BRPI0617287A2 - uso de pelo menos uma hidrofobina ou de um derivado desta, processo para desespumar combustìvel, composição de aditivo, composição de combustìvel, e, processo para produzir pelo menos uma composição de combustìvel - Google Patents

Abstract

USO DE PELO MENOS UMA HIDROFOBINA OU DE UM DERIVADO DESTA, PROCESSO PARA DESESPUMR COMBUSTìVEL, COMPOSIçãO DE ADITIVO, COMPROSIçãO DE COMBUSTìVEL, E, PROCESSO PARA PRODUZIR PELO MENOS UMA COMPOSIçãO DE COMBUSTìVEL. A invenção diz respeito ao uso de uma hidrofobina ou um derivado desta como um agente antiespumante em composições aditivas ou em combustíveis, a um método para desespumar combustíveis, um aditivo e composição de combustível contendo uma hidrofobina ou derivado desta e pelo menos um aditivo de combustível adicional e a um método para produzir uma composição de combustível.

Description

"USO DEBELO MENOS UMA HIDROFOBINA OU DE UM DERIVADO DESTA, PROCESSO PARA DESESPUMAR COMBUSTÍVEL, COMPOSIÇÃO DE ADITIVO, COMPOSIÇÃO DE COMBUSTÍVEL, E, PROCESSO PARA PRODUZIR PELO MENOS UMA COMPOSIÇÃO DE COMBUSTÍVEL'1

A presente invenção diz respeito ao uso de pelo menos uma hidrofobina ou de um derivado desta como um desespumante em composições aditivas ou combustíveis, a um processo para desespumar combustíveis, às composições de aditivo e combustível que compreendam φΙΟ pelo menos uma hidrofobina ou derivado desta e pelo menos um outro aditivo de combustível e também a um processo para produzir pelo menos uma composição combustível.

As misturas de hidrocarboneto usadas como combustível, que também podem incluir axomáticos, diesel e querosene, têm a propriedade desagradável de desenvolver espuma em conjunção com ar quando as mesmas são transferidas em recipientes de estoque tais como tanques de armazenagem - e tanques de combustível de veículos motores. Isto leva ao retardo da operação de transferência e ao enchimento insatisfatório dos vasos. É portanto habitual adicionar desespumantes ao combustível diesel. Estes desespumantes ^20 devem ser ativos na concentração mínima e não devem formar nenhum resíduo nocivo no curso da combustão do combustível diesel no motor ou adversamente afeta a combustão do combustível. Os desespumantes correspondentemente ativos são descritos na literatura de patente.

Por exemplo, antiespumantes e desespumantes com base em silício são conhecidos. A DE 103 13 853 A divulga, por exemplo, polissiloxanos organofuncionalmente modificado e seu uso para desespumar combustível líquido, especialmente combustível diesel.

A GB-B 2 173 510 diz respeito a um processo para desespumar combustível diesel ou combustível de jato, em que um antiespumante com base em um copolímero de poliéter de silício é adicionado ao combustível.

Uma desvantagem dos antiespumantes conhecidos é a desespumação deficiente de combustível diesel úmido. O combustível diesel úmido é entendido significar um combustível que inclui aproximadamente 250 ppm de água. Esta água é água de condensação que entra no combustível nos tanques de armazenagem ou é introduzida no combustível durante o transporte em navios petroleiros, como um resultado do esvaziamento incompleto do tanque de água.

Também é conhecido da US 5 542 960 que os derivados de fenol (mais preferivelmente eugenol) exibem uma capacidade desespumante relativamente boa em combustível diesel úmido.

Os antiespumantes descritos e outros antiespumantes conhecidos da técnica anterior para combustíveis diesel caracterizam várias desvantagens. Por exemplo, o teor de silício dos copolímeros de polissiloxano-polioxialquileno típicos é de 10 a 16 % em peso ou ainda de 20 a 25 % em peso. Visto que os compostos com um tal teor de silício alto podem levar a depósitos de dióxido de silício indesejados no motor no curso da combustão, existe um desejo quanto a desespumantes para combustíveis diesel com fração de silício reduzida, ou pelo menos prevenção de espuma e eliminação de espuma melhoradas, de modo a serem capazes de reduzir a concentração de uso destes aditivos.

Uma outra desvantagem dos antiespumantes conhecidos é que a sua compatibilidade (míscibilidade) com os pacotes de aditivo que são adicionados ao óleo diesel bruto para melhorar as suas propriedades é freqüentemente muito baixa, os pacotes de aditivo são entendidos significar misturas de aditivos diferentes, por exemplo agentes para melhorar o desempenho de combustão, agentes para reduzir a formação de ftimaça, agentes para reduzir a formação de gases de exaustão nocivos, inibidores para reduzir a corrosão no motor e suas partes, substâncias ativas de superfície, lubrificantes e outros. Tais pacotes de aditivo são descritos, por exemplo, na JP-05 132 682, GB-2 248 068 e no joumal Mineralõltechnik, 37(4), 20. Os aditivos do pacote de aditivo são dissolvidos em um solvente orgânico para dai utn concentrado de estoque que é adicionado ao combustível diesel bruto. Os antiespumantes com grupos polares freqüentemente não podem ser uniformemente incorporados nestes pacotes de aditivo ou separados no curso da armazenagem.

Um método possível é aquele de aditivos que ocorrem naturalmente que têm as propriedades desejadas. Uma variedade adequada de substâncias está presente, por exemplo, no caso de proteínas.

As proteínas são macromoléculas que são formadas a partir de aminoácidos. O comprimento destas cadeias polipeptídicas varia de abaixo de 50, por exemplo 10, até mais de 1000 aminoácidos.

Para o modo de ação das proteínas, a sua estrutura tri- dimensional, é particularmente importante. A estrutura da proteína pode ser descrita pela estrutura primária, pela estrutura secundária, pela estrutura terciária e pela estrutura quaternária. A estrutura primária refere-se à seqüência dos aminoácidos individuais dentro da cadeia polipeptídica. O arranjo tri-dimensional dos aminoácidos de uma proteína é aludida como a estrutura secundária. A estrutura terciária é um arranjo tri-dimensional da cadeia polipeptídica que é superior à estrutura secundária, Esta é determinada pelas forças e ligações entre os resíduos (isto é, as cadeias laterais) dos aminoácidos. Se uma pluralidade de moléculas em um arranjo tridimensional forma uma unidade funcional que é superior, isto é aludido como estrutura quaternária.

Uma distinção é traçada entre dois grupos principais de proteínas, as proteínas globulares cuja estrutura terciária ou quaternária tem um aspecto aproximadamente esférico ou forma de pêra e que são de modo usual facilmente solúveis em água ou soluções salinas e as proteínas fibrilares que têm uma estrutura semelhante à filamento ou fibrosa são usualmente insolúveis e pertencem às substâncias de suporte e armação.

As hidrofobinas são proteínas pequenas de cerca de 100 a 150 aminoácidos e são característicos de fungos filamentosos, por exemplo Schizophyllum commune. Estes no geral têm 8 unidades de cisteína.

As hidrofobinas têm uma afinidade acentuada com as interfaces e são portanto adequadas para revestir superfícies de modo a alterar as propriedades das interfaces pela formação de membranas anfípáticas. Por exemplo, Teflon pode ser revestido por meio de hidrofobinas para se obter uma superfície hidrofílica.

As hidrofobinas podem ser isoladas de fontes naturais. Igualmente conhecidos são os métodos de preparação para as hidrofobinas e seus derivados. Por exemplo, a DE 10 2005 007 480.4 divulga um processo de preparação para hidrofobinas e seus derivados.

Devido às propriedades excepcionais das hidrofobinas para o revestimento de superfícies, estas proteínas têm um alto potencial para numerosas aplicações industriais. A técnica anterior propõem o uso de hidrofobinas para várias aplicações.

A WO 96/41882 propõem o uso de hidrofobinas como emulsificadores; espessantes, substâncias ativas de superfície, para a hidrofilização de superfícies hidrofóbicas, para a melhora da resistência à água de substratos hidrofílicos, para a preparação de emulsões de óleo em água ou de emulsões de água em óleo. Também são propostas tais como a produção de ungüentos ou cremes e também aplicações cosméticas tais como na proteção de pele ou na produção de xampus capilares ou enxágües capilares. A WO 96/41882 adicionalmente reivindica composições, especialmente composições para aplicações farmacêuticas, que compreendem hidrofobinas. & ί-

A EP A 1 252 516 divulga ο revestimento de janelas, lentes de contato, biossensores, dispositivos médicos, recipientes para realizar experimentos ou para armazenagem, cascos de navio, partículas sólidas ou - carcaças ou chassis de veículos de passageiro com uma solução que compreende hidrofobinas em uma temperatura de 30 a 80° C.

A WO 03/53383 divulga o uso de hidrofobina para tratar materiais com queratina em aplicações cosméticas.

A WO 03/10331 divulga que as hidrofobinas têm propriedades ativas na superfície. Por exemplo, um sensor revestido com hidrofobina é |10 divulgado, por exemplo um eiétrodo de teste, ao qual outras substâncias, por exemplo substâncias eletroativas, anticorpos ou enzimas, são ligadas em uma maneira não covalente.

A WO 2004/000880 igualmente divulga o revestimento de superfícies com hidrofobina ou substâncias equivalentes à hidrofobina. Também é divulgado que emulsões de óleo em água ou de água em óleo, por adição de hidrofobinas estabilizadas.

A WO 01/74864 também divulga proteínas tipo hidrofobinas, que podem ser usadas para estabilizar dispersões e emulsões.

A EP 05 007 208,1 propõem o uso de proteínas, especialmente '20 de hidrofobinas ou seus derivados, como desmulsificadores.

Procedendo da técnica anterior, foi um objetivo da presente invenção fornecer desespumantes que tivessem boa ação desespumante e tivessem um teor de Si baixo.

Foi um outro objetivo da presente invenção fornecer desespumantes que, além de boa ação desespumante, fossem baratos;

Foi um outro objetivo da presente invenção fornecer desespumantes que, além de boa ação desespumante, fossem baratos e ambientalmente compatíveis.

De acordo com a invenção, este objetivo é obtido pelo uso de pelo menos uma hidrofobina ou de um derivado desta como um desespumante em composições aditivas ou combustíveis.

O uso de hidrofobinas ou seus derivados tem a vantagem de que as mesmas também são substâncias que ocorrem naturalmente que são biodegradáveis e assim não levam à poluição do ambiente. Além disso, a degradação forma duramente qualquer substância que leva a depósitos na área do motor.

De acordo com a invenção, hidrofobinas ou seus derivados são usados como desespumantes, isto é, a formação de espuma de um combustível ou de uma composição combustível é reduzida.

De acordo com a invenção, é possível adicionar pelo menos uma hidrofobina ou um derivado desta sozinhos a um combustível como um desespumante. Entretanto, é igualmente possível usar pelo menos uma hidrofobina ou derivado desta em combinação com pelo menos um outro composto que atua como um desespumante. É igualmente possível usar hidrofobinas diferentes ou seus derivados em combinação.

No contexto da presente invenção, uma hidrofobina ou um derivado desta é entendido significar uma hidrofobina ou uma hidrofobina modificada. A hidrofobina modificada, por exemplo, pode ser uma proteína de fusão de hidrofobina ou uma proteína que tenha uma seqüência de polipeptídeo que tenha pelo menos 60 %, por exemplo pelo menos 70 %, em particular pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 90 %, de modo especialmente preferível pelo menos 95 % de identidade com a seqüência de polipeptídeo de uma hidrofobina e que também satisfaça as propriedades biológicas de uma hidrofobina até um grau de 50 %, por exemplo a um grau de 60 %, em particular até o grau de 70 %, mais preferivelmente a um grau de 80 %, especialmente a propriedade de que as propriedades de superfície sejam alteradas pelo revestimento com estas proteínas tal que o ângulo de contato de uma gotícula de água antes e depois do revestimento de uma superfície de vidro com a proteína seja aumentada em pelo menos 20°, preferivelmente em pelo menos 25°, em particular em pelo menos 30°.

Foi descoberto, surpreendentemente, que as hidrofobinas ou seus derivados liberam bons resultados no caso de uso como desespumantes.

Para a definição de hidrofobinas, o que é crucial é a especificidade estrutural e não a especificidade de seqüência das hidrofobinas. A seqüência de aminoácido das hidrofobinas maduras é muito diversa, mas todas elas têm um padrão altamente característico de 8 resíduos de cisteína conservados. Estes resíduos formam quatro pontes de dissulfeto intramoleculares.

O terminal Neo terminal C são variáveis em relação a uma faixa relativamente ampla. É possível aqui adicionar na parceiro de fusão proteínas tendo um comprimento de 10 a 500 aminoácidos por meio das técnicas de biologia molecular conhecidas por aqueles habiltados na técnica.

Além disso, as hidrofobinas e seus derivados também são entendidos no contexto da presente invenção significar proteínas com uma estrutura similar e equivalência funcional.

No contexto da presente invenção, o termo "hidrofobinas" devem ser entendido daqui em diante significar polipeptídeos da fórmula estrutural geral (I)

Xi1-Ci-Xi-So-C2-Xo-S-C3-Xmoo-C4-Xi-Ioo-C5-Xi-So-C -Xo-S-C7-Xi-so-C -Xm (I)

onde X pode ser qualquer um dos 20 aminoácidos que ocorrem naturalmente (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, lie, Met, Tbr, Asn, Lys, Vai, Ala, Asp, Glu, Gly). Na fórmula, X pode ser o mesmo ou diferente em cada caso. Os índices juntos a X são cada um, o número de aminoácidos, C é cisteína, alanina, serina, glicina, metionina ou treonina, onde pelo menos quatro dos resíduos designados com C são cisteína e os índices nem são cada um independentemente números naturais entre 0 e 500, preferivelmente entre 15 e 300. Os polipeptídeos da fórmula (!) também são caracterizados pela propriedade de que; na temperatura ambiente, depois do revestimento de uma superfície de vidro, realizam um aumento no ângulo de contato de uma gotícula de água de pelo menos 20°, preferivelmente pelo menos 25° e mais preferivelmente 30°, comparados em cada caso com o ângulo de contato de uma gotícula de água igualmente grande com a superfície de vidro não revestida.

Os aminoácidos designados com C1 a C8 são preferivelmente cisteínas; entretanto, eles também podem ser substituídos por outros aminoácidos com preenchimento de espaço similar, preferivelmente por alanina, serina, treonina, metionina ou glicina. Entretanto, pelo menos quatro, preferivelmente pelo menos 5, mais preferivelmente pelo menos 6 e em particular pelo menos 7 das posições C1 a C8 devem consistir de cisteínas. Nas proteínas da invenção, as cisteínas podem estar presentes na forma reduzida ou na forma de pontes de dissulfeto entre si. Preferência particular é dada à formação intramolecular de pontes C-C, especialmente que com pelo menos uma ponte de dissulfeto intramolecular, preferivelmente 2, mais preferivelmente 3 e o mais preferivelmente 4 pontes de dissulfeto intramoleculares. No caso da troca descrita acima de cisteínas no lugar de aminoácidos com preenchimento de espaço similar, tais posições C são vantajosamente trocadas em pares que podem forma· pontes de dissulfeto intramoleculares entre si.

Se cisteínas, serinas, alaninas, glicinas, metioninas ou treoninas também são usadas nas posições designadas com X, a numeração das posições C individuais nas fórmulas gerais pode mudar correspondentemente.

Preferência é dada a usar a hidrofobia da fórmula geral (II) Xn-C1-X3.25-C2-Xo.2-C3.X5.50-C4-X2-35-C5-X2-15-C6-Xc1-2-C7-X3.35-C8-Xmai)

para realizar a presente invenção, onde X, C e os índices juntos &

a X e C são cada um como definidos acima, os índices η e m são cada um números entre 0 e 300 e as proteínas adicionalmente caracterizam a mudança ilustrada acima no ângulo de contato e pelo menos 6 dos resíduos designados com C são cisteína. Mais preferivelmente, todos os resíduos C são cisteína.

Preferência particular é dada ao uso de hidrofobinas da fórmula geral (III)

Xn-C1-X5-S-C2-C3-Xu-S9-C4-X2-ZJ-C5-X5^-C6-C7-X6-I8-C8-Xm (IH) onde X, C e os índices juntos a X são cada um como definidos acima, os índices nem são cada um números entre 0 e 200 e as proteínas adicionalmente caracterizam a mudança ilustrada acima no ângulo de contato.

Os resíduos Xn e Xra podem ser seqüências de peptídeo que naturalmente também são unidas a uma hidrofobina. Entretanto, um ou ambos os resíduos também podem ser seqüências de peptídeo que naturalmente não são tinidas a uma hidrofobina. Isto também é entendido significar aqueles resíduos Xn e/ou Xm em que uma seqüência de peptídeo que ocorre naturalmente em uma hidrofobina é encompridada por uma seqüência de peptídeo que não ocorre naturalmente em uma hidrofobina.

Se Xn e/ou Xm são seqüências de peptídeo que não são naturalmente ligadas nas hidrofobinas, tais seqüências são no geral pelo menos 20, preferivelmente pelo menos 35, mais preferivelmente pelo menos 50 e o mais preferivelmente pelo menos 100 aminoácidos no comprimento. Um tal resíduo que não é naturalmente unido a uma hidrofobina também será aludido a seguir como um parceiro de fusão. Isto é intencionado a expressar que as proteínas podem consistir de pelo menos uma porção de hidrofobina e uma porção de parceiro de fusão que não ocorrem juntas nesta forma na natureza.

A porção de parceiro de fusão pode ser selecionada de toma multidão de proteínas. Também é possível para uma pluralidade de parceiros de fusão serem unidos a uma porção de hidrofobina, por exemplo no terminal amino (Xn) e no terminal carboxila (Xra) da porção de hidrofobina. Entretanto, também é possível, por exemplo, para dois parceiros de fusão serem unidos a uma posição (Xn ou Xm) da proteína da invenção.

Os parceiros de fusão particularmente adequados são proteínas que ocorrem naturalmente em microorganismos, especialmente na E. coli ou Bacillus subtilis. Os exemplos de tais parceiros de fusão são as seqüências yaad (SEQ ID NO: 15 e 16), yaae (SEQ ID NO: 17 e 18) e tioredoxina. Também muito adequados são fragmentos ou derivados destas seqüências que compreendem apenas alguns, preferivelmente de 70 a 99 %, mais preferivelmente de 80 a 98 % das seqüências mencionadas, ou em que aminoácidos ou nucleotídeos individuais foram trocados comparados com a seqüência mencionada, caso este em que as porcentagens são cada um com base no número de aminoácidos.

As proteínas, usadas de acordo com a invenção como hídrofobinas ou seus derivados também podem ser modificadas na sua seqüência de polipeptídeo, por exemplo pela glicosilização, acetilação ou ainda pela reticulação química, por exemplo com glutaraldeído.

Uma propriedade das hídrofobinas ou seus derivados usados de acordo com a invenção é a mudança nas propriedades de superfície quando as superfícies são revestidas com as proteínas. A mudança nas propriedades de superfície podem ser determinadas experimentalmente, por exemplo, medindo-se o ângulo de contato de, uma gotícula de água antes e depois do revestimento da superfície com a proteína e determinando a diferença das duas medições.

O desempenho das medições de ângulo de contato é conhecido em princípio por aqueles habilitados na técnica. As medições são fundamentadas na temperatura ambiente e gotículas de água de 5 μΐ. As condições experimentais exatas para um exemplo de um método adequado para medir o ângulo de contato são dadas na seção experimental. Sob as condições aí mencionadas, as proteínas usadas de acordo com a invenção têm a propriedade de aumentar o ângulo de contato em pelo menos 20°, preferivelmente pelo menos 25°, mais preferivelmente pelo menos 30°, comparado em cada caso com o ângulo de contato de uma gota d'água igualmente grande com a superfície de vidro não revestida.

Na porção de hidrofobina das hidrofobinas ou seus derivados conhecidos até agora, as posições dos aminoácidos polares e não polares são conservadas, que é manifestada em uma plotagem de hidrofobicidade característica. As diferenças nas propriedades biofísicas e a hidrofobicidade levam à divisão das hidrofobinas conhecidas até agora em duas classes, I e Π (Wessels et ai. 1994, Ann. Rev. Phytopathol., 32,413-437).

As membranas montadas compostas de hidrofobinas classe I são altamente insolúveis (mesmo para dodecilsulfato de sódio a 1 % (SUS) em temperatura elevada) e apenas podem ser dissociadas novamente pelo ácido trifluoroacético concentrado (TFA) ou ácido fórmico. Ao contrário, as formas montadas de hidrofobinas de classe II são menos estáveis. Estas podem ser dissolvidas mais tuna vez meramente em etanol a 60 % ou 1 % de SDS (na temperatura ambiente).

Uma comparação das seqüências de aminoácido mostra que o comprimento da região entre a cisteína C3 e C4 em hidrofobinas é distintamente mais curta do que nas hidrofobinas de classe 1. Hidrofobinas de classe II também têm mais aminoácidos carregados do que a classe I.

As hidrofobinas particularmente preferidas para realizar a presente invenção são as hidrofobinas do tipo dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basfl, basf2, que são caracterizadas estruturalmente na listagem de seqüência que segue. Estas também podem ser apenas partes ou seus derivados. Também é possível para uma pluralidade de porções de hidrofobina, preferivelmente 2 ou 3, da mesma estrutura ou diferente a ser ligada a uma outra e ser ligada a uma seqüência de polipeptideo correspondente adequada que não é naturalmente unida a uma hidrofobina.

Particularmente, adequadas de acordo com a invenção são também as proteínas de fusão com as seqüências de polipeptídeo mostradas na SEQ ID NO 20, 22, 24 e também as seqüências de ácido nucleico que as codificam, especialmente as seqüências de acordo com a SEQID NO: 10, 21, 23. As formas de realização particularmente preferidas também são proteínas, que derivam da seqüência de polipeptídeos mostradas na SEQ ID NO. 20, 22 ou 24 em virtude de mudança, inserção ou deleção de pelo menos um, até 10, preferivelmente 5, mais preferivelmente 5 % de todos os aminoácidos e que ainda têm a propriedade biológica das proteínas de partida a um grau de pelo menos 50 %. Neste contexto, a propriedade biológica das proteínas refere-se à mudança no ângulo de contato nos pelo menos 20 % já descritos.

Os parceiros de fusão adequados são proteínas que levam à proteína de fusão assim gerada que é capaz de revestir superfícies e simultaneamente resistentes contra um tratamento detergente. Os exemplos de parceiros de fusão são, por exemplo, yaad e yaae em E coli e tiorredoxina.

Foi verificado que as proteínas de fusão produzidas deste modo já são funcionalmente ativos e as hidrofobinas não o são, como descrito na literatura, têm que ser dissociadas e assim ativadas pelo tratamento com ácido trifluoroacético ou ácido fórmico. As soluções que compreendem estas proteínas de fusão ou, depois da clivagem da proteína de fusão, compreendem apenas a hidrofobina são adequadas diretamente para o revestimento das superfícies.

Na fusão de terminal C ou N com um rótulo de afinidade (por exemplo His6, HA, calmociulina-BD, GST, MBD, quitina-BD, rótulo de estreptavidina-BD-Avi, rótulo Flag, T7, etc.) é descoberto ser favorável para a purificação rápida e eficiente. Os protocolos padrão correspondentes podem ser obtidos a partir de fornecedores comerciais do rótulos de afinidade.

Um sítio de clivagem entre a hidrofobina e o parceiro de fusão ou os parceiros de fusão podem ser utilizados para liberar a hidrofobina pura na forma não derivatizada (por exemplo pela clivagem com BrCN na metionina, clivagem por fator Xa, clivagem pela enterocinase, clivagem por trombina, clivagem por TEV3 etc.).

Também é possível gerar proteínas de fusão em sucessão a partir de um parceiro de fusão» por exemplo yaad ou yaae e uma pluralidade de hidrofobinas, mesmo de seqüência diferente por exemplo DewA-RodA ou Sc3-DewA, Sc3-RodA. É igualmente possível usar fragmentos de hidrofobina (por exemplo truncagens de terminal N ou C) ou muteína que têm até 70 % de homologia. As construções ótimas são em cada caso selecionadas em relação ao uso particular, isto é» o combustível a ser desespumado.

Os polipeptídeos usados de acordo com a invenção» ou presentes nas composições da invenção podem ser preparadas quimicamente por métodos conhecidos de síntese de peptídeo, por exemplo pela síntese de fase sólida de Merrifield.

As hidrofobinas que ocorrem naturalmente podem ser isoladas a partir de fontes naturais por meio de métodos adequados. Referência é feita por via de exemplo a Wõsten et al, Eur. J Cell Bio. 63, 122-129 (1994) ou WO 96/41882.

As proteínas de fusão podem ser preparadas preferivelmente pelos métodos de engenheiramento genético, em que uma seqüência de ácido nucleico, especialmente seqüência de DNA, que codifica o parceiro de fusão e um que codifica a porção de hidrofobina são combinados em um tal modo que a proteína desejada é gerada em um organismo hospedeiro como um resultado da expressão de gene da seqüência de ácido nucleico combinada. Um tal processo de preparação é divulgado, por exemplo, na DE 102006007480.4.

Os organismos hospedeiros adequados (organismos de produção) para o método de preparação mencionado podem ser procariotas (incluindo os Archaea) ou eucariotas, particularmente bactérias incluindo halobactérias e metanocócicos, fungos, células de inseto, células vegetais e células de mamífero, mais preferivelmente Escherichia eoli, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Piehia pastoris, Pseudomonas spec., lactobacilos, Hansenula polimorpha, Triehoderma reesei, SF9 (ou células relacionadas), entre outros.

Neste método, as construções de expressão que compreendem uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo usado de acordo com a invenção, sob o controle genético de seqüências de ácido nucleico regulatórias e também vetores que compreendem pelo menos uma destas construções de expressão, são usadas.

As construções que são usadas preferivelmente compreendem um promotor 5' a montante da seqüência codificadora particular e uma seqüência terminadora 3' a jusante e também, se apropriado, outros elementos regulatórios habituais, cada um ligado operativamente à seqüência codificadora.

No contexto da presente invenção, uma "ligação operativa" é entendida significar o arranjo seqüencial de promotor, seqüência codificadora, terminador e, se apropriado, outros elementos regulatórios, tal que cada um dos elementos regulatórios pode satisfazer a sua função como pretendido na expressão da seqüência codificadora.

Os exemplos de seqüências operativamente ligáveis são seqüências alvejadoras, e também realçadores, sinais de poliadenilação e outros. Outros elementos regulatórios compreendem marcadores selecionáveis, sinais de amplificação, origens de replicação e outros. As seqüências regulatórias adequadas são, por exemplo, descritas em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990):

Além destas seqüências de regulagem, a regulagem natural destas seqüências podem estar ainda presentes a montante dos genes estruturais reais e, se apropriado, foram geneticamente modificados de modo a desligar a regulagem natural e aumentar a expressão dos genes.

Uma construção de ácido nucleico preferida também vantajosamente compreende uma ou mais das chamadas seqüências "realçadoras", unidas funcionalmente ao promotor, que permite a expressão aumentada da seqüência de ácido nucleico. Também na extremidade 3' das seqüências de DNA, é possível que seqüências adicionais vantajosas sejam inseridas, tais como outras elementos reguladores ou terminadores.

Os ácidos nucleicos podem estar presentes na construção em uma ou mais cópias. Também é possível outros marcadores tais como resistências a antibiótico ou genes que complementem auxotrofias estejam presentes na construção, se apropriado para a seleção para a construção.

As seqüências de regulagem vantajosas para a preparação estão presentes, por exemplo, em promotores tais como os promotores cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, laclq-T7, T5, T3, gal, trc, ara, rhaP(rhaPBAD) SP6, lambda-PR ou imlambda-P, que vantajosamente encontram uso em bactérias Gram-negativas. Outras seqüências de regulagem vantajosas estão presentes, por exemplo, nos promotores Gram-positivos amy e SP02 e nos promotores de levedura ou füngicos AOO1, MFalfa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH.

Também é possível usar promotores sintéticos para a

regulagem.

Para a expressão em um organismo hospedeiro, a construção de ácido nucleico é vantajosamente inserido em um vetor, por exemplo um plasmídeo ou um fago que possibilita a expressão ótima dos genes no hospedeiro. À parte dos plasmídeos e fagos, vetores também são entendidos significar todos os outros vetores conhecidos por aqueles habilitados na técnica, por exemplo vírus tais como SV40, CMV, baculovírus e adenovírus, transposons, elementos IS, fasmídeos, cosmídeos e DNA linear ou circular e também o sistema de Agrobacterium.

Estes vetores podem ser replicados autonomamente no organismo hospedeiro ou cromossomicamente replicados. Os plasmídeos adequados são, por exemplo, na E. coli, pLG338, pACYC184, pB1322, ptiC19, pKC30, pFlep4, pHSl, pKK223-3, PDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pUR290, ρΙΝ-ΠΓ'3-Bl, tgtll ou pBdCl, em Streptomyces plJlOl, plJ364, plJ702 ou plJ361, em Bacillus pUBllO, pC194 ou pBD214, em Corynebacterium pSA77 ou pAJ667, em fungos pALSl, piL2 ou pBBlló, em leveduras 2alfa, pAG-1, YEp8, YEpl3 ou pEMBLY023 ou em plantas pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 ou pDH51. Os plasmídeos mencionados constituem uma pequena seleção dos plasmídeos possíveis. Outros plasmídeos são conhecidos por aqueles habilitados na técnica e pode ser tirados, por exemplo, do livro Cloning, Vectors (Eds. Pouwels Ρ. H. et al Elsevier, Amsterdam-Nova Iorque-Oxford, 1985, ISBN O 444 904018).

Vantajosamente, a construção de ácido nucleico, para a expressão dos outros genes presentes, adicionalmente também compreende seqüências reguladoras de terminal 3' e/ou 5' para realçar a expressão, que são selecionadas quanto a expressão ótima dependendo do organismo hospedeiro e gene ou genes selecionados.

Estas seqüências reguladoras são intencionadas a permitir a expressão controlada dos genes e da expressão de proteína. Dependendo do organismo hospedeiro, isto pode significar, por exemplo, que o gene é expressado ou super expressado apenas depois da indução, ou que o mesmo é expressado e/ou super expressado imediatamente.

As seqüências ou fatores reguladores preferivelmente podem influenciar positivamente e assim aumentar a expressão de gene dos genes introduzidos. Assim, uma amplificação dos elementos regulatórios pode ser vantajosamente efetuado ao nível transcricional usando-se sinais de transcrição fortes tais como promotores e/ou realçadores. Além disso, também é possível realçar a tradução, por exemplo, melhorando-se a estabilidade do mRNA.

Em uma outra forma de realização do vetor, o vetor que compreende a construção de ácido nucleico ou o ácido nucleico também podem ser introduzidos nos microorganismos vantajosamente na forma de um DNA linear e ser integrados no genoma do organismo hospedeiro por meios da recombinação heteróloga ou homóloga. Este DNA linear pode consistir de um vetor linearizado tal como um plasmídeo ou apenas da construção de ácido nucleico ou do ácido nucleico.

Para uma expressão ótima de genes heterólogos nos organismos, é vantajoso alterar as seqüências de ácido nucleico de acordo com o "uso de códon" específico usado no organismo. O uso de códon pode ser determinado facilmente com referência às avaliações de computador de outros genes conhecidos do organismo em questão.

Um cassete de expressão é preparado pela fusão de um promotor adequado com uma seqüência de nucleotídeo codificador adequado e um sinal terminador ou sinal de poliadenilação. Para esta finalidade, as técnicas de recombinação e clonagem comuns são usadas, como descrito, por exemplo, em T. Maniatis, E. F. Fritech e J. Sambrook5 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) e em T. J. Silhavy, M. L Berman e L W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) e em Ausubel, F. M. et ai, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley interscience (1987).

Para a expressão em um organismo hospedeiro adequado, a construção de ácido nucleico ou gene construção recombinantes é vantajosamente inserido em um vetor específico de hospedeiro que permite uma expressão ótima do genes no hospedeiro, os vetores também são conhecidos por aqueles habilitados na técnica e pode ser extraído, por exemplo, da "Cloning Vectors" (Pouwols Ρ. H. et al, eds., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985).

Com o auxílio dos vetores, é possível preparar os microorganismos recombinantes que foram, transformados, por exemplo, com pelo menos um vetor e podem ser usados para a produção de hidrofobinas ou seus derivados usada de acordo com a invenção. Vantajosamente, as construções recombinantes descritas acima são introduzidas em um sistema de hospedeiro adequado e expressado. Preferência é dada ao uso dos métodos de clonagem e transfecção familiares para aqueles habilitados na técnica, por exemplo coprecipitação, fusão de protoplasto, eletroporação, transfecção retroviral e outros, a fim de levar a expressão dos ácidos nucleicos mencionados no sistema de expressão particular, os sistemas adequados são descritos, por exemplo, em Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., ed., Wiley Interscience, New York 1997, ou Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2° edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Também é possível preparar microorganismos homologamente recombinados. para este fim, um vetor é preparado compreendendo pelo menos um seção de um gene a ser usado ou uma seqüência codifícadora, em que, se apropriado, pelo menos uma deleção, adição ou substituição de aminoácido foi introduzida a fim de mudar, por exemplo, interromper funcionalmente a seqüência (vetor de "nocaute"). A seqüência introduzida pode, por exemplo, também ser um homólogo de um microorganismo relacionado ou ser derivado de uma fonte de mamífero, levedura ou inseto. O vetor usado para a recombinação homóloga pode ser alternativamente configurado tal que o gene endógeno, no caso de recombinação homóloga foi mutado ou alterado de uma outra maneira, mas ainda codifica a proteína funcional (por exemplo, a região reguladora a montante pode ser mudada, tal que a expressao da proteina endogena seja mudada). A se9So mudada do gene usada de acordo com a inven?2o esta no vetor de recombinagSo homologa. A constru9So de vetores adequados para a recombinafSo homologa e descrita, por exemplo, em Thomas, K. Ft. e Capecchi, M. R, (1987) Cell 51: 503.

Em principio, todos os organismos procarioticos ou eucarioticos sao uteis como hospedeiros ou organismos recombinantes para tais icidos nucleicos ou tais construfoes de dcidos nucleicos. Vantaj osamente, os oi^anismos hospedeiros usados sao microorganismos, tais como bac^rias， fungos ou leveduras. Vantaj osamente, bactSrias de Gram-positivo ou Gram- negativo sao usadas, preferivelmente, bacterias das familias Enterobacteriacdae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae ou Nocardiaceae, mais preferivelmente, as bact0rias dos generos Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocar dia, Surkholderia, Salmonella, Agrobacterium ou Rhodococcus.

Os organismos usados nos processo de preparafao descritos acima para as proteinas de fusSo sao, dependendo do organismo hospedeiro, ou cultivado de uma mmeira conhecida por aqueles habilitados na tecnica. Os microorganismos sSo，no geral, desenvolvidos em um meio liquido que compreende uma fonte de carbono, usualmente na forma de a9iicares, uma fonte de nitroggnio, usualmente na forma de fontes de nitrogSnio organicas, tais como extrato de levedura ou sais, tais como sulfato de amonio, elementos tra^o, tais como ferro, manganes e sds de magnesio e tambem, se apropriado, vitaminas, em temperaturas entre O e IOO0 C, preferivelmente entire 10 e 60° C’ com pulverizafao de oxigenio. O pH do liquido nutriente pode ser mantido em um valor fixo, isto e, e regulado, ou nao, durante ο desenvolvimento. O desenvolvimento pode ser realizado em batelada, semi-batelada ou continuamente. Os nutrientes podem ser introduzidos no inicio da fermentapSo ou serem recarregados semi continuamente ou continuamente. As enzimas podem ser isoladas dos organismos pelo processo descrito nos exemplos ou serem usadas para a rea?ao como um extrato bruto. As proteinas usadas de acordo com a invenfao, ou fragmentos biologicamente ativos funcionais destes, podem ser preparadas por raeio de um processo para a prepara9ao recombinant^，em que um microorganismo que produz polipeptideo e cultivado, a expressao das proteinas e induzida se apropriado e estes sSo isolados da culture- As proteinas tambem podem ser produzidas desta maneira em uma escala industrial se isto for desejado. Os microorganismos recombinantes podem ser cultivados e fermentados por processos conhecidos. As bacterias podem ser propagadas, por exemplo, em meio TB ou LB e em uma temperature de 20 a 40° C e um pH de 6 a 9. As condi?5es de cultivo adequadas s3o descritas especificamente em T. Maniatis, E. F, Fritsch e I. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989).

Se as proteinas nao s2o secretadas no meio de cultura, as celulas sSo entao rompidas e ο produto έ obtido a partir do lisado pelos processos de isolamento de proteina conhecidos. Como desejado, as celulas podem ser rompidas pelo ultra-som de freqtiencia alta, por pressao alta, por exemplo, em uma celula de pressao de French, por osmolise, pela a^o de detergentes, enzimas liticas ou solventes orgaiicos, por homogeneizadores ou pela combina^ao de um pluralidade dos processos listados.

As proteinas podem ser purificadas pelos processos cromatograficos conhecidos, tais como cromatografia de peneira molecular (filtra$ao com gel), tal como cromatografia de Q Sepharose, cromatografia trocadora de ion e cromatografias hidrofobicas e tambem com outros processos de costume, tais como ultrafiltra^o, cristaliza^ao, dessaliniza9ao, dialise e eletroforese em gel natural. Os processos adeqiiados s2o descritos, por exemplo, em Cooper, F. O, Blochemische Arbeitsmethoden [Biochemical Techniques], Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York, ou em Scopes, Ft, Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin.

Pode ser vantajoso isolar a proteina recombinante usando-se sistemas de vetores ou oligonucleotideos que estendem ο cDNA por certas seqtiencias de nucleotideo e, em consequencia codificam os polipeptideos alterados ou proteinas de fusao que servem, por exemplo, para a purifica^So mais simples. Tais modificafoes adeqxiadas compreendem os denominados "rotulos" que funciona como ancoras, por exemplo, a modificayao conhecida como a ancora de hexa-histidina ou epitopos que podem ser reconhecidos como antigenos de anticorpos (descrito，por exemplo, em Harlow, E. e Lane, D.，1988，Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (N.Y.) ^io Press). Os r0tulos adequados adicionais sSo, por exemplo, HA, calmodulin- BD, GST, MBD; Chitin-BD5 Streptavidin-BD-Avi Tag, Flag-Tag, T7 etc. Estas Sncoras podem servir, por exemplo, para a Hga?ao as proteinas a um suporte solido, por exemplo, uma matriz polimerica, que pode ser introduzida, por exemplo, em uma coluna de cromatografia ou ser usada em uma placa microtituladora ou em um outro suporte. Os protocolos de purifica9ao correspondentes sao obteniveis a partir dos fornecedores de rotulo de afinidade comercial.

As proteinas preparadas como descrito podem ser usadas diretamente como proteinas de fusSo ou, depois do desligamento e remofao 書 20 do parceiro de fusao, como hidrofobinas "puras".

Quando uma remofao do parceiro de fiasao e pretendida, e aconselhavel incorporar um local de clivagem potencial (o local de reconhecimento especifico para proteases) na proteina de fusao entre ροΓςΙο de hidrofobina e por?ao de parceiro de fusSo. Os locais de clivagem adequados sao, especialmente aquelas seqiiencias de peptideo que, de outra maneira, nao ocorrem na por^o de hidrofobina nem no ροΓςδο de parceiro de fusao, que pode ser determinado facilmente com as ferramentas de bioinformatica. P^ticularmente adequadas sao, por exemplo, clivagem de BrCN em metionina ou clivagem mediada por protease com clivagem de fator Xa, clivagem de enterocinase, clivagem de trombina ou clivagem de TEV (Protease do virus de caustica^o do tabaco).

No Contexto da presente ΐηνεηςδο, os combustiveis s3o entendidos significar tanto combustiveis no sentido mais estreito, que sSo usados para operar motores de combustSo interna quanto combustiveis no geral.

Os combustiveis adequados sao destilados medios e combustiveis de gasolina. Entretanto5 Preferencia e dada ao uso de destilados midios.

Os destilados m0dios adequados s2o aqueles que entram em ebuli9§o em uma faixa de 120 a 500° C e s3o selecionados, por exemplo, a partir de diesel combustivel, querosene e oleo de aquecimento. Os destilados medios preferidos sSo combustiveis diesel.

Os combustiveis diesel s2o, por exemplo, rafmatos de oleo bruto que, tipicamente tern uma faixa de ebulifSo de 100 a 400° C. Estes s2o, usualmente d^tilados tendo um ponto de 95 % a 360° C ou ainda mais alto. Entretanto, estes tambim podem ser "diesel com teor de enxofre ultra baixo" ou "diesel urbano", caracterizado por um ponto de 95 % de, por exemplo, n5o mais do que 3450 C e um teor de enxofre de nao mais do que 0,005 %, em peso ou por um ponto de 95 % de, por exemplo, 285。C e um teor de enxofre de nSo mais do que 0,001 % em peso. Αΐέιη dos combustiveis diesel obteniveis por refinamento, aqueles que s5o obteniveis pela gaseifica9ao do carvao ou IiquefafSo do gas (combustiveis "gas-a-liquido (GIL)) sio adequada. Tambim sao adequadas as sao misturas dos combustiveis diesel mencionados acima com combustiveis renovaveis, tais como biodiesel ou bioetanol.

Os combustiveis diesel sao mais preferivelmente aqueles tendo um teor de enxofre baixo, isto e, tendo um teor de enxofre menor do que 0,05 % em peso, preferivelmente menor do que 0,02 % em peso, em particular menor do que 0,005 % em peso e especialmente menor do que 0,001 % em peso de enxofre. Os oleos de aquecimento tambem sao, mais preferivelmente aqueles tendo um teor de enxofre baixo, por exemplo tendo um teor de enxofre de, otimamente 0,1 % em peso, preferivelmente de, ma maioria, 0,05 % em peso, mais preferivelmente de, na maioria 0,005 % em peso e em particular de, na maioria 0,001 % em peso.

Preferencia e dada, de acordo com a ϊηνβηφδο ao uso de hidrofobinas ou seus derivados como desespumantes em combustiveis diesel.

Em uma outra forma de realizagao, a presente invenfao, portanto, diz respeito ao uso como descrito acima de pelo menos uma hidrofobina ou de um derivado desta como um desespumante, em que ο combustivel e um combustivei diesel.

De acordo com a inven^So, a peio menos uma hidrofobina ou derivado desta έ usada preferivelmente em uma quantidade de 0,01 a 100 ppm com base no combustivel, preferivelmente de 0,15 a 50 ppm, mais preferivelmente de 0,2 a 30 ppm ou de 0,3 a 10 ppm.

No contexto da presente aplicaiSo, a unidade ppm significa

mg por kg.

Em uma outra forma de realiza9ao, a presente invenfSo, portanto, diz respeito ao use como descrito acima de pelo menos uma hidrofobina ou de um derivado desta como um desespumante, em que a pelo menos uma hidrofobina ou derivado desta e usada em uma quantidade de 0,1 a 100 ppm com base no combustivel.

De acordo com a ΐηνβηςδο, um combustivel, especialmente um combustivel diesel, pode ser desespumado pela adi^So de peio menos uma hidrofobina ou um derivado desta.

Portanto, a presente inven^So tambem diz respeito a um processo para desespumar combustivel, que compreende a adi?So de pelo menos uma hidrofobina ou derivado desta a um combustivel. Em uma outra forma de realiza^So, a presente invents。diz respeito a um processo como descrito acima para desespumar combustivei, em que ο combustivei e um combustivei diesel.

Em uma outta forma de realizafSo preferida, a presente invenfSo diz respeito a um processo como descrito acima para desespumar combustivei, em que a pelo menos uma hidrofobina ou derivado desta e usada em uma quantidade de 0，1 a 100 ppm com base no combustivei.

Se, no contexto, for possivel da presente invenfao que a pelo menos uma hidrofobina ou derivado desta e adicionada diretamente a um combustivei ou a uma composi^o combustivei ou na forma de uma composi^So de aditivo.

A presente ϊηνβηςδο ainda diz respeito a composifdes aditivas que, alim de pelo menos um outro aditivo de combustivei, compreende pelo menos uma hidrofobina ou um derivado desta. A presente inven?ao tambem diz respeito a composi^des combustiveis que compreende pelo menos uma hidrofobina ou um derivado desta e pelo menos um outro aditivo de combustivei.

Em uma outra forma de realizafao, a presente inven^ao, portanto, diz respeito a uma composi9ao de aditivo que compreende pelo menos uma hidrofobina ou derivado desta e pelo menos um outro aditivo de combustivei.

Em uma outra forma de realiza^ao, a presente invenfao tambem diz respeito a uma composi^ao combustivei que compreende, alem disso, pelo menos um combustivei como um constituinte principal, pelo menos uma hidrofobina ou derivado desta e pelo menos um outro aditivo de combustivei.

A composi^o de aditivo ou ο combustivei compreende e a adi^So ao pelo menos uma hidrofobina ou derivado desta, pelo menos um outro aditivo de combustivei, especialmente pelo menos um detergente e/ou um demulsificante. Os aditivos detergentes adequados e demulsificadores s3o listados abaixo. As composipdes aditivas e combustiveis tambem pode comprometer, em vez ou alem disso, varios a<^tivos de combustivel, tais como 0leos veiculos, inibidores de corrosao, antioxidantes, antiestaticos, marcadores de pigmento e outros. Entretanto, a composi9ao de aditivo ou ο combustivel preferivelmente compreendem pelo menos um detergente e/ou um demulsificante e, se apropriado, outros aditivos de combustivel diferentes.

Em uma outra forma de realizafao preferida, a presente ίηνβηςδο, portanto, diz respeito a uma composiiao de aditivo ou composi9So combustivel como descrito acima, em que a composifSo compreende pelo menos um detergente. Em uma outra forma de realiza?5o preferida, a presente inven^ao tambem diz respeito a uma composi?So de aditivo ou composi9ao combustivel como descrito acima, em que a composi9ao compreende pelo menos um demulsificante.

Os aditivos detergentes adequados sao listados por meio de exemplo a seguir.

Os aditivos detergentes sSo preferivelmente substancias anfifilicas que tem, pelo menos um radical hidroca-bila hidrofobico tendo um peso molecular medio numerico (Mn) de 85 a 20.000 e pelo menos um porpao polar selecionada de:

(a) grupos mono- ou poliamino tendo ate 6 atomos de nitrogenio, dos quais pelo menos um dtomo de nitrogenio tem propriedades basicas;

(b) grupos nitro, se apropriado em cornbina^o com grupos

hidroxila;

(c) grupos hidroxila em combina9ao com grupos mono- ou poliamino, em que pelo menos um dtomo de nitrogenio tem propriedades basicas;

(d) grupos carboxila ou seus sais de metal alcalino ou de metal alcalino terroso; (e) grupos de acido suifonico ou seus sais de metal alcalino ou de metal alcalino terroso;

(f) grupos polioxi-alquileno C2 a C4 que s2o terminados por grupos Mdroxila5 grupos mono ou poliamino, em que pelo menos um atomo de nitrogenio tem propriedades basicas ou por grupos carbamato;

(g) grupos de ester carboxiiico;

(h) por9oes derivadas de anidrido succinico e tendo grupos hidroxila e/ou amino e/ou amido e/ou imido e/ou

(i) porfoes obtidas pela reafSo de Mannich de fenois substituidos por aldeidos e mono ou poliaminas.

O radical de hidrocarbila hidrofobico no aditivos detergentes acima, que garantem a solubilidade adequada no combustivel, tem um peso molecular medio numerico (Mn) de 85 a 20.000，especialmente de 113 a 10.000, em particular de 300 a 5000. Os radicals de hidrocarbila hidrofobicos tipicos, especialmente em conjun9ao com as porfdes poises (a), (c), (h) e (i), incluem radicals de polipropenila, polibutenila e poliisobutenila cada um tendo Mn = de 300 a 5000, especialmente de 800 a 2500, em particular de 700 a 2300.

Os exemplos dos grupos acima de aditivos detergentes incluem ο seguinte:

Os aditivos que compreendem grupos mono- ou poliamino (a) sSo preferivelmente polialqueno mono- ou polialquenopoliaminas com base em polipropeno ou poiibuteno ou poliisobuteno convencionais (isto έ, tendo liga?5es duplas predominantemente intemas) tendo Mn de 300 a 5000. Quando poiibuteno ou poliisobuteno tendo predominantemente IigaiSes duplas intemas (usualmente na posi^So beta e gama posi^So) sao usadas como materials de partida na prepara9ao dos aditivos, uma possivel via preparativa ocorre por cloreta9ao e amina^So subseqiientes pela oxida9ao da liga?2o dupla com ar ou ozonio para dar ο composto carbonila ou carboxila e amina?ao subsequente sob condifSes de redu9ao (hidrogena9ao). As aminas usadas aqui para a amina9So podem ser, por exemplo,咖0nia，mono-aminas ou poliaminas, tais como dimetilaminopropilamina, etilenodiamina, dietilenotriamina, trietilenotetramina ou tetraeiilenopentamina. Os aditivos correspondentes com base em polipropeno sSo descritos, em particular, no WO 04/24231.

Outros aditivos preferidos que compreendem grupos monoamino (a) sao os produtos de hidrogena9ao os produtos de reafao de poliisobutenos tendo urn grau medio de polimeriza?ao P de 5 a 100 com oxidos de nitrogenio ou misturas de oxidos de nitrogenio e oxigenio, como descrito, em particular no WO 97/03946.

Outtos aditivos preferidos que compreendem grupos monoamino (a) slo os compostos obteniveis a partir de poliisobuteno epoxidos pela rea$5o com aminas e subseqiiente de hidrata^ao e redu^ao dos aminoalcoois, como descrito em particular na DE-A 196 20 262.

Os aditivos que compreendem os grupos nitro (b), se apropriado em combinafao com os grupos hidroxila, sSo preferivelmente, produtos de rea?ao de poliisobutenos tendo um grau medio de polimeriza?ao P de 5 a 100 ou de 10 a 100 com oxidos de nitrogenio ou misturas de 0xidos de nitrogenio e oxigenio, como descrito, em particular, no WO 96/03367 e WO 96/03479. Estes produtos de reafao sSo, no geral, misturas de nitropoliisobutenos puros (por exemplo, α,β-dinitropoliisobuteno) e hidroxinitropoliisobutenos mistos (por exemplo, a-nitro-β- hidroxipoliisobuteno).

Os aditivos que compreendem grupos hidroxila em combinafSo com grupos mono- ou poliamino (c) sao, em particular, produtos de rea?ao de epoxidos de poliisobuteno obteniveis de poliisobuteno tendo, preferivelmente, liga?oes duplas predominantemente terminals e Mnde 300 a 5000, com am6nia ou mono- ou poliaminas, como descrito, em particular, no EP-A 476 486.

Os aditivos que compreendem, grupos carboxila ou seus sais de metal alcalino ou de metal alcalino terroso (d) sao preferivelmente copolimeros de olefmas C2-C40 com anidrido ma^ico tendo uma massa molar total de 500 a 20.000 e daqueles grupos carboxila alguns ou todos foram convertidos aos sais de metal alcalino ou de metal alcalino terroso e quaisquer remanescentes dos grupos carboxila foram reagidos com alcoois ou aminas. Tais aditivos sSo divulgados, em particular por EP-A 307 815. Tais aditivos 鲁 10 servem, principalmente para evitar ο desgaste da base da valvula e pode, como descrito no WO 87/01126, vantajosamente ser usado em combina^ao • com detergentes combustiveis de costume, tal como poli(iso)butenoaminas ou polieteraminas.

Os aditivos que compreendem grupos de icido sulfSnico ou seus sais de metal alcalino ou de metal alcalino terroso (e) s3o preferivelmente sais de metal alcalino ou de metal alcalino terroso de um sulfosuccinato de alquila, como descrito, em particular, em EP-A 639 632. Xais aditivos servem principalmente para evitar ο desgaste da base da valvula e podem ser usados vantajosamente em combinafao com detergentes 9 20 combustiveis de costume, tais como poli(iso)butenoaminas ou polieteraminas.

Os aditivos que compreendem porfdes de polioxi-alquileno C2-C4 (f) sao preferivelmente poli6teres ou polieteramin^ que s3o obteniveis pela reagao de alc^iois de C2 a C60, alcanodi0is de C6 a C30, mono- ou di- alquilaminas C2-C30, alquila C1-C30 cicloexanois ou alquilfenois C1-Cjo com 1 a 30 mol de oxido de etileno e/ou oxido de propileno e/ou oxido de butileno por grupo hidroxila ou grupo amino e, no caso d於 polieteraminas, pela amina醉ο redutiva subsequente com ara6nia, monoaminas ou poli-aminas. Tais produtos sao descritos, em particular no EP-A 310 975, EP-A 356 725, EP-A 700 985 eUS 4 877 416. No caso de poli6teres, tais produtos tambem tSm propriedades oleosas de carregador. Os exemplos tipicos destes sao butoxilatos de tridecanol, butoxilatos de isotridecanol, butolatos de isononilfenol e butoxilatos e propoxilatos de poliisobutenol e tambem os produtos de rea9ao correspondentes com amonia.

Os aditivos que compreendem grupos de ester carboxilico (g)

sSo preferivelmente esteres de acido mono-, di- ou tric^boxilicos com alcanois ou poliois de cadeia longa, em particular aqueles tendo uma viscosidade minima de 2 mm2/s em 100° C，como descrito em particular no DE-A 38 38 918. Os acidos mono-, di- ou tricarboxilicos usados podem ser

• 10 acidos alifdticos ou aromdticos e ^ster alcoois particularmente adequados ou

ester poliois de cadeia longa representatives tendo, por exemplo, de 6 a 24 • atomos de carbono. Os representatives tipicos dos esteres s2o adipatos, ftalatos; isoftalatos, tereftalatos e trimelitatos de isooctanol, de isononanol, de isodecanol e de isotridecanol. Tais produtos tambem tem propriedades oleosas de carregador.

Os aditivos que compreendem por?oes derivadas de anidrido succinico e tendo grupos hidroxila e/ou amino e/ou amido e/ou imido (h) sao preferivelmente derivados correspondentes de anidrido poliisobutenilsuccinico que sSo obteniveis pela rea?2o convencional ou

• 20 poliisobuteno altamente reativo tendo Mn de 300 a 5000 com anidrido

maleico pela via tennica ou por intermedio de poliisobuteno cloretado. As liga^oes de interesse particular aos derivados com poliaminas alifaticas, tais como etilenodiamina, dietilenotriamina, trietilenotetramina ou tetraetilenopentamina. As porfdes tendo grupos hidroxila e/ou amino e/ou amido e/ou imido sSo, por exemplo, grupos de acido carboxilico, amidas de acido, amidas de acido de di- ou poliaminas que, alem da fun5ao amida, tambem tem griqjos de amina livres, derivados de acido succinico tendo uma fun9ao de acido e uma fun92o de amida, carboximidas com monoaminas, carboximidas com di- ou poli, aminas que, alem da iun9ao imida, tambem 3

tSm trSs grupos amina e diimidas que sao formados pela rea?3o de di- ou poliaminas com dois derivados de acido succinic。. Tais aditivos de combustivel sao descritos, em particular, no US 4 849 572.

Os aditivos (i) que compreendam por^des obtidas pela rea9ao de Mannich de fenois substituidos com aldeidos e mono- ou poliaminas s3o, preferivelmente, produtos de rea?So de fenois substituidos por poliisobuteno com formaldeido e mono- ou poliaminas, tais como etilenodiamina, dietilenotriamina, trietilenotetramina, tetraetilenopentamina ou dimetilaminopropilamina. Os fenois substituidos por poliisobutenila podem

• 10 parar a partir de poliisobuteno convencionais ou altamente reativos tendo Mn

de 300 a 5000. Tais "bases de poliisobuteno-Mannich" sao descritas, em • particular no EP-A 831 141.

Para uma definifao mais precisa dos aditivos de combustivel individualmente detalhado, referencia e explicitamente feita neste com rela^ao a divulgafoes dos documentos da tecnica anterior mencionada acima.

Preferencia particular e dada aos aditivos detergentes do grupo (h). Estes sao, em succinimidas substituidas por poliisobutenila particulares, especialmente, as imidas com poliaminas alifaticas.

Os exemplos de demulsificantes adequados de acordo com a

• 20 inven^So incluera ο seguinte.

Os demulsificantes sSo substancias que realizam a desmistura de uma emulsao. Estas podem ser substancias ionogenicas ou nao ionogenicas que sao eficazes no limite de fase. Consequentemente, todas as substancias ativas na superficie sao, em principio adequadas como demulsificantes. Os demulsificantes particulannente adequados sao selecionados de compostos ativos de Snion, tais como os sais de metal alcalino ou de metal alcalino terroso de fenol- e naftalenossulfonatos substituidos por alquila e os sais de metal alcalino ou de metal alcalino terroso de acidos graxos e tambim

compostos nao carregados, tais como alcoxilados de alcool, por exemplo, ‘ 3, 饱 ϋ

etoxilados de alcool, alcoxilados de fenol, por exemplo, alcoxilados e terc- butilfenol ou etoxilados de terc-pentilfenol, acidos graxos, alquilfenois, produtos de condensa^So de oxido de etileno (EO) e oxido de propileno (PO), por exemplo, tamb^m na forma de copolimeros de bloco de ED/PO, polietilenoiminas ou ainda polissiioxanos.

A composi95o de aditivo e ο combustivel podem ser adicionalmente combinados com outros componentes e aditivos de costume. Men^So deve ser feita aqui, por exemplo, de oleos veiculos sem a a?2o do detergente comercializado, estes sendo utilizados, em particular no caso de uso nos combustiveis gasolina. Entretanto, ocasionalmente, estes tamb^m s2o usados em destilados medios.

Os 61eos veiculos adequados s2o listados por meio de exemplo

a seguir.

Os oleos veiculos minerais adequados sSo as fra^des obtidas no processamento do oleo bruto, tais como oleos de estoque claro ou base tendo viscosidades, por exemplo, a partir da classe SN, 500 - 2000 e tambem hidrocarbonetos aromaticos, hidrocarbonetos parafinicos e aIcoxialcan6is. Tambem e util uma fra^ao que έ obtida no refino de oleo mineral e e conhecido como "oleo de hidrocraque細ento" (corte destilado a vacuo tendo uma faixa de ebulifao de cerca de 360 a 5000 C, obtenivel do oleo mineral natural que foi cataliticamente hidrogenado sob pressSo alta e isomerizado e tambem desparafinizado). Tambem sao adequadas as misturas de oleos veiculos minerais mencionados acima.

Os exemplos de oleos veiculos sinteticos que sSo iiteis, de acordo com a invenfao sao selecionados de: poliolefinas (poli-alfa-olefinas ou poli(olefinas intemas), (poli)esteres, (poli) alcoxilados, polieteres, polieteraminas alifaticas, poliiteres iniciados por alquilfenol, polieteraminas iniciadas por alquilfenol e esteres carboxilicos de alcanois de cadeia longa.

Os exemplos de poliolefinas adequadas sao polimeros de

oleflna tendo Mn = de 400 a 1800, em particular com base em polibuteno ou poliisobuteno (hidrogenado ou nao hidrogenado).

Os exemplos de polieteres ou polieteraminas adequados s3o preferivelmente compostos que compreendem por?oes de polioxi-alquileno C2-C4 que sao obteniveis pela reafao de alcan6is C^-Qo5 alcanodiois Q-C30, mono- ou di-alquilaminas C2-C30, aiquila C1-C30 cicloexanois ou alquilfenois C1-C30 com 1 a 30 mol de oxido de etiieno e/ou 0xido de propileno e/ou oxido de butileno por grupo hidroxila ou grupo amino, e, no caso das polieteraminas, pela amina^So redutiva subseqilente com amonia, 參 10 monoaminas ou poliaminas. Tais produtos sao descritos, em particular em EP- A 310 875，EP-A 356 725, EP-A 700 985 e US 4.877.416. Por exemplo，as ‘ polieteraminas usadas podem ser poli-alquileno C2-C6 oxido aminas ou seus derivados funcionais. Os exemplos tipicos destes sSo butoxilatos de tridecanol ou butoxilatos de isotridecanol, butoxilatos de isononilfenol e tambim butoxilatos e propoxilatos de poliisobutenol e tambem os produtos de rea9§o correspondentes com amonia.

Os exemplos de esteres cwboxilicos de alcanois de cadeia longa sao, em particular, esteres de acidos mono-, di- ou tricarboxilicos com alcanois ou poliois de cadeia longa, como descrito, em particular em DE-A 38 ^ 20 38 918. Os acidos mono-, di- ou tricarboxilicos usados podem ser acidos alifaticos ou aromaticos; ester dlcoois ou poliois adequados sao, em particular rqjresentativos de cadeia longa particulares tendo, por exemplo, de 6 a 24 atomos de carbono. Os representatives tipicos os esteres sao adipatos, flaiatos, isoflalatos, tereftalatos e trimelitatos de isooctanol, isononanol, isodecanol e isotridecanol, por exemplo di-(n- ou isotridecil)ftalato.

Outros sistemas de 61eo carregador adequados s2o descritos, por exemplo, no DE-A 38 26 608，DE-A 41 42:241, DE-A 43 09 074，EP-A O 452 328 e EP-A O 548 617, que sao explicitamente incorporados neste por

meio de referencia. «Ι?

Os exemplos de oleos veiculos sinteticos particularmente adequados sao polieteres iniciados com alcool tendo de cerca de 5 a 35, por exemplo, de cerca de 5 a 30，unidades de oxido de alquileno C3-C6, por exemplo selecionado de unidades de oxido de propileno, oxido de n-butileno e oxido de isobutileno ou misturas destes. Os exemplos nao limitantes de alcoois iniciadores adequados sao alcan6is ou fenois de cadeia longa substituidos por alquila de cadeia longa em que ο radical alquila de cadeia longa e, em particular um radical alquila C5-C18 de cadeia reta ou ramiflcada. Os exemplos preferidos incluem tridecanol e nonilfenol. Outros oleos veiculos sinteticos adequados sao alquilfen0is

alcoxilados, como descrito no DE-A 10 102 913.6.

As composigoes inventivas podem, se apropriado, compreender co-aditivos adicionais.

Outros aditivos de costume sao aditivos que melhoram as propriedades contra ο frio do combustivel, por exemplo, nucleadores, melhoradores de fluxo, dispersantes de parafina e misturas destes, por exemplo, copolimeros de etileno-acetato de vinila; inibidores de corrosSo, por exemplo, com base em sais de amonio de acidos organicos carboxilicos, os ditos sais tendendo a formar peliculas ou em aromaticos heterociclicos no caso de prote^So contra a corrosSo de metais nao ferrosos; desembapantes; antiespumantes, por exemplo, certos compostos de siloxano; melhoradores do niimero de cetano (melhoradores de ignifao); melhoradores de combustao, antioxidantes ou estabilizantes, por exemplo com base em aminas, tais como p-fenilenodiamina, dicicloexilamina ou seus derivados ou em fenois, tais como 2,4-di-terc-butilfenol ou acido 3,5-di-terc-butil-4- hidroxifenilpropionico; antiestaticos, metalocenos, tais como ferroceno; metilciclopentadienilmanganes tricarbonila; melhoradores de lubrificidade, por exemplo, certos acidos graxos, esteres alquenilsuccinicos, aminas

bis(hidroxiaiquila) graxas, hidroxiacetamidas ou oleo de mamona e tambem pigmentos (marcadores). As aminas tambSm sao adicionadas se apropriado para diminuir ο pH do combustivel.

Quando os aditivos detergentes, por exemplo，aqueles tendo as por?oes polares (a) a (i), sao usadas, estes sao adicionados ao combustivel tipicamente em uma quantidade de 10 a 5000 ppm em peso, em particular de 50 a 1000 ppm em peso, mais preferivelmente de 25 a 500 ppm em peso.

Quando demulsificantes sao usados, estes sao adicionados ao combustivel tipicamente em uma quantidade de 0,1 a 100 ppm em peso, em particular de 0,2 a 10 ppm em peso. Os outros componentes e aditivos mencionados s3o, se

desejado, adicionados em quantidades de costume para este proposito.

Quando, a composigao de aditivo inventiva compreende um aditivo detergente, este esta presente, preferivelmente, em uma quantidade de 1 a 80 % em peso, preferivelmente de 1 a 50 % em peso, mais preferivelmente de 1 a 40 % em peso e em particular de 1 a 15 % em peso, com base no peso total da composifao.

Quando a composi^So de aditivo inventiva compreende um demulsificante, este esta presente preferivelmente em uma quantidade de 0,01 a 5 % em peso, mais preferivelmente de 0,01 a 2,5 % em peso e em particular de 0,01 a 1 % em peso, com base no peso total da composi9ao.

As composifoes inventivas tambem podem, se apropriadas, compreender um solvente ou diluente.

Os solventes e diluentes adequados sao, por exemplo, hidrocarbonetos aromaticos e alifaticos, por exemplo, alcanos C5-C10, tal como pentano, hexano, heptano, octano, nonano, decano, seus isomeros constitucionais e misturas; eter de petroieo, aromaticos, tal como benzeno, tolueno, xilenos e Solvente Nafta; alcanois tendo de 3 a 8 atomos de carbono, por exemplo, propanol, isopropanol, π-butanol, sec-butanol, isobutanol e

outros, em combinagSo com solventes de hidrocarboneto e alcoxialcanois. Os 35 化 diluentes adequados tambem sao, por exemplo, fra55es obtidas no processamento do 01eo bruto, tais como querosene, nafla ou estoque claro. Os diluentes usados com preferencia no caso de destilados m^dios，especialmente no caso de combustiveis diesel e oleos de aquecimento, sao nafla, querosene, combustiveis diesel, hidrocarbonetos aromaticos, tais como Solvente Nafta pesado, Solvesso ou Shellsor e tambem misturas destes solventes e diluentes.

Os componentes individuals podem ser adicionados ao combustivel ou a composifao de combustivel convencional ou como um concentrado preparado anteriormente (pacote de aditivo; composifao de

• 10 aditivo).

A presente inven^So tambem diz respeito a um processo para produzir pelo menos uma composigio combustivel, em que um combustivel ou uma composi^a。combustivel έ misturada

(a) com pelo menos uma hidrofobina ou derivado desta e pelo menos um outro aditivo de combustivel ou

(b) com um composi^ao de aditivo como descrito acima.

As hidrofobinas ou seus derivados tem boas propriedades na desespuma9ao de combustiveis.

A inven?ao e ilustrada a seguir pelos exemplo.

• 20 Εχβηφίοβ

Exemplo 1

Prepara^des para a clonagem de yaad-His^yaaE-Hise：

Uma rea?So de cadeia de polimerase foi realizada com ο auxilio dos oligonucleotideos Hal570 e Hal571 (Hal 572/ Hal 573). O DNA padr2o usado foi ο DNA genomico da bact6ria Bacillus subtilis. O fragmento de PCR resultante compreendeu a sequencia codificadora do gene yaaD/yaaE de Bacillus subtilis e um local de clivagem de restrigao de Ncol e BgIII respectivamente em cada extremidade. O fragmento de PCR foi purificado e cortado com as endonucleases de restri9ao Ncol e BgIII. Este fragmento de «λ 36 ^

DNA foi usado como uma inserção e clonado no vetor pQEóO da Qiagen, que foi linearizado anteriormente com as endonucleases de restrição Ncol e BgIII. Os vetores pQE60YAAD#2 / pQE60YaaE#5 formados desta maneira podem ser usados para expressar proteínas que consistem de YAAD::HISô ou YAAE::HIS6.

Hal570: gcgcgcccatggetcaaacaggtactga Hal571: gcagatctccagccgcgttcttgcatac Hal572; ggccatgggattaacaataggtgtactagg Hal573: gcagatcttacaagtgcatttgcttatattcc Exemplo 2

Clonagem de yaad hidrofobina DewA-His^ Uma reação de cadeia de polimerase foi realizada com o auxílio dos oligonucleotídeos KaM 416 e KaM 417. O DNA padrão usado foi o DNA genômico da natureza Aspergillus nidulans. O fragmento de PCR resultante compreendeu a seqüência codificadora do gene de hidrofobina dewA e um local de clivagem de proteinase do fator Xa de terminal Ν. O fragmento de PCR foi purificado e cortado com a endonuclease de restrição BamHl. Este fragmento de DNA foi usado como uma inserção e clonado no vetor pQE60YAAD#2 que foi linearizado anteriormente com a endonuclease

^ 20 de restrição BgIII.

O vetor #508 formado desta maneira pode ser usado para expressar uma proteína de fusão que consiste de YAAD::Xa::dewA::HIS$ KaM416: GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTIGGTACCAGCGC KaM417:

CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCT

CCGC

Exemplo 3

Clonagem de yaad hidrofobina RodA-Hise O plasmídeo #513 foi clonado analogamente ao plasmídeo #508 usando-se os oligonucleotídeos KaM 434 e KaM 435. KaM 434

GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC KaM 435 CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG Exemplo 4

Clonagem de yaad hidrofobina BASFl-HISe O plasmídeo #507 foi clonado analogamente ao plasmídeo #508 usando-se os oligonucleotídeos KaM 417 e KaM 418.

O DNA padrão usado foi uma seqüência de DNA sintética (hidrofobina BASF1) (ver anexo, SEQIDN0 11 e 12). KaM417:

CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCT

CCG

KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG Exemplo 5

Clonagem de yaad hidrofobina BASF I-HISg O plasmídeo #506 foi clonado analogamente ao plasmídeo #508 usando-se os oligonucleotídeos KaM 417 e KaM 418.

O DNA padrão usado foi uma seqüência de DNA sintética (hidrofobina BASF2) (ver anexo, SEOID N0 13 e 14). KaM417:

CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTTCTCCGTC TCCG

KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG Exemplo 6

Clonagem de yaad hidrofobina SC3-HÍS6 O plasmídeo #526 foi clonado analogamente ao plasmídeo #508 usando-se os oligonucleotídeos KaM464 e KaM465.

O DNA padrão usado foi o DNA de Schyzophillum commune (ver anexo, SEQID N0 9 e 10).

KaM: 464 CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGC KaM: 465 GCTAACAGATCTATGTMGCCCGTCTCCCCGTCGT Exemplo 7

Fermentação da cepa de E. coli yaad hidrofobina DewA-His6

A inoculação de 3 mi de meio líquido LB com uma cepa de E. coli que expressa yaad hidrofobina DewA-His6 em tubos Greiner de 15 ml. A inoculação por 9 horas a 37° C em um agitador a 200 rpm. Em cada caso dois frascos de Erlenmeyer de 1 litro com defletores e 250 ml de meio LB (+100 φ 10 i^g/ml de ampicilina) são inoculados com 1 ml em cada caso da cultura preliminar e incubado por 9 horas a 37° C em um agitador a 180 rpm.

Inocular 13,5 litros de meio LB (+100 μg/ml de ampicilina) com 0,5 litro de cultura preliminar (OD6OOnm, 1:10, medido contra H2O) em um fermentador de 20 litros. Em um OD60nm, de -3,5, adição de 140 ml de 100 mM de IPTG. Depois 3 h, esfriar o fermentador a IO0 C e centrifugar o caldo de fermentação. Usar grânulo celular para purificação adicional. Exemplo 8

Purificação da proteína recombinante de fusão de hidrofobina (Purificação de proteínas de fusão de hidrofobina que têm um ® 20 His6 tag de terminal C)

100 g de grânulo celular (100 a 500 mg de hidrofobina) são feitos de 200 ml de volume total com 50 mM de tampão de fosfato de sódio, pH 7,5 e recolocado em suspensão. A suspensão é tratada com um Ultraturrax tipo T25 (Janke and Kunkel, IKA-Labortechnik) por 10 minutos e subseqüentemente incubado com 500 unidades de Benzonase (Merck, Darmstadt; ordem N0 1.01697.0001) em temperatura ambiente por 1 hora para a degradação dos ácidos nucleicos. Antes da rompimento da célula, a filtração é realizada com um cartucho de vidro (PI). Para o rompimento da célula e para o corte do DNA genômico remanescente, dois ciclos 32- SL

homogeneizadores são realizados a 1500 bar (Microfluidizer M-110EH; Microfluidics Corp.)· O homogenado é centrifugado (ServaI) RC-5B, rotor GSA, copo de centrífuga de 250 ml, 60 minutos, 4o C, 12.000 rpm, 23.000 g), o sobrenadante foi colocado em gelo e o grânulo foi recolocado em suspensão em 100 ml de tampão de fosfato de sódio, pH 7,5. A centrifugação e a recolocação em suspensão são repetidas três vezes, o tampão de fosfato de sódio que compreende 1 % de SDS na terceira repetição. Após a recolocação em suspensão, a mistura é agitada por 1 hora e uma centrifugação final é realizada (Sorvall RC-5B, rotor GSA, copo de centrífuga de 250 ml, 60 φ 10 minutos, 4° C, 12.000 rpm, 23.000 g). De acordo com a análise de SDS- PAGE, a hidrofobina está presente no sobrenadante após a centrifugação final (figura 1). Os experimentos mostram que a hidrofobina está provavelmente presente na forma de corpos de inclusão nas células de E. coli correspondentes, 50 ml do sobrenadante que compreende hidrofobina são aplicados e uma coluna Sepharose High Performance 17-5268-02 de níquel de 50 ml (Amersham) que foi equilibrada com 50 mM de tampão de Tris-Cl pH 8,0. A coluna é lavada com 50 mM de tampão de Tris-Cl pH 8,0 e a hidrofobina é subseqüentemente eluída com 50 mM de tampão de Tris-Cl pH 8,0 que compreende 200 mM de imidazol. Para a remoção do imidazol, a ^ 20 solução é submetida à diálise contra 50 mM de tampão de Tris-Cl pH 8,0.

A Figura 1 mostra a purificação da hidrofobina preparada: Coluna A: Aplicação à coluna Sepharose de níquel (diluição

1:10)

Coluna B: Fluxo-direto = eluato da etapa de lavagem Coluna C a E: OD 280 Máxima das frações de eluição (WP1,

WP2, WP3)

Coluna F mostra o marcador aplicado.

A hidrofobina da figura 1 tem um tem um peso molecular de aproximadamente 53 kD. Algumas das faixas menores representam os produtos de degradação da hidrofobina.

Exemplo 9

Teste de desempenho: caracterização da hidrofobina pela mudança em ângulo de contato de uma gota de água em vidro

Substrato:

Vidro (vidro de janela, Süddeutsche Glas, Mannheim): concentração de hidrofobina: 100 μg/ml

- incubação das placas de vidro durante a noite (temperatura 80° C) em 50 mM de acetato de sódio pH 4 + 0,1 % de Tween 20

depois lavar o revestimento em água destilada

- então incubar 10 minutos/800 C/l % de solução de SDS em água destilada

Lavar em água destilada

As amostras são secadas sob ar e o ângulo de contato (em graus de uma gota de 5 μΐ de água são determinadas.

O ângulo de contato foi medido em um Dataphysics Contact Angle System OCA 15+, Software SCA 20.2.0. (Novembro 2002). A medição foi realizada de acordo com as instruções do fabricante.

O vidro não tratado deu um ângulo de contato de 30 ± 5o; um revestimento com a hidrofobina funcional de acordo com exemplo 8 (yaad- dewA-his6) deu ângulos de contato de 75 ± 5o.

Exemplo 10

Uso de um concentrado de hidrofobina (Yaad-dewA-His6) como um desespumante

A melhora na desespumação foi realizada por meio de um teste de espumação por agitação manual como segue:

- 100 ml de combustível ou combustível aditivado foram introduzidos em uma garrafa de vidro com tampa de rosca de 250 ml que foi firmemente selada; 6. - a amostra foi agitada por 2 minutos

- a amostra foi então colocada em repouso imediatamente e o volume da espuma (ml), o tempo de decomposição da espuma (segundos) foram determinados,

Para o experimento, um concentrado de hidrofobina (Yaad- dewA-Hisg, como um solução em tampão de NaH2PO4 (50 mmol/1, pH 7,5)) foi usado. A amostra de partida teve uma concentração de 6,1 mg/ml de hidrofobina. 2 ml da amostra de partida foram feitas até 100 ml (Hyd. sol. 1) e 3 ml da solução resultante adicionados a 97 ml de combustível (combustível EN 590). Os resultados do experimento são reproduzidos na tabela que segue.

Dosagem DK Espuma de acordo com a Repsol Volume Tempo de quebra Não aditivado 976 10 18 Hyd. sol 2 3 ml 976 0 0

A quantidade de espuma e o tempo de decomposição de

espuma foram menores no caso de aditivação com o concentrado de hidrofobina do que quando o combustível diesel não compreende qualquer hidrofobina. Denominação dos nomes das seqüências às seqüências de DNA e de polipeptídeo na listagem de seqüências

DewA DNA e seqüência de polipeptídeo SEQ ID N0: 1 DewA seqüência de polipeptídeo SEQID N°: 2 rodA DNA e seqüência de polipeptídeo SEQID N0: 3 rodA seqüência de polipeptídeo SEQ ID N0: 4 hypB DNA e seqüência de polipeptídeo SEQID N0: 5 hypB seqüência de polipeptídeo SEQID N°: 6 hypA DNA e seqüência de polipeptídeo SEQ ID N0: 7 hypA seqüência de polipeptídeo SEQID N0: 8 sc3 seqüência de polipeptídeo SEQID N°: 9 sc3 DNA e seqüência de polipeptídeo SEQIDN0: 10 basf 1 seqüência de polipeptídeo SEQID N0: 11 basfl DNA e seqüência de polipeptídeo SEQIDN0: 12 basf2 seqüência de polipeptídeo SEQIDN0: 13 bas£2 DNA e seqüência de polipeptídeo SEQ ID N0: 14 yaad seqüência de polipeptídeo SEQIDN0: 15 yaad DNA e seqüência de polipeptídeo SEQID N°: 16 yaae seqüência de polipeptídeo SEQIDN0: 17 yaae DNA e seqüência de polipeptídeo SEQIDN0: 18 yaad-Xa-dewA-his DNA e seqüência de polipeptídeo SEQID N0: 19 yaad-Xa-dewA-his seqüência de polipeptídeo SEQ ED N°: 20 yaad-Xa-rodA-his DNA e seqüência de polipeptídeo SEQ IDN°: 21 yaad-Xa-rodA-his seqüência de polipeptídeo SEQ ID N0: 22 yaad-Xa-basfl-his DNA e seqüência de polipeptídeo SEQID N0: 23 yaad-Xa-basfl-his seqüência de polipeptídeo SEQID N0: 24 LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA <110> 3Α8Γ Aicc£engesellsehaf t

«120> uso de proteínas coao ua componence anci-espuaa eu combuscíveis

<130» PF S7138

<160> 2«

«170» Pataniin vensSo 3.1

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Claims (11)

1. Uso de pelo menos uma hidrofobina ou de um derivado desta, caracterizado pelo fato de ser como um desespumante em composições de aditivo ou combustíveis.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o combustível é um combustível diesel.

3. Uso de acordo com cada uma das reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma hidrofobina ou derivado desta são usados em uma quantidade de 0,1 a 100 ppm com base no combustível.

4. Processo para desespumar combustível, caracterizado pelo fato de que compreende a adição de pelo menos uma hidrofobina ou derivado desta a um combustível.

5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o combustível é um combustível diesel.

6. Processo de acordo com cada uma das reivindicações 4 e 5, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma hidrofobina ou derivado desta são usados em uma quantidade de 0,1 a 100 ppm com base no combustível.

7. Composição de aditivo, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma hidrofobina ou derivado desta e pelo menos um outro aditivo de combustível.

8. Composição de combustível, caracterizada pelo fato de que compreende, além de pelo menos um combustível como um constituinte principal, pelo menos uma hidrofobina ou derivado desta e pelo menos um outro aditivo de combustível.

9. Composição de aditivo ou composição de combustível de acordo com cada uma das reivindicações 7 e 8, caracterizada pelo feto de que a composição compreende pelo menos um detergente.

10. Composição de aditivo ou composição de combustível de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 9, caracterizada pelo fato de que a composição compreende pelo menos um desemulsificador.

11. Processo para produzir pelo menos uma composição de combustível, caracterizado pelo fato de que um combustível ou uma composição de combustível é misturada (a) com pelo menos uma hidrofobina ou derivado desta e pelo menos um outro aditivo de combustível ou (b) com uma composição de aditivo como definido em qualquer uma das reivindicações de 7, 9 ou 10.