KR101265375B1 - 연료의 발포 방지 성분으로서의 단백질의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 첨가제 조성물 또는 연료에서 발포 방지제로서의 하나 이상의 히드로포빈 또는 이의 유도체의 용도, 연료의 소포 방법, 하나 이상의 히드로포빈 또는 이의 유도체 및 하나 이상의 추가 연료 첨가제를 포함하는 첨가제 및 연료 조성물, 및 하나 이상의 연료 조성물의 생성 방법에 관한 것이다.

Description

연료의 발포 방지 성분으로서의 단백질의 용도{USE OF PROTEINS AS AN ANTIFOAMING CONSTITUENT IN FUELS}

본 발명은 첨가제 조성물 또는 연료에서 소포제로서의 하나 이상의 히드로포빈 또는 이의 유도체의 용도, 연료의 소포 방법, 하나 이상의 히드로포빈 또는 이의 유도체 및 하나 이상의 추가 연료 첨가제를 포함하는 첨가제 및 연료 조성물, 및 또한 하나 이상의 연료 조성물의 생성 방법에 관한 것이다.

방향족, 경유 및 등유를 또한 포함할 수 있는, 연료로 사용되는 탄화수소 혼합물은, 이들이 자동차의 저장 탱크 및 연료 탱크와 같은 저장 용기로 이송되는 경우 공기와 함께 발포체를 발생시키는 불량한 특성을 갖는다. 그 결과 이송 작업이 방해받고 용기의 충전이 불만족스러워진다. 따라서, 디젤 연료에 소포제를 첨가하는 것이 일반적이다. 상기 소포제는 최소 농도에서 활성이 있어야 하며 엔진에서 디젤 연료의 연소 과정 중 임의의 해로운 잔류물을 형성하거나 연료의 연소에 불리한 영향을 끼치거나 해서는 안된다. 상응한 활성 소포제는 특허 문헌에 기술되어 있다.

예를 들어, 규소를 주성분으로 하는 발포방지제 및 소포제가 공지되어 있다. DE 103 13 853 A는, 예를 들어, 유기 작용적으로 변형된 폴리실록산 및 액체 연료, 특히 디젤 연료에서의 소포를 위한 이의 용도를 개시하고 있다.

GB-B 2 173 510은 규소 폴리에테르 공중합체를 주성분으로 하는 발포방지제를 연료에 첨가하는, 디젤 연료 또는 제트 연료의 소포 방법에 관한 것이다.

기존의 발포방지제의 한가지 단점으로는 습식(moist) 디젤 연료에서는 소포가 불량하다는 것이다. 습식 디젤 연료는 대략 250 ppm의 물을 포함하는 연료를 의미하는 것으로 이해된다. 상기 물은 저장 탱크에서의 연료로 들어간 응축수이거나 또는 탱크의 물이 불완전하게 비워져서 오일 탱커로 이송되는 동안 연료로 도입된 것이다.

또한 페놀 유도체(더욱 바람직하게는 유게놀)가 습식 디젤 연료에서 비교적 양호한 소포력을 나타낸다는 것이 US 5 542 960에 개시되어 있다.

디젤 연료용으로 기술된 발포방지제 및 종래 기술에 공지된 추가의 발포방지제는 다수의 단점을 특징으로 한다. 예를 들어, 일반적인 폴리실록산-폴리옥시알킬렌 공중합체의 규소 함량은 10∼15 중량%이거나 또는 심지어 20∼25 중량%이다. 그러한 높은 규소 함량을 갖는 화합물은 연소 과정 중에 엔진 내에 불필요한 이산화규소를 침착시킬 수 있기 때문에, 이러한 첨가제의 사용 농도를 감소시킬 수 있도록 규소 비율이 감소되거나 또는 적어도 발포체 방지 및 발포체 제거가 개선된 디젤 연료용 소포제가 바람직하다.

공지된 발포방지제의 추가 단점은 성질을 향상시키기 위해 원료 디젤 오일에 첨가된 첨가제 패키지와의 상용성(혼화성)이 종종 너무 낮다는 점이다. 첨가제 패키지는 상이한 첨가제들, 예컨대 연소 성능 향상제, 연기 형성 감소제, 유해 배기 가스 형성 감소제, 엔진 및 이의 부품 중 부식 감소용 억제제, 계면-활성 물질, 윤활제 등의 혼합물을 의미하는 것으로 이해된다. 그러한 첨가제 패키지는, 예를 들어 JP-05 132 682, GB-2 248 068 및 저널 Mineraloeltechnik, 37(4), 20에 기술되어 있다. 첨가제 패키지의 첨가제를 유기 용매에 용해시켜 원료 디젤 연료에 첨가되는 스톡 농축물을 형성한다. 극성 기를 갖는 발포방지제는 종종 상기 첨가제 패키지로 균일하게 도입할 수 없거나 저장 과정 중에 분리된다.

하나의 가능한 접근법은 목적하는 특성을 갖는 첨가제를 천연적으로 발생시키는 것이다. 적당한 다수의 물질들은, 예를 들어 단백질의 경우에 존재한다.

단백질들은 아미노산에서 형성되는 고분자이다. 이의 폴리펩티드 쇄의 길이는 50 이하, 예를 들어 10, 최대 1000 이상의 아미노산을 범위로 한다.

단백질의 작용 방식의 경우에는, 이들의 3차원 구조가 특히 중요하다. 단백질 구조는 1차 구조, 2차 구조, 3차 구조 및 4차 구조에 의해 기술될 수 있다. 1차 구조는 폴리펩티드 쇄 내의 각 아미노산의 서열을 의미한다. 단백질의 아미노산의 3차원 구조 배열은 2차 구조로서 언급된다. 3차 구조는 2차 구조를 포괄하는 폴리펩티드 쇄의 3차원 배열이다. 이것은 아미노산의 잔기(즉, 측쇄) 사이의 힘과 결합에 의해 결정된다. 3차원 배열의 복수의 분자가 상위 기능적 단위를 형성하는 경우, 이는 4차 구조로서 언급된다.

2개의 주요 단백질 군으로 구별하면 구상 단백질과 섬유상 단백질이 있는데, 구상 단백질은 이의 3차 또는 4차 구조가 대략 구형 또는 배형(pear-shaped) 외관을 갖고 일반적으로 물 또는 염 용액에 용이하게 가용되며, 섬유상 단백질은 실 형 태(thread-like) 또는 섬유 구조를 갖고 일반적으로 불용성이며 지지체 및 골격 물질이다.

히드로포빈은 약 100∼150 아미노산의 소형 단백질로서, 사상성 진균, 예컨대 스키조필룸 코무네(Schizophyllum commune)의 특징적 물질이다. 이들은 통상 8 시스테인 단위를 갖는다.

히드로포빈은 계면에 대해 현저한 친화력을 가지므로, 양친매성 막을 형성하여 계면의 특성을 바꾸기 위한 표면 코팅에 적당하다. 예를 들어, 테플론을 히드로포빈으로 코팅하여 친수성 표면을 얻을 수 있다.

히드로포빈은 천연 원료에서 단리될 수 있다. 히드로포빈과 이의 유도체의 제조 방법이 마찬가지로 공지되어 있다. 예를 들어, DE 10 2005 007 480.4는 히드로포빈 및 이의 유도체의 제조 방법을 개시하고 있다.

표면 코팅에 대한 히드로포빈의 예외적인 특성때문에, 상기 단백질들은 다수의 공업 분야에 상당한 잠재력을 갖는다. 종래 기술분야는 다양한 분야에서 히드로포빈의 용도를 제안하고 있다.

WO 96/41882는 유화제, 증점제, 계면 활성 물질로서의, 소수성 표면의 친수화, 친수성 표면의 방수성의 향상, 수중유 유화액 또는 유중수 유화액의 제조를 위한 히드로포빈의 용도를 제안하고 있다. 또한, 연고 또는 크림의 생산과 같은 약학 분야 용도, 및 또한 피부 보호 또는 헤어 샴푸 또는 헤어 린스의 생산과 같은 화장료 분야 용도도 제안되고 있다. WO 96/41882는 히드로포빈을 포함하는 조성물, 특히 약학용 조성물을 추가로 청구하고 있다.

EP-A 1 252 516은 30∼80℃의 온도에서 히드로포빈을 포함하는 용액을 이용한, 창문, 콘텍트 렌즈, 바이오센서, 메디컬 장치, 실험 수행용 또는 저장용 용기, 배의 선체, 고체 입자 또는 승용차의 프레임 또는 차대(chassis)의 코팅을 개시하고 있다.

WO 03/53383은 화장료 분야에서 케라틴 재료를 처리하기 위한 히드로포빈의 용도를 개시하고 있다.

WO 03/10331은 히드로포빈이 표면 활성 특성을 갖는 것을 개시하고 있다. 예를 들어, 히드로포빈 코팅된 센서는, 예를 들어 추가 물질, 예컨대 전기활성 물질, 항체 또는 효소가 비공유 방식으로 결합한 테스트 전극을 개시하고 있다.

WO 2004/000880은 마찬가지로 히드로포빈 또는 히드로포빈 유사 물질을 사용하여 표면을 코팅하는 것을 개시하고 있다. 또한 수중유 또는 유중수 유화액은 또한 히드로포빈을 첨가시켜 안정화될 수 있다.

히드로포빈 유사 단백질에 관한 WO 01/74864는 또한 이들이 분산액 및 유화액을 안정화시키는데 사용될 수 있음을 개시하고 있다.

EP 05 007 208.1은 항유화제로서의 단백질, 특히 히드로포빈 또는 이의 유도체의 용도를 제안하고 있다.

종래 기술 분야에서 더 나아가, 본 발명의 목적은 소포 작용이 양호하고 Si 함량이 낮은 소포제를 제공하는 것이었다.

본 발명의 추가의 목적은 소포 작용이 양호한 것 이외에 저렴한 소포제를 제공하는 것이었다.

본 발명의 추가의 목적은 소포 작용이 양호한 것 이외에 저렴하고 환경 친화적인 소포제를 제공하는 것이었다.

본 발명에 따르면, 이 목적은 첨가제 조성물 또는 연료에 소포제로서 하나 이상의 히드로포빈 또는 이의 유도체를 사용하여 실현된다.

히드로포빈 또는 이의 유도체는 생분해성으로서 환경을 오염시키지 않는 천연 물질이라는 점에서 이의 사용은 유리하다. 또한, 이러한 분해는 엔진 부분에 침착되는 임의의 물질을 거의 형성하지 않는다.

본 발명에 따르면, 히드로포빈 또는 이의 유도체를 소포제로 사용하는데, 즉 연료 또는 연료 조성물의 발포체 형성을 감소시킨다.

본 발명에 따르면, 하나 이상의 히드로포빈 또는 이의 유도체를 단독으로 소포제로서 연료에 첨가할 수 있다. 하지만, 마찬가지로 소포제로 작용하는 하나 이상의 추가의 화합물과 함께 하나 이상의 히드로포빈 또는 이의 유도체도 사용할 수 있다. 마찬가지로, 상이한 히드로포빈 또는 이의 유도체를 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 히드로포빈 또는 이의 유도체는 히드로포빈 또는 변형된 히드로포빈을 의미하는 것으로 이해된다. 변형된 히드로포빈은, 예를 들어, 히드로포빈의 폴리펩티드 서열과 60% 이상, 예컨대 70% 이상, 특히 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상 동일한 폴리펩티드 서열을 갖고, 50%의 범위, 예를 들어 60%의 범위, 특히 70%의 범위, 더욱 바람직하게는 80%의 범위로 히드로포빈의 생물학적 특성, 특히 단백질로 유리 표면을 코팅하기 전후에 물방울의 접촉각이 20° 이상, 바람직하게는 25° 이상, 특히 30° 이상이 증가하도록 상기 단백질을 이용하여 코팅함으로써 바뀌는 표면 특성 또한 만족하는 단백질 또는 히드로포빈 융합 단백질일 수 있다.

놀랍게도, 히드로포빈 또는 이의 유도체를 소포제로 사용하는 경우 양호한 결과를 가져온다는 것을 발견하였다.

히드로포빈의 정의에 있어서는, 히드로포빈의 서열 특이성이 아니라 구조 특이성이 중요하다. 성숙한 히드로포빈의 아미노산 서열은 매우 다양하지만, 이들은 모두 매우 특징적인 8개의 보존된 시스테인 잔기 패턴을 가진다. 이러한 잔기는 4개의 분자내 디설피드 가교 결합을 형성한다.

N 말단 및 C 말단은 비교적 넓은 범위에 걸쳐 가변적이다. 여기서 당업자에게 공지된 분자 생물학 기술에 의해 길이가 10∼500 아미노산을 가지는 단백질을 융합 파트너 상에 첨가할 수 있다.

또한, 히드로포빈 및 이의 유도체는 또한 유사한 구조 및 기능적 등가물을 갖는 단백질을 의미하는 것으로 본 발명에서 해석되고 있다.

이하, 본 발명에 있어서, 용어 "히드로포빈"은 하기 화학식 I의 폴리펩티드를 의미하는 것으로 해석해야 한다:

X_n-C¹-X_1-50-C²-X_0-5-C³-X_1-100-C⁴-X_1-100-C⁵-X_1-50-C⁶-X_0-5-C⁷-X_1-50-C⁸-X_m

상기 식에서, X는 20개의 천연 아미노산(Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, Ile Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly) 중 어느 하나일 수 있다. 상기 식에서, X는 각 경우에서 동일하거나 상이할 수 있다. X 다음에 표시된 지수는 각각 아미노산의 수이고, C는 시스테인, 알라닌, 세린, 글리신, 메티오닌 또는 트레오닌(여기서 C로 표시된 잔기 중 4개 이상은 시스테인임)이며, 지수 n 및 m은 각각 독립적으로 0 내지 500, 바람직하게는 15와 300 사이의 자연수이다.

화학식 I의 폴리펩티드는 또한 실온에서 유리 표면의 코팅 후 각 경우에 비코팅된 유리 표면 상에서 동일한 크기의 물방울의 접촉각과 비교하였을 때 물방울의 접촉각을 20° 이상, 바람직하게는 25° 이상, 더욱 바람직하게는 30° 로 증가시키는 특성을 갖는 것을 특징으로 한다.

C¹ 내지 C⁸로 표시된 아미노산은 시스테인인 것이 바람직하지만; 이들은 또한 유사한 공간 충전을 갖는 다른 아미노산, 바람직하게는 알라닌, 세린, 트레오닌, 메티오닌 또는 글리신에 의해 치환될 수 있다. 하지만, C¹ 내지 C⁸ 위치 중 4 이상, 바람직하게는 5 이상, 더욱 바람직하게는 6 이상 및 특히 7 이상이 시스테인으로 이루진다. 본 발명의 단백질에 있어서, 시스테인은 환원된 형태로 존재하거나 또는 서로 디설피드 가교 결합을 형성할 수 있다. 특히 1개 이상의 분자내 디설피드 가교 결합, 바람직하게는 2개, 더욱 바람직하게는 3개 및 가장 바람직하게는 4개의 분자내 디설피드 가교 결합을 포함하는, C-C 가교 결합의 분자내 형성이 특히 바람직하다. 상기 기술된 바와 같이 시스테인이 유사한 공간 충전을 갖는 아미노산으로 치환되는 경우, 상기 C 위치가 서로 간에 분자내 디설피드 가교 결합을 형성할 수 있는 쌍대 치환인 것이 유리하다.

시스테인, 세린, 알라닌, 글리신, 메티오닌 또는 트레오닌은 또한 X로 표시된 위치에 사용되는 경우, 상기 화학식에서 각 C 위치의 숫자는 그에 따라 변경될 수 있다.

본 발명을 실행하기 위해 바람직하게는 하기 화학식 II의 히드로포빈을 사용하는 것이 바람직하다:

X_n-C¹-X_3-25-C²-X_0-2-C³-X_5-50-C⁴-X_2-35-C⁵-X_2-15-C⁶-X_0-2-C⁷-X_3-35-C⁸-X_m

상기 식에서, X, C 및 X와 C 다음에 표시된 지수는 각각 상기 정의된 바와 같고, 지수 n 및 m은 각각 0과 300 사이의 수이고, 상기 단백질은 접촉각에서 상기 예시된 변화를 추가 특징으로 하며, C로 표시된 잔기의 6 이상은 시스테인이다. 더욱 바람직하게는, 모든 C 잔기는 시스테인이다.

특히 하기 화학식 III의 히드로포빈을 사용하는 것이 바람직하다:

X_n-C¹-X_5-9-C²-C³-X_11-39-C⁴-X_2-23-C⁵-X_5-9-C⁶-C⁷-X_6-18-C⁸-X_m

상기 식에서, X, C 및 X 다음에 표시된 지수는 각각 상기 정의된 바와 같고, 지수 n 및 m은 각각 0과 200 사이의 수이고, 단백질은 접촉각에서 상기 예시된 변화를 추가 특징으로 한다.

잔기 X_n 및 X_m은 또한 히드로포빈에 자연적으로 연결되는 펩티드 서열일 수 있다. 하지만, 하나 또는 두 잔기 모두 히드로포빈에 자연적으로 연결된 펩티드 서열일 수도 있다. 또한 X_n 및/또는 X_m 잔기는 히드로포빈에서 자연적으로 발생한 펩티드 서열이 히드로포빈에서 자연적으로 발생하지 않는 펩티드 서열에 의해 연장되는 것으로 이해된다.

X_n 및/또는 X_m이 히드로포빈으로 자연적으로 결합되지 않는 펩티드 서열일 경우, 그러한 서열은 통상 아미노산 길이가 20 이상, 바람직하게는 35 이상, 더욱 바람직하게는 50 이상 및 가장 바람직하게는 100 이상이다. 히드로포빈에 자연적으로 연결되지 않는 잔기는 또한 이하에서 융합 파트너로 언급될 것이다. 이것은 단백질이 하나 이상의 히드로포빈 부분 및 자연적으로는 이러한 형태가 함께 발생하지 않는 융합 파트너 부분으로 이루어질 수 있음을 의미한다.

상기 융합 파트너 부분은 복수의 단백질에서 선택될 수 있다. 또한 다수의 융합 파트너를 하나의 히드로포빈 부분에, 예를 들어 히드로포빈 부분의 아미노 말단(X_n) 및 카르복실 말단(X_m)에 연결시키는 것도 가능하다. 하지만, 또한 예를 들어 2개의 융합 파트너를 본 발명의 단백질의 한 위치(X_n 또는 X_m)에 연결시키는 것도 가능 하다.

특히 적당한 융합 파트너는 미생물, 특히 이. 콜라이(E. Coli) 또는 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)에 자연적으로 발생하는 단백질이다. 그러한 융합 파트너의 예는 서열 yaad (서열 번호 15 및 16), yaae (서열 번호 17 및 18), 및 티오레독신이 있다. 또한, 상기 서열의 단지 일부분, 바람직하게는 70∼99%, 더욱 바람직하게는 80∼98%(이때 백분율은 각각 아미노산 수를 기준으로 함)를 포함하거나, 또는 상기 서열과 비교하여 각각의 아미노산 또는 뉴클레오티드가 변경된, 상기 서열의 단편 또는 유도체 역시 매우 적당한다.

히드로포빈 또는 이의 유도체와 같이 본 발명에 따라 사용된 단백질은 또한, 예를 들어 글리코실화, 아세틸화 또는 그 밖에, 예컨대 글루타르알데히드를 이용한 화학적 가교 결합에 의해 그 폴리펩티드 서열이 변형될 수 있다.

본 발명에 따라 사용된 히드로포빈 또는 이의 유도체의 특성 중 하나는 표면을 단백질로 코팅하는 경우 표면 특성이 변화된다는 것이다. 표면 특성의 변화는, 예를 들어 단백질을 이용하여 표면 코팅의 전후에 물방울의 접촉각을 측정하고 두 측정값의 차이를 측정함으로써 실험적으로 측정할 수 있다.

접촉각 측정 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 측정은 실온에서 5 ㎕의 물방울을 기준으로 한다. 접촉각을 측정하기 위한 적당한 방법의 예를 위한 정확한 실험 조건은 실험 부문에서 기술한다. 그 부분에 언급된 조건 하에, 본 발명에 따라 사용된 단백질은 각 경우에 비코팅된 유리 표면 상의 동일한 크기의 물방울의 접촉각과 비교하였을 때 20° 이상, 바람직하게는 25° 이상, 더욱 바람직하게는 30° 이상이 증가되는 특성을 갖는다.

지금까지 공지된 히드로포빈 또는 이의 유도체의 히드로포빈 부분에 있어서, 극성 및 비극성 아미노산의 위치는 보존되어 있어서, 특징적인 소수성 플롯을 형성한다. 생물물리학적 특성 및 소수성에 있어서의 차이점은 지금까지 공지된 히드로포빈의 두 부류, 즉 I형 및 II형으로 나누어져 있다(Wessels et al, 1994, Ann. Rev. Phytopathol., 32, 413-437).

I형 히드로포빈으로 이루어져 조립된 막은 (고온에서 1% 도데실황산나트륨(SDS)에 대해) 상당히 불용성이며 진한 트리플루오로아세트산(TFA) 또는 포름산에 의해서만 다시 분리될 수 있다. 이와 달리, II형 히드로포빈의 조립 형태는 덜 안정적이다. 이들은 60% 에탄올 또는 1% SDS(실온에서)에 의해 거의 다시 용해될 수 있다.

아미노산 서열의 비교는 II형 히드로포빈에서 시스테인 C³ 및 C⁴ 사이의 길이가 I형 히드로포빈에서보다 확실히 더 짧다는 것을 제시하고 있다. 또한 II형 히드로포빈은 I형보다 하전된 아미노산을 더 많이 갖는다.

본 발명을 수행하기 위해 특히 바람직한 히드로포빈은 dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basf1, basf2 유형의 히드로포빈이며, 이들은 하기 서열 목록에서 구조적 특징이 제시된다. 또한 이들은 단지 그 일부분 또는 이의 유도체일 수도 있다. 또한 동일하거나 상이한 구조의 다수의 히드로포빈 부분, 바람직하게는 2개 또는 3개의 히드로포빈을 서로, 또, 히드로포빈에 자연적으로 연결되지 않는 적당한 해당 폴리펩티드 서열에 연결하는 것도 가능하다.

본 발명에 따라 특히 적당한 것은 서열 번호 20, 22, 24에 제시된 폴리펩티드 서열을 가지는 융합 단백질과, 또한 이것을 암호화하는 핵산 서열, 구체적으로 서열 번호 19, 21, 23에 따른 서열이다. 특히 바람직한 구체예는, 서열 번호 20, 22 또는 24에 제시된 폴리펩티드 서열로부터 출발하여, 전체 아미노산 중 1개 이상, 최대 10개, 바람직하게는 5개, 더욱 바람직하게는 5%가 치환, 삽입 또는 결실되어 있으나 여전히 출발 단백질의 생물학적 특성의 50% 이상을 갖는 단백질을 또한 포함한다. 본 발명에 있어서, 상기 단백질의 생물학적 특성은 상기 접촉각의 변화가 이미 기술된 20° 이상인 것을 의미한다.

적당한 융합 파트너는 표면을 코팅하여 세정제 처리에 대해 동시에 내성일 수 있는 융합 단백질을 유도하는 단백질이다. 융합 파트너의 예는, 예를 들어 이. 콜라이 및 티오레독신에서 yaad 및 yaae이다.

이러한 방식으로 생성된 융합 단백질은 기능적으로 이미 활성이 있으며, 문헌에 기술된 바와 같이, 히드로포빈은 용해되어 트리플루오로아세트산 또는 포름산 처리에 의해 활성화되어야 하는 것은 아님을 발견하였다. 이러한 융합 단백질을 포함하거나, 또는 융합 단백질의 분해 후, 히드로포빈만을 포함하는 용액은 바로 표면을 코팅하는데 적당하다.

C 또는 N 말단에서 친화력 태그(예, His₆, HA, 칼모듈린-BD, GST, MBD, 키틴-BD, 스트렙타비딘-BD-아비 태그, 플래그(Flag)-태그, T7 등)와의 융합은 신속하고 효율적인 정제에 유리한 것으로 밝혀졌다. 해당 표준 프로토콜은 친화력 태그의 시 판 중인 보충제에서 얻을 수 있다.

히드로포빈과 융합 파트너 또는 융합 파트너들 사이의 분해 위치를 사용하여 (예컨대, 메티오닌에서 BrCN 분해, 인자 Xa 분해, 엔테로키나제 분해, 트롬빈 분해, TEV 분해 등에 의해) 비유도화된 형태로 순수한 히드로포빈을 방출할 수 있다.

또한 하나의 융합 파트너, 예컨대 yaad 또는 yaae, 및 복수의 히드로포빈, 또는 상이한 서열, 예를 들어 DewA-RodA 또는 Sc3-DewA, Sc3-RodA로부터 연달아 융합 단백질을 발생시키는 것이 가능하다. 최대 70% 동일한 뮤테인 또는 히드로포빈 단편(예, N 또는 C 말단 절단)을 사용하는 것이 동일하게 가능하다. 최적의 구성체는 각 경우에 있어서 특정 용도, 즉 소포될 연료와 관련하여 선택된다.

본 발명에 따라 사용되거나 또는 본 발명의 조성물에 존재하는 폴리펩티드는 통상의 펩티드 합성 기법, 예를 들어 메리필드(Merrifield) 고상 합성법으로 화학적으로 제조될 수 있다.

천연 히드로포빈은 적당한 방법에 의해 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다. 이에 관해서는 예를 들어 문헌[Woesten et. al., Eur. J Cell Bio. 63, 122-129 (1994)] 또는 WO 96/41882를 참조할 수 있다.

바람직하게는 융합 단백질은, 융합 파트너를 암호화하는 1개의 핵산 서열, 특히 DNA 서열과, 히드로포빈 부분을 암호화하는 1개의 핵산 서열, 특히 DNA 서열을 조합하여, 조합된 핵산 서열의 유전자 발현에 의해 숙주 유기체에서 목적하는 단백질이 발생되도록 하는 유전 공학 기법으로 제조할수 있다. 이러한 제조 방법은, 예를 들어 DE 102005007480.4에 개시되어 있다.

언급된 제조 방법에 적당한 숙주 유기체(생산 유기체)로는 원핵 생물(고세균 포함) 또는 진핵 생물, 특히 호염성 박테리아 및 메탄 생성균(methanococcia)을 비롯한 박테리아, 진균류, 곤충 세포, 식물 세포 및 포유동물 세포, 더욱 바람직하게는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 섭틸리스, 바실러스 메가테륨(Bacillus megaterium), 아스퍼질러스 오리지(Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 락토바실러스(lactobacilli), 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha), 트리코더마 레세이(Trichoderma reesei), SF9 (또는 관련 세포) 등을 들 수 있다.

이러한 방법에 있어서는, 조절 핵산 서열의 유전적 제어 하에, 본 발명에 따라 사용된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구성체와, 또한 상기 발현 구성체 중 하나 이상을 포함하는 벡터를 사용한다.

사용된 구성체는 특정 암호화 서열의 5' 상류의 프로모터와 특정 암호화 서열의 3' 하류의 종결 서열, 및 적당한 경우, 각각 암호화 서열에 작동 가능하게 연결된 통상적인 추가 조절 요소를 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, "작동 가능한 연결"이란 각각의 조절 요소가 암호화 서열을 발현하는데 필요한 기능을 충족할 수 있도록, 프로모터, 암호화 서열, 종결 서열 및, 적당한 경우, 추가 조절 요소가 순차적으로 배열되어 있는 것을 의미한다.

작동 가능하게 연결할 수 있는 서열의 예로는 표적화 서열, 및 또한 인헨서, 폴리아데닐화 신호 등이 있다. 추가의 조절 요소는 선별 마커, 증폭 신호, 복제 기 점 등을 포함한다. 적당한 조절 서열은, 예를 들어 문헌[Goeddel, Gene Expression Technology : Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 기술되어 있다.

상기 조절 서열 이외에, 실질적 구조의 유전자의 상류에 상기 서열의 천연 조절 요소가 존재할 수도 있고, 적당한 경우, 천연 조절 요소가 차단되어 유전자의 발현을 증가될 수 있도록 천연 조절 요소를 유전적으로 변형시킬 수 있다.

바람직한 핵산 구성체는 또한 프로모터에 작용적으로 연결되어 있고 핵산 서열의 발현을 증가시킬 수 있는 하나 이상의 언급된 "인헨서" 서열을 포함하는 것이 유리하다. 추가적인 조절 요소 또는 종결 서열 등의 유리한 추가 서열을 DNA 서열의 3' 말단에 삽입시킬 수도 있다.

핵산은 하나 이상의 카피가 구성체 내에 존재할 수 있다. 또한 이것은, 적당한 경우, 상기 구성체의 선별을 위한 추가적인 마커, 예컨대 항생제 내성 또는 구성체 내에 존재하는 영양 요구성 보완 유전자일 수 있다.

제조에 유리한 조절 서열은, 예를 들어 cos, tac, trp, tet, trp-tet, Ipp, lac, Ipp-lac, laclq-T7, T5, T3, gal-, trc, ara, rhaP(rhaPBAD) SP6, lambda-PR 또는 imlambda-P 프로모터 등의 프로모터에 존재하고, 상기 프로모터는 그램 음성 박테리아에 유리하게 사용된다. 또한 유리한 조절 서열은, 예를 들어 그램 양성 프로모터 amy 및 SPO2, 효모 또는 진균류 프로모터 ADC1, MF알파, AC, p-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH에 존재한다.

또한 조절을 위해 합성 프로모터를 사용하는 것도 가능하다.

숙주 유기체에서 발현시키는 경우, 숙주에서의 유전자의 최적의 발현을 가능하게 하는 벡터, 예를 들어 플라스미드 또는 파지에 핵산 구성체를 삽입시키는 것이 바람직하다. 플라스미드 및 파지와는 별개로, 벡터는 또한 당업자에게 공지된 모든 다른 벡터, 예를 들어 SV4O, CMV, 베큘로바이러스 및 아데노바이러스와 같은 바이러스, 트랜스포존, IS 엘리먼트, 파지미드, 코스미드 및 선형 또는 환형 DNA와 또한 아그로박테라아 시스템을 의미하는 것으로 이해된다.

이러한 벡터는 숙주 유기체에서 자율적으로 또는 염색체를 통해 복제할 수 있다. 적당한 플라스미드, 예를 들어 이. 콜라이용 플라스미드, 즉 pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III"3-B1, tgt11 또는 pBdCl, 스트렙토마이세스용 플라스미드, 즉 pIJ101, pIJ364, pIJ702 또는 pIJ361, 바실러스용 플라스미드, 즉 pUB110, pC194 또는 pBD214, 코리네박테리아용 플라스미드, 즉 pSA77 또는 pAJ667, 진균용 플라스미드, 즉 pALS1, pIL2 또는 pBB116, 효모용 플라스미드, 즉 2알파, pAG-1, YEp6, YEp13 또는 pEMBLYe23 또는 식물용 플라스미드, 즉 pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 또는 pDH51이 있다. 언급한 플라스미드는 가능한 플라스미드 중 적은 부분으로 이루어 진다. 또한 플라스미드는 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018)]에서 찾아볼 수 있다.

유리하게는, 핵산 구성체는 존재하는 추가 유전자를 발현시키기 위해 숙주 유기체 및 유전자(들)의 선택에 따라 최적의 발현을 위해 선택되는, 발현의 증가를 위한 3' 말단 및/또는 5' 말단의 조절 서열을 추가로 포함한다.

이러한 조절 서열들은 유전자 및 단백질의 발현이 제어될 수 있도록 한다. 숙주 유기체에 따라, 이것은, 예를 들어 유전자가 유도 후에만 발현 또는 과발현되는 것, 또는 유전자가 즉시 발현 및/또는 과발현되는 것을 의미할 수 있다.

조절 서열 또는 인자는 바람직하게는 긍정적으로 영향을 받아서 도입된 유전자의 유전자 발현이 증가될 수 있다. 따라서, 조절 요소는 프로모터 및/또는 인헨서 등의 강력한 전사 신호를 이용하여 전사 수준을 증가시키는 것이 바람직할 수 있다. 추가로, 또한 예를 들어 mRNA의 안정성을 향상시킴으로써 번역을 증가시키는 것도 가능하다.

벡터의 추가 구체예에 있어서, 핵산 구성체 또는 핵산을 포함하는 벡터를 선형 DNA의 형태로 미생물에 도입하여 이종성 또는 상동성 재조합에 의해 숙주 유기체의 게놈으로 통합되도록 하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 선형 DNA는 플라스미드와 같은 선형화된 벡터로 이루어지거나 핵산 구성체 또는 핵산으로만 이루어질 수 있다.

유기체에서의 이종성 유전자의 최적의 발현을 위해서는, 그 유기체에 사용된느 특정 "코돈 이용 방식"에 따라 핵산 서열을 변형시키는 것이 바람직하다. "코돈 이용 방식"은 해당 유기체의 다른 공지된 유전자의 컴퓨터 평가를 이용하여 용이하게 결정될 수 있다.

적당한 암호화 뉴클레오티드 서열 및 종결 신호 또는 폴리아데닐화 신호에 적당한 프로모터를 융합하여 발현 카세트를 제조한다. 이를 위해, 예를 들어, 문 헌[T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NV (1989)], 문헌[T. J. Silhavy, M. L. Berman and L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)] 및 문헌[Ausubel, F, M, et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greens Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987)]에 기술된 바와 같은 통상적인 재조합 및 클로닝 기법을 사용한다.

적당한 숙주 유기체에서의 발현을 위해서는, 재조합 핵산 구성체 또는 유전자 구성체를, 그 숙주에서의 유전자의 최적 발현을 가능하게 하는 숙주 특이적 벡터에 삽입시키는 것이 유리하다. 벡터는 당업자에게 잘 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌["Cloning Vectors" (Pouwels P. H, et al., eds., Elsevier, Amsterdam-New York-0xford, 1985)]에서 정보를 입수할 수 있다.

벡터를 이용하여, 예를 들어 하나 이상의 벡터로 형질전환되고 본 발명에 따라 사용되는 히드로포빈 또는 이의 유도체의 제조에 이용될 수 있는 재조합 미생물을 제조할 수 있다. 바람직하게는, 상기 기술된 재조합 구성체를 적당한 숙주 시스템에 도입하여 발현시킨다. 이와 관련하여, 언급된 핵산이 특정 발현 시스템에서 발현되도록 하기 위해, 당업자에게 공지되어 있는 클로닝 방법 및 형질감염 방법, 예를 들어 공침전법, 원형질 융합법, 전기천공법, 레트로바이러스 형질감염법 등을 이용하는 것이 바람직하다. 적당한 시스템은, 예를 들어 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., ed., Wiley Interscience, New York 1997], 또는 문헌[Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]에 기술되어 있다.

또한 상동성 재조합 미생물을 제조할 수도 있다. 이를 위해, 사용될 유전자의 적어도 일부분, 또는 서열을 변형시키기 위해, 예를 들어 기능적으로 파괴하기 위해("넉아웃" 벡터), 적당한 경우, 하나 이상의 아미노산 결실, 아미노산 추가 또는 아미노산 치환이 도입되는 암호화 서열의 적어도 일부분을 포함하는 벡터를 제조한다. 도입된 서열은, 예를 들어 관련 미생물 유래의 동족체이거나, 포유동물, 효모 또는 곤충 기원에서 유래된 것일 수도 있다. 대안적으로, 상동성 재조합에 사용된 벡터는, 상동성 재조합의 경우, 내생적 유전자가 돌연변이되거나 다른 방식으로 변경되지만, 여전히 작용성 단백질을 암호화하도록 구성될 수 있다(예를 들어, 내생적 단백질의 발현이 변화되도록 상류 조절 영역을 변경할 수 있다).본 발명에 따라 사용된 유전자의 변경된 부분은 상동성 재조합 벡터 내에 존재한다. 상동성 재조합에 적당한 벡터의 구성은, 예를 들어 문헌[Thomas, K. R. and Capecchi, M. R. (1987) Cell 51 : 503]에 기술되어 있다.

원칙적으로, 상기 핵산 또는 상기 핵산 구성체에 적당한 재조합 숙주 유기체는 모든 원핵 또는 진핵 유기체가 유용하다. 바람직하게는, 사용되는 숙주 유기체는 미생물, 예컨대 박테리아, 진균류 또는 효모이다. 바람직하게는, 그램 양성 또는 그램 음성 박테리아를 사용하고, 바람직하게는 장내세균(Enterobacteriaceae) 과, 슈도모나스과(Pseudomonadaceae) 과, 리조비아(Rhizobiaceae) 과, 스트렙토마 이세스(Streptomycetaceae) 과 또는 노카디아( Nocardiaceae) 과 박테리아를 사용하는 것이 바람직하고, 에스케리키아 속, 슈도모나스 속, 스트렙토마이세스 속, 노카디아 속, 부르크홀더리아(Burkholderia) 속, 살모넬라(Salmonella) 속, 아그로박테리아(Agrobacterium) 속 또는 로도코쿠스(Rhodococcus) 속의 박테리아를 사용하는 것이 더욱 바람직하다.

상기 기술된 융합 단백질의 제조 방법에서 사용된 유기체는, 숙주 유기체에 따라, 당업자에게 공지된 방법으로 생육 또는 배양된다. 미생물은 통상, 일반적으로 당 형태의 탄소원, 일반적으로 유기 질소원 형태의 질소원, 예컨대 효모 추출물 또는 염, 예컨대 황산암모늄 염, 미량 원소의 염, 예를 들어 철염, 망간염 및 마그네슘 염과, 또한 적당한 경우, 비타민을 포함하는 액체 배지에서, 산소를 공급하면서, 0℃∼100℃, 바람직하게는 10∼60℃의 온도에서 배양된다. 영양 액체의 pH는 고정값으로 유지할 수 있으며, 즉 배양 도중에 조절하거나 또는 조절하지 않을 수도 있다. 배양은 뱃치식, 반뱃치식 또는 연속식으로 실시할 수 있다. 영양분은 발효 초반부에 공급하거나 반연속식 또는 연속식으로 공급할 수 있다. 효소는 실시예에 기술된 방법에 의해 유기체에서 분리하거나, 미정제 추출물로서 반응에 사용할 수 있다.

폴리펩티드 생산 미생물을 배양하고, 적당한 경우, 단백질의 발현을 유도하며 상기를 배양물로부터 분리하여, 본 발명에 따라 사용된 단백질, 이의 작용성, 생물학적 활성 단편을 재조합 방식으로 제조하는 방법에 의해 제조할 수 있다. 또한 상기 단백질은 상기 방식으로 필요에 따라 공업 규모로 제조할 수도 있다. 재조합 미생물은 기존의 방법에 의해 배양 또는 발효될 수 있다. 박테리아는, 예를 들어 TB 배지 또는 LB 배지에서 온도 20∼40℃ 및 pH 6∼9에서 증폭시킬 수 있다. 적당한 배양 조건은, 예를 들어 문헌[T. Maniatis, E. F, Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)]에 상세하게 기재되어 있다.

단백질이 배양 배지로 분비되지 않는 경우, 세포를 파괴하고 공지된 단백질 분리 방법으로 용해물로부터 생성물을 얻는다. 필요에 따라, 세포는 고주파 초음파를 이용하거나, 예를 들어 프랜치 압력 셀에서와 같이 고압을 이용하거나, 삼투압 분해를 이용하거나, 계면활성제, 용해성 효소 또는 유기 용매의 작용에 의하거나, 균질화기를 이용하거나 또는 상기 방법 중 복수의 방법을 병용하여 파괴할 수 있다.

단백질은 분자체 크로마토그래피(겔 여과), 예컨대 Q 세파로스 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 크로마토그래피 등의 공지된 크로마토그래피 방법을 이용하고, 또한 한외여과, 결정화, 염석, 투석 및 네이티브(native) 겔 전기영동법 등의 기타 통상적인 방법을 이용하여 정제할 수 있다. 적당한 방법은, 예를 들어 문헌[Cooper, F. G., Biochemische Albeitsrnethoden [Biochemical Techniques], Verlag Walter do Gruyter, Berlin, New York], 또는 문헌[Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin]에 기술되어 있다.

cDNA를 특정 뉴클레오티드 서열만큼 연장함으로써, 변경된 폴리펩티드 또는 융합 단백질(이는 예를 들어 정제를 간소화하는데 이용됨)을 암호화하는 벡터 시스템 또는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 재조합 단백질을 분리하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 적당한 변형은 앵커로 작용하는 소위 "태그", 예컨대 6-히스티딘 앵커로 공지된 변형, 또는 항체의 항원으로 인식될 수 있는 에피토프를 포함한다(참고 문헌: Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (N.Y.) Press]. 적당한 다른 태그는, 예를 들어 HA, 칼모듈린-BD, GST, MBD; 키틴-BD, 스트렙타비딘-BD-아비 태그, 플래그-태그, T7 등이 있다. 이렇나 앵커들은, 예를 들어 크로마토그래피 컬럼에 도입될 수 있거나, 또는 미량적정 평판 또는 또다른 지지체 상에서 이용될 수 있는, 중합체 매트릭스 등의 고체 지지체에 단백질을 부착시키는데 이용될 수 있다. 해당 정제 프로토콜은 시판되는 친화성 태그 공급업자로부터 입수할 수 있다.

기술된 바와 같이 제조된 단백질은 융합 단백질로 바로 사용되거나 또는 융합 파트너 부분을 절단 및 제거한 후 "순수한" 히드로포빈으로서 이용할 수 있다.

융합 파트너 부분을 제거하고자 하는 경우, 히드로포빈 부분과 융합 파트너 부분 사이의 융합 단백질에 잠재적 분해 부위(프로테아제에 대한 특이적 인식 부위)를 포함시키는 것이 바람직하다. 적당한 분해 부위는 특히 생물정보학 도구를 이용하여 용이하게 결정할 수 있는, 히드로포빈 부분에도 융합 파트너 부분에도 존재하지 않는 펩티드 서열을 포함한다. 특히 적당한 것은, 예를 들어 메티오닌에 대한 BrCN 분해, 또는 인자 Xa 분해를 이용한 프로테아제 매개 분해, 엔테로키나제 분해, 트롬빈 분해 또는 TEV (담배 식각 바이러스 프로테아제) 분해이다.

본 발명에 있어서, 연료는 내부 연소 엔진을 조작하는데 사용되는 협의의 연료와, 통상의 연료를 모두 의미하는 것으로 이해된다.

적당한 연료는 중간 증류물 및 가솔린 연료이다. 하지만, 중간 증류물을 사용하는 것이 바람직하다.

적당한 증간 증류물은 120∼150℃의 범위에서 비등하는 것이고, 예를 들어 디젤 연료, 켈센 및 가열 오일에서 선택된다. 바람직한 중간 증류물은 디젤 연료이다.

디젤 연료는, 예를 들어 통상적으로 100∼400℃의 범위에서 비등하는 미정제 오일 라피네이트이다. 일반적으로 최대 360℃ 이상에서 95% 포인트인 증류물이다. 하지만, 이들은 또한 예를 들어 345℃ 이하에서 95% 포인트이고 황 함량은 0.005 중량% 이하이거나, 또는 예를 들어 285℃에서 95% 포인트이고 황 함량은 0.001 중량% 이하를 특징으로 하는 "초저 황 디젤" 또는 "시티 디젤"일 수 있다. 정제에 의해 얻을 수 있는 디젤 연료 이외에, 석탄 기화 또는 가스 액화에 의해 얻을 수 있는 것("가스 액화"(GTL) 연료)이 적당하다. 또한 상기 언급된 디젤 연료와 갱신가능한 연료, 에컨대 바이오디젤 또는 바이오에탄올의 혼합물도 적당하다.

디젤 연료는 황 함량이 낮은 것, 즉 황 함량이 0.05 중량% 미만, 바람직하게는 0.02 중량% 미만, 특히 0.005 중량% 미만, 특히 0.001 중량% 미만인 것이 더욱 바람직하다. 가열 오일은 또한 황 함량이 낮은 것, 예를 들어 황 함량이 0.1 중량% 이하, 바람직하게는 0.05 중량% 이하, 더욱 바람직하게는 0.005 중량% 이하, 특히 0.001 중량% 이하인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명에 따르면, 디젤 연료에 소포제로 히드로포빈 또는 이의 유도체를 사용하는 것이 바람직하다.

추가 구체예에 있어서, 본 발명은 따라서 상기 기술된 하나 이상의 히드로포빈 또는 이의 유도체의 소포제로서의 용도(이때, 상기 연료는 디젤 연료임)에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 하나 이상의 히드로포빈 또는 이의 유도체는 바람직하게는 연료를 기준으로 0.01∼100 ppm, 바람직하게는 0.15∼50 ppm, 더욱 바람직하게는 0.2∼30 ppm 또는 0.3∼10 ppm의 양을 사용한다.

본 발명에 있어서, 단위 ppm은 kg 당 mg을 의미한다.

추가의 구체예에 있어서, 본 발명은 따라서 상기 기술된 하나 이상의 히드로포빈 또는 이의 유도체의 소포제로서의 용도(이때, 하나 이상의 히드로포빈 또는 이의 유도체는 연료를 기준으로 0.1∼100 ppm의 양을 사용함)에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 연료, 특히 디젤 연료는, 하나 이상의 히드로포빈 또는 이의 유도체를 첨가함으로써 소포될 수 있다.

본 발명은 따라서 하나 이상의 히드로포빈 또는 이의 유도체를 연료에 첨가하는 단계를 포함하는 연료의 소포 방법에 관한 것이다.

추가의 구체예에 있어서, 본 발명은 상기 언급된 바와 같이 연료를 소포시키는 방법(이때, 연료는 디젤 연료임)에 관한 것이다.

추가의 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명은 상기 언급된 바와 같이 연료를 소포시키는 방법(이때, 하나 이상의 히드로포빈 또는 이의 유도체는 연료를 기준으 로 0.1∼100 ppm의 양이 사용됨)에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 하나 이상의 히드로포빈 또는 이의 유도체를 연료 또는 연료 조성물에 바로 첨가하거나 또는 첨가제 조성물의 형태로 첨가하는 것이 가능하다.

본 발명은 또한 하나 이상의 추가 연료 첨가제 이외에 하나 이상의 히드로포빈 또는 이의 유도체를 포함하는 첨가제 조성물에 관한 것이다. 마찬가지로 본 발명은 하나 이상의 히드로포빈 또는 이의 유도체 및 하나 이상의 추가 연료 첨가제를 포함하는 연료 조성물에 관한 것이다.

추가 구체예에 있어서, 본 발명은 따라서 하나 이상의 히드로포빈 또는 이의 유도체 및 하나 이상의 추가 연료 첨가제를 포함하는 추가 조성물에 관한 것이다.

추가 구체예에 있어서, 본 발명은 마찬가지로 주 성분으로서 하나 이상의 연료 이외에 하나 이상의 히드로포빈 또는 이의 유도체 및 하나 이상의 추가 연료 첨가제를 포함하는 연료 조성물에 관한 것이다.

첨가제 조성물 또는 연료는, 하나 이상의 히드로포빈 또는 이의 유도체 이외에, 하나 이상의 추가 연료 첨가제, 특히 하나 이상의 계면활성제 및/또는 항유화제를 포함한다. 적당한 계면활성제 첨가제 및 항유화제는 하기에 열거한다. 첨가제 조성물 및 연료는 또한 대신 또는 추가로 다양한 연료 첨가제, 예를 들어 담체유, 부식 억제제, 산화방지제, 정전기 방지제, 염료 마커 등을 포함할 수 있다. 하지만, 첨가제 조성물 또는 연료는 바람직하게는 하나 이상의 계면활성제 및/또는 항유화제 및, 적당한 경우, 추가의 상이한 연료 첨가제를 포함한다.

추가의 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명은 따라서 상기 기술된 첨가제 조성물 또는 연료 조성물에 관한 것이며, 이때 조성물은 하나 이상의 계면활성제를 포함한다. 추가의 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명은 마찬가지로 상기 기술된 첨가제 조성물 또는 연료 조성물에 관한 것이며, 이때 조성물은 하나 이상의 항유화제를 포함한다.

적당한 계면활성 첨가제는 이하 실시예에서 열거된다.

계면활성 첨가제는 바람직하게는 수평균 분자량(Mn)이 85∼20,000이고 하기 (a) 내지 (i)에서 선택된 하나 이상의 극성 부분을 갖는 하나 이상의 소수성 히드로카르빌 라디칼을 갖는 양친매성 물질이다:

(a) 질소 원자가 최대 6개이고, 하나 이상의 질소 원자가 염기성을 갖는 모노아미노기 또는 폴리아미노기;

(b) 적당한 경우 히드록실기를 갖는 니트로기;

(c) 하나 이상의 질소 원자가 염기성이고, 모노아미노기 또는 폴리아미노기를 갖는 히드록실기;

(d) 카르복실기 또는 이의 알칼리 금속 또는 이의 알칼리 토금속 염;

(e) 설폰산기 또는 이의 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염;

(f) 하나 이상의 질소 원자가 염기성이고, 히드록실기, 모노아미노기 또는 폴리아미노기가 말단에 있거나 또는 카르바메이트기가 말단에 있는 폴리옥시-C₂- 내지 -C₄-알킬렌 기;

(g) 카르복실계 에스테르기;

(h) 숙신산 무수물에서 유도되고 히드록실 및/또는 아미노 및/또는 아미도 및/또는 이미도 기를 갖는 부분; 및/또는

(i) 치환된 페놀과 알데히드 및 모노아민 또는 폴리아민의 Mannich 반응에 의해 얻어진 부분.

연료에서 충분한 용해성을 보장하는 상기 계면활성 첨가제에서 소수성 히드로카르빌 라디칼은 85∼20000, 특히 113∼10000, 특히 300∼5000의 수평균 분자량(Mn)을 갖는다. 특히 극성 부분 (a), (c), (h) 및 (i)와 함께 통상적인 소수성 히드로카르빌 라디칼은 폴리프로페닐, 폴리부테닐 및 폴리이소부테닐 라디칼을 포함하고 각각 Mn은 300∼5000, 특히 500∼2500, 특히 700∼2300을 갖는다.

상기 계면활성 첨가제 군의 예는 하기를 포함한다:

모노아미노기 또는 폴리아미노기(a)를 포함하는 첨가제는 폴리프로펜 또는 Mn이 300∼5000인 통상적인 (즉, 주로 내부 이중 결합을 가짐) 폴리부텐 또는 폴리이소부텐을 주성분으로 하는 폴리알킬렌모노아민 또는 폴리알킬렌폴리아민이 바람직하다. (통상 베타 및 감마 위치에서) 주로 내부 이중 결합을 갖는 폴리부텐 또는 폴리이소부텐은 첨가제의 제조시 출발 재료로 사용되고, 가능한 제조 경로는 염소화 및 후속 아민화에 의해 또는 공기 또는 오존을 이용하여 이중 결합을 산화시켜 카르보닐 또는 카르복실 화합물을 얻은 후 환원(수소화) 조건 하에서 아민화시킨다. 아민화를 위해 여기서 사용된 아민은, 예를 들어 암모니아, 모노아민 또는 폴리아민, 예컨대 디메틸아미노프로필아민, 에틸렌디아민, 디에틸렌트리아민, 트리에 틸렌테트라민 또는 테트라에틸렌펜타민일 수 있다. 폴리프로펜을 주성분으로 하는 해당 첨가제는 특히 WO 94/24231에 기술되어 있다.

모노아민기(a)를 포함하는 추가의 바람직한 첨가제는 특히 WO 97/03946에 기술된 바와 같이 평균 중합도 P가 5∼100인 폴리이소부텐과 산화질소 또는 산화질소 및 산소의 혼합물의 반응 생성물의 수소화 산물이다.

모노아미노기(a)를 포함하는 추가의 바람직한 첨가제는 특히 DE-A 196 20 262에 기술된 바와 같이 아민과의 반응 후 탈수 그리고 아미노 알콜의 환원에 의해 폴리이소부텐 에폭사이드에서 얻을 수 있는 화합물이다.

적당한 경우 히드록실기와 함께, 니트로기(b)를 포함하는 첨가제는 바람직하게는 특히 WO 96/03367 및 WO 96/03479에 기술된 바와 같이 평균 중합도 P가 5∼100 또는 10∼100인 폴리이소부텐과 산화질소 또는 산화질소 및 산소의 혼합물의 반응 생성물이다. 이 반응 생성물은 일반적으로 혼합된 히드록시니트로폴리이소부텐(예, α-니트로-β-히드록시폴리이소부텐)과 순수한 니트로폴리이소부텐(예, α,β-디니트로폴리이소부텐)의 혼합물이다.

모노아미노기 또는 폴리아미노기(c)와 함께 히드록실기를 포함하는 첨가제는 특히 EP-A 476 485에 기술된 바와 같이 특히 바람직하게는 주로 말단에 이중 결합을 갖고 Mn이 300∼5000인 폴리이소부텐에서 얻을 수 있는 폴리이소부텐 에폭사이드와 암모니아 또는 모노아민 또는 폴리아민의 반응 생성물이다.

카르복실기 또는 이의 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염(d)을 포함하는 첨 가제는 바람직하게는 몰질량이 500∼20,000인, 말레산 무수물과 C₂-C₄₀-올레핀의 공중합체이고 카르복실기 중 일부 또는 모두 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염으로 전환되며 카르복실기 중 임의의 잔기는 알콜 또는 아민과 반응하였다. 상기 첨가제는 특히 EP-A 307 815에 개시되어 있다. 상기 첨가제는 주로 WO 87/01126에 기술된 바와 같이, 밸브 시트 마모를 방지하기 위해 제공되며 폴리(이소)부텐아민 또는 폴리에테르아민 등의 일반적인 연료 계면활성제와 함께 사용하는 것이 바람직할 수 있다.

설폰산기 또는 이의 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염(e)을 포함하는 첨가제는 바람직하게는 특히 EP-A 639 032에 기술된 바와 같이, 알킬 설포숙시네이트의 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염이다. 상기 첨가제는 주로 밸브 시트 마모를 방지하기 위해 제공되며 폴리(이소)부텐아민 또는 폴리에테르아민 등의 일반적인 연료 계면활성제와 함께 사용하는 것이 바람직할 수 있다.

폴리옥시-C₂-C₄-알킬렌 부분(f)을 포함하는 첨가제는 바람직하게는 폴리에테르아민의 경우 C₂- 내지 C₆₀-알칸올, C₆- 내지 C₃₀-알칸디올, 모노- 또는 디-C₂-C₃₀-알킬아민, C₁-C₃₀-알킬시클로헥산올 또는 C₁-C₃₀-알킬페놀과 히드록실기 또는 아미노기 당 산화에틸렌 및/또는 산화프로필렌 및/또는 산화부틸렌 1 내지 30 몰을 반응시킨 후, 암모니아, 모노아민 또는 폴리아민과 환원성 아민화함으로써 얻을 수 있는 폴리에테르 또는 폴리에테르아민이다. 상기 생성물은 특히 EP-A 310 875, EP-A 356 725, EP-A 700 985 및 US 4 877 416에 기술되어 있다. 폴리에테르의 경우, 상기 생 성물은 또한 담체유 특성을 갖는다. 이의 통상적 예는 트리데칸올 부톡실레이트, 이소트리데칸올 부톡실레이트, 이소노닐페놀 부톡실레이트 및 폴리이소부텐올 부톡실레이트 및 프로폭실레이트이며 또한 해당 반응은 암모니아를 생성한다.

카르복실계 에스테르기(g)를 포함하는 첨가제는 특히 DE-A 38 38 918에 기술된 바와 같이 바람직하게는 장쇄 알칸올 또는 폴리올을 갖는 모노카르복실산, 디카르복실산 또는 트리카르복실산의 에스테르이며, 특히 이는 100℃에서 최소 점도가 2 mm²/s이다. 사용된 모노카르복실산, 디카르복실산 또는 트리카르복실산은 지방족 또는 방향족 산일 수 있고, 특히 적당한 에스테르 알콜 또는 에스테르 폴리올은, 예를 들어 탄소 원자가 6 내지 24개인 장쇄가 대표적이다. 통상 대표적인 에스테르는 아디페이트, 프탈레이트, 이소프탈레이트, 테레프탈레이트 및 이소옥탄올, 이소노난올, 이소데칸올 및 이소트리데칸올의 트리멜리테이트이다. 상기 생성물은 또한 담체유 특성을 갖는다.

숙신산 무수물에서 유도되고 히드록실 및/또는 아미노 및/또는 아미도 및/또는 이미도 기를 갖는 부분(h)을 포함하는 첨가제는 바람직하게는 열 경로 또는 염소화된 폴리이소부텐에 의해 Mn이 300∼5000인, 일반적이거나 고반응성 폴리이소부텐과 말레산 무수물을 반응시켜 얻을 수 있는 폴리이소부테닐숙신산 무수물의 상응한 유도체이다. 특히 해당기는 에틸렌디아민, 디에틸렌트리아민, 트리에틸렌테트라민 또는 테트라에틸렌펜타민 등의 지방족 폴리아민을 이용하여 유도체에 부착한다. 히드록실 및/또는 아미노 및/또는 아미도 및/또는 이미도 기를 갖는 부분은, 예를 들어 카르복실산 기, 산 아미드, 아미드 작용 이외에 또한 자유 아민기를 갖는 이아민 또는 폴리아민의 산 아미드, 산 및 아미드 작용을 갖는 숙신산 유도체, 이미드 작용 이외에, 자유 아미노기를 갖는 모노아민을 갖는 카르복시이미드, 디아민 또는 폴리아민을 갖는 카르복시이미드, 및 디아민 또는 폴리아민과 2개의 숙신산 유도체의 반응에 의해 형성된 디이미드이다. 상기 연료 첨가제는 특히 US 4 849 572에 기술되어 있다.

치환된 페놀과 알데히드 및 모노아민 또는 폴리아민의 Mannich 반응에 의해 얻어진 부분(i)을 포함하는 첨가제는 바람직하게는 폴리이소부텐 치환된 페놀과 포름알데히드 및 에틸렌디아민, 디에틸렌트리아민, 트리에틸렌테트라민, 테트라에틸렌펜타민 또는 디메틸아미노프로필아민 등의 모노아민 또는 폴리아민의 반응 생성물이다. 폴리이소부테닐 치환된 페놀은 Mn이 300∼5000인, 일반적이거나 고반응성인 폴리이소부텐에서 유도될 수 있다. 상기 "폴리이소부텐 Mannich 염기"는 특히 EP-A 831 141에 기술되어 있다.

연료 첨가제를 상세하게 개별적으로 더욱 정확하게 정의하기 위해, 본원에는 상기 언급된 종래 기술 문헌이 명확하게 참고인용된다.

(h) 군 유래의 계면활성 첨가제가 특히 바람직하다. 특히 폴리이소부테닐 치환된 숙신이미드, 특히 지방족 폴리아민을 갖는 이미드가 있다.

본 발명에 따른 적당한 항유화제의 예는 다음을 포함한다.

항유화제는 유화액의 탈혼합을 실시하는 물질이다. 이들은 상 경계에 효과적인 이온발생 또는 비이온발생 물질일 수 있다. 따라서, 모든 표면 활성 물질은 특 히 항유화제에 적당하다. 특히 적당한 항유화제는 음이온 활성 화합물, 예컨대 알킬 치환된 페놀 및 나프탈렌설포네이트의 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염 및 지방산의 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염, 및 또한 비하전된 화합물, 예를 들어 알콜 알콕실레이트, 예컨대 알콜 에톡실레이트, 페놀 알콕실레이트, 예컨대 tert-부틸페놀 에톡실레이트 또는 tert-페틸페놀 에톡실레이트, 지방산, 알킬페놀, (예, EO/PO 블럭 공중합체의 형태인) 산화에틸렌(EO)과 산화프로필렌(PO)의 축합 생성물, 폴리에틸렌이민 또는 그 밖에 폴리실록산에서 선택한다.

첨가제 조성물 및 연료는 추가의 일반적인 성분 및 첨가제와 함께 추가로 배합될 수 있다. 여기서는, 예를 들어 현저한 계면활성제 작용 없이 담체유로 만들어져야 하고, 이들은 특히 가솔린 연료를 사용하는 경우 이용된다. 하지만, 이들은 종종 또한 중간 증류물에 사용된다.

적당한 담체유는 이하 실시예에서 열거된다.

적당한 무기 담체유는, 예를 들어 점도가 SN 500∼2000 클래스인 브라이트스톡 또는 염기 오일; 및 또한 방향족 탄화수소, 파라핀계 탄화수소 및 알콕시알칸올 등의 미정제 오일 가공에서 얻어진 단편이다. 마찬가지로 무기유를 정제하여 얻어지고 "수소화분해 오일(hydrocrack oil)"으로 공지되어 있는 단편이 유용하다(고압 하에 촉매 수소화되고 이성체화되며 탈파라핀화되는 천연 무기유에서 얻을 수 있는 비점 범위가 약 360∼500℃인 진공 증류물). 마찬가지로 적당한 것은 상기 언급된 무기 담체유의 혼합물이다.

본 발명에 따라 유용한 합성 담체유의 예는 폴리올레핀 (폴리-알파-올레핀 또는 폴리(내부 올레핀)), (폴리)에스테르, (폴리)알콕실레이트, 폴리에테르, 지방족 폴리에테르아민, 알킬페놀 출발한 폴리에테르, 알킬페놀 출발한 폴리에테르아민 및 장쇄 알칸올의 카르복실계 에스테르에서 선택한다.

적당한 폴리올레핀의 예는 특히 폴리부텐 또는 폴리이소부텐 (수소화 또는 비수소화됨)을 주성분으로 하는 Mn이 400∼1800인 올레핀 중합체이다.

적당한 폴리에테르 또는 폴리에테르아민의 예는 바람직하게는 폴리에테르아민의 경우 C₂-C₆₀-알칸올, C₆-C₃₀-알칸디올, 모노- 또는 디-C₂-C₃₀-알킬아민, C₁-C₃₀-알킬시클로-헥산올 또는 C₁-C₃₀-알킬페놀과 히드록실기 또는 아미노기 당 산화에틸렌 및/또는 산화프로필렌 및/또는 산화부틸렌이 1∼30 몰을 반응시킨 후, 암모니아, 모노아민 또는 폴리아민과 환원성 아민화하여 얻을 수 있는 폴리옥시-C₂-C₄-알킬렌 부분을 포함하는 화합물이다. 상기 생성물은 특히 EP-A 310 875, EP-A 356 725, EP-A 700 985 및 US 4,877,416에 기술되어 있다. 예를 들어, 사용된 폴리에테르아민은 폴리-C₂-C₆-산화알킬렌 아민 또는 이의 작용성 유도체일 수 있다. 이의 일반적인 예는 트리데칸올 부톡실레이트 또는 이소트리데칸올 부톡실레이트, 이소노닐페놀 부톡실레이트 및 또한 폴리이소부텐올 부톡실레이트 및 프로폭실레이트이고, 또한 해당 반응은 암모니아를 생성한다.

장쇄 알칸올의 카르복실계 에스테르의 예는 특히 DE-A 38 38 918에 기술된 바와 같이 모노카르복실산, 디카르복실산 또는 트리카르복실산과 장쇄 알칸올 또는 폴리올의 에스테르이다. 사용된 모노카르복실산, 디카르복실산 또는 트리카르복실산은 지방족 또는 방향족 산일 수 있고; 적당한 에스테르 알콜 또는 폴리올은 특히, 예를 들어 탄소 원자가 6 내지 24개인 장쇄가 대표적이다. 통상 대표적인 에스테르는 이소옥탄올, 이소노난올, 이소데칸올 및 이소트리데칸올, 예컨대 디-(n- 또는 이소트리데실)프탈레이트의 아디페이트, 프탈레이트, 이소프탈레이트, 테레프탈레이트 및 트리멜리테이트이다.

특히 적당한 담체유 시스템은 특히 DE-A 38 26 608, DE-A 41 42 241, DE-A 43 09 074, EP-A 0 452 328 및 EP-A 0 548 617에 기술되어 있고, 본원에 정확하게 참고문헌으로 참고인용되어 있다.

특히 적당한 합성 담체유의 예는, 예를 들어 산화프로필렌, n-산화부틸렌 및 산화이소부틸렌 단위, 또는 이의 혼합물에서 선택된 C₃-C₆-산화알킬렌 단위가 약 5∼35개, 예컨대 약 5∼30개인 알콜 출발 폴리에테르이다. 적당한 출발 알콜의 비제한적인 예는 장쇄 알칸올 또는 장쇄 알킬(이때 장쇄 알킬 라디칼은 특히 직쇄 또는 분지쇄 C₆-C₁₈-알킬 라디칼임)에 의해 치환된 페놀이다. 바람직한 예는 트리데칸올 및 노닐페놀을 포함한다.

또한 적당한 합성 담체유는 DE A 10 102 913.6에 기술된 바와 같은 알콕실화된 알킬페놀이다.

적당한 경우, 본 발명의 조성물은 추가의 보조첨가제를 포함할 수 있다.

또한 일반적인 첨가제는 연료의 냉각 특성을 향상시키는 첨가제, 예를 들어 핵형성제, 유동 향상제, 파라핀 분산제 및 이의 혼합물, 예컨대 에틸렌-비닐 아세 테이트 공중합체; 예컨대 막을 형성하는 상기 염, 유기 카르복실산의 암모늄 염을 주성분으로 하거나 또는 비철 금속 부식 보호제의 경우 복소환 방향족을 주성분으로 하는 부식 억제제; 흐림방지제; 발포방지제, 예컨대 특정한 실록산 화합물; 세탄 수 향상제(점화 향상제); 연소 향상제; 예를 들어 아민, 예컨대 p-페닐렌디아민, 디시클로헥실아민 또는 이의 유도체를 주성분으로 하거나 또는 페놀, 예컨대 2,4-디-tert-부틸페놀 또는 3,5-디-tert-부틸-4-히드록시페닐프로피온산을 주성분으로 하는 산화방지제 또는 안정화제; 정전기방지제; 메탈로센, 예컨대 퍼로센; 메틸시클로펜타디에닐망간 트리카르보닐; 윤활성 향상제, 예컨대 특정한 지방산, 알케닐숙신계 에스테르, 비스(히드록시알킬) 지방 아민, 히드록시아세트아미드 또는 피마자유; 및 또한 염료(마커)이다. 아민은 적당한 경우 연료의 pH를 낮추기 위해 첨가된다.

예를 들어 극성 부분 (a) 내지 (i)를 갖는 계면활성 첨가제를 사용하는 경우, 이들은 통상적으로 10∼5000 중량ppm, 특히 50∼1000 중량ppm, 더욱 바람직하게는 25∼500 중량ppm의 양으로 연료에 첨가된다.

항유화제가 사용되는 경우, 이들은 통상적으로 0.1∼100 중량ppm, 특히 0.2∼10 중량ppm의 양으로 연료에 첨가된다.

언급된 기타 성분 및 첨가제는, 필요한 경우 상기 목적에 일반적인 양으로 첨가된다.

본 발명의 첨가제 조성물이 계면활성 첨가제를 포함하는 경우, 조성물의 총 중량을 기준으로 1∼60 중량%, 바람직하게는 1∼50 중량%, 더욱 바람직하게는 1∼ 40 중량%, 특히 1∼15 중량%의 양으로 존재한다.

본 발명의 첨가제 조성물이 항유화제를 포함하는 경우, 조성물의 총 중량을 기준으로 0.01∼5 중량%, 더욱 바람직하게는 0.01∼2.5 중량%, 특히 0.01∼1 중량%의 양으로 존재한다.

적당한 경우, 본 발명의 조성물은 또한 용매 또는 희석제를 포함할 수 있다.

적당한 용매 및 희석제는, 예를 들어 방향족 및 지방족 탄화수소, 예를 들어 C₅-C₁₀-알칸, 예컨대 펜탄, 헥산, 헵탄, 옥탄, 노난, 데칸, 이의 구조적 이성질체 및 혼합물; 석유 에테르, 방향족, 예컨대 벤젠, 톨루엔, 크실렌 및 용매 나프타; 탄화수소 용매와 함께 탄소 원자가 3∼8개인 알칸올, 예를 들어 프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, sec-부탄올, 이소부탄올 등; 및 알콕시알칸올이다. 적당한 희석제는 또한, 예를 들어 등유, 나프타 또는 브라이트스톡 등의 미정제 오일 가공에서 얻어진 단편이다. 중간 증류물의 경우, 특히 디젤 연료 및 가열 오일의 경우 바람직하게 사용된 희석제는 나프타, 등유, 디젤 연료, 방향족 탄화수소, 예컨대 용매 나프타 헤비, Solvesso^?또는 Shellsol^?, 및 상기 용매 및 희석제의 혼합물이다.

개별 성분들을 연료에 또는 통상적인 연료 조성물에 개별적으로 또는 미리 제조된 농축물로서 첨가할 수 있다(첨가제 패키지; 첨가제 조성물).

본 발명은 또한 하나 이상의 연료 조성물을 생성하는 방법에 관한 것이고, 이때 연료 또는 연료 조성물은

(a) 하나 이상의 히드로포빈 또는 이의 유도체 및 하나 이상의 추가 연료 첨 가제 또는

(b) 상기 기술된 첨가제 조성물

과 혼합된다.

히드로포빈 또는 이의 유도체는 연료를 소포시키는데 양호한 특성을 갖는다.

본 발명은 이하 실시예에 의해 예시된다.

도 1은 제조된 히드로포빈의 정제를 도시한다:

레인 A: 니켈 셀파로스 컬럼에의 적용(1:10 희석)

레인 B: 통과액(Flow-through) = 세척 단계의 용출액

레인 C∼E: 용출 분획의 OD280 멕시멈 (WP1, WP2, WP3)

레인 F: 적용된 마커를 제시하고 있다.

도 1의 히드로포빈은 분자량이 대략 53 kD이다. 작은 밴드 중 일부는 히드로포빈의 분해 생성물을 나타낸다.

실시예 1

yaad-His ₆ /yaaE-His ₆ 의 클로닝을 위한 제조

올리고뉴클레오티드 Hal570 및 Hal571 (Hal 572/ Hal 573)을 이용하여 중합효소 연쇄 반응을 수행하였다. 이용된 템플릿 DNA는 박테리아 바실러스 섭틸리스의 게놈 DNA였다. 생성된 PCR 단편은 바실러스 섭틸리스 yaaD/yaaE 유전자의 암호화 서열과, 각각의 경우에 그 말단에 위치한 Ncol 및 BglII 제한 절단 부위를 포함하였다. 상기 PCR 단편을 정제하여 제한 엔도뉴클레아제 Ncol 및 BglII로 절단하였다. 이 DNA 단편을 삽입체로 사용하여 제한 엔도뉴클레아제 Ncol 및 BglII로 미리 선형화된, Qiagen사의 벡터 pQE60에 클로닝하였다. 따라서 형성된 벡터 pQE60YAAD#2/pQE60YaaE#5를 사용하여 YAAD::HIS₆ 또는 YAAE::HIS₆로 이루어진 단백질을 발현시킬 수 있다.

Hal570: gcgcgcccatggctcaaacaggtactga

Hal571: gcagatctccagccgcgttcttgcatac

Hal572: ggccatgggattaacaataggtgtactagg

Hal573: gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc

실시예 2

yaad 히드로포빈 DewA-His ₆ 의 클로닝

올리고뉴클레오티드 KaM 416 및 KaM 417을 이용하여 중합효소 연쇄 반응을 수행하였다. 사용된 템플릿 DNA는 사상균 아스퍼질러스 니둘란스의 게놈 DNA였다. 생성된 PCR 단편은 히드로포빈 유전자 dewA의 암호화 서열 및 N 말단 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하였다. 상기 PCR 단편을 정제하여 제한 엔도뉴클레아제 BamHI로 절단하였다. 이 DNA 단편을 삽입체로 사용하여 제한 엔도뉴클레아제 BglII로 미리 선형화된 벡터 pQE60YAAD#2에 클로닝하였다.

따라서 형성된 벡터 #508을 사용하여 YAAD::Xa::dewA::HIS₆로 이루어진 융합 단백질을 발현시킬 수 있다.

KaM416: GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGC

KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC

실시예 3

yaad 히드로포빈 RodA-His ₆ 의 클로닝

올리고뉴클레오티드 KaM 434 및 KaM 435를 이용하여, 플라스미드 #513을 플라스미드 #508과 유사하게 클로닝하였다.

KaM434: GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC

KaM435: CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG

실시예 4

yaad 히드로포빈 BASF1-His ₆ 의 클로닝

올리고뉴클레오티드 KaM 417 및 KaM 418을 이용하여, 플라스미드 #507을 플라스미드 #508과 유사하게 클로닝하였다.

사용된 템플릿 DNA은 합성 DNA 서열이었다(히드로포빈 BASF1)(첨부물 서열 번호 11 및 12 참조).

KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC

KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG

실시예 5

yaad 히드로포빈 BASF2-His ₆ 의 클로닝

올리고뉴클레오티드 KaM 417 및 KaM 418을 이용하여, 플라스미드 #506을 플라스미드 #508과 유사하게 클로닝하였다.

사용된 템플릿 DNA은 합성 DNA 서열이었다(히드로포빈 BASF2)(첨부물 서열 번호 13 및 14 참조).

KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC

KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG

실시예 6

yaad 히드로포빈 SC3-His ₆ 의 클로닝

올리고뉴클레오티드 KaM464 및 KaM465를 이용하여, 플라스미드 #526을 플라스미드 #508과 유사하게 클로닝하였다.

사용된 템플릿 DNA은 스키조필럼 커뮨 cDNA이었다(첨부물 서열 번호 9 및 10 참조).

KaM464: CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGC

KaM465: GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT

실시예 7

재조합 이. 콜라이 균주 yaad 히드로포빈 DewA-His ₆ 의 발효

15 ㎖ 그라이너 튜브에서, LB 액체 배지 3 ㎖에, yaad 히드로포빈 DewA-His₆를 발현하는 이. 콜라이 균주를 접종하였다. 37℃에서 8시간 동안 200 rpm의 진탕기에서 배양하였다. 각 경우에, 배플(baffle)이 구비되어 있고 LB 배지(+ 100 μg/ ㎖의 암피실린) 250 ㎖를 포함한 2개의 1 ℓ 에를렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크에, 사전 배양물 1 ㎖를 접종하여, 37℃, 180 rpm의 진탕기에서 9시간 동안 항온처리하였다.

20 ℓ 발효기에서, LB 배지(+ 100 μg/㎖의 암피실린) 13.5 ℓ에, 사전 배양물 0.5 ℓ(OD_600nm 1:10, H₂O에 대하여 측정)를 접종하였다. OD_600nm ∼3.5에서 100 mM IPTG 140 ㎖를 첨가하였다. 3시간 후 발효기를 10℃로 냉각시키고 원심분리로 발효액을 제거하였다. 세포 펠렛을 추가 정제에 사용하였다.

실시예 8

재조합 히드로포빈 융합 단백질의 정제

(C 말단 His6 태그를 갖는 히드로포빈 융합 단백질의 정제)

세포 펠렛 100 g(히드로포빈 100∼500 mg)에, 총 부피 200 ㎖가 되도록 50 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.5)을 첨가하여 재현탁하였다. 이 현탁액을 울트라투락스(Ultraturrax) 타입 T25(Janke and Kunkel; IKA-Labortechnik)로 10분 동안 처리하고, 이어서 핵산의 분해를 위해, 벤조나제(Merck, Darmstadt; 주문 번호 1.01697.0001) 500 유닛과 함께 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 세포를 파괴하기 전에, 유리 카트리지(P1)를 사용하여 여과를 실시하였다. 세포 파괴와 잔류 게놈 DNA의 전단을 위해, 1500 바에서 균질화기를 이용한 처리를 2회 수행하였다(Microfluidizer M-11-EH; Microfluidics Corp.). 균질물을 원심분리하고(Sorvall RC-5B, GSA 로터, 250 ㎖ 원심분리용 비커, 60분, 40℃, 12,000 rpm, 23,000 g), 상청액을 얼음 위에 놓고 펠렛을 인산나트륨 완충액 100 ㎖에 재현탁시켰다. 원심분리 및 재현탁을 3회 반복하였고, 3회차에 사용된 인산나트륨 완충액은 1% SDS를 포함하였다. 재현탁 후, 혼합물을 1시간 동안 교반하고 최종 원심분리(Sorvall RC-5B, GSA 로터, 250 ㎖ 원심분리 비커, 60분, 4℃, 12,000 rpm, 23,000 g)를 수행하였다. SDS-PAGE 분석에 의하면, 히드로포빈은 최종 원심분리 후에도 상청액에 존재한다(도 1). 이 실험은 히드로포빈이 해당 이. 콜라이 세포 내에 봉입체 형태로 존재할 수도 있다는 것을 제시하였다. 히드로포빈 함유 상청액 50 ㎖를, 50 mM Tris-Cl pH 8.0 완충액으로 평형화시킨 50 ㎖ 니켈-셀파로스 고성능 17-5268-02 컬럼(Amersham)에 적용하였다. 이 컬럼을 50 mM Tris-Cl pH 8.0 완충액으로 세척한 후, 히드로포빈을 200 mM 이미다졸을 포함하는 50 mM Tris-Cl pH 8.0 완충액으로 용출하였다. 이미다졸을 제거하기 위해, 용액을 50 mM Tris-Cl pH 8.0 완충액에 대해 투석하였다.

실시예 9

성능 테스트: 유리 위 물방울의 접촉각 변화에 의한 히드로포빈의 특징

기재:

유리 (창문 유리, 독일 만하임 소재의 Sueddeutsche Glas):

- 히드로포빈 농도: 100 μg/㎖

- 50 mM 아세트산나트륨 pH 4 + 0.1% Tween 20 중에서, 유리 슬라이드를 밤새 항온처리(온도 80℃)

- 이후 증류수에서 코팅 세척

- 이후 증류수에서 10분/80℃/1% SDS 용액의 항온처리

- 증류수로 세척

샘플을 공기 건조하고 5 ㎕ 물방울의 접촉각(°)을 측정하였다.

접촉각은 Dataphysics Contact Angle System OCA 15+, Software SCA 20.2.0(2002년 11월)을 사용하여 측정하였다. 측정은 제조자의 지시에 따라 실시하였다.

미처리 유리는 접촉각이 30±5°이고, 실시예 8에 따른 기능성 히드로포빈(yaad-dewA-his₆)으로 코팅된 유리는 접촉각이 75±5°였다.

실시예 10

소포제로서의 히드로포빈 농축물( Yaad-dewA-His ₆ )의 용도

소포의 향상은 다음과 같이 핸드쉐이크 발포에 의해 수행되었다:

- 연료 또는 첨가된 연료 100 ㎖를 단단히 밀봉된 250 ㎖ 스크류탑 유리병에 도입

- 샘플을 2분 동안 진탕

- 이후 샘플을 바로 다운시키고 발포체의 부피(㎖)와 발포체의 분해 시간(초)을 측정.

상기 실험의 경우, 히드로포빈 농축물(Yaad-dewA-His ₆ ), NaH₂PO₄ 완충액(50 mmol/L, pH 7.5))을 사용하였다. 출발 샘플은 히드로포빈의 6.1 mg/㎖의 농도를 가졌다. 출발 샘플 2 ㎖를 최대 100 ㎖(히드로포빈 용액 1)로 만들고 생성 용액 3 ㎖ 를 연료(EN 590 연료) 97 ㎖에 첨가하였다. 실험의 결과는 하기 표에서 재현되었다.

	용량	DK	Repsol에 따른 발포
			부피	분해 시간
비첨가		976	10	18
히드로포빈 용액 2	3 ㎖	976	0	0

발포체 양과 발포체 분해 시간은, 디젤 연료가 히드로포빈을 포함하지 않았을 경우보다 히드로포빈 농축물을 첨가한 경우에 더 낮았다.

DNA 및 폴리펩티드 서열의 서열명을 표시한 서열 목록.

dewA DNA 및 폴리펩티드 서열	서열 번호: 1
dewA 폴리펩티드 서열	서열 번호: 2
rodA DNA 및 폴리펩티드 서열	서열 번호: 3
rodA 폴리펩티드 서열	서열 번호: 4
hypA DNA 및 폴리펩티드 서열	서열 번호: 5
hypA 폴리펩티드 서열	서열 번호: 6
hypB DNA 및 폴리펩티드 서열	서열 번호: 7
hypB 폴리펩티드 서열	서열 번호: 8
sc3 DNA 및 폴리펩티드 서열	서열 번호: 9
sc3 폴리펩티드 서열	서열 번호: 10
basf1 DNA 및 폴리펩티드 서열	서열 번호: 11
basf1 폴리펩티드 서열	서열 번호: 12
basf2 DNA 및 폴리펩티드 서열	서열 번호: 13
basf2 폴리펩티드 서열	서열 번호: 14
yaad DNA 및 폴리펩티드 서열	서열 번호: 15
yaad 폴리펩티드 서열	서열 번호: 16
yaae DNA 및 폴리펩티드 서열	서열 번호: 17
yaae 폴리펩티드 서열	서열 번호: 18
yaad-Xa-dewA-his DNA 및 폴리펩티드 서열	서열 번호: 19
yaad-Xa-dewA-his 폴리펩티드 서열	서열 번호: 20
yaad-Xa-rodA-his DNA 및 폴리펩티드 서열	서열 번호: 21
yaad-Xa-rodA-his 폴리펩티드 서열	서열 번호: 22
yadd-Xa-basf1-his DNA 및 폴리펩티드 서열	서열 번호: 23
yaad-Xa-basf1-his 폴리펩티드 서열	서열 번호: 24

SEQUENCE LISTING <110> BASF Aktiengesellschaft <120> Verwendung von Proteinen als Antischaum-Komponente in Kraftstoffen <130> AE 200500622 <160> 24 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 405 <212> DNA <213> basf-dewA <220> <221> CDS <222> (1)..(405) <223> <400> 1 atg cgc ttc atc gtc tct ctc ctc gcc ttc act gcc gcg gcc acc gcg 48 Met Arg Phe Ile Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala 1 5 10 15 acc gcc ctc ccg gcc tct gcc gca aag aac gcg aag ctg gcc acc tcg 96 Thr Ala Leu Pro Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser 20 25 30 gcg gcc ttc gcc aag cag gct gaa ggc acc acc tgc aat gtc ggc tcg 144 Ala Ala Phe Ala Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser 35 40 45 atc gct tgc tgc aac tcc ccc gct gag acc aac aac gac agt ctg ttg 192 Ile Ala Cys Cys Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu 50 55 60 agc ggt ctg ctc ggt gct ggc ctt ctc aac ggg ctc tcg ggc aac act 240 Ser Gly Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr 65 70 75 80 ggc agc gcc tgc gcc aag gcg agc ttg att gac cag ctg ggt ctg ctc 288 Gly Ser Ala Cys Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu 85 90 95 gct ctc gtc gac cac act gag gaa ggc ccc gtc tgc aag aac atc gtc 336 Ala Leu Val Asp His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn Ile Val 100 105 110 gct tgc tgc cct gag gga acc acc aac tgt gtt gcc gtc gac aac gct 384 Ala Cys Cys Pro Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala 115 120 125 ggc gct ggt acc aag gct gag 405 Gly Ala Gly Thr Lys Ala Glu 130 135 <210> 2 <211> 135 <212> PRT <213> basf-dewA <400> 2 Met Arg Phe Ile Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala 1 5 10 15 Thr Ala Leu Pro Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser 20 25 30 Ala Ala Phe Ala Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser 35 40 45 Ile Ala Cys Cys Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu 50 55 60 Ser Gly Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr 65 70 75 80 Gly Ser Ala Cys Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu 85 90 95 Ala Leu Val Asp His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn Ile Val 100 105 110 Ala Cys Cys Pro Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala 115 120 125 Gly Ala Gly Thr Lys Ala Glu 130 135 <210> 3 <211> 471 <212> DNA <213> basf-rodA <220> <221> CDS <222> (1)..(471) <223> <400> 3 atg aag ttc tcc att gct gcc gct gtc gtt gct ttc gcc gcc tcc gtc 48 Met Lys Phe Ser Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val 1 5 10 15 gcg gcc ctc cct cct gcc cat gat tcc cag ttc gct ggc aat ggt gtt 96 Ala Ala Leu Pro Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val 20 25 30 ggc aac aag ggc aac agc aac gtc aag ttc cct gtc ccc gaa aac gtg 144 Gly Asn Lys Gly Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val 35 40 45 acc gtc aag cag gcc tcc gac aag tgc ggt gac cag gcc cag ctc tct 192 Thr Val Lys Gln Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser 50 55 60 tgc tgc aac aag gcc acg tac gcc ggt gac acc aca acc gtt gat gag 240 Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu 65 70 75 80 ggt ctt ctg tct ggt gcc ctc agc ggc ctc atc ggc gcc ggg tct ggt 288 Gly Leu Leu Ser Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly 85 90 95 gcc gaa ggt ctt ggt ctc ttc gat cag tgc tcc aag ctt gat gtt gct 336 Ala Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala 100 105 110 gtc ctc att ggc atc caa gat ctt gtc aac cag aag tgc aag caa aac 384 Val Leu Ile Gly Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn 115 120 125 att gcc tgc tgc cag aac tcc ccc tcc agc gcg gat ggc aac ctt att 432 Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile 130 135 140 ggt gtc ggt ctc cct tgc gtt gcc ctt ggc tcc atc ctc 471 Gly Val Gly Leu Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu 145 150 155 <210> 4 <211> 157 <212> PRT <213> basf-rodA <400> 4 Met Lys Phe Ser Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val 1 5 10 15 Ala Ala Leu Pro Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val 20 25 30 Gly Asn Lys Gly Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val 35 40 45 Thr Val Lys Gln Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser 50 55 60 Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu 65 70 75 80 Gly Leu Leu Ser Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly 85 90 95 Ala Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala 100 105 110 Val Leu Ile Gly Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn 115 120 125 Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile 130 135 140 Gly Val Gly Leu Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu 145 150 155 <210> 5 <211> 336 <212> DNA <213> basf-HypA <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <223> <400> 5 atg atc tct cgc gtc ctt gtc gct gct ctc gtc gct ctc ccc gct ctt 48 Met Ile Ser Arg Val Leu Val Ala Ala Leu Val Ala Leu Pro Ala Leu 1 5 10 15 gtt act gca act cct gct ccc gga aag cct aaa gcc agc agt cag tgc 96 Val Thr Ala Thr Pro Ala Pro Gly Lys Pro Lys Ala Ser Ser Gln Cys 20 25 30 gac gtc ggt gaa atc cat tgc tgt gac act cag cag act ccc gac cac 144 Asp Val Gly Glu Ile His Cys Cys Asp Thr Gln Gln Thr Pro Asp His 35 40 45 acc agc gcc gcc gcg tct ggt ttg ctt ggt gtt ccc atc aac ctt ggt 192 Thr Ser Ala Ala Ala Ser Gly Leu Leu Gly Val Pro Ile Asn Leu Gly 50 55 60 gct ttc ctc ggt ttc gac tgt acc ccc att tcc gtc ctt ggc gtc ggt 240 Ala Phe Leu Gly Phe Asp Cys Thr Pro Ile Ser Val Leu Gly Val Gly 65 70 75 80 ggc aac aac tgt gct gct cag cct gtc tgc tgc aca gga aat caa ttc 288 Gly Asn Asn Cys Ala Ala Gln Pro Val Cys Cys Thr Gly Asn Gln Phe 85 90 95 acc gca ttg att aac gct ctt gac tgc tct cct gtc aat gtc aac ctc 336 Thr Ala Leu Ile Asn Ala Leu Asp Cys Ser Pro Val Asn Val Asn Leu 100 105 110 <210> 6 <211> 112 <212> PRT <213> basf-HypA <400> 6 Met Ile Ser Arg Val Leu Val Ala Ala Leu Val Ala Leu Pro Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Ala Thr Pro Ala Pro Gly Lys Pro Lys Ala Ser Ser Gln Cys 20 25 30 Asp Val Gly Glu Ile His Cys Cys Asp Thr Gln Gln Thr Pro Asp His 35 40 45 Thr Ser Ala Ala Ala Ser Gly Leu Leu Gly Val Pro Ile Asn Leu Gly 50 55 60 Ala Phe Leu Gly Phe Asp Cys Thr Pro Ile Ser Val Leu Gly Val Gly 65 70 75 80 Gly Asn Asn Cys Ala Ala Gln Pro Val Cys Cys Thr Gly Asn Gln Phe 85 90 95 Thr Ala Leu Ile Asn Ala Leu Asp Cys Ser Pro Val Asn Val Asn Leu 100 105 110 <210> 7 <211> 357 <212> DNA <213> basf-HypB <220> <221> CDS <222> (1)..(357) <223> <400> 7 atg gtc agc acg ttc atc act gtc gca aag acc ctt ctc gtc gcg ctc 48 Met Val Ser Thr Phe Ile Thr Val Ala Lys Thr Leu Leu Val Ala Leu 1 5 10 15 ctc ttc gtc aat atc aat atc gtc gtt ggt act gca act acc ggc aag 96 Leu Phe Val Asn Ile Asn Ile Val Val Gly Thr Ala Thr Thr Gly Lys 20 25 30 cat tgt agc acc ggt cct atc gag tgc tgc aag cag gtc atg gat tct 144 His Cys Ser Thr Gly Pro Ile Glu Cys Cys Lys Gln Val Met Asp Ser 35 40 45 aag agc cct cag gct acg gag ctt ctt acg aag aat ggc ctt ggc ctg 192 Lys Ser Pro Gln Ala Thr Glu Leu Leu Thr Lys Asn Gly Leu Gly Leu 50 55 60 ggt gtc ctt gct ggc gtg aag ggt ctt gtt ggc gcg aat tgc agc cct 240 Gly Val Leu Ala Gly Val Lys Gly Leu Val Gly Ala Asn Cys Ser Pro 65 70 75 80 atc acg gca att ggt att ggc tcc ggc agc caa tgc tct ggc cag acc 288 Ile Thr Ala Ile Gly Ile Gly Ser Gly Ser Gln Cys Ser Gly Gln Thr 85 90 95 gtt tgc tgc cag aat aat aat ttc aac ggt gtt gtc gct att ggt tgc 336 Val Cys Cys Gln Asn Asn Asn Phe Asn Gly Val Val Ala Ile Gly Cys 100 105 110 act ccc att aat gcc aat gtg 357 Thr Pro Ile Asn Ala Asn Val 115 <210> 8 <211> 119 <212> PRT <213> basf-HypB <400> 8 Met Val Ser Thr Phe Ile Thr Val Ala Lys Thr Leu Leu Val Ala Leu 1 5 10 15 Leu Phe Val Asn Ile Asn Ile Val Val Gly Thr Ala Thr Thr Gly Lys 20 25 30 His Cys Ser Thr Gly Pro Ile Glu Cys Cys Lys Gln Val Met Asp Ser 35 40 45 Lys Ser Pro Gln Ala Thr Glu Leu Leu Thr Lys Asn Gly Leu Gly Leu 50 55 60 Gly Val Leu Ala Gly Val Lys Gly Leu Val Gly Ala Asn Cys Ser Pro 65 70 75 80 Ile Thr Ala Ile Gly Ile Gly Ser Gly Ser Gln Cys Ser Gly Gln Thr 85 90 95 Val Cys Cys Gln Asn Asn Asn Phe Asn Gly Val Val Ala Ile Gly Cys 100 105 110 Thr Pro Ile Asn Ala Asn Val 115 <210> 9 <211> 408 <212> DNA <213> basf-sc3 <220> <221> CDS <222> (1)..(408) <223> <400> 9 atg ttc gcc cgt ctc ccc gtc gtg ttc ctc tac gcc ttc gtc gcg ttc 48 Met 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Ser Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val 1 5 10 15 gcc gcc ctc cct cag cac gac tcc gcc gcc ggc aac ggc aac ggc gtc 96 Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val 20 25 30 ggc aac aag ttc cct gtc cct gac gac gtc acc gtc aag cag gcc acc 144 Gly Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr 35 40 45 gac aag tgc ggc gac cag gcc cag ctc tcc tgc tgc aac aag gcc acc 192 Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr 50 55 60 tac gcc ggc gac gtc ctc acc gac atc gac gag ggc atc ctc gcc ggc 240 Tyr Ala Gly Asp Val Leu Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly 65 70 75 80 ctc ctc aag aac ctc atc ggc ggc ggc tcc ggc tcc gag ggc ctc ggc 288 Leu Leu Lys Asn Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly 85 90 95 ctc ttc gac cag tgc gtc aag ctc gac ctc cag atc tcc gtc atc ggc 336 Leu Phe Asp Gln Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly 100 105 110 atc cct atc cag gac ctc ctc aac cag gtc aac aag cag tgc aag cag 384 Ile Pro Ile Gln Asp Leu Leu Asn Gln Val Asn Lys Gln Cys Lys Gln 115 120 125 aac atc gcc tgc tgc cag aac tcc cct tcc gac gcc acc ggc tcc ctc 432 Asn Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu 130 135 140 gtc aac ctc ggc ctc ggc aac cct tgc atc cct gtc tcc ctc ctc cat 480 Val Asn Leu Gly Leu Gly Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His 145 150 155 160 atg 483 Met <210> 12 <211> 161 <212> PRT <213> basf-BASF1 <400> 12 Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val 1 5 10 15 Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val 20 25 30 Gly Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr 35 40 45 Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr 50 55 60 Tyr Ala Gly Asp Val Leu Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly 65 70 75 80 Leu Leu Lys Asn Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly 85 90 95 Leu Phe Asp Gln Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly 100 105 110 Ile Pro Ile Gln Asp Leu Leu Asn Gln Val Asn Lys Gln Cys Lys Gln 115 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tcc ggc tcc gag ggc ctc ggc ctc 288 Leu Lys Asn Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu 85 90 95 ttc gac cag tgc gtc aag ctc gac ctc cag atc tcc gtc atc ggc atc 336 Phe Asp Gln Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly Ile 100 105 110 cct atc cag gac ctc ctc aac cag cag tgc aag cag aac atc gcc tgc 384 Pro Ile Gln Asp Leu Leu Asn Gln Gln Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys 115 120 125 tgc cag aac tcc cct tcc gac gcc acc ggc tcc ctc gtc aac ctc ggc 432 Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly 130 135 140 aac cct tgc atc cct gtc tcc ctc ctc cat atg 465 Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His Met 145 150 155 <210> 14 <211> 155 <212> PRT <213> basf-BASF2 <400> 14 Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val 1 5 10 15 Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val 20 25 30 Gly Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr 35 40 45 Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Val Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly Leu 65 70 75 80 Leu Lys Asn Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu 85 90 95 Phe Asp Gln Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly Ile 100 105 110 Pro Ile Gln Asp Leu Leu Asn Gln Gln Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys 115 120 125 Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly 130 135 140 Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His Met 145 150 155 <210> 15 <211> 882 <212> DNA <213> basf-yaad <220> <221> CDS <222> (1)..(882) <223> <400> 15 atg gct caa aca ggt act gaa cgt gta aaa cgc gga atg gca gaa atg 48 Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met 1 5 10 15 caa aaa ggc ggc gtc atc atg gac gtc atc aat gcg gaa caa gcg aaa 96 Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys 20 25 30 atc gct gaa gaa gct gga gct gtc gct gta atg gcg cta gaa cgt gtg 144 Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val 35 40 45 cca gca gat att cgc gcg gct gga gga gtt gcc cgt atg gct gac cct 192 Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro 50 55 60 aca atc gtg gaa gaa gta atg aat gca gta tct atc ccg gta atg gca 240 Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala 65 70 75 80 aaa gcg cgt atc gga cat att gtt gaa gcg cgt gtg ctt gaa gct atg 288 Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met 85 90 95 ggt gtt gac tat att gat gaa agt gaa gtt ctg acg ccg gct gac gaa 336 Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu 100 105 110 gaa ttt cat tta aat aaa aat gaa tac aca gtt cct ttt gtc tgt ggc 384 Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly 115 120 125 tgc cgt gat ctt ggt gaa gca aca cgc cgt att gcg gaa ggt gct tct 432 Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser 130 135 140 atg ctt cgc aca aaa ggt gag cct gga aca ggt aat att gtt gag gct 480 Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala 145 150 155 160 gtt cgc cat atg cgt aaa gtt aac gct caa gtg cgc aaa gta gtt 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cca gaa cag cgt 864 Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg 275 280 285 atg caa gaa cgc ggc tgg 882 Met Gln Glu Arg Gly Trp 290 <210> 16 <211> 294 <212> PRT <213> basf-yaad <400> 16 Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met 1 5 10 15 Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys 20 25 30 Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val 35 40 45 Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro 50 55 60 Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala 65 70 75 80 Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met 85 90 95 Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu 100 105 110 Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly 115 120 125 Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser 130 135 140 Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala 145 150 155 160 Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala 165 170 175 Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro 180 185 190 Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val 195 200 205 Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met 210 215 220 Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys 225 230 235 240 Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr 245 250 255 His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly 260 265 270 Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg 275 280 285 Met Gln Glu Arg Gly Trp 290 <210> 17 <211> 591 <212> DNA <213> basf-yaae <220> <221> CDS <222> (1)..(591) <223> <400> 17 atg gga tta aca ata ggt gta cta gga ctt caa gga gca gtt aga gag 48 Met Gly Leu Thr Ile Gly Val Leu Gly Leu Gln Gly Ala Val Arg Glu 1 5 10 15 cac atc cat gcg att gaa gca tgc ggc gcg gct ggt ctt gtc gta aaa 96 His Ile His Ala Ile Glu Ala Cys Gly Ala Ala Gly Leu Val Val Lys 20 25 30 cgt ccg gag cag ctg aac gaa gtt gac ggg ttg att ttg ccg ggc ggt 144 Arg Pro Glu Gln Leu Asn Glu Val Asp Gly Leu Ile Leu Pro Gly Gly 35 40 45 gag agc acg acg atg cgc cgt ttg atc gat acg tat caa ttc atg gag 192 Glu Ser Thr Thr Met Arg Arg Leu Ile Asp Thr Tyr Gln Phe Met Glu 50 55 60 ccg ctt cgt gaa ttc gct gct cag ggc aaa ccg atg ttt gga aca tgt 240 Pro Leu Arg Glu Phe Ala Ala Gln Gly Lys Pro Met Phe Gly Thr Cys 65 70 75 80 gcc gga tta att ata tta gca aaa gaa att gcc ggt tca gat aat cct 288 Ala Gly Leu Ile Ile Leu Ala Lys Glu Ile Ala Gly Ser Asp Asn Pro 85 90 95 cat tta ggt ctt ctg aat gtg gtt gta gaa cgt aat tca ttt ggc cgg 336 His Leu Gly Leu Leu Asn Val Val Val Glu Arg Asn Ser Phe Gly Arg 100 105 110 cag gtt gac agc ttt gaa gct gat tta aca att aaa ggc ttg gac gag 384 Gln Val Asp Ser Phe Glu Ala Asp Leu Thr Ile Lys Gly Leu Asp Glu 115 120 125 cct ttt act ggg gta ttc atc cgt gct ccg cat att tta gaa gct ggt 432 Pro Phe Thr Gly Val Phe Ile Arg Ala Pro His Ile Leu Glu Ala Gly 130 135 140 gaa aat gtt gaa gtt cta tcg gag cat aat ggt cgt att gta gcc gcg 480 Glu Asn Val Glu Val Leu Ser Glu His Asn Gly Arg Ile Val Ala Ala 145 150 155 160 aaa cag ggg caa ttc ctt ggc tgc tca ttc cat ccg gag ctg aca gaa 528 Lys Gln Gly Gln Phe Leu Gly Cys Ser Phe His Pro Glu Leu Thr Glu 165 170 175 gat cac cga gtg acg cag ctg ttt gtt gaa atg gtt gag gaa tat aag 576 Asp His Arg Val Thr Gln Leu Phe Val Glu Met Val Glu Glu Tyr Lys 180 185 190 caa aag gca ctt gta 591 Gln Lys Ala Leu Val 195 <210> 18 <211> 197 <212> PRT <213> basf-yaae <400> 18 Met Gly Leu Thr Ile Gly Val Leu Gly Leu Gln Gly Ala Val Arg Glu 1 5 10 15 His Ile His Ala Ile Glu Ala Cys Gly Ala Ala Gly Leu Val Val Lys 20 25 30 Arg Pro Glu Gln Leu Asn Glu Val Asp Gly Leu Ile Leu Pro Gly Gly 35 40 45 Glu Ser Thr Thr Met Arg Arg Leu Ile Asp Thr Tyr Gln Phe Met Glu 50 55 60 Pro Leu Arg Glu Phe Ala Ala Gln Gly Lys Pro Met Phe Gly Thr Cys 65 70 75 80 Ala Gly Leu Ile Ile Leu Ala Lys Glu Ile Ala Gly Ser Asp Asn Pro 85 90 95 His Leu Gly Leu Leu Asn Val Val Val Glu Arg Asn 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gtt gcc cgt atg gct gac cct 192 Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro 50 55 60 aca atc gtg gaa gaa gta atg aat gca gta tct atc ccg gta atg gca 240 Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala 65 70 75 80 aaa gcg cgt atc gga cat att gtt gaa gcg cgt gtg ctt gaa gct atg 288 Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met 85 90 95 ggt gtt gac tat att gat gaa agt gaa gtt ctg acg ccg gct gac gaa 336 Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu 100 105 110 gaa ttt cat tta aat aaa aat gaa tac aca gtt cct ttt gtc tgt ggc 384 Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly 115 120 125 tgc cgt gat ctt ggt gaa gca aca cgc cgt att gcg gaa ggt gct tct 432 Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser 130 135 140 atg ctt cgc aca aaa ggt gag cct gga aca ggt aat att gtt gag gct 480 Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala 145 150 155 160 gtt cgc cat atg cgt aaa gtt aac gct caa gtg cgc aaa gta gtt gcg 528 Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala 165 170 175 atg agt gag gat gag cta atg aca gaa gcg aaa aac cta ggt gct cct 576 Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro 180 185 190 tac gag ctt ctt ctt caa att aaa aaa gac ggc aag ctt cct gtc gtt 624 Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val 195 200 205 aac ttt gcc gct ggc ggc gta gca act cca gct gat gct gct ctc atg 672 Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met 210 215 220 atg cag ctt ggt gct gac gga gta ttt gtt ggt tct ggt att ttt aaa 720 Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys 225 230 235 240 tca gac aac cct gct aaa ttt gcg aaa gca att gtg gaa gca aca act 768 Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr 245 250 255 cac ttt act gat tac aaa tta atc gct gag ttg tca aaa gag ctt ggt 816 His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly 260 265 270 act gca atg aaa ggg att gaa atc tca aac tta ctt cca gaa cag cgt 864 Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg 275 280 285 atg caa gaa cgc ggc tgg aga tcc att gaa ggc cgc atg cgc ttc atc 912 Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Arg Phe Ile 290 295 300 gtc tct ctc ctc gcc ttc act gcc gcg gcc acc gcg acc gcc ctc ccg 960 Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Leu Pro 305 310 315 320 gcc tct gcc gca aag aac gcg aag ctg gcc acc tcg gcg gcc ttc gcc 1008 Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser Ala Ala Phe Ala 325 330 335 aag cag gct gaa ggc acc acc tgc aat gtc ggc tcg atc gct tgc tgc 1056 Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser Ile Ala Cys Cys 340 345 350 aac tcc ccc gct gag acc aac aac gac agt ctg ttg agc ggt ctg ctc 1104 Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu 355 360 365 ggt gct ggc ctt ctc aac ggg ctc tcg ggc aac act ggc agc gcc tgc 1152 Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr Gly Ser Ala Cys 370 375 380 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Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met 85 90 95 Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu 100 105 110 Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly 115 120 125 Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser 130 135 140 Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala 145 150 155 160 Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala 165 170 175 Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro 180 185 190 Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val 195 200 205 Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met 210 215 220 Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys 225 230 235 240 Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr 245 250 255 His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly 260 265 270 Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg 275 280 285 Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser 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aat gcg gaa caa gcg aaa 96 Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys 20 25 30 atc gct gaa gaa gct gga gct gtc gct gta atg gcg cta gaa cgt gtg 144 Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val 35 40 45 cca gca gat att cgc gcg gct gga gga gtt gcc cgt atg gct gac cct 192 Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro 50 55 60 aca atc gtg gaa gaa gta atg aat gca gta tct atc ccg gta atg gca 240 Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala 65 70 75 80 aaa gcg cgt atc gga cat att gtt gaa gcg cgt gtg ctt gaa gct atg 288 Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met 85 90 95 ggt gtt gac tat att gat gaa agt gaa gtt ctg acg ccg gct gac gaa 336 Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu 100 105 110 gaa ttt cat tta aat aaa aat gaa tac aca gtt cct ttt gtc tgt ggc 384 Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly 115 120 125 tgc cgt gat ctt ggt gaa gca aca cgc cgt att gcg gaa ggt gct tct 432 Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser 130 135 140 atg ctt cgc aca aaa ggt gag cct gga aca ggt aat att gtt gag gct 480 Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala 145 150 155 160 gtt cgc cat atg cgt aaa gtt aac gct caa gtg cgc aaa gta gtt gcg 528 Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala 165 170 175 atg agt gag gat gag cta atg aca gaa gcg aaa aac cta ggt gct cct 576 Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro 180 185 190 tac gag ctt ctt ctt caa att aaa aaa gac ggc aag ctt cct gtc gtt 624 Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val 195 200 205 aac ttt gcc gct ggc ggc gta gca act cca gct gat gct gct ctc atg 672 Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met 210 215 220 atg cag ctt ggt gct gac gga gta ttt gtt ggt tct ggt att ttt aaa 720 Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys 225 230 235 240 tca gac aac cct gct aaa ttt 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aag tgc ggt gac cag gcc cag ctc tct tgc tgc aac aag 1104 Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys 355 360 365 gcc acg tac gcc ggt gac acc aca acc gtt gat gag ggt ctt ctg tct 1152 Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu Gly Leu Leu Ser 370 375 380 ggt gcc ctc agc ggc ctc atc ggc gcc ggg tct ggt gcc gaa ggt ctt 1200 Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly Ala Glu Gly Leu 385 390 395 400 ggt ctc ttc gat cag tgc tcc aag ctt gat gtt gct gtc ctc att ggc 1248 Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala Val Leu Ile Gly 405 410 415 atc caa gat ctt gtc aac cag aag tgc aag caa aac att gcc tgc tgc 1296 Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys Cys 420 425 430 cag aac tcc ccc tcc agc gcg gat ggc aac ctt att ggt gtc ggt ctc 1344 Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile Gly Val Gly Leu 435 440 445 cct tgc gtt gcc ctt ggc tcc atc ctc gga tct cat cac cat cac cat 1392 Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu Gly Ser His His His His His 450 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Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val 195 200 205 Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met 210 215 220 Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys 225 230 235 240 Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr 245 250 255 His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly 260 265 270 Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg 275 280 285 Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Lys Phe Ser 290 295 300 Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Pro 305 310 315 320 Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val Gly Asn Lys Gly 325 330 335 Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val Thr Val Lys Gln 340 345 350 Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys 355 360 365 Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu Gly Leu Leu Ser 370 375 380 Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly Ala Glu Gly Leu 385 390 395 400 Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala Val Leu Ile Gly 405 410 415 Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys Cys 420 425 430 Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile Gly Val Gly Leu 435 440 445 Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu Gly Ser His His His His His 450 455 460 His 465 <210> 23 <211> 1407 <212> DNA <213> basf-yaad-Xa-BASF1-his <220> <221> CDS <222> (1)..(1407) <223> <400> 23 atg gct caa aca ggt act gaa cgt gta aaa cgc gga atg gca gaa atg 48 Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met 1 5 10 15 caa aaa ggc ggc gtc atc atg gac gtc atc aat gcg gaa caa gcg aaa 96 Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys 20 25 30 atc gct gaa gaa gct gga gct gtc gct gta atg gcg cta gaa cgt gtg 144 Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val 35 40 45 cca gca gat att cgc gcg gct gga gga gtt gcc cgt atg gct gac cct 192 Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro 50 55 60 aca atc gtg gaa gaa gta atg aat gca gta tct atc ccg gta atg gca 240 Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala 65 70 75 80 aaa gcg cgt atc gga cat att gtt gaa gcg cgt gtg ctt gaa gct atg 288 Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met 85 90 95 ggt gtt gac tat att gat gaa agt gaa gtt ctg acg ccg gct gac gaa 336 Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu 100 105 110 gaa ttt cat tta aat aaa aat gaa tac aca gtt cct ttt gtc tgt ggc 384 Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly 115 120 125 tgc cgt gat ctt ggt gaa gca aca cgc cgt att gcg gaa ggt gct tct 432 Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser 130 135 140 atg ctt cgc aca aaa ggt gag cct gga aca ggt aat att gtt gag gct 480 Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala 145 150 155 160 gtt cgc cat atg cgt aaa gtt aac gct caa gtg cgc aaa gta gtt gcg 528 Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala 165 170 175 atg agt gag gat gag cta atg aca gaa gcg aaa aac cta ggt gct cct 576 Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro 180 185 190 tac gag ctt ctt ctt caa att aaa aaa gac ggc aag ctt cct gtc gtt 624 Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val 195 200 205 aac ttt gcc gct ggc ggc gta gca act cca gct gat gct gct ctc atg 672 Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met 210 215 220 atg cag ctt ggt gct gac gga gta ttt gtt ggt tct ggt att ttt aaa 720 Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys 225 230 235 240 tca gac aac cct gct aaa ttt gcg aaa gca att gtg gaa gca aca act 768 Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr 245 250 255 cac ttt act gat tac aaa tta atc gct gag ttg tca aaa gag ctt ggt 816 His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly 260 265 270 act gca atg aaa ggg att gaa atc tca aac tta ctt cca gaa cag cgt 864 Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg 275 280 285 atg 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Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg 275 280 285 Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Lys Phe Ser 290 295 300 Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Pro 305 310 315 320 Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val Gly Asn Lys Phe 325 330 335 Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr Asp Lys Cys Gly 340 345 350 Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp 355 360 365 Val Leu Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly Leu Leu Lys Asn 370 375 380 Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln 385 390 395 400 Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly Ile Pro Ile Gln 405 410 415 Asp Leu Leu Asn Gln Val Asn Lys Gln Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys 420 425 430 Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly 435 440 445 Leu Gly Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His Met Gly Ser His 450 455 460 His His His His His 465

Claims (11)

1. 첨가제 조성물 또는 연료에서 소포제로서의 하나 이상의 히드로포빈 또는 이의 유도체의 사용 방법.
2. 제1항에 있어서, 연료는 디젤 연료인 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하나 이상의 히드로포빈 또는 이의 유도체는 연료를 기준으로 0.1∼100 ppm의 양으로 사용하는 방법.
4. 하나 이상의 히드로포빈 또는 이의 유도체를 연료에 첨가하는 단계를 포함하는 연료의 소포 방법.
5. 제4항에 있어서, 연료는 디젤 연료인 방법.
6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 하나 이상의 히드로포빈 또는 이의 유도체는 연료를 기준으로 0.1∼100 ppm의 양으로 사용하는 방법.
7. 하나 이상의 히드로포빈 또는 이의 유도체 및 하나 이상의 추가 연료 첨가제를 포함하는 첨가제 조성물.
8. 주 성분으로서 하나 이상의 연료 이외에, 하나 이상의 히드로포빈 또는 이의 유도체 및 하나 이상의 추가 연료 첨가제를 포함하는 연료 조성물.
9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 첨가제 조성물 또는 연료 조성물.
10. 제7항 또는 제8항에 있어서, 하나 이상의 항유화제를 포함하는 첨가제 조성물 또는 연료 조성물.
11. (a) 하나 이상의 히드로포빈 또는 이의 유도체 및 하나 이상의 추가 연료 첨가제 또는

    (b) 제7항에 따른 첨가제 조성물

    과 연료 또는 연료 조성물을 혼합하는, 하나 이상의 연료 조성물을 생성하는 방법.

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