DE102005015043A1

DE102005015043A1 - Verwendung von Polypeptiden als Haftvermittler

Info

Publication number: DE102005015043A1
Application number: DE200510015043
Authority: DE
Inventors: Hermann Dr. Seyffer; Karl-Heinz Dr. Schumacher; Hans-Georg Dr. Lemaire; Ulf Dr. Baus; Thomas Dr. Subkowski; Marvin Dr. Karos; Claus Dr. Bollschweiler; Thomas Dr. Heidenfelder
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2005-03-31
Filing date: 2005-03-31
Publication date: 2006-10-05
Also published as: CN101151148A; CN101151148B

Abstract

Mehrschichtiger Verbund oder beschichtetes Substrat, enthaltend Verbindungen, welche zu mindestens 40 Gew.-% aus über Peptidbindungen verknüpften alpha-Aminosäuren aufgebaut sind (im Nachfolgenden kurz Polypeptid genannt) als Haftungsvermittler zwischen mindestens zwei benachbarten Schichten des Verbunds oder zwischen der Beschichtung und dem Substrat.

Description

Die Erfindung betrifft einen mehrschichtigen Verbund oder ein beschichtetes Substrat, enthaltend Verbindungen, welche zu mindestens 40 Gew.-% aus über Peptidbindungen verknüpften alpha-Aminosäuren aufgebaut sind (im nachfolgenden kurz Polypeptid genannt), als Haftvermittler zwischen mindestens zwei benachbarten Schichten des Verbunds oder zwischen der Beschichtung und dem Substrat. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung von Hydrophobinen als Haftvermittler.

Hydrophobine sind kleine Proteine von etwa 100 bis 150 Aminosäuren, die charakteristisch für filamentöse Pilze, beispielsweise Schizophyllum commune, sind. Sie weisen in aller Regel 8 Cystein-Einheiten auf.

Hydrophobine weisen eine ausgeprägte Affinität zu Grenzflächen auf und eignen sich daher zur Beschichtung von Oberflächen. So lässt sich beispielsweise Teflon mittels Hydrophobinen unter Erhalt einer hydrophilen Oberfläche beschichten.

Hydrophobine können aus natürlichen Quellen isoliert werden. Unsere ältere Anmeldung DE 10 2005 007 480.4 offenbart ein Herstellverfahren für Hydrophobine.

Im Stand der Technik ist die Verwendung von Hydrophobinen für verschiedene Anwendungen vorgeschlagen worden.

WO 96/41882 schlägt die Verwendung von Hydrophobinen als Emulgatoren, Verdicker, oberflächenaktive Substanzen, zum Hydrophilieren hydrophober Oberflächen, zur Verbesserung der Wasserbeständigkeit hydrophiler Substrate, zur Herstellung von Öl-in-Wasser-Emulsionen oder von Wasser-in-Öl-Emulsionen vor. Weiterhin werden pharmazeutische Anwendungen wie die Herstellung von Salben oder Cremes sowie kosmetische Anwendungen wie Hautschutz oder die Herstellung von Haarshampoos oder Haarspülungen vorgeschlagen.

EP 1 252 516 offenbart die Beschichtung von Fenstern, Kontaktlinsen, Biosensoren, medizinischen Vorrichtungen, Behältern zur Durchführung von Versuchen oder zur Lagerung, Schiffrümpfen, festen Teilchen oder Rahmen oder Karosserie von Personenkraftwagen mit einer Hydrophobine enthaltenden Lösung bei einer Temperatur von 30 bis 80°C.

WO 03/53383 offenbart die Verwendung von Hydrophobin zum Behandeln von Keratin-Materialien in kosmetischen Anwendungen.

WO 03/10331 offenbart einen mit Hydrophobin beschichteten Sensor, beispielsweise eine Messelektrode, an den nicht kovalent weitere Substanzen, z. B. elektroaktive Substanzen, Antikörper oder Enzyme gebunden sind.

Bisher werden unterschiedlichste Haftvermittler zur Verbesserung der Haftfestigkeit, z. B. von Beschichtungen auf unterschiedlichsten Substraten verwendet. Gemäß Römpp Chemie Lexikon (Auflage 1990) kommen z. B. Titanate, Silane, Crom-Komplexe ungesättigter Carbonsäuren, in Betracht. Speziell als Haftvermittler für Klebstoffe werden Ethylen/Acylamid Copolymere, polymere Isocyanate oder reaktive Silicium-organische Verbindungen genannt.

Bekannt sind auch Polyurethane und Polyethylenimine als Haftvermittler.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung waren alternative Haftvermittler, welche möglichst gute anwendungstechnische Eigenschaften haben und insbesondere eine gute Haftung der einzelnen Schichten eines mehrschichtigen Verbunds oder einer Beschichtung auf einem Substrat bewirkt.

Demgemäß wurde der eingangs definierte mehrschichtige Verbund oder das beschichtete Substrat gefunden.

Zum Haftvermittler

Der mehrschichtige Verbund oder das beschichtete Substrat enthält das eingangs definierte Polypeptid als Haftvermittler.

Das Polypeptid besteht zu mindestens 40 Gew.-%, vorzugsweise zu mindestens 70 Gew.-%, besonders bevorzugt zu mindestens 90 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt zu mindestens 95 oder 99 Gew.-% aus über Peptidbindungen verknüpften alpha-Aminosäuren.

In einer besonderen Ausführungsform besteht das Polypeptid ausschließlich aus über Peptidbindungen verknüpften alpha-Aminosäuren.

Als alpha-Aminosäuren in Betracht kommen insbesondere Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Tyrosin, Prolin, Hydroxyprolin, Serin, Threonin, Cystein, Cystin, Methionin, Tryptophan, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Arginin, Lysin und Histidin.

Vorzugsweise enthält das Polypeptid Cystein als alpha-Aminosäure im Gemisch mit anderen alpha-Aminosäuren.

Besonders bevorzugt besteht das Polypeptid zu mindestens 0,1 Gew.-%, besonders bevorzugt zu mindestens 0,5, ganz besonders bevorzugt zu mindestens 1 Gew.-% aus Cystein. Der Gehalt an Cystein im Polypeptid übersteigt im allgemeinen nicht Werte von 15 Gew.-% insbesondere nicht Werte von 10 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt übersteigt er nicht Werte von 7 Gew.-%.

In einer besonderen Ausführungsform handelt es sich bei den Polypeptiden um Hydrophobine.

Unter dem Begriff „Hydrophobine" im Sinne dieser Erfindung sollen im Folgenden Polypeptide der allgemeinen Strukturformel (I) X_n-C¹-X_1-50-C²-X_0-5-C³-X_1-100-C⁴-X_1-100-C⁵-X_1-50-C⁶-X_0-5-C⁷-X_1-50-C⁸-X_m (I)verstanden werden, wobei X für jede der 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, Ile Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly) stehen kann. Hierbei stellen die bei X stehenden Indizes jeweils die Anzahl der Aminosäuren dar, C steht für Cystein, und die Indizes n und m stehen unabhängig voneinander für natürliche Zahlen zwischen 0 und 500, bevorzugt zwischen 15 und 300.

Die Polypetide sind weiterhin durch die Eigenschaft charakterisiert, dass sie nach Beschichten einer Glasoberfläche eine Vergrößerung des Kontaktwinkels eines Wassertropfens von mindestens 20°, bevorzugt mindestens 25° und besonders bevorzugt 30° bewirken (bei 20°C).

Die mit C¹ bis C⁸ benannten Cysteine können entweder reduziert vorliegen oder miteinander Disulfidbrücken ausbilden. Besonders bevorzugt ist die intramolekulare Ausbildung von C-C Brücken, insbesondere die mit mindestens einer, bevorzugt 2, besonders bevorzugt 3 und ganz besonders bevorzugt 4 intramolekularen Disulfidbrücken.

Bevorzugt werden Hydrophobine der allgemeinen Formel (II) X_n-C¹-X_3-25-C²-X_0-2-C³-X_5-50-C⁴-X_2-35-C⁵-X_2-15-C⁶-X_0-2-C⁷-X_3-35-C⁸-X_m (II)zur Ausführung der vorliegenden Erfindung eingesetzt, wobei X, C und die bei X stehenden Indizes die obige Bedeutung haben, die Indizes n und m für Zahlen zwischen 0 und 300 stehen, und sich die Proteine weiterhin durch die oben erwähnte Kontaktwinkeländerung auszeichnen.

Besonders bevorzugt werden Hydrophobine der allgemeinen Formel (III) X_n-C¹-X_5-9-C²-C³-X_11-39-C⁴-X_2-23-C⁵-X_5-9-C⁶-C⁷-X_6-18-C⁸-X_m (III)eingesetzt, wobei X, C und die bei X stehenden Indizes die obige Bedeutung haben, die Indizes n und m für Zahlen zwischen 0 und 200 stehen, und sich die Proteine weiterhin durch die oben erwähnte Kontaktwinkeländerung auszeichnen.

Bei den Resten X_n und X_m kann es sich um Peptidsequenzen handeln, die natürlicherweise auch mit einem Hydrophobin verknüpft sind. Es kann sich aber auch bei einem oder beiden Resten um Peptidsequenzen handeln, die natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verknüpft sind. darunter sind auch solche Reste X_n und/oder X_m zu verstehen, bei denen eine natürlicherweise in einem Hydrophobin vorkommende Peptidsequenz durch eine nicht natürlicherweise in einem Hydrophobin vorkommende Peptidsequenz verlängert ist.

Falls es sich bei X_n und/oder X_m um natürlicherweise nicht in Hydrophobinen vorkommende Peptidsequenzen handelt, sind derartige Sequenzen in der Regel mindestens 20, bevorzugt mindestens 35, besonders bevorzugt mindestens 50 und ganz besonders bevorzugt mindestens 100 Aminosäuren lang. Ein derartiger, natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verknüpfter Rest soll im Folgenden auch als Fusionspartner bezeichnet werden. Damit soll ausgedrückt werden, dass die Proteine aus einem Hydrophobinteil und einem Fusionspartnerteil bestehen, die in der Natur nicht zusammen in dieser Form vorkommen.

Der Fusionspartnerteil kann aus einer Vielzahl von Proteinen ausgewählt werden. Es können auch mehrere Fusionspartner mit einem Hydrophobinteil verknüpft werden, beispielsweise am Aminoterminus (X_n) und am Carboxyterminus (X_m) des Hydrophobinteils. Es können aber auch beispielsweise zwei Fusionspartner mit einer Position (X_n oder X_m) des erfindungsgemässen Proteins verknüpft werden.

Besonders geeignete Fusionspartner sind Polypeptide, die natürlicherweise in Mikroorganismen, insbesondere in E. coli oder Bacillus subtilis vorkommen. Beispiele für solche Fusionspartner sind die Sequenzen yaad (SEQ ID NO:15 und 16), yaae(SEQ ID NO: 17 und 18), und Thioredoxin. Gut geeignet sind auch Fragmente oder Derivate dieser genannten Sequenzen, die nur einen Teil, bevorzugt 70–99 %, besonders bevorzugt 80–98% der genannten Sequenzen umfassen, oder bei denen einzelne Aminosäuren, bzw. Nukleotide gegenüber der genannten Sequenz verändert sind.

Die erfindungsgemäß verwendeten Polypeptide können auch noch in ihrer Polypeptidsequenz modifiziert sein, beispielsweise durch Glycosilierung, Acetylierung oder auch durch chemische Quervernetzung beispielsweise mit Glutardialdehyd.

Eine Eigenschaft der erfindungsgemäß verwendeten Polypeptide ist die Änderung von Oberflächeneigenschaften, wenn die Oberflächen mit den Polypeptiden beschichtet werden. Die Änderung der Oberflächeneigenschaften lässt sich experimentell dadurch bestimmen, dass der Kontaktwinkel eines Wassertropfens vor und nach der Beschichtung der Oberfläche mit dem Protein gemessen wird und die Differenz der beiden Messungen ermittelt wird.

Die Durchführung von Kontaktwinkelmessungen ist dem Fachmann prinzipiell bekannt. Die genauen experimentellen Bedingungen zur Messung des Kontaktwinkels sind im experimentellen Teil dargestellt. Unter den dort genannten Bedingungen besitzen die erfindungsgemäß verwendeten Polypeptide die Eigenschaft, den Kontaktwinkel um mindestens 20°, bevorzugt mindestens 25°, besonders bevorzugt mindestens 30° zu vergrößern.

Im Hydrophobinteil der bisher bekannten Hydrophobine sind die Positionen der polaren und unpolaren Aminosäuren konserviert, was sich in einem charakteristischen Hydrophobizitätsplot äußert. Unterschiede in den biophysikalischen Eigenschaften und in der Hydrophobizität führten zur Einteilung der bisher bekannten Hydrophobine in zwei Klassen, I und II (Wessels et al. 1994, Ann. Rev. Phytopathol., 32, 413–437).

Die assemblierten Membranen aus Klasse I Hydrophobinen sind hochgradig unlöslich (selbst gegenüber 1 % SDS bei erhöhter Temperatur) und können nur durch konzentrierte Trifluoressigsäure (TFA), bzw. Ameisensäure wieder dissoziiert werden. Im Gegensatz dazu sind die assemblierten Formen von Klasse II Hydrophobinen weniger stabil. Sie können bereits durch 60%iges Ethanol, bzw. 1 % SDS (bei Raumtemperatur) wieder aufgelöst werden.

Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen zeigt, dass die Länge des Bereichs zwischen Cystein C³ und C⁴ bei Klasse II Hydrophobinen deutlich kürzer ist, als bei Hydrophobinen der Klasse I. Klasse II Hydrophobine weisen weiterhin mehr geladene Aminosäuren als Klasse I auf.

Besonders bevorzugte Hydrophobine zur Ausführung der vorliegenden Erfindung sind die Hydrophobine des Typs dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basf1, basf2, die im nachfolgenden Sequenzprotokoll strukturell charakterisiert sind. Es kann sich auch nur um Teile oder Derivate davon handeln. Es können auch mehrere Hydrophobine, bevorzugt 2 oder 3, gleicher oder unterschiedlicher Struktur miteinander verknüpft und mit einer entsprechenden geeigneten Polypeptidsequenz, die natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verbunden ist, verknüpft werden.

Besonders geeignet zur Durchführung der vorliegenden Erfindung sind weiterhin die Fusionsproteine mit den in SEQ ID NO: 20, 22, 24 dargestellten Polypeptidsequenzen sowie den dafür codierenden Nukleinsäuresequenzen, insbesondere den Sequenzen gemäss SEQ ID NO: 19, 21, 23. Auch Proteine, die sich ausgehend von den in SEQ ID NO. 22, 22 oder 24 dargestellten Polypeptidsequenzen durch Austausch, Insertion oder Deletion von mindestens einer, bis hin zu 10. bevorzugt 5, besonders bevorzugt 5 % aller Aminosäuren ergeben, und die die biologische Eigenschaft der Ausgangsproteine noch zu mindestens 50 % besitzen, sind besonders bevorzugte Ausführungsformen. Unter biologischer Eigenschaft der Proteine wird hierbei die bereits beschriebene Änderung des Kontaktwinkels um mindestens 20° verstanden.

Die erfindungsgemäß verwendeten Polypeptide lassen sich chemisch durch bekannte Verfahren der Peptidsynthese, beispielsweise durch Festphasensynthese nach Merrifield herstellen.

Natürlich vorkommende Hydrophobine lassen sich aus natürlichen Quellen mittels geeigneter Methoden isolieren. Beispielhaft sei auf Wösten et. al., Eur. J Cell Bio. 63, 122–129 (1994) oder WO 96/41882 verwiesen.

Die Herstellung von Fusionsproteinen kann bevorzugt durch gentechnische Verfahren erfolgen, bei denen eine für den Fusionspartner und eine für den Hydrophobinteil codierende Nukleinsäuresequenz, insbesondere DNA-Sequenz, so kombiniert werden, dass in einem Wirtsorganismus durch Genexpression der kombinierten Nukleinsäuresequenz das gewünschte Protein erzeugt wird. Ein derartiges Herstellverfahren ist in unserer älteren Anmeldung DE 10 2005 007 480.4 offenbart.

Geeignete Wirtsorganismen (Produktionsorganismen) für das genannte Herstellverfahren können dabei Prokaryonten (einschließlich der Archaea) oder Eukaryonten sein, besonders Bakterien einschliesslich Halobacterien und Methanococcen, Pilze, Insektenzellen, Pflanzenzellen und Säugerzellen, besonders bevorzugt Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus. megaterium, Aspergillus oryzea, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Pichia pastoris, Pseudomonas spec., Lactobacillen, Hansenula polymorpha, Trichoderma reesei, SF9 (bzw. verwandte Zellen) u.a..

Gegenstand der Erfindung sind außerdem Expressionskonstrukte, enthaltend unter der genetischen Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen eine für ein erfindungsgemäß verwendetes Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz, sowie Vektoren, umfassend wenigstens eines dieser Expressionskonstrukte.

Vorzugsweise umfassen eingesetzte Konstrukte 5'-stromaufwärts von der jeweiligen kodierenden Sequenz einen Promotor und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der kodierenden Sequenz.

Unter einer "operativen Verknüpfung" versteht man die sequentielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls weiterer regulativer Elemente derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann.

Beispiele für operativ verknüpfbare Sequenzen sind Targeting-Sequenzen sowie Enhancer, Polyadenylierungssignale und dergleichen. Weitere regulative Elemente umfassen selektierbare Marker, Amplifikationssignale, Replikationsursprünge und dergleichen. Geeignete regulatorische Sequenzen sind z. B. beschrieben in Goeddel, Gene Expression Techno- logy: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).

Zusätzlich zu diesen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde.

Ein bevorzugtes Nukleinsäurekonstrukt enthält vorteilhaft auch eine oder mehrere der schon erwähnten "Enhancer"-Sequenzen, funktionell verknüpft mit dem Promotor, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren.

Die Nukleinsäuren können in einer oder mehreren Kopien im Konstrukt enthalten sein. Im Konstrukt können noch weitere Marker, wie Antibiotikaresistenzen oder Auxotrophien komplementierende Gene, gegebenenfalls zur Selektion auf das Konstrukt enthalten sein.

Vorteilhafte Regulationssequenzen für das Verfahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-, tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-,laclq-T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, rhaP(rhaPBAD) SP6-, lambda-PR-oder imlambda-P-Promotor enthalten, die vorteilhaft in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SP02, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1, MFalpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH enthalten.

Es können auch künstliche Promotoren für die Regulation verwendet werden.

Das Nukleinsäurekonstrukt wird zur Expression in einem Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen Vektor, wie beispielsweise einem Plasmid oder einem Phagen inseriert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Unter Vektoren sind außer Plasmiden und Phagen auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, also z. B. Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus und Adenovirus, Transposons,IS-Elemente, Phasmide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA, sowie das Agrobacterium-System zu verstehen.

Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden. Diese Vektoren stellen eine weitere Ausgestaltung der Erfindung dar. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III''3-B1, tgt11 oderpBdCl, in StreptomycesplJ101, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALS1, pIL2 oder pBB116, in Hefen 2alpha, pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 oder pDH51. Die genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden.

Vorteilhaft enthält das Nukleinsäurekonstrukt zur Expression der weiteren enthaltenen Gene zusätzlich noch 3'-und/oder 5'-terminale regulatorische Sequenzen zur Steigerung der Expression, die je nach ausgewähltem Wirtorganismus und Gen oder Gene für eine optimale Expression ausgewählt werden.

Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.

In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann der das Nukleinsäurekonstrukt oder die Nukleinsäure enthaltende Vektor auch vorteilhaft in Form einer linearen DNA in die Mikroorganismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Vektor wie einem Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurekonstrukt oder der Nukleinsäure bestehen.

Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist es vorteilhaft die Nukleinsäuresequenzen entsprechend des im Organismus verwendeten spezifischen "codon usage" zu verändern. Der "codon usage" lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.

Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten kodierenden Nukleotidsequenz sowie einem Terminator- oder Polyadenylierungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F.Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. andWiley Interscience (1987) beschrieben sind.

Das rekombinante Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt wird zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus, vorteilhaft in einen wirtsspezifischen Vektor insertiert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) entnommen werden.

Mit Hilfe der Vektoren sind rekombinante Mikroorganismen herstellbar, welche beispielsweise mit wenigstens einem Vektor transformiert sind und zur Produktion der erfindungsgemäß verwendeten Polypeptide eingesetzt werden können. Vorteilhafterweise werden die oben beschriebenen rekombinanten Konstrukte in ein geeignetes Wirtssystem eingebracht und exprimiert. Dabei werden vorzugsweise dem Fachmann bekannte geläufige Klonierungs- und Transfektionsmethoden, wie beispielsweise Co-Präzipitation, Protoplastenfusion, Elektroporation, retrovirale Transfektion und dergleichen, verwendet, um die genannten Nukleinsäuren im jeweiligen Expressionssystem zur Expression zu bringen. Geeignete Systeme werden beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology, F.Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, oder Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben.

Es sind auch homolog rekombinierte Mikroorganismen herstellbar. Dazu wird ein Vektor hergestellt, der zumindest einen Abschnitt eines erfindungsgemäß zu verwendenden Gens oder einer kodierenden Sequenz enthält, worin gegebenenfalls wenigstens eine Aminosäure-Deletion, -Addition oder -Substitution eingebracht worden ist, um die Sequenz zu verändern, z. B. funktionell zu disruptieren ("Knockout"- Vektor). Die eingebrachte Sequenz kann z. B. auch ein Homologes aus einem verwandten Mikroorganismus sein oder aus einer Säugetier-, Hefe- oder Insektenquelle abgeleitet sein. Der zur homologen Rekombination verwendete Vektor kann alternativ derart ausgestaltet sein, dass das endogene Gen bei homologer Rekombination mutiert oder anderweitig verändert ist, jedoch noch das funktionelle Protein kodiert (z. B. kann der stromaufwärts gelegene regulatorische Bereich derart verändert sein, dass dadurch die Expression des endogenen Proteins verändert wird). Der veränderte Abschnitt des erfindungsgemäß verwendeten Gens ist im homologen Rekombinationsvektor. Die Konstruktion geeigneter Vektoren zur homologen Rekombination ist z. B. beschrieben in Thomas, K. R. und Capecchi, M. R. (1987) Cell 51: 503.

Als rekombinante Wirtsorganismen für die erfindungsgemäß verwendete Nukleinsäure oder dem Nukleinsäurekonstrukt kommen prinzipiell alle prokaryontischen oder eukaryontischen Organismen in Frage. Vorteilhafterweise werden als Wirtsorganismen Mikroorganismen wie Bakterien, Pilze oder Hefen verwendet. Vorteilhaft werden grampositive oder gram-negative Bakterien, bevorzugt Bakterien der Familien Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae oder Nocardiaceae, besonders bevorzugt Bakterien der Gattungen Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium oder Rhodococcus verwendet.

Die im Herstellverfahren für Fusionsproteine verwendeten Organismen werden je nach Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw. gezüchtet. Mikroorganismen werden in der Regel in einem flüssigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle meist in Form von Zuckern, eine Stickstoffquelle meist in Form von organischen Stickstoffquellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat, Spurenelemente wie Eisen-, Mangan- und Magnesiumsalze sowie gegebenenfalls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0 und 100°C, bevorzugt zwischen 10 bis 60°C unter Sauerstoffbegasung angezogen. Dabei kann der pH-Wert der Nährflüssigkeit auf einem festen Wert gehalten werden, das heißt während der Anzucht reguliert werden oder nicht. Die Anzucht kann "batch"-weise, "semi-batch"-weise oder kontinuierlich erfolgen. Nährstoffe können zu Beginn der Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder kontinuierlich nachgefüttert werden. Die Enzyme können nach dem in den Beispielen beschriebenen Verfahren aus den Organismen isoliert werden oder als Rohextrakt für die Reaktion verwendet werden.

Geeignet sind auch Verfahren zur rekombinanten Herstellung der erfindungsgemäß verwendeten Polypeptide oder funktioneller, biologisch aktiver Fragmente davon, wobei man einen Polypeptide-produzierenden Mikroorganismus kultiviert, gegebenenfalls die Expression der Polypeptide induziert und diese aus der Kultur isoliert. Die Polypeptide können so auch in großtechnischem Maßstab produziert werden, falls dies erwünscht ist. Der rekombinante Mikroorganismus kann nach bekannten Verfahren kultiviert und fermentiert werden. Bakterien können beispielsweise in TB-oder LB-Medium und bei einer Temperatur von 20 bis 40°C und einem pH-Wert von 6 bis 9 vermehrt werden. Im Einzelnen werden geeignete Kultivierungsbedingungen beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschrieben.

Die Zellen werden dann, falls die Polypeptide nicht in das Kulturmedium sezerniert werden, aufgeschlossen und das Produkt nach bekannten Proteinisolierungsverfahren aus dem Lysat gewonnen. Die Zellen können wahlweise durch hochfrequenten Ultraschall, durch hohen Druck, wie z. B. in einer French-Druckzelle, durch Osmolyse, durch Einwirkung von Detergenzien, lytischen Enzymen oder organischen Lösungsmitteln, durch Homogenisatoren oder durch Kombination mehrerer der aufgeführten Verfahren aufgeschlossen werden.

Eine Aufreinigung der Polypeptide kann mit bekannten, chromatographischen Verfahren erzielt werden, wie Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), wie Q- Sepharose-Chromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Chromatographie, sowie mit anderen üblichen Verfahren wie Ultrafiltration, Kristallisati- on, Aussalzen, Dialyse und nativerGelelektrophorese. Geeignete Verfahren werden beispielsweise in Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Water de Gruyter, Berlin, New York oder in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin beschrieben.

Vorteilhaft kann es sein, zur Isolierung des rekombinanten Proteins Vektorsysteme oder Oligonukleotide zu verwenden, die die cDNA um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide oder Fusionsproteine kodieren, die beispielsweise einer einfacheren Reinigung dienen. Derartige geeignete Modifikationen umfassen als Anker fungierende sogenannte "Tags", wie beispielsweise die als Hexa-Histidin-Anker bekannte Modifikation oder Epitope, die als Antigene von Antikörpern erkannt werden können (beschrieben zum Beispiel in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N. Y.) Press). Weitere geeignete Tags sind z. B. HA, Calmodulin-BD, GST, MBD; Chitin-BD, Steptavidin-BD-Avi-Tag, Flag-Tag, T7 etc. Diese Anker können zur Anheftung der Proteine an einen festen Träger, wie z. B. einer Polymermatrix, dienen, die beispielsweise in einer Chromatographiesäule eingefüllt sein kann, oder an einer Mikrotiterplatte oder an einem sonstigen Träger verwendet werden kann. Die entsprechenden Reinigungsprotokolle sind von den kommerziellen Affinitäts-Tag-Anbietern erhältlich.

Die wie beschrieben hergestellten Proteine können sowohl direkt als Fusionsproteine als auch nach Abspaltung und Abtrennung des Fusionspartners als „reine" Hydrophobine verwendet werden.

Wenn eine Abtrennung des Fusionspartners vorgesehen ist, empfiehlt es sich eine potentielle Spaltstelle (spezifische Erkennungsstelle für Proteasen) in das Fusionsprotein zwischen Hydrophobinteil und Fusionspartnerteil einzubauen. Als Spaltstelle geeignet sind insbesondere solche Peptidsequenzen geeignet, die ansonsten weder im Hydrophobinteil noch im Fusionspartnerteil vorkommen, was sich mit bioinformatischen Tools leicht ermitteln lässt. Besonders geeignet sind beispielsweise BrCN-Spaltung an Methionin, oder durch Protease vermittelte Spaltlung mit Faktor Xa-, Enterokinase-, Thrombin, TEV-Spaltung (Tobacca etch virus Protease).

Zuordnung der Sequenznamen zu DNA- und Polypeptidsequenzen im Sequenzprotokoll

Zum mehrschichtigen Verbund

Mehrschichtige Verbunde werden für unterschiedlichste Zwecke, z. B. als Verpackungsmittel (insbesondere Verbundfolien) oder selbstklebende Artikel (mehrschichtiger Verbund aus mindestens Träger und Klebstoffschicht) eingesetzt.

Die mehrschichtigen Verbunde enthalten mindestens zwei, vorzugsweise zwei bis fünf Schichten, wobei die einzelnen Schichten eine Dicke von z. B. 0,01 bis 5 mm haben können. Die einzelnen Schichten können aus natürlichen oder synthetischen Polymeren oder auch aus Metall bestehen. Bei den Schichten handelt es sich insbesondere um Polymerfolien, Papier, Metallfolien, metallisierte Polymerfolien etc.

Zwischen mindestens zwei benachbarten Schichten des mehrschichtigen Verbunds werden die obigen Polypeptide als Haftvermittler verwendet. Vorzugsweise handelt es sich bei mindestens einer der benachbarten Schichten um eine Schicht aus einem natürlichen oder synthetischen Polymeren. Als Polymere kommen insbesondere Polykondensate, wie Polyester, Polyaddukte wie Polyurethane, Polyamide, Polycarbonate oder Polyphenylenether oder Polyphenylensulfide oder Polymere, welche durch radikalische oder ionische Polymerisation von ethylenisch ungesättigten Verbindungen erhältlich sind (kurz radikalische Polymere genannt). Derartige radikalische Polymere bestehen vorzugsweise zu mindestens 60 Gew.-%, besonders bevorzugt zu mindestens 80 Gew.-% aus sogenannten Hauptmonomeren, ausgewählt aus C1 bis C20 Alkyl(meth)acrylaten, Vinylestern von bis zu 20 C-Atome enthaltenden Carbonsäuren, Vinylaromaten mit bis zu 20 C-Atomen, ethylenisch ungesättigten Nitrilen, Vinylhalogeniden, Vinylethern von 1 bis 10 C Atome enthaltenden Alkoholen, aliphatischen Kohlenwasserstoffen mit 2 bis 8 C Atomen und ein oder zwei Doppelbindungen, insbesondere Ethylen und Propylen.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide eignen sich insbesondere auch als Haftvermittler für unpolare Polymere; daher besteht vorzugsweise zumindest eine der benachbarten Schichten aus einem unpolaren Polymer.

Ein Maß für die Polarität von Polymeren ist die Oberflächenspannung gegenüber Luft (21 °C). Je geringer die Oberflächenspannung, desto unpolarer ist das Polymer.

Vorzugsweise besteht daher zumindset eine der benachbarten Schichten aus einem unpolaren Polymer mit einer Oberflächenspannung kleiner 50 mN/m (milliNewton/Meter), insbesondere kleiner 40 mN/m. Derartige unpolare Polymere sind z. B. Polyamid 66 (42,5 mN/m), Polystyrol (43,5 mN/m), PVC (38,4 mN/m), Polyethylen (36,1 mN/m), Polypropylen (29 mN/m) oder Polytetrafluorethan (22,5 mN/m).

Besonders bevorzugt bestehen beide benachbarten Schichten aus einem derartigen unpolaren Polymeren.

Die für die Haftvermittling benötigte Menge des Polypeptids beträgt im allgemeinen 0,01 bis 1000 mg (Milligramm/m² (Quadratmeter), insbesondere 0,01 bis 100 mg/m² und besonders bevorzugt 0,1 bis 10 mg/m².

Das Polypeptid kann auf eine der benachbarten Schichten aufgetragen werden, alternativ kann das Polypeptid auch auf beide Schichten aufgetragen werden, wenn beide Schichten bereits vorgebildet sind.

Das Polypeptid liegt vorzugsweise als wässrige Lösung vor; der Polypeptidgehalt der Lösung beträgt vorzugsweise 0,01 bis 5 Gew.-Teile Polypeptid auf 100 Gew.-Teile Wasser. Für die erfindungsgemäße Verwendung wird die Lösung vorzugsweise weiter verdünnt auf eine Konzentration von 1 bis 10000 μg/ml Wasser, insbesondere 10 bis 1000 μg/ml Wasser.

Nach dem Auftragen kann daher zunächst eine Trocknung zur Entfernung des Wassers erfolgen.

Danach können die beiden benachbarten Schichten durch übliche Methoden, z. B. durch Kaschierung verbunden werden.

Insbesondere kann das Polypeptid auch auf eine der benachbarten Schichten (erste Schicht) aufgetragen werden und die andere benachbarte Schicht (zweite Schicht) danach durch Aufbringen einer Polymerdispersion, Polymerlösung oder eines lösemittelfreien Polymeren auf die erste, mit dem Haftvermittler versehene Schicht und anschließende Verfilmung und/oder thermische oder photochemische Härtung hergestellt werden. Insbesondere liegt das Polymer dazu in Form einer wässrigen Dispersion oder Lösung vor, besonders bevorzugt handelt es sich um eine wässrige Dispersion eines Emulsionspolymerisats, vorzugsweise eines oben aufgeführten radikalischen Polymeren. Nach dem Auftragen des Polymeren erfolgt dann gegebenenfalls eine Trocknung.

Zum beschichteten Substrat

Substrate werden zu unterschiedlichsten Zwecken beschichtet. Genannt seien insbesondere dekorative Überzüge oder Schutzüberzüge (zusammenfassend Lackierungen) oder auch Klebstoffbeschichtungen, wobei der Klebstoff als solcher auf das Substrat aufgebracht werden kann oder z. B. in Form eines selbstklebenden Artikels (Etikett oder Klebeband) aufgeklebt wird.

Das Substrat, bzw. die Substratoberfläche, kann aus einem beliebigen Material bestehen. Ebenso kann die Beschichtung bzw. die substratseitige Oberfläche der Beschichtung aus einem beliebigen Material bestehen.

Vorzugsweise besteht die Substratoberfläche oder die Beschichtung, bzw. die substratseitige Oberfläche der Beschichtung aus natürlichen oder synthetischen Polymeren.

Als Polymere kommen insbesondere Polykondensate, wie Polyester, Polyaddukte wie Polyurethane, Polyamide, Polycarbonate oder Polyphenylenether oder Polyphenylensulfide oder Polymere, welche durch radikalische oder ionische Polymerisation von ethylenisch ungesättigten Verbindungen erhältlich sind (kurz radikalische Polymere genannt).

Zum Aufbau der radikalischen Polymeren und ihren Gehalt an Hauptmonomeren gilt das oben gesagte.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide eignen sich insbesondere auch als Haftvermittler für unpolare Polymere; daher besteht vorzugsweise zumindest die Substratoberfläche oder die substratseitige Oberfläche der Beschichtung aus einem unpolaren Polymer.

Für den Kontaktwinkel als Maß für die Polarität gilt ebenfalls das oben gesagte.

Besonders bevorzugt bestehen sowohl die Substratoberfläche als auch die substratseitige Oberfläche der Beschichtung aus einem derartigen unpolaren Polymeren.

Die für die Haftvermittling benötigte Menge des Polypeptids entspricht der oben angegebenen Menge.

Das Polypeptid kann auf die Substratoberfläche, auf die substratseitige Oberfläche der Beschichtung oder auf beide aufgetragen werden. Aufbringen auf die substratseitige Oberfläche der Beschichtung ist dann möglich, wenn die Beschichtung vorgebildet ist, d. h. wenn eine einfache Folie oder einen mehrschichtigen Verbund (s.o.) auf das Substrat aufgebracht werden soll.

Das Polypeptid liegt vorzugsweise als wässrige Lösung vor; der Gehalt der Lösung ist wie oben angegeben.

Die Beschichtung kann nach üblichen Methoden auf das Substrat aufgebracht werden, Folien oder mehrschichtige Verbunde können z. B. aufkaschiert werden.

Insbesondere kann die Beschichtung durch Aufbringen einer Polymerdispersion, Polymerlösung oder eines lösemittelfreien Polymeren auf die mit dem Haftvermittler versehene subtratseitige Oberfläche und anschließende Verfilmung und/oder thermische oder photochemische Härtung hergestellt werden. Insbesondere liegt das Polymer dazu in Form einer wässrigen Dispersion oder Lösung vor, besonders bevorzugt handelt es sich um eine wässrige Dispersion eines Emulsionspolymerisats, vorzugsweise eines oben aufgeführten radikalischen Polymeren. Nach dem Auftragen des Polymeren erfolgt dann gegebenenfalls eine Trocknung

Die erfindungsgemäßen mehschichtigen Verbunde und beschichteten Substrate haben eine deutlich erhöhte Festigkeit. Die Beschichtung haftet durch die Verwendung der Polypeptide als haftvermitteler stärker auf dem Substrat und die einzelnen Schichten des mehrschichtigen Verbunds haften besser aneinander.

Experimenteller Teil
Herstellungsbeispiele
Beispiel 1
Vorarbeiten für die Klonierung von yaad-His₆/yaaE-His₆
Mit Hilfe der Oligonukleotide Hal570 und Hal571 (Hal 572/Hal 573) wurde eine Polymerase Kettenreaktion durchgeführt. Als Template DNA wurde genomische DNA des Bakteriums Bacillus subtilis verwendet. Das erhaltene PCR Fragment enthielt die codierende Sequenz des Gens yaaD/yaaE aus Bacillus subtilis, und an den Enden je eine NcoI bzw. BgIII Restriktionsschnittstelle. Das PCR Fragment wurde gereinigt und mit den Restriktionsendonukleasen NcoI und BgIII geschnitten. Dieses DNA Fragment wurde als Insert verwendet, und in den zuvor mit den Restriktionsendonukleasen NcoI und BgIII linearisierten Vektor pQE60 der Firma Qiagen kloniert. Die so enstandenen Vektoren pQE60YAAD#2/pQE60YaaE#5 können zur Expression von Proteinen bestehend aus, YAAD::HIS₆ bzw. YAAE::HIS₆ verwendet werden.
Hal570: gcgcgcccatggctcaaacaggtactga
Hal571: gcagatctccagccgcgttcttgcatac
Hal572: ggccatgggattaacaataggtgtactagg
Hal573: gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc
Beispiel 2
Klonierung von yaad-Hydrophobin DewA-His₆
Mit Hilfe der Oligonukleotide KaM 416 und KaM 417 wurde eine Polymerase Kettenreaktion durchgeführt. Als Template DNA wurde genomische DNA des Schimmelpilzes Aspergillus nidulans verwendet. Das erhaltene PCR Fragment enthielt die codierende Sequenz des Hydrophobin Gens dewA und einer N-Terminalen FaktorXa Proteinase Schnittstelle. Das PCR Fragment wurde gereinigt und mit der Restriktionsendonuklease BamHI geschnitten. Dieses DNA Fragment wurde als Insert verwendet, und in den zuvor mit der Restriktionsendonuklease BgIII linearisierten Vektor pQE60YAAD#2 kloniert.
Der so enstandene Vektor #508 kann zur Expressions eines Fusionsproteins bestehend aus, YAAD::Xa::dewA::HIS₆ verwendet werden.
KaM416: GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGC
KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC
Beispiel 3
Klonierung von yaad-Hydrophobin RodA-His₆
Die Klonierung des Plasmids #513 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM 434 und KaM 435.
KaM434: GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC
KaM435: CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG
Beispiel 4
Klonierung von yaad-Hydrophobin BASF1-His₆
Die Klonierung des Plasmids #507 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM 417 und KaM 418. Als Template DNA wurde ein künstlich synthetisierte DNA Sequenz – Hydrophobin BASF1 -eingesetzt (siehe Anhang).
KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC
KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG
Beispiel 5
Klonierung von yaad-Hydrophobin BASF2-His₆
Die Klonierung des Plasmids #506 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM 417 und KaM 418. Als Template DNA wurde ein künstlich synthetisierte DNA Sequenz – Hydrophobin BASF2 -eingesetzt (siehe Anhang).
KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC
KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG
Beispiel 6
Klonierung von yaad-Hydrophobin SC3-His₆
Die Klonierung des Plasmids #526 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM464 und KaM465. Als Template DNA wurde cDNA von Schyzophyllum commune eingesetzt (siehe Anhang).
KaM464: CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGC
KaM465: GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT
Beispiel 7
Fermentation des rekombinanten E.coli Stammes yaad-Hydrophobin DewA-His₆
Inokulation von 3ml LB Flüssigmedium mit einem yaad-Hydrophobin DewA-His₆ exprimierenden E.coli Stamm in 15ml Greiner Röhrchen. Inkubation für 8h bei 37°C auf einem Schüttler mit 200 UpM. Je 2 1l Erlenmeyer Kolben mit Schikanen und 250ml LB Medium (+ 100μg/ml Ampicillin) werden mit jeweils 1 ml der Vorkultur angeimpft und 9h bei 37°C auf einem Schüttler mit 180 UpM inkubiert. 13.5l LB-Medium (+100μg/ml Ampicillin) in einem 20l Fermenter mit 0,5l Vorkultur (OD_600nm 1:10 gegen H₂O gemessen) animpfen. Bei einer OD_60nm von ~3.5 Zugabe von 140ml 100mM IPTG. Nach 3h Fermenter auf 10°C abkühlen und Fermentationsbrühe abzentrifugieren. Zellpellet zur weiteren Aufreinigung verwenden.
Beispiel 8
Reinigung des rekombinanten Hydrohobin-Fusionsproteins (Reinigung von Hydrophobin-Fusionsproteinen, die ein C-terminales His6-tag besitzen)
100 g Zellpellet (100–500 mg Hydrophobin) werden mit 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5 auf 200 ml Gesamtvolumen aufgefüllt und resuspendiert. Die Suspension wird mit einem Ultraturrax Typ T25 (Janke und Kunkel; IKA-Labortechnik) für 10 Minuten behandelt und anschliessend für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 500 Einheiten Benzonase (Merck, Darmstadt; Best.-Nr. 1.01697.0001) zum Abbau der Nukleinsäuren inkubiert. Vor dem Zellaufschluss wird mit einer Glaskartusche (P1) filtriert. Zum Zellaufschluß und für das Scheren der restlichen genomischen DNA werden zwei Nomogenisatorläufe bei 1.500 bar durchgeführt (Microfluidizer M-110EH; Microfluidics Corp.). Das Homogenisat wird zentrifugiert (Sorvall RC-5B, GSA-Rotor, 250 ml Zentrifugenbecher, 60 Minuten, 4°C, 12.000 Upm, 23.000 g), der Überstand auf Eis gestellt und das Pellet in 100 ml Natriumphosphatpuffer, pH 7,5 resuspendiert. Zentrifugation und Resuspendieren werden dreimal wiederholt, wobei der Natriumphosphatpuffer bei der dritten Wiederholung 1 % SDS enthält. Nach der Resuspension wird für eine Stunde gerührt und eine abschliessende Zentrifugation durchgeführt (Sorvall RC-5B, GSA-Rotor, 250 ml Zentrifugenbecher, 60 Minuten, 4°C, 12.000 Upm, 23.000 g). Gemäß SDS-PAGE Analyse ist das Hydrophobin nach der abschliessenden Zentrifugation im Überstand enthalten (1). Die Versuche zeigen, dass das Hydrophobin wahrscheinlich in Form von Einschlusskörpern in den entsprechenden E.coli Zellen enthalten ist. 50 ml des Hydrophobin-enthaltenden Überstandes werden auf eine 50 ml Nickel-Sepharose High Performance 17-5268-02 Säule aufgetragen (Amersham), die mit 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer äquilibriert wurde. Die Säule wird mit 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer gewaschen und das Hydrophobin anschliessend mit 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer, der 200 mM Imidazol enthält, eluiert. Zur Entfernung des Imidazols wird die Lösung gegen 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer dialysiert.
1 zeigt die Reinigung des hergestellten Hydrophobins:
Spur 1: Auftrag Nickel-Sepharose Säule (1:10 Verdünnung)
Spur 2: Durchlauf = Eluat Waschschritt
Spuren 3–5: OD 280 Maxima der Elutionsfraktionen
Das Hydrophobin der 1 besitzt ein Molekulargewicht von ca. 53 kD. Die kleineren Banden repräsentieren zum Teil Abbauprodukte des Hydrophobins.
Beispiel 9
Anwendungstechnische Prüfung; Charakterisierung des Hydrophobins durch Kontaktwinkeländerung eines Wassertropfens auf Glas
Substrat:

Glas (Fensterglas, Süddeutsche Glas, Mannheim):
Konzentration Hydrophobin: 100 μg/mL
Inkubation von Glasplättchen über Nacht (Temperatur 80°C) in 50mM Na-Acetat pH 4 + 0,1 % Tween 20
danach Beschichtung waschen in destilliertem Wasser
danach Inkubation 10min/80°C/1% SDS-Lösung in dest. Wasser
Waschen in dest. Wasser

Die Proben werden an der Luft getrocknet und der Kontaktwinkel (in Grad) eines Tropfens von 5 μl Wasser bestimmt.
Die Kontaktwinkelmessung wurde auf einem Gerät Dataphysics Contact Angle System OCA 15+, Software SCA 20.2.0. (November 2002) bestimmt. Die Messung erfolgte gemäss den Herstellerangaben.
Unbehandeltes Glas ergab einen Kontaktwinkel von 30 ± 5°; eine Beschichtung mit dem funktionellen Hydrophobin gemäss Beispiel 8 (yaad-dewA-his₆) ergab Kontaktwinkel von 75 ± 5°.
Verwendungsbeispiele
Verwendete Materialien:
Verwendete Lösung:
Für die anwendungstechnischen Versuche wurde eine Lösung des gemäß Beispiel 8 hergestellten Fusionsproteines yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 19) in Wasser eingesetzt. Konzentration des Hydrophobins in Lösung: 100 μg/ml (0,01 Gew.-%).
Substrat: Formkörper (Plättchen) aus Polyethylen
Beschichtung:
Eine Polyesterfolie wurde mit Acronal A 240, eine handelsübliche, wässsrige Polyacrylatdispersion der BASF für Haftklebstoffe, beschichtet und getrocknet und in 2,5 cm breite Streifen geschnitten. Die erhaltenen Klebstreifen wurden zur Beschichtung der PE Plättchen verwendet.
Durchführung:
Die Polypeptid-Lösung wurde auf Polyethylen-Plättchen aufgetragen und getrocknet (vorbehandelte Polyethylen-Plättchen).
Anschließend wurden Klebstreifen auf vorbehandelte und zum Vergleich auf nicht vorbehandelte Polyethylen-Plättchen geklebt und die zum Abziehen der Klebestreifen notwendige Kraft bestimmt (Schälfestigkeit in N)
Schälfestigkeit mit Polypeptid als Haftvermittler: 4,7 N
Schälfestigkeit ohne Polypeptid als Haftvermittler: 2,6 N

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Mehrschichtiger Verbund oder beschichtetes Substrat, enthaltend Verbindungen, welche zu mindestens 40 Gew.-% aus über Peptidbindungen verknüpften alpha-Aminosäuren aufgebaut sind (im nachfolgenden kurz Polypeptid genannt), als Haftungsvermittler zwischen mindestens zwei benachbarten Schichten des Verbunds oder zwischen der Beschichtung und dem Substrat.
Mehrschichtiger Verbund oder beschichtetes Substrat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Polypeptide zu mindestens 80 Gew.-% aus alpha-Aminosäuren bestehen.
Mehrschichtiger Verbund oder beschichtetes Substrat gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Polypeptide Cystein als Bestandteil enthalten.
Mehrschichtiger Verbund oder beschichtetes Substrat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 dadurch gekennzeichnet, dass die Polypeptide zu mindestens 0,5 Gew.-% aus Cystein bestehen.
Mehrschichtiger Verbund oder beschichtetes Substrat gemäß Anspruch 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Polypeptiden um Hydrophobine der Formel X_n-C1-X1-50-C2-X0-5-C3-X1-100-C4-X1-100-C5-X1-50-C6-X0-5-C7-X1-50-C8-Xm (I)handelt, wobei X für jede der 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, Ile Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly) stehen kann. Hierbei stellen die bei X stehenden Indizes jeweils die Anzahl der Aminosäuren dar, C steht für Cystein, und die Indizes n und m stehen unabhängig voneinander für natürliche Zahlen zwischen 0 und 500, bevorzugt zwischen 15 und 300.
Mehrschichtiger Verbund gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest eine der benachbarten Schichten aus einem natürlichen oder synthetischen Polymeren besteht.
Mehrschichtiger Verbund gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest eine der benachbarten Schichten aus einem (unpola ren) synthetischen Polymeren mit einer Oberflächenspannung kleiner 50 mN/m besteht.
Mehrschichtiger Verbund gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass beide benachbarten Schichten aus einem natürlichen oder synthetischen Polymeren bestehen.
Verfahren zur Herstellung des mehrschichtigen Verbunds dadurch gekennzeichnet, dass – das Polypeptid auf eine der benachbarten Schichten aufgebracht wird – ggb. eine Trocknung erfolgt, wenn das Polypeptid in Form einer wässrigen Lösung aufgebracht wurde und – anschließend die andere benachbarte Schicht aufkaschiert wird oder durch Verfilmung eines natürlichen oder synthetischen Polymeren hergestellt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das natürliche oder synthetische Polymer der anderen Schicht in Form einer wässrigen Lösung oder Dispersion vorliegt und nach der Verfilmung eine Trocknung erfolgt.
Beschichtetes Substrat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Substratoberfläche oder substratseitige Oberfläche der Beschichtung aus einem natürlichen oder synthetischen Polymeren besteht.
Beschichtetes Substrat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Substratoberfläche oder die substratseitige Oberfläche der Beschichtung aus einem (unpolaren) synthetischen Polymeren mit einer Oberflächenspannung kleiner 50 mN/m besteht.
Beschichtetes Substrat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Substratoberfläche und die substratseitige Oberfläche der Beschichtung aus einem natürlichen oder synthetischen Polymeren bestehen.
Verfahren zur Herstellung des beschichteten Substrats gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 11 bis 13 dadurch gekennzeichnet, dass – das Polypeptid auf die Substratoberfläche oder die substratseitige Oberfläche des Beschichtungsmittels aufgebracht wird, – ggb. eine Trocknung erfolgt, wenn das Polypeptid in Form einer wässrigen Lösung aufgebracht wurde und – anschließend das Beschichtungsmittel auf das Substrat aufgebracht wird.
Verfahren zur Herstellung des beschichteten Substrats gemäß Anspruch 14 dadurch gekennzeichnet, dass – das Polypeptid auf die Substratoberfläche aufgebracht wird – ggb. eine Trocknung erfolgt, wenn das Polypeptid in Form einer wässrigen Lösung aufgebracht wurde und – anschließend die Beschichtung durch Verfilmung eines natürlichen oder synthetischen Polymeren auf der Substratoberfläche hergestellt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das natürliche oder synthetische Polymer in Form einer wässrigen Lösung oder Dispersion vorliegt und nach der Verfilmung eine Trocknung erfolgt.
Verfahren gemäß Anspruch 10 oder 16 dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der wässrigen Lösung oder Dispersion um eine wässrige Dispersion eines Emulsionspolymerisats handelt.
Verwendung von Verbindungen, welche zu mindestens 40 Gew.-% aus über Peptidbindungen verknüpften alpha-Aminosäuren aufgebaut sind (kurz Polypeptid genannt), als Haftungsvermittler zwischen mindestens zwei benachbarten Schichten eines mehrschichtigen Verbunds oder zwischen Beschichtung und Substrat eines beschichteten Substrats.