JP2003522187A - ハイドロホビン含有溶液中に存在するハイドロホビンの精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はハイドロホビン含有溶液中に存在するハイドロホビンの精製方法に関する。本発明によると、該溶液を吸着用表面と接触させ、該表面はハイドロホビンを消尽した溶液から分離する。次いで該表面を９０℃未満の温度で界面活性剤含有溶液と接触させる。脱着されたハイドロホビンを該表面から分離する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明はハイドロホビン含有溶液中に存在するハイドロホビンの精製方法に関
する。

【０００２】 ハイドロホビン類は対象物の表面に水不溶性コーティングを形成する能力を有
することで知られたタンパク質である。その粘着性は非常に強く、そのコーティ
ングが２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液中で沸騰させても除去し得な
い程のものである。実際に、例えば、バイオセンサーの表面をハイドロホビンで
被覆し、該表面の疎水性／親水性を改変することが示唆されている。ハイドロホ
ビン含有溶液は注意して取り扱うべきとされるが、その理由は振り混ぜるなどの
動作がハイドロホビン凝集塊を含む濁りのある溶液を生じ、それが表面の均一な
コーティングに影響を与えるからである。相当の規模でハイドロホビンを応用す
るには、ハイドロホビン含有溶液、例えば、発酵増殖培地中に存在するハイドロ
ホビンを精製するための工業的規模の方法が必要である。現在の技術水準による
方法はトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の使用に依存するが、これは環境問題および
安全性の理由で望ましくない。

【０００３】 この目的のために、本発明は前提項に記載した方法において、ハイドロホビン
含有溶液を吸着用表面と接触させてその表面にハイドロホビンを吸着させ、吸着
されたハイドロホビンを担持する表面とハイドロホビンを消尽した溶液とを分離
し、次いで吸着されたハイドロホビンを担持する表面を９０℃未満の温度で界面
活性剤含有溶液と接触させ、該表面に吸着されたハイドロホビンを可溶化し、ハ
イドロホビン濃縮化界面活性剤含有溶液を該表面から分離することを特徴とする
方法を提供する。

【０００４】 驚くべきことに、温度条件が合致するならば、ハイドロホビンはその吸着して
いる表面から溶出させ得ることが判明した。言うまでもなく、該表面は表面と容
量との高い比を有する対象物の表面である。該ハイドロホビンを不溶性とする構
造上の不可逆的変化を防止するために、ハイドロホビン担持表面は、界面活性剤
含有溶液と接触させる前に、９０℃を超える温度としてはならない。

【０００５】 ハイドロホビン類は疎水性−親水性境界面で自己集合し得る明確な分類群のタ
ンパク質であり、保存配列として、 Ｘ_ｎ−Ｃ−Ｘ_５−９−Ｃ−Ｃ−Ｘ_{１１−３９}−Ｃ−Ｘ_８−２３−Ｃ−Ｘ_５−９−
Ｃ−Ｃ−Ｘ_６−１８−Ｃ−Ｘ_ｍ （Ｘは勿論何らかのアミノ酸を表し、ｎおよびｍは勿論独立して整数を表す） で示される配列を有する。一般に、ハイドロホビンはその長さが１２５個までの
アミノ酸からなる。保存配列でのシステイン残基（Ｃ）はジスフィド架橋の部分
である。本発明において、ハイドロホビンという用語は機能的に等価のタンパク
質をも含む幅広い意味をもち、以下の配列、 Ｘ_ｎ−Ｃ−Ｘ_１−５０−Ｃ−Ｘ_０−５−Ｃ−Ｘ_{１−１００}−Ｃ−Ｘ_{１−１００}−
Ｃ−Ｘ_１−５０−Ｃ−Ｘ_０−５−Ｃ−Ｘ_１−５０−Ｃ−Ｘ_ｍ またはその部分を含んでなる一群のタンパク質であって、なお疎水性−親水性境
界面で自己集合してタンパク質薄膜となる特性を示すものをも包含する。本発明
の定義に従うと、自己集合体はタンパク質をに吸着させ、円二色性を使用して検
出し、二次構造（一般にはα−へリックス）の存在を証明することができる（文
献２）。薄膜の形成はタンパク質溶液中でテフロン（登録商標）シートをインキ
ュベートし、次いで水またはバッファーにて少なくとも３回洗浄することにより
容易に確立することができる（文献３）。タンパク質薄膜は技術的に確立されて
いる何らかの方法、例えば、蛍光化合物での標識などにより、または蛍光抗体を
使用することにより可視化することができる。ｍおよびｎは０ないし２０００の
範囲の数値であってもよい。この定義には、ハイドロホビンと他のタンパク質と
の融合タンパク質も包含され、かかる組換えタンパク質は本発明の方法により同
様に精製することが可能である。

【０００６】 好ましくは、該温度は６０℃未満、例えば４０℃未満、取分け２０℃未満、よ
り好ましくは１０℃未満である。

【０００７】 一般に、該界面活性剤の濃度は０．００１％ないし５％（ｗ／ｖ）、有利には
０．０１％ないし１．０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０２％ないし０．１％で
ある。

【０００８】 界面活性剤の適切な濃度は種々の分光学的技法、例えば、ド・ヴォヒト（De V
ocht）ら（文献２）が記載するような円二色性（ＣＤ）、または赤外線（ＩＲ）
スペクトル（同上）などの各種スペクトル技術により容易に決定することができ
る。別法として、界面活性剤の適切な濃度は簡単な試行錯誤により決定すること
も可能である；表面をハイドロホビン含有溶液で被覆し、次いで該表面を界面活
性剤含有溶液で処理し、その後でハイドロホビンの存在を、例えば、蛍光に基づ
くまたは放射活性に基づく技法により検討する。適切に標識したハイドロホビン
に対する抗体を使用することも可能であるが、標識したハイドロホビンで表面を
被覆し、残存する標識量を、同じ溶液で処理したが界面活性剤では処理しなかっ
た表面と比較して検出することがより簡単である。

【０００９】 さらなる態様によると、該ハイドロホビンは少なくとも１．１バールの圧力下
に可溶化する。

【００１０】 圧力を上昇させると、吸着されたハイドロホビンを担持する表面から、吸着さ
れたハイドロホビンを溶出するのが容易となる。

【００１１】 もう一つの好適な態様によると、該圧力は該表面にハイドロホビンを吸着させ
る際に低下させる。

【００１２】 吸着させる際に減圧すると、該表面に対するハイドロホビンの吸着が容易にな
る。一般に、ハイドロホビン含有溶液の圧力は、該溶液を最初に該表面と接触さ
せる場合に、少なくとも１．１バールの圧力を有する。

【００１３】 原則として、ハイドロホビンを吸着させる表面は、ガラスまたはプラスティッ
クなどの材料の表面でもよい。好ましくは、該表面は水に対し６０°を超える接
触角を有する。かかる接触角は、該表面を、ハイドロホビン含有溶液中に存在す
るハイドロホビンを吸着させるのに非常に適切なものとする。

【００１４】 好適な態様によると、該表面は表面と容量との高い比を有する対象物の表面で
ある。

【００１５】 このことは比較的小容量のハイドロホビンの精製を可能とする。 ここで以下の実施例により本発明を説明する。

【００１６】 方法 Ａ）二次構造の測定 ハイドロホビンの二次構造は円二色性スペクトル法（ＣＤ）により検討した。
ＣＤスペクトルは、１ｍｍ石英キュベットを用い、既知手法に従って、アビブ（
Aviv）６２Ａ ＤＳ ＣＤ分光光度計（アビブ・アソシエーツ（Aviv Associates
）、レークウッド、ニュージャージー、米国）上、１９０〜２５０ｎｍの波長領
域に記録した（２）。サンプル室には連続的にＮ_２ガスを流し、温度は２５℃の
一定に維持した。バンド幅１ｎｍ、階段幅１ｎｍ、点あたり平均１秒として、１
０回の走査を平均した。スペクトルは該タンパク質を含まない参照溶液を用いて
補正した。典型的には、５０ｍＭリン酸（ｐＨ７．０）中１０μＭのタンパク質
濃度を使用した。疎水性支持体に結合したＳＣ３のスペクトルに対し、水中１３
０ｎｍ非安定化コロイドテフロン球（デュポン・ド・ネマース（Dupont de Nemo
urs）、ジュネーブ、スイス）を該溶液に加えた。

【００１７】 Ｂ）テフロンへの結合 ＳＣ３によるテフロン（ノートン・フルオルプラスト（Norton Fluorplast B.
V.）、ラームスドンクスベール（Raamsdonksveer）、オランダ）のコーティング
は、基本的にウーステン（Wosten）らの記載通りに評価した（３）。十分に清浄
化した（文献３）テフロンシートを２０μｇ／ｍｌの^３５Ｓ−標識ハイドロホビ
ン／水中、１６時間インキュベートし、次いで水で３回、それぞれ１０分間洗浄
した。吸着された^３５Ｓ−標識タンパク質量をシンチレーション計測により定量
した。

【００１８】 実施例１ ５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ＝７．０）中、５０μｇ／ｍｌのＳＣ３を１
３０ｎｍ非安定化コロイドテフロン球（デュポン・ド・ネマース（Dupont de Ne
mours）、ジュネーブ、スイス）と２５℃で混合した。ＳＣ３はテフロンの表面
に吸着され、α−へリックス状態となった（計算表面処理範囲９％）。

【００１９】 球体を０．１％ｗ／ｖトゥイーン−２０または０．１％ｖ／ｗトゥイーン−８
０にて２５℃で１０分間処理し、遠沈させた（１分間；１０,０００ｇ）。実質
的に１００％のＳＣ３を界面活性剤添加により脱着させ、モノマー状態とした。
界面活性剤不存在下では予測したとおりに、ＳＣ３は吸着されたままであった（
ＣＤで測定した場合はα−へリックス状態）。

【００２０】 実施例２ テフロンシート（２ｃｍ^２、厚さ０．２５ｍｍ）を２０μｇ／ｍｌの^３５Ｓ−
標識ＳＣ３中、室温で一夜インキュベートした。引き続き、ＳＣ３−被覆シート
を室温で水洗した。次いで、シートを２％トゥイーン−２０（ｐＨ７．０）また
は水（対照）にて、室温または１００℃（対照）で３０分間処理した。この処理
の後、シートを取り出した。遠心分離（１分間、１０,０００ｇ）後に得られた
上清中に放出された放射活性ＳＣ３の量を定量した。百分比はシートに当初結合
した放射活性量に対する相対比である。

【００２１】 放出されたＳＣ３ ％ 室温 １００℃ ２％トゥイーン−２０ ７８％ ６％ 水（対照） ６％ ７％

【００２２】 これは温度の要件が合致する場合に界面活性剤を用いてハイドロホビンを溶出
させ得ることを示している。

【００２３】

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年１２月２０日（２００１．１２．２０）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０００５】 ハイドロホビン類は疎水性−親水性境界面で自己集合し得る明確な分類群のタ
ンパク質であり、保存配列として、 Ｘ_n−Ｃ−Ｘ_5-9−Ｃ−Ｃ−Ｘ_11-39−Ｃ−Ｘ_8-23−Ｃ−Ｘ_5-9−Ｃ−Ｃ−Ｘ_6-18−
Ｃ−Ｘ_m （Ｘは勿論何らかのアミノ酸を表し、ｎおよびｍは勿論独立して整数を表す） で示される配列を有する。一般に、ハイドロホビンはその長さが１２５個までの
アミノ酸からなる。保存配列でのシステイン残基（Ｃ）はジスフィド架橋の部分
である。本発明において、ハイドロホビンという用語は機能的に等価のタンパク
質をも含む幅広い意味をもち、以下の配列、 Ｘ_n−Ｃ−Ｘ_1-50−Ｃ−Ｘ_0-5−Ｃ−Ｘ_1-100−Ｃ−Ｘ_1-100−Ｃ−Ｘ_1-50−Ｃ−Ｘ _0-5 −Ｃ−Ｘ_1-50−Ｃ−Ｘ_m またはその部分を含んでなる一群のタンパク質であって、なお疎水性−親水性境
界面で自己集合してタンパク質薄膜となる特性を示すものをも包含する。本発明
の定義に従うと、自己集合体はタンパク質をテフロンに吸着させ、円二色性を使
用して検出し、二次構造（一般にはα−へリックス）の存在を証明することがで
きる（文献２）。薄膜の形成はタンパク質溶液中でテフロンシートをインキュベ
ートし、次いで水またはバッファーにて少なくとも３回洗浄することにより容易
に確立することができる（文献３）。タンパク質薄膜は技術的に確立されている
何らかの方法、例えば、蛍光化合物での標識などにより、または蛍光抗体を使用
することにより可視化することができる。ｍおよびｎは０ないし２０００の範囲
の数値であってもよい。この定義には、ハイドロホビンと他のタンパク質との融
合タンパク質も包含され、かかる組換えタンパク質は本発明の方法により同様に
精製することが可能である。 ＷＯ−Ａ−９６４１８８２は一般的様式によるハイドロホビンの精製について
、沈殿法およびクロマトグラフ法、特に、メタノール、エタノール、アセトンお
よび硫酸アンモニウムによる沈殿法、およびイオン交換クロマトグラフィーとヒ
ドロキシアパタイトクロマトグラフィーの使用について記載している。ＳＤＳに
ついてはハイドロホビンを産生した細胞から、またその細胞が存在する培地から
ハイドロホビンを単離する場合の補助手段として言及している。 マーチン（Martin G.G）らはアメリカ化学会誌（J. Am. Chem. Soc. vol. 39
(1), p. 347-348 (1998)）に、調製用電気泳動を用い、次いでヒドロキシアパタ
イトクロマトグラフィーによりＳＤＳを除去するハイドロホビンの精製法につい
て記載している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ウォステン，ヘルマン アベル ベルナル ト オランダ国 ゼイスト コンスタンチン フイヘンスラーン 19 (72)発明者 ウェッセルズ，ヨセフ ヘラルト ヒュー ベルト オランダ国 ミットラーレン トルハイス ウェフ 34 Ｆターム(参考） 4H045 AA20 CA11 CA15 EA61 EA65 GA20

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ハイドロホビン含有溶液中に存在するハイドロホビンの精製方
   法において、ハイドロホビン含有溶液を吸着用表面と接触させてその表面にハイ
   ドロホビンを吸着させ、吸着されたハイドロホビンを担持する表面とハイドロホ
   ビンを放出した溶液とを分離し、次いで吸着されたハイドロホビンを担持する表
   面を９０℃未満の温度で界面活性剤含有溶液と接触させ、該表面に吸着されたハ
   イドロホビンを可溶化し、ハイドロホビン濃縮化界面活性剤含有溶液を該表面か
   ら分離することを特徴とする、ハイドロホビン精製方法。
2. 【請求項２】 温度を６０℃未満、例えば４０℃未満、好ましくは２０℃未満
   、より好ましくは１０℃未満とすることを特徴とする、請求項１記載の精製方法
   。
3. 【請求項３】 界面活性剤濃度を０．００１％ないし５％（ｗ／ｖ）、有利に
   は０．０１％ないし１．０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０２％ないし０．１％
   とすることを特徴とする、請求項１または２記載の精製方法。
4. 【請求項４】 ハイドロホビンを少なくとも１．１バールの圧力下で可溶化す
   ることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の精製方法。
5. 【請求項５】 ハイドロホビンを該表面に吸着させるに際して、減圧とするこ
   とを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の精製方法。
6. 【請求項６】 該表面が、６０°を超える水との接触角を有することを特徴と
   する前記請求項のいずれかに記載の精製方法。