MX2007012018A - Uso de hidrofobinas para el tratamiento de superficie de materiales de construccion de mineral endurecido, piedra natural, piedra artificial y ceramica. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere al uso de hidrofobinas para tratar las superficies de materiales de construccion de mineral endurecido, piedra natural, piedra artificial o ceramica. La invencion tambien se refiere a un metodo para tratar dichas superficies, y a superficies de materiales de construccion de mineral endurecido, piedra natural, piedra artificial o ceramica provistos con un revestimiento conteniendo hidrofobinas.

Description

USO DE HlDROFOBiNAS PARA EL TRATARA. ENTQ DE SUPERFDC.E DE MATERIALES DE CONSTRUCCIÓN DE ¡MINERAL ENDUREC.DQ.

PIEDRA NATURAL. PIEDRA ARTIFICIAL Y GERÁM.CA La presente invención se refiere al uso de hidrofobinas para tratar la superficie de materiales de construcción de mineral curado, piedra natural, bloque de hormigón o cerámica que tienen un revestimiento que comprende hidrofobinas. Se sabe para superficies tanto de interiores como exteriores a ser revestidas con revestimientos mejorar la durabilidad y/o la apariencia de la superficie. Dichos revestimientos, por ejemplo, deben conservar, repeler humedad, inhibir suciedad o facilitar la limpieza de la superficie. Los revestimientos pueden ser revestimientos permanentes, por ejemplo, revestimientos inspirados por el efecto loto, como se describe por EP-A 933 388. Los revestimientos también pueden ser revestimientos temporales. Dicho efecto repelente a suciedad temporal se puede lograr, por ejemplo, vía sustancias en una formulación limpiadora que se aplican mientras se limpia la superficie. Por ejemplo, pueden ser limpiadores para azulejos. EP-A 467 472 describe una composición para elevar la hidrofilicidad de superficies duras, por ejemplo, superficies domésticas, a fin de que se pueda lograr limpieza más fácil en pasos de limpieza posteriores. La formulación comprende un polímero soluble en agua, iónico o no iónico, por ejemplo, un polímero catiónico teniendo unidades de alquil metacplato de amonio cuaternizado Las formulaciones limpiadoras descritas comprenden 0 02% a 5% en peso del polímero WO 03/002620 describe el uso de dialquilaminoalquil (met)acr?latos como polímeros de liberación de suciedad para superficies duras, por ejemplo, pisos de piedra fina o superficies de acero inoxidable Las formulaciones limpiadoras descritas comprenden 0 1% a 5% en peso del polímero DE-A 100 61 897 describe composiciones de limpieza comprendiendo partículas hidrofílicas con silicato que conducen a desprendimiento de suciedad mejorado acoplado con re-ensuciamiento reducido Las partículas son tomadas por la superficie de los sustratos a ser limpiados y por consiguiente afectan las propiedades de la superficie Las hidrofobmas son proteínas pequeñas de aproximadamente 100 a 150 aminoácidos que son característicos de hongos filamentosos, por ejemplo Schizophyllum commune Por lo general tienen 8 unidades de cisteína Las hidrofobinas tienen una afinidad marcada por interfaces y por tanto son útiles para revestir superficies Por ejemplo, Teflón se puede revestir con hidrofobinas para obtener una superficie hidrofí ca Las hidrofobmas se pueden aislar de recursos naturales Pero también es posible sintetizar hidrofobinas que no ocurren de manera natural por medio de métodos químicos y/o biotecnológicos de producción. Nuestra solicitud anterior DE 102005007480.4 describe un proceso para producir hidrofobinas que no ocurren en naturaleza.

Hay técnica anterior proponiendo el uso de hidrofobinas para varias aplicaciones. WO 96/41882 propone el uso de hidrofobinas como emulsores, espesantes o agentes tensioactivos, para dar propiedades hidrofílicas a superficies hidrofóbicas, para mejorar la resistencia a agua de sustratos hidrofílicos, para preparar emulsiones de aceite en agua o emulsiones de agua en aceite. Otras propuestas incluyen aplicaciones farmacéuticas tal como la preparación de ungüentos o cremas y también aplicaciones cosméticas tal como protección de la piel o la producción de champús o acondicionadores. EP-A 1 252 516 describe el revestimiento de ventanas, lentes de contacto, biosensores, dispositivos médicos, contenedores para realizar ensayos o para almacenamiento, cascos de buque, partículas sólidas o marco o cuerpo de automóviles con una solución conteniendo hidrofobina a 30 a 80°C. WO 03/53383 describe el uso de hidrofobina para tratar materiales de keratina en aplicaciones cosméticas. WO 03/10331 describe un sensor revestido con hidrofobina (un electrodo de medición, por ejemplo) al que otras sustancias, por ejemplo sustancias electro-activas, anticuerpo o enzimas, se unen no covalentemente. Ninguna de las referencias citadas describe materiales de construcción de mineral curado de tratamiento de superficie, piedra natural, piedra de hormigón o cerámica. Un objeto de la presente invención es proveer técnicas novedosas para tratar dichas superficies por las que se puede obtener al menos un efecto repelente a suciedad y/o hidrofobicízante y/o de conservación. Se ha descubierto que este objeto se logra por el uso de una hidrofobina para tratar una superficie de un material seleccionado a partir del grupo que consiste de materiales de construcción de mineral curado, piedra natural, piedra de hormigón o cerámica. En una modalidad preferida, una formulación que comprende una hidrofobina y también al menos un solvente se usa para ese propósito. En un segundo aspecto, la presente invención provee un proceso para tratar una superficie, el cual comprende contactar dicha superficie con al menos una hidrofobina, en donde dicha superficie comprende la superficie de un material seleccionado a partir del grupo que consiste de materiales de construcción de mineral curado, piedra natural, piedra de hormigón o cerámica. En un tercer aspecto, la presente invención provee una superficie revestida con al menos una hidrofobina, dicha superficie que comprende materiales de construcción de mineral curado, piedra natural, piedra de hormigón o cerámica. De manera sorprendente se descubrió que, incluso cantidades extremadamente pequeñas de hidrofobinas, son suficientes para un tratamiento repelente a suciedad efectivo de superficies duras y/o hidrofobicizar y/o conservar las superficies de materiales de construcción de mineral curado, piedras o cerámicas Una descripción detallada de la presente invención sigue De acuerdo con la presente invención, por lo menos una hidrofobina se usa para tratar la superficie de materiales de construcción de mineral curado, piedra natural, piedra de hormigón o cerámica También se puede usar una mezcla de una pluralidad de hidrofobmas diferentes El término "hidrofobinas" como se usa en la presente se debe referir mas adelante a polipéptidos de la fórmula general estructural (I) Xn-C - -t 5Q-C -Xo 5_C -Xi ?oo"C -X-i 100-C -Xi 50-C -XQ S_C -XI 50-C -Xm (I) en donde X puede ser cualquiera de los 20 aminoácidos que ocurren de manera natural (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, lie, Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly) Cada X puede ser la misma o diferente Los índices junto a X indican en cada caso el número de aminoácidos, C representa cisteína, alanina, sepna, glicina, metiomna o treonina sujeto a la condición de que por lo menos cuatro de los aminoácidos identificados por C son cisteína, y los índices n y m son independientemente números naturales en la escala de 0 a 500 y de preferencia en la escala de 15 a 300 Los polipéptidos de la fórmula (I) se caracterizan además por la propiedad (después de revestir una superficie de vidrio) de aumentar el ángulo de contacto de una gota de agua por al menos 20°, de preferencia al menos 25°, más preferible al menos 30° y muy preferible al menos 35°, en comparación con el ángulo de contacto formado por una gota de agua del mismo tamaño con la superficie de vidrio no revestida, cada medición siendo llevada a cabo a temperatura ambiente. Los aminoácidos indicados C1 a C8 son de preferencia cisteínas; pero también pueden ser reemplazados por otros aminoácidos de volumen similar, de preferencia por alanina, serina, treonina, metionina o glicina. Sin embargo, por lo menos cuatro, de preferencia al menos 5, más preferible al menos 6 y en especial por lo menos 7 de las posiciones C1 a C8 deben consistir de cisteínas. Las cisteínas en proteínas usadas de conformidad con la presente invención pueden estar presentes en forma reducida o formar puentes de disulfuro entre sí. Se da particular preferencia a formación intramolecular de puentes C-C, en particular involucrando al menos uno, de preferencia 2, más preferible 3 y muy preferible 4 puentes de disulfuro intramoleculares. En el caso del intercambio antes descrito de cisteínas para aminoácidos de volumen similar, es ventajoso para dichas posiciones C estar involucradas en un intercambio en forma de par ya que son capaces de formar puentes de dísulfuro intramoleculares entre sí. Cuando se usan cisteínas, serinas, alaninas, glicinas, metioninas o treoninas en las posiciones designadas X, la numeración de las posiciones C individuales en las fórmulas generales puede cambiar por consiguiente. Se da preferencia a usar hidrofobinas de la fórmula general (II) C -X3.25-C -XQ-2- C3 V Xn "? Yo-2- ft.- -?3.35- f- -? Vr (ll) en donde X, C y los índices junto a X son cada uno como se definió antes, los índices n y m representan números en la escala de 0 a 300, y las proteínas se distinguen además por el cambio de ángulo de contacto mencionado antes. Se da preferencia a usar hidrofobinas de la fórmula general (lll) Xn-C -X5-9-C -C -X11-39-C -X2. 3"C -X5.9-C -C -?6-18"C -Xr (lll) en donde X, C y los índices junto a X son cada uno como se definió antes, los índices n y m representan números en la escala de 0 a 200, las proteínas se distinguen además por el cambio de ángulo de contacto antes mencionado y además al menos seis de los aminoácidos indicados C son cisteína. Es particularmente preferible para todos los aminoácidos indicados C ser cisteína. Los residuos Xn y Xm pueden ser secuencias de péptído que se ligan naturalmente a una hidrofobina. Sin embargo, uno o ambos de los residuos Xn y Xm pueden ser secuencias de péptido que no se ligan naturalmente a una hidrofobina. Esto también incluye residuos de Xn y/o Xm en donde una secuencia de péptído que ocurre de manera natural en una hidrofobina se extiende por una secuencia de péptido no ocurriendo de manera natural en una hidrofobina. Cuando Xn y/o Xm son secuencias de péptido que no ocurren de manera natural en hidrofobinas, la longitud de dichas secuencias por lo general es al menos 20 aminoácidos, de preferencia por lo menos 35 aminoácidos, más preferible al menos 50 aminoácidos y muy preferible por lo menos 100 aminoácidos. Un residuo de esta clase, que no está ligado de manera natural a una hidrofobina, también será referido como una porción de pareja de fusión más adelante. Esto es para articular el hecho de que las proteínas consisten de una porción de hidrofobina y una porción de pareja de fusión que no ocurren juntas en esta forma en naturaleza. La porción de pareja de fusión se puede seleccionar a partir de una multiplicidad de proteínas. También es posible para una pluralidad de porciones de pareja de fusión ligarse a una porción de hidrofobina, por ejemplo, a la terminal de aminoácido (Xn) o a la terminal carboxi (Xm) de la porción de hidrofobina. Pero también es posible, por ejemplo, ligar dos porciones de pareja de fusión a una posición (Xn o Xm) de la proteína usada de conformidad con la presente invención. Las porciones de pareja de fusión particularmente adecuadas son polipéptidos que ocurren de manera natural en microorganismos, en particular en E. coli o Bacillus subtilis. Ejemplos de dichas porciones de pareja de fusión son las secuencias yaad (SEC ID NO: 15 y 16), yaae (SEC ID NO: 17 y 18) y tioredoxina. También altamente adecuados son fragmentos o derivados de las secuencias antes mencionadas que comprenden sólo una porción, de preferencia 70% a 99% y más preferible 80% a 98% de dichas secuencias, o en donde aminoácidos individuales o nucleótidos se han alterado en comparación con la secuencia mencionada. Las proteínas usadas de conformidad con la presente invención se pueden modificar adicionalmente en su secuencia de polipéptido, por ejemplo, mediante glicosilación, acetilación o ya sea por entrelazamiento químico, por ejemplo con glutaraldehído. Una propiedad de las proteínas usadas de conformidad con la presente invención es el cambio en propiedades de superficie cuando las superficies se revisten con las proteínas. El cambio en propiedades de superficie se puede determinar experimentalmente al medir el ángulo de contacto de una gota de agua antes y después de revestir la superficie con la proteína y determinar la diferencia entre las dos mediciones. Un experto en la técnica conocerá en principio cómo realizar mediciones de ángulo de contacto. Las condiciones experimentales precisas para medir el ángulo de contacto se describen en la porción experimental. Bajo las condiciones mencionadas aquí, las proteínas usadas de conformidad con la presente invención tienen la propiedad de aumentar el ángulo de contacto de una gota de agua en una superficie de vidrio por al menos 20°, de preferencia por lo menos 25° y más preferible por lo menos 30°.

Las posiciones de los aminoácidos polares y apolares en la porción de hidrofobina de las hidrofobinas conocidas a la fecha se conservan, resultando en un gráfico de hidrofobicidad característica. Las diferencias en propiedades biofísicas e hidrofobicidad condujeron a las hidrofobinas conocidas a la fecha a clasificarse en dos clases, I y II (Wessels et al., Ann. Rev. Phytopathol., 1994, 32, 413-437). Las membranas ensambladas de hidrofobinas de clase I son altamente insolubles (incluso en una solución acuosa de 1% en peso de n-dodecil sulfato de sodio (SDS) a una temperatura elevada y sólo se puede desasociar una vez más por medio de ácido trifluoroacético concentrado (TFA) o ácido fórmico). En contraste, las formas ensambladas de hidrofobinas de clase II son menos estables. Se pueden disolver una vez más por medio de justo 60% en peso de etanol o 1% en peso de SDS (a temperatura ambiente). La comparación de las secuencias de aminoácidos revela que la longitud de la región entre cisteína C3 y cisteína C4 es distintamente más corta en hidrofobinas de clase II que en hidrofobinas de clase I. Las hidrofobinas de clase II tienen además más aminoácidos cargados que la clase I. Las hidrofobinas particularmente preferidas para mostrar la presente invención son aquellas del tipo dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basfl, basf2, que se caracterizan estructuralmente en el listado de secuencia más adelante. También sólo pueden ser partes o derivados de las mismas. También es posible ligar una pluralidad de hidrofobina, de preferencia 2 ó 3, de la misma o diferente estructura y a una secuencia de polipéptido adecuada correspondiente que no se conecta de manera natural a una hidrofobina. De particular idoneidad para la práctica de la presente invención son además las proteínas de fusión teniendo las secuencias de polipéptido indicadas en SEC ID NO: 20, 22, 24 y también las secuencias de ácido nucleico codificando para las mismas, en particular las secuencias que codifican a SEC ID NO: 19, 21, 23. Las modalidades particularmente preferidas incluyen además proteínas que, partiendo de las secuencias de polipéptido indicadas en SEC ID NO: 20, 22 ó 24, resultan de la sustitución, inserción u omisión de al menos, hasta 10, preferiblemente 5, más preferible 5% de todos los aminoácidos y que todavía posee por lo menos 50% de la propiedad biológica de las proteínas de partida. La propiedad biológica de las proteínas usadas de conformidad con la presente invención en la presente se debe entender como significando el cambio antes mencionado en el ángulo de contacto por al menos 20°.

Los polipéptidos usados de conformidad con la presente invención se pueden preparar químicamente por técnicas familiares de síntesis de péptido, por ejemplo, por síntesis de fase sólida de Merrifield. Las hidrofobinas que ocurren de manera natural se pueden aislar de fuentes naturales usando métodos adecuados. Como un ejemplo, ver Wósten et al., Eur. J Cell Bio. 63, 122-129 (1994) o WO 96/41882.

Las proteínas de fusión que ocurren de manera no natural se pueden preparar de preferencia por procesos de ingeniería genética en donde una secuencia de ácido nucleico, en particular una secuencia de ADN, codificando para la pareja de fusión y una secuencia de ácido nucleico, en particular una secuencia de ADN, codificando para la porción de hidrofobina se combinan de modo que la proteína deseada se genera en un organismo huésped por expresión de genes de la secuencia de ácido nucleico combinada. Dicho método de hacer se describe en nuestra solicitud anterior DE 102005007480.4. Organismos huésped adecuados, o productores, para el método de hacer procariotas (incluyendo Archaea) o eucariotas, en particular bacteria incluyendo halobacteria y metanococci, hongos, células de insecto, células vegetales y células de mamífero, más preferible Escherichia coli, Bacillus subtillis, Bacíllus megaterium, Aspergillus oryzea, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Pichia pastoris, Pseudomonas spec., lactobacilli, Hansenula polymorpha, Trichoderma reesei, SF9 (o células relacionadas), y así sucesivamente. Para los propósitos de la presente invención las construcciones de expresión obtenidas, bajo el control genético de secuencias de ácido nucleico reguladoras, una secuencia de ácido nucleico codificando para un polipéptido usado de conformidad con la presente invención, y también vectores comprendiendo al menos una de estas construcciones de expresión se pueden usar para preparar hidrofobinas. Las construcciones de expresión usadas comprenden de preferencia un promotor 5' ascendente de la secuencia codificadora particular y una secuencia terminadora 3' descendente de la secuencia codificadora particular y también, de ser apropiado, más elementos reguladores de costumbre, cada uno ligado operativamente a la secuencia codificadora. "Ligadura operativa" se refiere a la disposición en secuencia de promotor, secuencia codificadora, terminador y, de ser apropiado, más elementos reguladores de modo que cada uno de los elementos reguladores es capaz de cumplir su función según se requiera en expresar la secuencia codificadora. Ejemplos de secuencias que se pueden ligar operativamente son secuencias focalizadoras y también potenciadores, señales de poliadenilación y similares. Otros elementos reguladores comprenden marcadores que se pueden seleccionar, señales de amplificación, orígenes de réplica y similares. Se describen secuencias reguladoras adecuadas, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Además de estas secuencias reguladoras, la regulación natural de estas secuencias todavía puede estar presente ascendente de los genes estructurales reales y, de ser apropiado, se pudo haber modificado genéticamente de modo que la regulación natural se ha cambiado y se ha realzado la expresión de los genes. Una construcción de ácido nucleico preferida ventajosamente comprende también una o más de las secuencias potenciadoras antes mencionadas que se ligan funcionalmente al promotor y que permiten una expresión potenciada de la secuencia de ácido nucleico Secuencias ventajosas adicionales tales como elementos reguladores o terminadores también se pueden insertar en el extremo 3' de las secuencias de ADN Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en la construcción en una o más copias La construcción puede comprender además marcadores adicionales tales como resistencias antibtóticas o genes complementarios de auxotrofía, si es apropiado para el propósito de seleccionar dicha construcción Secuencias ventajosamente reguladoras para el proceso están presentes, por ejemplo, en promotores tales como cos, tac, trp, tet, trp- tet, Ipp, lac, Ipp-lac, laclq-T7, T5, T3, gal, tre, ara, rhaP (rhaPBAD) SP6, lambda-PR o promotor imlambda-P, los cuales promotores se usan ventajosamente en bacteria Gram-negativa Otras secuencias reguladoras ventajosas están presentes, por ejemplo, en los promotores Gram-positivos amy y SP02, en los promotores de levadura u hongo ADC1, MFalfa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH También es posible usar promotores artificiales para regulación Para expresar la construcción de ácido nucleico en un organismo huésped, se inserta ventajosamente en un vector, por ejemplo, un plásmido o fago, lo que permite expresión óptima de los genes en el huésped. Los vectores, así como plásmidos y fagos, incluyen además todos los otros vectores conocidos per se, es decir, por ejemplo, virus, tales como SV40, CMV, baculovírus y adenovírus, transposons, elementos IS, fásmidos, cósmicos, y ADN lineal o circular, y también el sistema Agrobacterium. Estos vectores se pueden replicar autónomamente en el organismo huésped o cromosómicamente. Estos vectores constituyen otra forma de la invención. Ejemplos de plásmidos adecuados son, en E. coli, pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRe?4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, plN-lll"3-B1 , tgt 11 o pBdCI, en Streptomyces, pl J 101 , plJ364, pl J702 o pl J361 , en Bacillus pUB110, pC194 o pBD214, en Corynebacterium pSA77 o pAJ667, en hongos pALS1, plL2 o pBB116, en levaduras 2alfa, pAG-1, YEp6, YEp13 o pEMBLYe23 o en plantas pLGV23, pHGIac + , pBIN19, pAK2004 o pDH51. Los plásmidos mencionados constituyen una selección pequeña de los plásmidos posibles. Otros plásmidos son conocidos per se y se pueden descubrir, por ejemplo, en el libro Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, ?msterdam-Nueva York-Oxford, 1985, ISBN 0444904018). Para expresar los otros genes que están presentes, la construcción de ácido nucleico ventajosamente comprende además secuencias reguladoras de terminal 3' y/o 5' para realzar la expresión que se seleccionan para expresión óptima de conformidad con la elección de organismo huésped y gen o genes.

Estas secuencias reguladoras deben permitir a los genes y expresión de proteína expresarse específicamente. Dependiendo del organismo huésped, esto puede significar, por ejemplo, que el gen se exprese o sobreexprese sólo después de inducción, o que se exprese y/o sobreexprese de inmediato. Es preferiblemente la expresión de los genes que se han introducido la que se puede influenciar positivamente y así realzar por las secuencias reguladoras o factores. Los elementos reguladores así se pueden realzar ventajosamente en el nivel de transcripción al usar señales de transcripción fuertes tales como promotores y/o potenciadores. Sin embargo, además de esto, también es posible realzar la traducción al mejorar la estabilidad del mARN, por ejemplo. En otra forma del vector, el vector que comprende la construcción de ácido nucleico o el ácido nucleico también se puede introducir ventajosamente en los microorganismos en la forma de un ADN lineal e integrarse en el genoma del organismo huésped vía recombinación heteróloga u homologa. Este ADN lineal puede consistir de un vector linealizado tal como un plásmido o solamente de la construcción de ácido nucleico o el ácido nucleico. Para expresión óptima de genes heterólogos en organismos, es ventajoso modificar las secuencias de ácido nucleico de conformidad con el uso de codón específico utilizado en el organismo. El uso de codón se puede determinar prontamente con la ayuda de análisis a computadora de otros genes conocidos del organismo en cuestión.

Una cinta de expresión se prepara al fusionar un promotor adecuado a una secuencia de nucleótido codificadora adecuada y a un terminador o señal de poliadenilación. Se usan para este propósito técnicas de recombinación y clonación comunes como se describe en, por ejemplo, T. Maniatis, E. F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) y también en T. J. Silhavy, M. L. Berman y L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) y en Ausubel, F. M. y otros, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. y Wiley Interscience (1987). Para lograr expresión en un organismo huésped adecuado, la construcción de ácido nucleico recombinante, o construcción de gen, se inserta ventajosamente en un vector específico de huésped que provee expresión óptima de los genes en el huésped. Vectores son conocidos per se y se pueden tomar, por ejemplo, de "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. y otros, Eds, Elsevier, Ámsterdam-Nueva York-Oxford, 1985). Es posible preparar, con la ayuda de los vectores, microorganismos recombinantes que son, por ejemplo, transformados con al menos un vector y que se pueden usar para producir los polipéptidos usados de conformidad con la invención. Ventajosamente, las construcciones recombinantes descritas antes se introducen en un sistema huésped adecuado y se expresan. En esta conexión, de preferencia se usan métodos de clonación y transfección familiares conocidos a un experto en la técnica, tales como, por ejemplo, coprecipitación, fusión de protoplasto, electroporación, transfección retroviral y similares, a fin de causar que dichos ácidos nucleicos se expresen en el sistema de expresión particular. Se describen sistemas adecuados, por ejemplo, en Current Protocols ¡n Molecular Biology, F. Ausubel y otros, Eds., Wiley Interscience, Nueva York 1997, o Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spríng Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. También es posible preparar microorganismos homólogamente recombinados. Para este propósito, se prepara un vector que comprende por lo menos una sección de un gen a usarse de conformidad con la invención o de una secuencia codificadora en donde, si es apropiado, por lo menos una omisión de aminoácido, adición de aminoácido o sustitución de aminoácido se ha introducido a fin de modificar, por ejemplo trastornar funcionalmente, la secuencia (vector de golpe). La secuencia introducida, por ejemplo, también puede ser un homólogo de un microorganismo relacionado o se puede derivar de una fuente de mamífero, levadura o insecto. Alternativamente, el vector usado para recombinación homologa se puede diseñar en tal manera que el gen endógeno, en el caso de recombinación homologa, se muta o de lo contrario altera pero todavía codifica la proteína funcional (por ejemplo, la región reguladora ascendente pudo haber sido alterada en tal manera que la expresión de la proteína endógena así se altera). La sección alterada del gen usado de conformidad con la invención está en el vector de recombinación homologa. La construcción de vectores que son adecuados para recombinación homologa se describe, por ejemplo, en Thomas, K.R. y Capecchi, M.R. (1987) Cell 51:503. Los organismos huésped recombinantes adecuados para el ácido nucleico usado de conformidad con la invención o la construcción de ácido nucleico son en principio cualquier organismo procariótico o eucariótico. Ventajosamente, los microorganismos tales como bacteria, hongos o levaduras se usan como organismos huésped. También se usan ventajosamente bacteria Gram-positiva y Gram-negativa, de preferencia bacteria de las familias Enterobacteriaceae, Psudomonadeceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae o Nocardiaceae, en particular preferiblemente bacteria del género Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium o Rhodococcus. Los organismos usados en el proceso de preparar proteínas de fusión son, dependiendo del organismo huésped, crecidos o cultivados en una manera conocida al experto en la técnica. Los microorganismos usualmente son crecidos en un medio líquido que comprende una fuente de carbón, usualmente en la forma de azúcares, una fuente de nitrógeno, usualmente en la forma de fuentes de nitrógeno orgánico tales como extracto de levadura o sales tales como sulfato de amonio, elementos de rastro tales como sales de hierro, sales de manganeso y sales de magnesio y, si es apropiado, vitaminas, a temperaturas de entre 0°C y 100°C, de preferencia entre 10°C y 60°C, al mismo tiempo siendo suministrado con oxígeno. En esta conexión, el pH del líquido nutriente se puede mantener a un valor fijo, es decir, se puede o no regular durante el cultivo. El cultivo se puede llevar a cabo en forma de lote, en forma de semilote o continuamente. Los nutrientes se pueden introducir inicialmente al comienzo de la fermentación o alimentarse posteriormente en una manera semicontinua o continua. Las enzimas se pueden aislar de los organismos por el proceso descrito en los ejemplos o usarse para la reacción como un extracto crudo. También son adecuados procesos para preparar recombinantemente polipéptidos o fragmentos biológicamente activos, funcionales de los mismos, con un microorganismo produciendo polipéptido siendo cultivado, expresión de los polipéptidos siendo inducidos si es apropiado y dichos polipéptidos siendo aislados del cultivo. También se pueden producir polipéptidos en esta manera en una escala industrial si esto se desea. El microorganismo recombinante se puede cultivar y fermentar por métodos conocidos. Se puede propagar bacteria, por ejemplo, en medio TB o medio LB y a una temperatura de 20 a 40°C y un pH de 6 a 9. Se describen condiciones de cultivo adecuadas en detalle, por ejemplo, en T. Maniatis, E.F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989). Si los polipéptidos no son secretados en el medio de cultivo, entonces las células se trastornan y el producto se obtiene del lisato por procesos de aislamiento de proteína conocidos. Las células se pueden trastornar, según se desee, por medio de ultrasonido de frecuencia alta, por medio de presión alta, tal como, por ejemplo, en una célula de presión francesa, por medio de osmolisis, por la acción de detergentes, enzimas líticas o solventes orgánicos, por medio de homogenizadores o por una combinación de dos o más de los procesos listados. Se pueden purificar polipéptidos usando métodos cromatográficos conocidos tales como cromatografía de tamiz molecular (filtración de gel), tal como cromatografía de Q Sefarosa, cromatografía de intercambio de iones y cromatografía hidrofóbica, y también usando otros métodos de costumbre tales como ultrafiltración, precipitación por sales, diálisis y electroforesis de gel nativa. Procesos adecuados se describen, por ejemplo, en Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlín, Nueva York o en Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, Nueva York, Heidelberg, Berlín. Puede ser ventajoso aislar la proteína recombinante al usar sistemas de vector u oligonucleótidos que extienden el cADN por secuencias de nucleótido particulares y así codifican polipéptidos alterados o proteínas de fusión que se usan, por ejemplo, para simplificar la purificación. Ejemplos de modifícaciones adecuadas de esta clase son "etiquetas" actuando como anclas, tal como la modificación conocida como el ancla de hexa-histidina, o epitopos que se pueden reconocer como antígenos por anticuerpos (descritos, por ejemplo, en Harlow, E y Lañe, D , 1988, Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (NY) Press) Otras etiquetas adecuadas son, por ejemplo, HA, calmodu n-BD, GST, MBD, quitin-BD, steptavidin-BD-avi-tag, Flag-tag, T7, etc Estas anclas se pueden usar para fijar las proteínas a un soporte sólido tal como una matriz de polímero, por ejemplo, que, por ejemplo, se puede empacar en una columna de cromatografía, o se puede usar en una placa de microtítulo o en otro soporte Los protocolos de purificación correspondientes se pueden obtener de los proveedores de etiqueta de afinidad comerciales Las proteínas preparadas como se describió se pueden usar directamente como proteínas de fusión o, después de cortar y eliminar la porción de pareja de fusión, como hidrofobmas "puras" Cuando se pretende eliminación de la porción de pareja de fusión, se aconseja incorporar un sitio de corte potencial (sitio de reconocimiento específico para proteasas) en la proteína de fusión entre la porción de hidrofobina y la porción de pareja de fusión Sitios de corte adecuados incluyen en particular aquellas secuencias de péptido que de lo contrario ocurren ni en la porción de hidrofobina ni en la porción de pajera de fusión, como se determina prontamente por medio de herramientas bioinformáticas Son particularmente adecuados, por ejemplo, corte BrCN en metionina o corte mediado con proteasa con factor Xa, corte de enterokinasa, trombina, corte de TEV (proteasa de virus por ataque de tabaco) Las superficies que, de conformidad con la presente invención, se deben tratar con hidrofobinas comprenden la superficie de un material seleccionado a partir del grupo que consiste de materiales de construcción de mineral curado, piedra natural, piedra de hormigón o cerámica. Dichas superficies encuentran en particular en el sector de construcción de edificios, tanto interiores como exteriores. Los materiales de construcción de mineral curado para los propósitos de esta invención son masas de tipo piedra obtenibles al mezclar esencialmente materiales de construcción inorgánicos con agua y curación posterior debido a reacciones químicas y/o físicas. Los materiales de partida son materiales de construcción hidráulicamente de curación que curan tanto en aire como en agua, o materiales de construcción que se curan en aire, que curan solamente en aire. Los materiales de construcción pueden comprender además materiales de construcción curados a vapor, por ejemplo. Ejemplos de dichos materiales de construcción curados comprenden en particular concreto o mortero, cada uno obtenible de cemento, tal como cemento Pórtland, cemento de alúmina o cemento Puzzolan y sus mezclas con agregados ásperos tales como arena, grava o materiales expandidos así como agua. En manera conocida pueden comprender además materiales auxiliares inorgánicos y/u orgánicos, tales como superplastificadores de concreto, por ejemplo. Ejemplos adicionales de materiales de construcción curados comprenden yeso, cal o lo convierte para aplicaciones interiores y exteriores. La piedra natural comprende piedra que ocurre de manera natural tal como arenisca, granito, gneiss, pizarra, cal o mármol. Estas clases de piedra se pueden usar no sólo como piedra rota en una forma irregular, sino también en la forma de componentes estructurales moldeados, por ejemplo, como piedra de construcción, alféizar, escalones, parapetos, marcos de puerta, bloques para pavimento, bloques para pisos, bloques para techos, elementos decorativos o esculturas. La piedra de hormigón comprende componentes estructurales que se pueden usar de manera similar a piedra natural, pero que no provienen de fuentes naturales sino se fabrican por lo general industrialmente. Ejemplos comprenden azulejos, clínker, ladrillo de arena-cal, bloque de concreto, bloque de concreto aireado o bloque de arcilla expandida. El término "cerámica" es conocido en principio a un experto en la técnica. Cerámica es una designación colectiva para artículos hechos de compuestos inorgánicos no metálicos y normalmente hechos listos para usarse por operaciones a temperatura alta. La cerámica puede ser materiales de arcilla-cerámica, teniendo al menos 20% en peso de mineral de arcilla en la mezcla cruda, y materiales de especialidad de cerámica, que están libres de mineral de arcilla o tienen solamente un contenido de mineral de arcilla bajo. La cerámica puede ser fina o áspera, porosa o densa. Los materiales de cerámica, como serán conocidos en principio, pueden tener vidriado. Los vidriados pueden ser coloreados así como sin color. Ejemplos de materiales de arcilla-cerámica comprenden artículos estructurales tales como ladrillo de pared de albañilería o clínker, tubos de arcilla, ladrillo de chamotte, tejas para techo, productos de alfarería, productos de piedra de arcilla, productos de piedra de cal, piedras de feldespato, cerámica de gres, porcelana dura, porcelana blanda o azulejos, que también pueden ser vidriados. Ejemplos de artículos de cerámica de especialidad comprenden piedra de sílice, carburo de silicio unido a arcilla, piedra colada por fusión, aislantes de óxido-cerámica, filtros de cerámica, materiales de carburo-cerámica, electrocerámica, cerámica de imán o cerámica dental. Se pueden encontrar más detalles concernientes a cerámica, por ejemplo, en Büchner y otros, " Industrielle Anorganische Chemie", VCH Verlag, Weinheim, Nueva York 1986, páginas 431 a 476. Las superficies se pueden hacer de varios materiales diferentes. Un ejemplo es una pared con azulejo que comprende una superficie hecha de azulejos de cerámica y mortero de azulejo. Las superficies pueden comprender además diferentes clases de materiales, por ejemplo, partes incrustadas de metal. Se pueden usar hidrofobinas en sustancia cuando se usan de conformidad con la presente invención para el tratamiento repelente a suciedad de superficies duras. Sin embargo, preferiblemente, las hidrofobinas se usan como formulaciones o composiciones en al menos un solvente adecuado. La elección de hidrofobinas para abarcar la invención no está restringida. Es posible usar una hidrofobina o de lo contrario una pluralidad de diferentes. Un experto en la técnica hará una elección adecuada. Por ejemplo, es posible usar proteínas de fusión tales como, por ejemplo, yaad-Xa-dewA-his (SEC ID NO: 19) o yaad-Xa-rodA-his (SEC ID NO: 21), en cuyo caso la pareja de fusión yaad también puede estar en un estado acortado. Los solventes para formulaciones pueden comprender agua y/o solventes orgánicos. También se pueden usar mezclas de solvente. La identidad del solvente depende de la hidrofobina, la identidad de la superficie a tratarse y también el uso, y se selecciona apropiadamente por un experto en la técnica. El solvente comprende de preferencia agua o mezclas de agua y solventes orgánicos miscibles en agua. Ejemplos de dichos solventes orgánicos comprenden alcoholes monohídricos o polihídricos miscibles en agua, por ejemplo, metanol, etanol, n-propanol, i-propanol, etilen glicol, propilen glicol o glicerol. También son una posibilidad alcoholes de éter. Ejemplos comprenden éteres monoalquílicos de (pol i )et ilen o (poli)propilen glicoles tal como éter monobutílico de etilen glicol. La identidad y cantidad de los solventes solubles en agua y de los orgánicos se eligen por un experto en la técnica. Para preparar la composición usada de conformidad con la presente invención, se puede preferir emplear las soluciones de hidrofobina acuosas como sintetizadas, aisladas y/o purificadas. Estas todavía pueden comprender, dependiendo de su pureza, residuos de auxiliares de la síntesis. Pero también es posible aislar las hidrofobinas al inicio como sustancia, por ejemplo, secado en frío, y para que sólo se formulen en un segundo paso. La cantidad de hidrofobina en la formulación se puede determinar por un experto en la técnica de conformidad con la identidad de la superficie y/o el uso planeado. Pero incluso cantidades relativamente pequeñas serán suficientes para lograr un efecto repelente a suciedad. Una cantidad de 0.0001% a 1% en peso con base en la suma total de todos los constituyentes de la formulación se ha descubierto satisfactoria sin la invención así siendo restringida a esta escala. La cantidad está de preferencia en la escala de 0.0005% a 0.5% en peso y más preferible en la escala de 0.001% a 0.1% en peso. La formulación puede comprender además opcionalmente otros componentes, por ejemplo, materiales y/o asistentes de mezcla. Ejemplos de dichos componentes comprenden en particular agentes tensioactivos, por ejemplo, aniónicos, no iónicos, anfotéricos y/o catiónicos. Ejemplos de otros materiales de mezcla comprenden ácidos o bases, por ejemplo ácidos carboxílicos o amoníaco, sistemas reguladores, polímeros, partículas inorgánicas tales como S¡O2 o silicatos, colorantes, fragancias o biocidas. De acuerdo con la presente invención, se tratan superficies duras en una manera repelente a suciedad al contactar la superficie dura con una composición que comprende por lo menos una hidrofobina y también al menos un solvente El contacto es gobernado por el tipo de artículo Se puede realizar, por ejemplo, mediante aspersión, enjuague o limpieza de la superficie con la composición o de lo contrario al sumergir el artículo entero en la formulación El último naturalmente sólo es posible con artículos que no se han instalado El tiempo de tratamiento es decidido por un experto en la técnica Puede tardar algunos segundos a varias horas Después del tratamiento, la superficie se puede enjuagar, con agua, por ejemplo, para eliminar el exceso de solución de tratamiento El tratamiento también se puede realizar en combinación con una limpieza de la superficie Esto se hace usando la composición limpiadora que comprende como se describió antes por lo menos una hidrofobina, por lo menos un agente tensioactivo y también al menos un solvente El tratamiento se puede llevar a cabo fuera a temperaturas inferiores a temperatura ambiente, a temperatura ambiente o temperaturas elevadas, por ejemplo a 20 a 100°C, de preferencia 20 a 60°C Después del tratamiento con la composición, se seca la superficie tratada El secado de la superficie tratada puede ocurrir casi a temperatura ambiente, o el secado también se puede llevar a cabo a temperaturas elevadas El tratamiento y también, si es apropiado, el secado de la superficie se puede seguir por un post-tratamiento térmico de la superficie a temperaturas elevadas, por ejemplo, a temperaturas de hasta 120°C. El post-tratamiento térmico también se puede llevar a cabo combinado con el secado. Las temperaturas de post-tratamiento térmico de preferencia están en la escala de 30 a 100°C, más preferible en la escala de 40 a 80°C y por ejemplo en la escala de 50 a 70°C. El tiempo de tratamiento es decido por un experto en la técnica, y puede estar en la escala de 1 minuto a 10 horas, por ejemplo. Se puede realizar lo térmico después de tratamiento, dependiendo de la naturaleza del tratamiento, por ejemplo, al irradiar la superficie con un radiador IR o soplar con chorros de aire tibio. El proceso de la presente invención provee una superficie seleccionada a partir del grupo que consiste de materiales de construcción de mineral curado, piedra natural, piedra de hormigón o cerámica que comprende un revestimiento que comprende por lo menos una hidrofobina. El revestimiento por lo general comprende al menos una capa monomolecular de hidrofobina en la superficie. El efecto repelente a suciedad se puede determinar por medio de métodos conocidos en principio, por ejemplo, al comparar el desprendimiento de suciedad al enjuagar con agua para una superficie no tratada contra una superficie tratada con hidrofobinas. El grado de hidrofobicización se puede determinar en una manera conocida al medir el ángulo de contacto. El tratamiento de conformidad con la presente invención es particularmente útil para superficies de cerámica, por ejemplo para azulejos, en donde se obtiene tanto un efecto repelente a suciedad como hidrofobicizante. Esto es una ventaja significativa particularmente en habitaciones húmedas, tales como baños, por ejemplo. Los ejemplos que siguen ilustran la invención: Parte A: Preparación y prueba de hidrofobinas usadas de acuerdo con la invención Ejemplo 1 Trabajo preliminar para la clonación de vaad-HiSfi/yaaE-HiSB Se llevó a cabo una reacción en cadena de polimerasa con la ayuda de los oligonucleótidos Hal570 y Hal571 (Hal 572/Hal 573). El ADN molde usado fue ADN genómico de la bacteria Bacillus subtilis. El fragmento de PCR obtenido comprendió la secuencia codificadora del gen Bacillus subtilis yaaD/yaaE y, en su terminal, en cada caso un Ncol y, respectivamente, sitio de corte de restricción Bglll. El fragmento de PCR se purificó y cortó con las endonucleasas de restricción Ncol y Bglll. Este fragmento de ADN se usó como inserto y se clonó en el vector pQE60 de Qiagen, que se había linearizado previamente con las endonucleasas de restricción Ncol y Bglll. Los vectores así obtenidos, pQE60YAAD#2/pQE60YaaE#5, se puede usar expresando proteínas consistiendo de YAAD::HIS6 y YAAE::HIS6, respectivamente.

Hal570 gcgcgcccatggctcaaacaggtactga Hal571 gcagatctccagccgcgttcttgcatac Hal572 ggccatgggattaacaataggtgtactagg Hal573 gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc Ejemplo 2 Clonación de yaad hidrofobina DewA-HiSs Se llevó a cabo una reacción en cadena de polimerasa con el oligonucleótido KaM 416 y KaM 417 El ADN molde usado fue ADN genómico del molde Aspergillus nidulans El fragmento de PCR obtenido comprendió la secuencia codificadora del gen de hidrofobina dewA y un sitio de corte de proteinasa Xa de factor de terminal N El fragmento de PCR se purificó y cortó con la endonucleasa de restricción BamHl Este fragmento de ADN se usó como inserto y se clonó en el vector pQE60YAAD#2 previamente hneapzado con la endonucleasa de restricción Bglll El vector así obtenido, #508, se puede usar para expresar una proteína de fusión que consiste de YAAD Xa dewA HIS6 KaM416 GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGC KaM417 CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCC GC Ejemplo 3 Clonación de yaad hidrofobina RodA-His^ El plásmido #513 se clonó análogamente al plásmido #508, usando los oligonucleótidos KaM 434 y KaM 435.

KaM434: GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC KaM435: CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG Ejemplo 4 Clonación de yaad hidrofobina BASF1-Hisg El plásmido #507 se clonó análogamente al plásmido #508, usando los oligonucleótidos KaM 417 y KaM 418. El ADN molde empleado fue una secuencia de ADN artificialmente sintetizada -hidrofobina BASF1 (ver apéndice).

KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCC GC KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG Ejemplo 5 Clonación de yaad hidrofobina BASF2-Hisg El plásmido #506 se clonó análogamente al plásmido #508, usando los o gonucleótidos KaM 417 y KaM 418. El ADN molde empleado fue una secuencia de ADN artificialmente sintetizada -hidrofobina BASF2 (ver apéndice).

KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCC GC KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG Ejemplo 6 Clonación de yaad hidrofobina SC3-His^ El plásmido #526 se clonó análogamente al plásmido #508, usando los oligonucleótidos KaM464 y KaM465. El ADN molde empleado fue cADN Schyzophyllum commune (ver apéndice).

KaM464: CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGC KaM465: GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT Ejemplo 7 Fermentación de la cepa recombinante E. coli yaad hidrofobina DewA-HisR Inoculación de 3 ml de medio líquido LB con una cepa E. coli expresando yaad hidrofobina DewA-His6 en 15 ml de tubos Greíner.

Incubación en un agitador a 200 rpm a 37°C durante 8 horas. En cada caso, 2 frascos Erlenmeyer de 1 ml con deflectores y 250 ml de medio LB (+ 100 µg/ml ampicilina) se inocularon con 1 ml de precultivo y se incubaron en un agitador a 180 rpm a 37°C durante 9 horas. Inocular 13.5 I de medio LB (_100 µg/ml de ampicilina) con 0.5 I de precultivo (OD600nm 1:10 medido contra H2O) en un fermentador de 20 I. Adición de 140 ml de 100 mM de IPTG a un OD6onm de -3.5. Después de 3 horas, enfriar fermentador a 10°C y eliminar caldo de fermentación mediante centrifugación. Usar perdigón de célula para purificación adicional.

Ejemplo 8 Purificación de la proteína de fusión hidrofobina recombinante (purificación de proteínas de fusión hidrofobina poseyendo una etiqueta Hís6 de terminal C) 100 g de perdigón de célula (100 - 500 mg de hidrofobina) se hicieron con 50 mM de regulador de fosfato de sodio, pH 7.5, a un volumen total de 200 ml y se resuspendieron. La suspensión fue tratada con un Ultraturrax tipo T25 (Janke y Kunkel; IKA-Labortechnik) durante 10 minutos y posteriormente, para los propósitos de degradar los ácidos nucleicos, incubados con 500 unidades de benzonasa (Merck, Darmstadt; orden No. 1.01697.0001) a temperatura ambiente durante 1 hora. Antes de la disrupcíón celular, se llevó a cabo una filtración usando un cartucho de vidrio (P1). Para los propósitos de trastornar las células y de cortar el ADN genómico restante, se llevaron a cabo dos vueltas del homogenizador a 1500 bar (Microfluidizer M-110EH; Microfluidics Corp.). El homogeneizado se centrifugó (Sorvall RC-5B, GSA Rotor, 250 ml de vaso de precipitados centrífugo, 60 minutos, 4°C, 12000 rpm, 23000 g), el sobrenadante se puso en hielo y el perdigón se resuspendió en 100 ml de regulador de fosfato de sodio, pH 7 5 Se repitieron la centrifugación y resuspensión tres veces, el regulador de fosfato de sodio comprendiendo 1% de SDS en la tercera repetición Después de resuspender, la solución se agitó durante una hora, seguido por una centrifugación final (Sorvall RC-5B, GSA Rotor, 250 ml vaso de precipitados centrífugo, 60 minutos, 4°C, 12000 rpm, 23000 g) De acuerdo con análisis SDS-PAGE, la hidrofobina está presente en el sobrenadante después de la centrifugación final (figura 1) Los experimentos muestran que la hidrofobina está presente en las células E coh correspondientes probablemente en la forma de cuerpos de inclusión 50 ml del sobrenadante conteniendo hidrofobina se aplicaron a una columna de 50 ml níquel-Sepharose High Performance 17-5268-02 (Amersham) equilibrada con 50 mM de regulador de Tps-CI, pH 8 0 La columna se lavó con 50 mM de regulador de Tps-CI, pH 80, y la hidrofobina fue eluada posteriormente con 50 mM de regulador de Tps-CI, pH 8 0, comprendiendo 200 mM de imidazol Para el propósito de eliminar el imidazol, la solución se dializó contra 50 mM de regulador de Tps-CI, pH 8 0 La figura 1 ilustra la purificación de la hidrofobina preparada Línea 1 solución aplicada a columna de níquel-Sefarosa (1 10 dilución) Línea 2: flujo = eluado de paso de lavado Líneas 3-5: picos OD 280 de fracciones de elución La hidrofobina de la figura 1 tiene un peso molecular de aproximadamente 53 kD. Algunas de las bandas más pequeñas representan productos de degradación de hidrofobina.

Ejemplo 9 Prueba de rendimiento: caracterización de la hidrofobina al cambiar el ángulo de contacto de una gota de aqua en vidrio Sustrato: Vidrio (vidrio de ventana, Süddeutsche Glas, Mannheim, Alemania): Concentración de hidrofobina: 100 µg/ml Incubación de portaobjetos de vidrio durante la noche (temperatura 80°C) en 50 mM de acetato de sodio (pH 4) + 0.1% en peso de Tween 20 seguido por, lavado de portaobjetos de vidrio con revestimiento de hidrofobina en agua destilada seguido por incubación: 10 min/80°C/1% en peso de solución acuosa de n-dodecil sulfato de sodio (SDS) en agua destilada lavado en agua destilada Las muestras se secan al aire (temperatura ambiente) y se someten a temperatura ambiente a una determinación del ángulo de contacto (en grados) de una gota de 5 µ\ de agua. La medición de ángulo de contacto se determinó en un sistema Dataphysics Contact Angle System OC 15 + , Software SCA 20.2.0. (Noviembre 2002). La medición se llevó a cabo de conformidad con las instrucciones del fabricante. El vidrio no tratado dio un ángulo de contacto de 30 ± 5°; un revestimiento con la hidrofobina funcional del ejemplo 8 (yaad-dewA-his6) dio ángulo de contacto de 75 ±5°.

Parte B: Uso de hidrofobinas para revestimiento repelente a suciedad en superficies duras Solución usada: Las pruebas de rendimiento se llevaron a cabo usando una solución en agua de la proteína de fusión yaad-Xa-dewA-his (SEC ID NO: 19) preparada de conformidad con el ejemplo 8. Concentración de la hidrofobina en solución: 100 µg/ml (0.01% en peso).

Superficie dura usada: Azulejo de cerámica, blanco brillante, 10 cm x 15 cm (de Novocker), limpiado con etanol y agua.

Suciedad usada: Las pruebas se llevaron a cabo usando suciedad de balasta IKW (de conformidad con Seifen, Fette, Ole, Wachse (SOFW) Journal, volumen 124, 14/98, página 1029).

Método de tratamiento Un azulejo tuvo 2 g de la solución de hidrofobina acuosa antes mencionada teniendo una concentración de 100 µg/ml sumergida en (1.3 µm de hidrofobina/cm2) y distribuida suavemente con una tela para cubrir toda la superficie. El azulejo entonces se dejó estar para secarse al aire durante 24 horas. El azulejo se enjuagó posteriormente con agua y se colocó durante 3 x 10 minutos en un vaso de precipitados de vidrio con agua. Se usó agua fresca para cada enjuague. El azulejo entonces se dejó secar al aire verticalmente.

Medición de ángulo de contacto y efecto repelente a suciedad El azulejo tratado dio una medición de ángulo de contacto contra una gota de agua (S µ\, método como se describió antes) de 56° (promedio de 10 mediciones). Para comparación, un azulejo no tratado tiene un ángulo de contacto de 20°. El azulejo así ha sido distintamente hidrofobicizado. El azulejo tratado y, en comparación, un azulejo no tratado cada uno se manchó con 50, 100 y 200 µg de suciedad de balasto IKW usando una pipeta de transferencia y se dejó secar a temperatura ambiente durante una hora. Los azulejos entonces se enjuagaron 3 veces con 500 ml de agua cada vez. Aunque esto no desprendió la suciedad de la superficie no tratada, se observó desprendimiento de suciedad parcial para el azulejo pretratado con hidrofobina. El pretratamiento con hidrofobina así condujo a adhesión de suciedad reducida en la superficie del azulejo. La asignación de nombres de secuencia a ADN y secuencias de polipéptido en listado de secuenciación secuencia de yaae polipéptido SEC ID NO: 18 secuencias de yaad-Xa-dewA-his ADN y polipéptido SEC ID NO: 19 secuencia de yaad-Xa-dewA-his polipéptido SEC ID NO: 20 secuencias de yaad-Xa-rodA-his ADN y polipéptido SEC ID NO: 21 secuencia de yaad-Xa-rodA-his polipéptido SEC ID NO: 22 secuencias de yaad-Xa-basf1 -his ADN y polipéptido SEC ID NO: 23 secuencia de yaad-Xa-basf1 -his polipéptido SEC ID NO: 24

Claims (2)

REIVINDICACIONES

1.- El uso de una hidrofobina para tratar una superficie de un material seleccionado a partir del grupo que consiste de materiales de construcción de mineral curado, piedra natural, piedra de hormigón o cerámica.

2.- El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicho tratamiento se realiza usando una composición que comprende un solvente así como al menos una hidrofobina. 3 - Un proceso para tratar una superficie, el cual comprende contactar dicha superficie con al menos una hidrofobina, en donde dicha superficie comprende la superficie de un material seleccionado a partir del grupo que consiste de materiales de construcción de mineral curado, piedra natural, piedra de hormigón o cerámica. 4.- El proceso de conformidad con la reivindicación 3, en donde dicho tratamiento se realiza usando una composición que comprende un solvente así como al menos una hidrofobina. 5.- El proceso de conformidad con la reivindicación 3 ó 4, en donde dicho solvente comprende agua. 6.- El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en donde la cantidad de hidrofobina en dicha composición está en la escala de 0.0001% a 1% en peso con base en la suma total de todos los constituyentes de dicha formulación. 7.- Una superficie revestida con al menos una hidrofobina, dicha superficie que comprende la superficie de un material seleccionado a partir del grupo que consiste de materiales de construcción de mineral curado, piedra natural, piedra de hormigón o cerámica. 8 - La superficie revestida de conformidad con la reivindicación 7, que se caracteriza por repelencia a suciedad. 9.- La superficie revestida de conformidad con la reivindicación 7 u 8, que se caracteriza por hidrofobicidad.