica alternativa para Ia inmovilización no covalente y purificación de moléculas biológicas (cfr. Hutchens T.W. et al., 1987, Biochemistrv vol. 26, pp. 7199- 7204). Para Ia preparación de estas resinas tiofílicas Ia estrategia utilizada supone Ia reacción de divinilsulfona, como reactivo difuncional, con un compuesto de silica conteniendo grupos hidroxilo, silica recubierta con dextrano ó grupos tiol obteniéndose así un material activado que se hace reaccionar normalmente in situ con tiol derivados sencillos.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
En Ia presente invención se proporciona un nuevo compuesto que comprende silica funcionalizada con grupos vinilsulfona a través de una cadena conteniendo un grupo funcional del tipo tiol o amina. Además de proporcionar el procedimiento de obtención de los mismos y sus usos, en particular en Ia inmovilización de biomoléculas dentro del campo de Ia biotecnología.
El nuevo compuesto proporciona una técnica de inmovilización que no requiere ninguna estrategia de activación y que combina las propiedades de Ia silica como soporte con Ia reactividad de Ia vinilsulfona con grupos presentes de forma natural en las biomoléculas en condiciones de reacción suaves compatibles con su naturaleza biológica.
El uso de silica como material para soportar grupos vinilsulfona supone una serie de importantes ventajas con respecto a otros materiales poliméricos como, por ejemplo, polisacáridos o poliestireno:
o Estabilidad mecánica. El material puede ser sometido a agitación mecánica sin sufrir alteraciones en su tamaño Io que permite llevar a cabo procesos en "baten". Otro aspecto importante es Ia estabilidad a alta presión de Ia silica Io que permite su uso en HPLC.
o Estabilidad química y biológica. El material no es susceptible de sufrir degradaciones por Ia acción de microorganismos y agentes químicos (por ejemplo ácidos).
o Estabilidad térmica. Es posible utilizar un amplio rango de temperaturas sin que el material sufra descomposiciones térmicas. El material es también susceptible de ser usado en procesos asistidos con microondas.
o Independencia del disolvente. El material no sufre ni encogimiento ni hinchado como consecuencia de Ia acción de los disolventes. Además, no es soluble en ningún disolvente Io que facilita Ia operatividad.
o Facilidad de uso en Io que respecta, fundamentalmente, al manejo y pesado. No se requieren lavados extensos. El material no se pega ni al vidrio ni al plástico. Por estas razones, el material es susceptible de ser usado en procesos automatizados.
o Flexibilidad de formatos. Es posible preparar fácilmente silicas funcionalizadas con un amplio rango de tamaños de partícula. Al no sufrir hinchamiento en contacto con disolventes estos materiales pueden ser empaquetados en una variedad de flujos a través de formatos tales como columnas de HPLC, cartuchos flash.
o Reproducibilidad. Permiten cargas de material exactas incrementando el grado de reproducibilidad en sus aplicaciones.
o Optimización de los recursos de partida: silica, silanoles y divinilsulfona (DVS) que son productos de partida baratos. Optimización de las condiciones de reacción: temperatura ambiente, disolventes baratos, y tiempo de reacción. Ambos factores permiten obtener un producto competitivo en el mercado.
Los materiales que se describen en el estado de Ia técnica, denominadas resinas tiofílicas o "T-GeI", han sido utilizados como soportes de cromatografía de afinidad explotándose las interacciones tiofílicas reversibles de este tipo de materiales con biomoléculas. La función vinilsulfona, en estos materiales, es utilizada para posibilitar Ia formación de grupos éter ó tioeter en Ia construcción de las cadenas de tipo 0-CH2- CH2-SO2-CH2-CH2-S-R unidas a los soportes. Sin embargo, en estas resinas tiofílicas, Ia función vinilsulfona ha sido utilizada para que los materiales que Ia contienen puedan llevar a cabo Ia unión no covalente en Ia inmovilización de biomoléculas. Mientras que en Ia invención se produce unión covalente en Ia inmovilización de biomoléculas con el uso del compuesto de silica-vinilsulfona.
Además, se ha comprobado, en Ia presente invención, que Ia incorporación de Ia función vinilsulfona a Ia silica se puede realizar en más de una etapa usando bisvinilsulfonas a partir de silica comercial. Se requiere el uso de un compuesto de silica funcionalizada con grupos que tengan un carácter nucleófilo, preferentemente grupos tioles o aminos, con capacidad para reaccionar fácilmente con bisvinilsulfonas. Estos grupos tioles o aminos pueden estar unidos al soporte inorgánico a través de un espaciador de longitud y naturaleza variable. Sin embargo, Ia utilización de silicas funcionalizadas conteniendo aminas primarias no es factible dado que en Ia reacción de estos compuestos con bisvinilsulfonas se produce una segunda delación intramolecular con formación de compuestos cíclicos. La solución a este inconveniente supone Ia preparación de un compuesto de silica conteniendo aminas secundarias que en Ia reacción con bisvinilsulfonas permiten Ia obtención de los compuestos de silica de Ia invención.
Así, un primer aspecto de Ia presente invención se refiere a un compuesto de fórmula general (I):
Figure imgf000009_0001
(i)
Donde: n representa Ia unión entre el Si y X mediante un grupo alquilo, sustituido o no sustituido, donde el número de carbonos dependerá del valor de n.
n tiene valores comprendidos entre 0 y 15, preferiblemente 2, 3 ó 11 y más preferiblemente 3.
X es un átomo de azufre (S) ó de nitrógeno (N). Cuando X es S, el grupo R1 no existe.
R es un grupo seleccionado de entre un alquilo(Ci-Cio), sustituido o no sustituido, o un alquenilo(Ci-Cio), sustituido o no sustituido. Preferiblemente R1 es un grupo metilo.
Y puede ser un grupo -SO2R2, donde R2 es un alquilo(CrCio) o un dialquilarilo ((Ci-Cio)Ar(Ci-Cio)). En una realización preferida del compuesto de silica de Ia presente invención, Y no existe.
Figure imgf000009_0002
, representa un soporte poroso de silica.
Por "alquilo" se refiere en Ia presente invención a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 10 átomos de carbonos, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, t-butilo, n-pentilo, etc. Por "alquenilo" se refiere en Ia presente invención a un radical alquilo que tiene entre 1 y 10 átomo de carbono y que tiene uno o más enlaces insaturados. Los radicales alquenilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como un arilo, halógeno, hidroxilo, alcoxilo, carboxilo, ciano, carbonilo, acilo, alcoxicarbonilo, amino, nitro, mercapto, etc.
En una realización preferida, el compuesto de Ia invención puede ser:
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000010_0002
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere al procedimiento de obtención del compuesto de fórmula general (I) que comprende: a. Obtención de silica funcionalizada con grupos tiol o amina. b. Reacción del compuesto de silica obtenido en el paso (a) con divinilsulfona en presencia de una base orgánica.
Una realización preferida del procedimiento de Ia invención comprende una amina terciaria como base orgánica que se puede seleccionar del grupo que comprende, sin limitarse a, trietilamina ó diisopropiletilamina
Otra realización más preferida del procedimiento de Ia invención, comprende en Ia reacción del paso (b) el uso de disolventes que se pueden seleccionar entre mezclas de THF con un alcohol como, por ejemplo isopropanol o terc-butanol, preferiblemente isopropanol. A continuación se describe esquemáticamente el procedimiento de Ia invención:
Figure imgf000011_0001
(IV) X = S; R1 no existe
(V) X = N
Figure imgf000011_0002
(I)
n, X ,R1 e Y están descritos anteriormente.
Otro aspecto más de Ia presente invención, se refiere al compuesto N- alquil ó alquenil-aminopropil-silica (V), obtenido en el paso (a) del procedimiento de obtención del compuesto de silica de Ia invención y cuya fórmula es:
Figure imgf000011_0003
(V)
donde n y R1 están descritos anteriormente, preferentemente n=3 y/o R1 es metilo(Me).
Más preferiblemente, el compuesto puede tener Ia fórmula (Vl)
Figure imgf000012_0001
Aún otro aspecto de Ia presente invención se refiere al uso del compuesto de fórmula general (I) para inmovilizar biomoléculas. Esta inmovilización se produce mediante Ia unión covalente entre Ia biomolécula y el grupo vinilsulfona presente en el compuesto de Ia invención. Este método de inmovilización covalente se lleva a cabo en condiciones de reacción suaves que son compatibles con Ia naturaleza biológica de las biomoléculas a través de grupos funcionales ya presentes en las mismas macromoléculas en un número considerable y accesible, por Io que no hay que realizar modificaciones químicas o mutagénesis dirigida para funcionalizarlas. La alta reactividad de Ia función vinilsulfona, en el compuesto de Ia invención, permite inmovilizar una amplia variedad de biomoléculas. Se describen varios casos en los que se pone de manifiesto Ia capacidad de inmovilización covalente de diferentes biomoléculas en términos de peso molecular, punto isoeléctrico y función. Los ejemplos se refieren, pero sin limitarse, a Ia posibilidad de unir el compuesto de Ia invención a enzimas (invertasa, lactasa y peroxidasa), para poner de manifiesto que tras Ia inmovilización mantienen Ia actividad catalítica, y a péptidos/proteínas (glutatión, nitroso glutatión y tiorredoxina h del guisante), para demostrar que Ia inmovilización transforma Ia silica- vinilsulfona en un soporte de cromatografía de afinidad apto para Ia purificación y experimentos de "pull-down".
Además, el compuesto de fórmula general (I) puede inmovilizar cualquier biomolécula que tenga grupos amina y/o tioles y usarse como soportes cromatográficos para cromatografía de afinidad según Ia necesidad en cada momento. Los resultados son extrapolables a lípidos y carbohidratos y otros sistemas que reaccionen con Ia vinilsulfona.
A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG 1. Muestra Ia variación de Ia concentración de invertasa en solución (no inmovilizada) en función del tiempo de reacción con el compuesto de silica-vinilsulfona a dos temperaturas.
FIG 2. Muestra Ia actividad enzimática de Ia invertasa inmovilizada. Variación del poder rotatorio (producto de Ia actividad catalítica del enzima inmovilizada) de una solución de sacarosa en contacto con Ia invertasa inmovilizada a dos temperaturas.
FIG 3. Muestra un estudio de Ia viabilidad de inmovilizar Ia lactasa sobre columnas de compuesto de silica-vinilsulfona previamente empacadas. Poder rotatorio específico (alfa) de Ia muestra a distintos intervalos de tiempo. La hidrólisis de Ia lactosa en glucosa y galactosa origina un incremento de alfa.
FIG 4. Muestra un cromatograma del experimento de "pull-down" con nitrosoglutatión inmovilizado
FIG 5. Muestra Ia electroforesis bidimensional de las fracciones recogidas en el experimento de "pull-down" llevadas a cabo con tiorredoxina h-1 del guisante, inmovilizada sobre el compuesto de silica-vinilsulfona.
EXPOSICIÓN DETALLADA DE MODOS DE REALIZACIÓN
A continuación se ilustrará Ia invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto Ia especificidad y efectividad de los compuestos de Ia invención. EJEMPLO 1.- Preparación del compuesto de silica-vinilsulfona de fórmula (II).
Primeramente, se transformó silica en el derivado mercaptopropil-sílica (IV). Este derivado es un compuesto conocido (cfr. Howard, A. G et al., (1987), Analvst vol. 112, pp. 159) que se obtiene por reacción de silica con 3-mercaptopropiltrimetoxisilano y que también se puede obtener comercialmente (Silicycle).
El compuesto de fórmula (II) se obtuvo por reacción del compuesto (IV) con divinilsulfona según el siguiente procedimiento: La mercaptopropil- silica (1 g) se suspendió en una mezcla de THF-isopropanol (1 :2, 10 ml_) que se burbujea con argón para posteriormente añadir DVS (0.515 ml_, 5 eq) y trietilamina (0.028 ml_, 0.2 eq). La mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente durante 16 h. Tras ese tiempo, se filtró el compuesto resultante de fórmula (II) que fue lavado con acetona y secado en una estufa de vacío a 50 0C.
EJEMPLO 2.- Preparación del compuesto de silica-vinilsulfona de fórmula (III).
El compuesto de formula (III) se obtuvo en un procedimiento de dos etapas:
a) Primero se obtuvo el compuesto 3-(metilamino)-propil-silica, de fórmula (V) (X=N R1=Me), por silanización de silica: Se suspendió silica (5 g) activada previamente por tratamiento térmico (120 0C a vacío durante 24 h) en tolueno (25 mL) y se adicionó 3-(metilamino)-propil- trimetoxisilano (1 ,250 g) calentándose a reflujo durante 2 h. Se evaporó un 20% del disolvente (5 mL) y se volvió a poner a reflujo durante 1 h adicional. El compuesto resultante de fórmula (V) se filtra y seca. b) Reacción del compuesto 3-(metilamino)-propil-silica (V, X=N R1=Me) con DVS: 1 .53 g del compuesto de fórmula (V) fueron suspendidos en una mezcla de THF-isopropanol (1 :2, 10 mL) y se Ie añadió DVS (0.640 mL, 5 eq). La mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente durante 16 h. Tras ese tiempo, el compuesto resultante de fórmula (III) se filtró y lavó sucesivamente con metanol y cloruro de metileno, secándose posteriormente en una estufa de vacio a 50 0C.
EJEMPLO 3. Protocolo general de inmovilización en discontinuo ("baten")
A una suspensión de sílica-vinilsulfona de fómula (II) ó (III) (0.5 g) en un tampón que no contenga aminas libres, como por ejemplo fosfato o HEPES, de fuerza iónica moderada (50 - 200 mM) y pH básico (7,5 -8,7) (10 ml_) se adicionó Ia molécula a inmovilizar (0.6 micromoles) y se dejaron reaccionar durante tiempo suficiente (entre 6 horas y 10 horas) con agitación. Posteriormente se adicionó mercaptoetanol (8 micromoles) y se agitó durante 1 hora. Los excesos de reactivos se eliminaron mediante sucesivos lavados con una solución de NaCI 2M y Ia resina (proteína inmovilizada en Ia silica-vinilsulfona) se equilibró con el tampón en el que se realizaron los experimentos posteriores.
EJEMPLO 4. Protocolo general de inmovilización en columna.
La inmovilización de una biomolécula puede ser llevada a cabo directamente sobre silica-vinilsulfona empacada en una columna haciendo recircular una solución de Ia biomolécula de interés en un tampón que no contenga aminas libres, como por ejemplo fosfato o HEPES, de fuerza iónica moderada (50 - 200 mM) y pH básico (7,5 -8,7) durante un tiempo suficiente (en función del flujo de Ia columna y del volumen de Ia solución de macromolécula. A modo de ejemplo, para 49 mi de solución de macromolécula y un flujo de de 0.5 ml/min, el tiempo de reacción fue de 14 horas). El empacado se llevó a cabo suspendiendo Ia silica vinil-sulfona en el tampón anteriormente mencionado y de forma general se utilizaron 3 g de silica vinil sulfona/micromol de biomolécula. Para bloquear los grupos vinilsulfona que no hayan reaccionado se trató el material con una disolución de β-mercaptoetanol (16 micromoles por gramo de vinil-sílica empacada) durante tiempo suficiente (en función del flujo de Ia columna y del volumen de Ia solución) a temperatura ambiente. Este protocolo permite Ia transformación directa de vinil-sílica previamente empacada en una columna cromatográfica y/o reactor enzimático basado en Ia macromolécula que se inmoviliza.
EJEMPLO 5. Inmovilización de Ia invertasa.
La invertasa (beta-fructofuranosidasa [EC3.2.1.26]), enzima que cataliza Ia hidrólisis de sacarosa en fructosa y glucosa, es elegida como enzima modelo teniendo en cuenta que (a) Ia proteína es comercial, (b) el sustrato es barato, (c) Ia actividad puede ser fácilmente medida en el laboratorio y (d) tiene aplicación industrial en el sector alimentario, donde se prefiere Ia fructosa sobre Ia glucosa por ser más dulce y no cristalizar tan fácilmente.
La inmovilización de invertasa de levadura comercial (10 mg, Sigma I- 4504) se realizó según el protocolo general mediante una reacción en discontinuo ("baten"). El estudio de Ia influencia de Ia temperatura sobre Ia reacción (FIG. 1 ) muestra que a las 10 horas Ia reacción es completa, independientemente de Ia temperatura utilizada (temperatura ambiente ó
40C). El análisis de Ia funcionalidad de Ia invertasa inmovilizada (FIG. 2) demuestra que el enzima mantiene su actividad.
EJEMPLO 6. Inmovilización de Ia lactasa
La lactasa (glicosidasa hidrolasa [EC3.2.1.23]), enzima que cataliza Ia hidrólisis de lactosa en glucosa y galactosa, es elegida como enzima a inmovilizar teniendo en cuenta el alto interés que ello tiene tanto en Ia industria alimentaria, dado que Ia lactosa es poco soluble y su capacidad edulcorante es insuficiente, como en medicina, debido a Ia intolerancia a este disacárido.
La inmovilización de lactasa de Kluyveromyces lactis (Sigma G-3665) se llevó a cabo en columna, siguiendo el protocolo general arriba indicado, empacando Ia silica-vinil sulfona (2.5 g) y haciendo recircular una solución de lactasa (49 mL) a temperatura ambiente a un flujo de 0.5 mL/min. Para estudiar Ia actividad de Ia enzima inmovilizada se midió el poder rotatorio específico de Ia muestra de lactosa a distintos intervalos de tiempo sobre Ia base de que Ia hidrólisis de Ia lactosa en glucosa y galactosa origina un incremento del poder rotatorio (FIG. 3). El estudio muestra que Ia inmovilización de lactasa sobre silica-vinilsulfona previamente empacada es factible y que el material así obtenido mantiene Ia actividad del enzima.
EJEMPLO 7. Inmovilización de peroxidasa.
Las peroxidasas [EC1.11.1.x] son enzimas que catalizan Ia reducción de peróxido de hidrógeno con Ia ayuda de un sustrato que pierde dos átomos de hidrógeno. Los enzimas con capacidad redox son capaces de provocar Ia polimerización de compuestos fenólicos en presencia de peróxido de hidrógeno. Estos polímeros fenólicos son inocuos o menos tóxicos e insolubles en agua, facilitando su eliminación. En este contexto Ia inmovilización de peroxidasa es interesante. Además, al tratarse de una glicoproteína es un buen modelo para demostrar Ia capacidad de Ia silica vinil-sulfona en Ia inmovilización de este tipo de biomoléculas. En concreto se seleccionaron las peroxidasas de rábano picante y alcachofa.
La inmovilización de las peroxidasa (10.9 mg) fue llevada a cabo usando el protocolo general mediante una reacción en discontinuo ("batch").
Para demostrar que Ia inmovilización de peroxidasa de alcachofa ha tenido lugar se midió Ia actividad enzimática. El enzima inmovilizado es activo.
EJEMPLO 8. Inmovilización de glutatión
El glutatión es un tripéptido de interés en biotecnología como elemento presente en resinas comerciales de uso en purificación de proteínas de fusión con glutatión-S- transferasa (GST) basadas en Ia afinidad de Ia GST por el glutatión inmovilizado (cfr Smith, D. B. and Johnson, K. S. ,1988, Gene vol. 67, pp. 31-40). Las proteína diana se purifican casi a homogeneidad en un solo paso y las condiciones de elución con glutatión reducido son suaves, evitando desnaturalización de Ia proteína.
La inmovilización de glutatión comercial (2.4 mg Sigma G4251 ) se realizo según el protocolo general mediante una reacción en "baten" usando 1 g de silica-vinil-sulfona. Los grupos vinilsulfona que no han reaccionado se bloquean con β-mercaptoetanol (563 μL).
La silica-glutation fue empacada en una columna y empleada para purificar una proteína de fusión con GSH. Un lisado de un cultivo de bacterias que expresaron Ia proteína de fusión se pasó a través de Ia columna de silica- glutatión. Se lavó Ia columna con 200 mi de HEPES 100 mM pH 7,5 y NaCI 200 mM. La elución se realizó con 50 mM de glutatión en 50 mM Tris-HCI pH 7,5.
EJEMPLO 9. Inmovilización de nitrosoglutatión
El S-nitrosoglutatión (GSNO) es un tripéptido que transfiere NO a proteínas con grupos tiol. Dada Ia importancia del óxido nítrico como molécula implicada en aspectos claves de Ia regulación de los sistemas inmune, cardiovascular y nervioso, Ia inmovilización de GSNO se llevó a cabo para poder obtener un soporte de afinidad cromatográfica basado en este péptido y poder realizar experimentos de "pull-down" para identificar proteínas susceptibles de ser nitrosadas (proteínas diana).
La preparación de este material se llevó a cabo en un proceso en tres etapas: a) Inmovilización de L-glutatión oxidado (GSSG) comercial (2.5 mg Sigma G4501 ). Se lleva a cabo según el protocolo general en "baten" usando 1 g de resina. Los grupos vinilsulfona que no han reaccionado se bloquean por tratamiento con β-mercaptoetanol (563 μL). b) Reducción del GSSG y desprotección del grupo -SH del L-glutatión (GSH) inmovilizado. Se lleva a cabo por tratamiento del material obtenido en Ia anterior etapa con DTT (14 mg) durante 2 h. a 20 0C c) Nitrosación del GSH inmovilizado y obtención de silica-GSNO. Se lleva a cabo según el procedimiento de Lamas y col. (Biochem J. 2000, 349, 567) por tratamiento con HCI 10 mM y NaNO2 10 mM (10 mL) durante 1 h a 20 0C. Se filtra y repite el tratamiento durante 30 min. Se filtra y lava con HEPES 40 mM pH 7.5 y NaCI 50 mM.
Para comprobar Ia eficacia de Ia inmovilización y Ia aplicabilidad de Ia silica-GSNO, se procedió a realizar un experimento de "pull-down" a partir de un extracto de girasol según el procedimiento que se indica: Ia silica- GSNO se empacó usando 250 mi de HEPES 50 mM pH 7.5 y NaCI 50 mM. Se cargó un extracto de girasol (150 mi), se lavó con NaCI 200 mM para despegar las proteínas unidas a Ia columna mediante interacciones no específicas y se eluyó selectivamente con fuerza iónica (1.5 M NaCI) y con poder reductor (10 mM DTT en 1.5 M NaCI). El cromatograma obtenido (FIG.4) muestra que los picos de proteína eluida (Absorbancia a 280) presentaban Ia señal característica del enlace S-NO (Absorbancia a 340), es decir, que las proteínas retenidas por Ia resina son y/o se han nitrosado, por Io que constituyen potenciales dianas del GSNO.
EJEMPLO 10. Inmovilización de tiorredoxina h1.
Las tiorredoxinas, enzimas redox que actúan como interruptores que modulan Ia actividad de numerosas proteínas vía el intercambio de puentes disulfuro, han sido elegidas como proteínas de interés para demostrar Ia eficacia de Ia silica vinil-sulfona para Ia inmovilización de proteínas. La inmovilización de Ia tiorredoxina h1 de guisante no es conocida y experimentos de "pull-down" son una estrategia viable para identificarla.
La inmovilización de Ia tiorredoxina h1 de guisante recombinante con cola de His expresada en E. coli (6.08 mg) fue llevada a cabo usando el protocolo general mediante una reacción en "batch" y Ia alta reactividad de los restos de histidinas presentes en Ia cola de esa proteína hacia los grupos vinil-sulfona es aprovechada para favorecer Ia orientación de Ia molécula (Ia molécula reaccionará preferentemente con Ia cola de polihistidina, que está en Ia cara opuesta al centro activo, por Io que éste queda accesible). Para demostrar Ia inmovilización de Ia tiorredoxina h1 y Ia aplicabilidad del material obtenido se llevaron a cabo experimentos de "pull-down" siguiendo el esquema de elución expuesto en el ejemplo anterior: se pasa el extracto, se lava Ia columna con 200 mM NaCI para despegar las proteínas unidas a Ia columna mediante interacciones no específicas y se eluye selectivamente con fuerza iónica (1.5 M NaCI) y con poder reductor (10 mM DTT en 1.5 M NaCI). Una electroforesis bidimensional (FIG. 5) de las fracciones recogidas en el experimento revela que sólo unas pocas proteínas han sido retenidas por Ia columna, Io cual apoya Ia especificidad de Ia interacción y Ia viabilidad de Ia silica-vinilsulfona como resina sobre Ia que llevar a cabo experimentos de "pull-down".
EJEMPLO 11. Inmovilización de biotina
La inmovilización de aminobiotina comercial (0.1 g de biotina Merck) se llevó a cabo usando el protocolo general mediante una reacción en "baten" con las siguientes modificaciones: 1.25 g de resina, una mezcla de THF- isopropanol (2:1 , 10 mi) como disolvente y trietil amina (38 mg) como base. Tras un periodo de reacción de 14 h, se filtró y lavó con cloruro de metileno:metanol (1 :1 ).
Para demostrar que Ia inmovilización de biotina ha tenido lugar se llevó a cabo una cromatografía de afinidad para el aislamiento y purificación de avidina.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Compuesto de fórmula general (I):
Figure imgf000021_0001
(I)
donde: n tiene valores comprendidos entre 0 y 15.
X es S ó N.
R1 es un grupo seleccionado de entre un alquilo (C1-C10), sustituido o no sustituido, o un grupo alquenilo(Ci-Cio), sustituido o no sustituido.
Y no existe ó es el grupo -SO2R2, donde R2 es un grupo alquilo (d-
C10), ó un dialquilarilo ((CI-CIO)AΓ(CI-CIO)).
2. Compuesto según Ia reivindicación 1 , donde n tiene un valor de 3.
3. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde X es S.
4. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde X es N.
5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2 ó 4, donde R es metilo.
6. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde Y no existe.
7. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 ó 6, de fórmula (II)
Figure imgf000022_0001
8. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2 ó 4 a 6, de fórmula (III)
Figure imgf000022_0002
9. Método de obtención de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende: a. obtención de silica funcionalizada con grupos tiol o amina; b. reacción del compuesto de silica obtenida en el paso (a) con divinilsulfona en presencia de una base orgánica.
10. Método según Ia reivindicación 9, donde Ia base orgánica usada en el paso (b) es trietilamina
11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, que además comprende el uso de THF-isopropanol como disolvente de Ia reacción del paso (b).
12. Compuesto de fórmula general (V):
Figure imgf000022_0003
donde n y R1 están descritos en Ia reivindicación 1.
13. Compuesto según Ia reivindicación 12, donde n es 3.
14. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13, donde R1 es metilo.
15. Uso de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, como inmovilizador de biomoléculas.
16. Uso del compuesto según Ia reivindicación 15, donde las biomoléculas son enzimas, glutatión, nitrosoglutatión o biotina..
17. Uso del compuesto según Ia reivindicación 16, donde los enzimas se seleccionan de entre invertasa, lactasa, peroxidasa ó, tiorredoxina h1.
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