KR0145948B1

KR0145948B1 - 효모로부터 재조합 인간 안티트립신-α-1 단백질을 발현 분비시키기 위한 벡터

Info

Publication number: KR0145948B1
Application number: KR1019950003140A
Authority: KR
Inventors: 정봉현; 남수완; 박영훈; 유명희; 강현아
Original assignee: 김은영; 한국과학기술연구원
Priority date: 1995-02-18
Filing date: 1995-02-18
Publication date: 1998-08-01
Also published as: KR960031601A

Abstract

본 발명은 효모세포에서 발현된 인간 안티트립신-α-1 단백질을 세포의 배지로 효율적으로 분비시키는 발현 분비 벡터에 관한 것으로, 이누리나제 분비 시그날 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 연결된 인간 안티트립신-α-1 구조 유전자를 포함하는 인간 안티트립신-α-1의 발현 분비 벡터, 상기 발현 분비 벡터로 형질 전환된 재조합 효모 세포; 및 상기 재조합 효모 세포를 배양하여 인간 안티트립신-α-1 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

Description

효모로부터 재조합 인간 안티트립신-α-1 단백질을 발현 분비시키기 위한 벡터

제1도는 본 발명에 따른 발현 분비 벡터 pYInu-AT의 제작과정을 나타낸 것이고,

제2도는 발현 분비 벡터 pYInu-AT중의 이누리나제 분비 시그날 서열의 올리고뉴클레오티드의 구성도(a), 및 이누리나제 시그날서열과 안티트립신-α-1의 연결부분의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열(b)을 나타낸 것이고,

제3도는 발현 분비 벡터 pYInu-AT를 함유하는 재조합 효모의 유가배양 상등액을 웨스턴 블롯팅(Western blottin)한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 효모로부터 인간 안티트립신-α-1(antitrypsin-α-1) 단백질을 효율적으로 발현 분비시키는 분비 벡터, 및 상기 벡터를 함유한 재조합 효모의 배양을 통한 인간 안티트립신-α-1 단백질의 생산 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은 효모에서 발현된 인간 안티트립신-α-1 단백질을 균체외로 효율적으로 분비시키는, 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyvermyces marxianus)로 부터 유래된 이누리나제(inulinase) 분비 시그날 서열을 포함하는 인간 안티트립신-α-1 발현 분비 벡터, 상기 발현 분비 벡터로 형질전환된 재조합 효모세포, 및 상기 재조합 효모를 배양하여 인간 안티트립신-α-1 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

다양한 단백질, 특히 의약품으로 사용되는 단백질은 안정성이 널리 인식되어 있는 사카로마이세스속(Saccharomyces)을 포함한 효모에서 생산되어 왔고(Marten Seo, Chap. 7, Expression Systems and Processes for rDNA Prdducts, ed. by Hatch et al., ACS Symp. Ser., 477(1991), 목적 단백질을 발현 및 분비시키기 위하여, 전사 촉진 서열(프로모터, promoter)-분비 시그날 펩티드를 코딩하는 DNA-목적 단백질의 구조 유전자-전사 종결자(transcription terminator)로 구성된 발현 분비 플라스미드 벡터를 사용하해왔다.

이러한 플라스미드에 사용하기 위한 프로모터로서는 PGK(Loison 등, 대한민국 특허공개 제88-7727호 및 제88-700234호; Bio/Technol., 6, 72(1988)), GAPDH, 교배인자-α(mating factor-α, MF α-1), PHO5(Meyhack 등, 대한민국 특허공개 제86-381호 및 제87-6185호; Genetics and Molecular Biology of Industrial Microorganisms, ed. by Hershberger 등, pp. 311-321(1989), 미합중국 미생물학회간), 및 포도당이 고갈된 배지에 갈락토스를 첨가함으로써 유도되는 GAL1 드으이 GAL 시리즈 프로모터(Johnston, Microbiol, Rev., 51, 458-476(1987))가 사용되고 있다.

그러나, PGK, GAPDH, 또는 MFα-1 프로모터의 조절 하에서는 유전자가 구성적으로 또는 균체 증식기 말기에 발현되고 소량의 단백질만이 생산되며, 나아가 이러한 프로모터를 포함하는 플라스미드의 안정성이 배양 도중 저하되기 쉽다. 또한 PHO5 프로모터는 배지 내의 인산염 농도가 낮을 때 유전자의 발현을 유도하는데, 재조합 효모의 발효 도중 배지 내의 인산염 농도를 낮추는 것이 매우 복잡하고 번거롭다. 이러한 이유 때문에, GAL 시리즈 프로모터가 이종 유전자 발현조절용으로 발람직하게 사용되고 있다.

효모로부터 목적 단백질을 분비시키기 위해 현재 사용되고 있는 분비 시그날 서열로는 인버타제 시그날 서열(미합중국 특허 제5,010,003호), 산 포스타파제 시그날 서열(미합중국 특허 제5,013,652호), 교배인자-α의 프리포로 리더(prepro leader) 서열(이하 ppL로 약칭 함; 미합중국 특허 제 4,588,684호), 킬러(killer) 독소의 리더 서열(Baldari emd, EMBO J., 6, 229-234(1987))등이 있는데, 이중 ppL이 가장 보편적으로 사용되고 있다.

제보(Zsebo)등은 ppL을 이용하여 효모에서 이종 단백질을 분비시킬 때 31개의 아미노산으로 이루어진 β-엔돌핀 또는 32개의 아미노산으로 이루어진 칼시토닌은 완전히 균체 외로 분비되었으나, 166개의 아미노산으로 이루어진 α-인터페론은 95%가 세포 내에 잔류한다는 것을 보고한 바 있다(J. Biol. Chem., 261, 5858-5865(1986)). 이는 ppL이 비교적 분자량이 큰 단백질의 분비를 위한 분비 시그날 서열로서는 적합하지 않다는 것을 나타낸다.

한편, 랄루(Laloux)등은 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus)가 생산하는 이누리나제의 40%가 균체외 배지로 분비되고, 재조합 사카로마이세스에서는 발현된 이누리나제의 70%가 분비되었음을 보고하였다(FEBS Lett,. 289, 64-68(1991)). 후자의 결과는 고증환의 박사학위 논문(Studies on the Extracellular Secretion of Proteins in Yeast, 농예화학과, 동경대학(1990))에서도 관찰되었다.

한편, 인간 안티트립신-α-1 단백질은 포유동물의 간 세포에서 생산되어 혈장으로 분비되는 혈청 단백질의 일종이다. 안티트립신-α-1은 트롬빈(thrombin), 플라스민(plasmin) 및 트립신(trypsin)등의 단백질 분해효소의 저해제이고, 주된 기능은 폐에 존재하는 엘라스타제(elastase)의 활성을 저해 조절하는 것이다(Carrell 등, Nature, 298, 329-334(1982)) 정상적인 혈장내 안티트립신-α-1 농도는 약 2㎎/㎖ 정도이며, 이보다 낮은 농도로 존재시 만성폐기종이나 소아 간경변증과 같은 병을 일으키는 것으로 알려져있다. 또한, 포유류에서 안티트립신-α-1 단백질은 46, 86, 및 247번째의 아스파리긴(asparagine) 잔기에 당쇄부가(glycosylation)가 일어난 당단백질 형태로 생산된다(Carrell 등, FEBS Lett., 135. 301-303(1981)). 대장균이나 사카로마이세스 세레비지에 세포질에서 분리정제한 당쇄 결핍 안티트립신-α-1이 여러가지 시험관내 검사에서 완전한 활성을 보유하는 것으로 보아 이러한 당쇄가 생물학적 활성에 필수적인 것은 아닌 것으로 보인다(Courtney 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 81, 669-673 (1984); Cabezon 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 81, 6594-6598(1984)). 그러나, 당쇄 결핍된 안티트립신-α-1은 생체내 혈청내에서의 수명 및 시험관내 열 안정성이 당단백질 형태의 안티트립신-α-1보다 크게 감소한다(Travis 등, J. Biol. Chem., 260, 4384-4389(1995)). 이러한 안티트립신-α-1을 정맥주사하면 폐기종 치료에 효과적임이 밝혀져(Gadek and Crystal, Am. Rev. Resp. Dis. 127, Suppl. 2, 45-46(1983)), 안티트립신-α-1 결핍증 연구 및 치료에 대량의 안티트립신-α-1 단백질이 필요하게 되었다.

따라서, 유전공학 기술을 이용한 재조합 미생물의 배양을 통해 안티트립신-α-1 대량 생산 기술의 개발이 요구되며, 인간에 최소한의 면역성을 나타내면서 적당한 당쇄부가가 일어나는 효모 분비계를 개발하면 유용한 형태의 안티트립신-α-1을 생산할 수 있을 것이다.

포유 동물로부터 유래하는 분비 단백질을 효모에서 분비 생산할 경우, 자제 분비 펩티드는 효모에서의 기능이 비효율적이다(Smith 등, Science. 229, 1219-1224(1985)). 따라서, 효모에서 안티트립신-α-1을 분비 생산하는 경우 효모의 균체의 단백질 분비 펩티드를 사용하는 것이 발람직하디.

본 발명자들은 안티트립신-α-1 단백질과 같이 분자량이 비교적 큰 목적 단백질들을 재조합 효모 세포 외로 효율적으로 분비시키는 데는 클루이베로마이세스 마르시아누스로부터 유래된 이누리나제의 분비 시그날 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 효과적임을 발견한바 있다(대한민국 특허 출원 제93-27269호)

따라서, 본 발명의 목적은 상기 이누리나제 분비 시그날 서열 및 인간 안티트립신-α-1 구조 유전자를 이용한 인간 안티트립신-α-1 발현 분비 벡터를 제공하는 것이다. 상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 이누리나제 분비 시그날 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결된 인간 안티트립신-α-1 구조 유전자를 포함하는 인간 안티트립신-α-1 발현 분비 벡터를 제공한다.

본 발명의 다른 목적은 인간 안티트립신-α-1 단백질을 세포외로 완전히 분비할 수 있는, 상기 재조합 발현 분비 벡터로 형질전환된 재조합 효모 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 효모 세포를 배양 배지 상에서 배양한후 상기 배양 배지인간 안티트립신-α-1 단백질을 회수함을 포함하는, 효모 세포로 부터 인간 안티트립신-α-1 단백질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

1. 분비 시그날 서열

본 발명의 발현 분비 벡터 제조에 사용되는 분비 시그날은, 클루이베로마이세스 마르시아누스(Rouwenhorst 등, Appl. Environ. Microbiol., 56, 3337-3345(1990)) 및 재조합 사카로 마이세스 세레비지애(랄루 등, 상기 문헌 참조)의 세포 외로 분비되는 모든 성숙한 이누리나제가 그들의 아미노 말단이 24번째 아미로산인 아스파르트산(aspartic acid)으로 부터 시작한다는 공통점을 갖고 ; 이누리나제 유전자가 코드하는 미성숙 단백질의 22번째와 23번째 아미노산이 각각 라이신, 아르기닌이고; 라이신-아르기닌의 서열은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 내부 단백질분해효소(endoprotease) yscF(KEX2 유전자의 발현물)의 인식부위이며(Julius 등, Cell, 37, 1075-1089(1984); 이누리나제 유전자가 코드하는 단백질의 첫번째 아미노산이 메티오닌으로부터 23번째 아미노산인 아르기닌으로 이루어진 폴리펩티드가 분비 시그날 서열로 추정된다는 사실을 기초로 하여 제조되었다(대한민국 특허 출원 제93-27269호로 출원됨)

이누리나제 유전자에 의해 코드화된 단백질의 1번 내지 23번 아미노산으로 이루어진 분비 시그날 펩티드의 아미노산 서열은 다음과 같다.

한편, 상기 아미노산 서열에서 임의의 아미노산 치환, 첨가 또는 삭제가 일어날 수 있으며, 유전자 암호(genetic codes)의 축퇴(degeneracy) 및 효모에서의 코돈 사용빈도(codon usage)로 인해 동일한 아미노산 서열을 코드할 수 있는 다수의 가능한 뉴클레오티드 서열이 존재할 수 있다. 이렇게 변형된 아미노산 서열이 인간 안티트립신-α-1의 분비를 위한 위래의 서열과 기능적으로 동등한 한, 그러한 벽화 역시 본 발명의 범위에 포함된다.

상기 이누리나제 분비 시그날 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 이누리나제 유전자로부터 분리함으로써 얻을 수 있을 뿐만 아니라 화학적 합성할 수도 있다.

2. 인간 안티트립신-α-1의 발현 분비 벡터 및 그 형질전환체

상기 이누리나제 분비 시그날 서열은 인간 안티트립신-α-1 단백질을 세포외로 효율적으로 분비시키기 위해 다양한 벡터 시스템, 예를 들어, YEp352(Hill 등, Yeast, 2 163(1986)), pYES 2.0(Invitrogen사, 미국)등과 같은 효모 벡터에 널리 사용할 수 있다. 인간 안티트립신-α-1 단백질을 코딩하는 구조 유전자를 이누리나제 분비 시그날 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 하류에 연결하여 번역 리당 프레임을 형성함으로써 인간 안티트립신-α-1 분비 생산용 재조합 발현 분비 벡터를 제조할 수 있다.

본 발명에 따라 제조한 재조합 발현 분비 벡터로는 인간 안티트립신-α-1구조 유전자와 이누리나제 분비 시그날 서열을 플라스미드 내에 연결하여 제조한 플라스미드 pYInu-AT이 포함된다. 사용된 프로모터 및 전사 종결자등에 따라 다양한 재조합 발현 분비 벡터가 존재할 수 있으며 그러한 재조합 발현 분비 벡터 역시 본 발명의 범위에 포함된다.

상기 재조합 발현 분비 벡터를 이용하여 통상의 방법, 예를 들어, 문헌(Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics, ed, F. Sherman, G.R. Fink, and J.B. Hicks, Cold Spring Harbor Laboratory (1986))에 기술된 방법에 따라 효모 세포를 형질전환시킬 수 있다. 숙주 세포로서는 사카로마이세스속(Saccharomyces), 시조사카로마이세스속(Schizosaccharomyces), 클루이베로마이세스속(Kouyveromyces), 한세놀라속(Hansenula), 야로위아속(Yarrowia) 및 피치아속(Pichia) 등에 속하는 다양한 효모 세포들, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애를 사용할 수 있다. 효모에서는 유전자 복제 시스템으로는 목적 유전자를 효모 염색체내로 삽입시키는 삽입 벡터(integrating vectors), 염색체외의 동원체(centromere), 또는 2㎛ 플라스미드 복제원을 이용하는 에피소말 벡터(episomal vectors)등 (Parent 등, Yeast, l, 83-138(1985))을 사용할 수 있다.

형질전환된 효모 세포를, 숙주 세포 및 사용된 발현 시스템에 따라 선택된, 목적 단백질의 생산에 적절한 배지 상에서 적절한 조건하에 배양하고 배양 배지로 분비된 단백질을 정제함으로써 목적 단백질을 얻을 수 있다.

하기 실시예들은 본 발명을 보다 상세히 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들로 제한되지 않으며, 실시예에 사용된 실험방법들은 달리 언급되지 않는 한, 기존의 문헌((Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics, ed, F. Sherman, G.R. Fink, and J.B. Hicks, Cold Spring Harbor Laboratory (1986); Sambrook, 등, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)들을 참고로 하여 수행할 수 있다. 또한, 고체 혼합물 중 고체, 액체 중 액체 및 액체 중 고체에 대해 주어진 퍼센트는 달리 기재되지 않는 한 각각 중량/중량, 부피/부피 및 중량/부피 기준이다.

[실시예 1]

발현 분비 벡터의 제조

(단계1)

인간 안티트립신-α-1 구조 유전자의 증폭 및 BglⅡ와 SalⅠ 제한요소 인식 부위의 도입을 위하여, 하기 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머(1) 및 (2)를 DNA 합성기(Applied Biosystems사(미국) 제품, Model 391)를 사용하여 합성하였다.

프라이머(1) 및 (2) 각각 1㎕(100pmoles), 주형 DNA로서 플라스미드 pE(BGL)AT(이 등, Mol. Cells, 3, 71-74(1993)) 2ng, 10배 농축 종합효소 완충액(베링거 만하임사 제품) 10㎕ 및 10배 농축 dNTP 혼합액(dGTP, dATP, dTTP 및 dCTP각 각각 2mM, 베링거 만하임사 제품) 10㎕의 혼합물에 멸균 증류수 72㎕를 가하여 총 부피를 100㎕로 만들고, 반응 혼합물의 증발을 방지하기 위해 미네럴 오일(시그마사(미국) 제품) 100㎕를 가하였다. 반응 혼합물을 95℃에서 5분간 가열한 후 72℃로 냉각시켰다. 1㎕(5단위)의 Taq DNA중합효소(베링거 만하임사 제품)를 혼합물에 첨가하고, EZ 순환기(Ericomp Inc., 미국)를 사용하여 95℃, 1분 : 55℃, 2분 : 72℃, 3분으로 구성된 종합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR) 사이클을 25회 반복함으로써 PCR을 수행하였다. 상기 PCR로 얻은 0.1㎕의 DNA 단편(약 1,220 염기쌍)을 BglⅡ 및 SalⅠ으로 절단하여 인간 안티트립신-α-1 유전자를 포함하는 약 1,200염기쌍의 DNA 단편을 분리하였다(단편1).

(단계 2)

이누리나제 유전자(이하, INUIA)의 분비 시그날 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티를 하기 서열을 갖는 6개의 올리고뉴클레이티드 (Ⅰ), (Ⅱ), (Ⅲ), (Ⅳ), (Ⅴ), 및 (Ⅵ)로 나누어 DNA 합성기(Applied Biosystems 사(미국) 제품, Model 391)로 합성하였다.

상기 올리고뉴클레이티드(I), (II), (III), (IV), (V), 및 (VI) 각각 1㎕(100 pmoles)를 혼합하여 폴리뉴클레오티 인산화 효소(T4 polynucleotide kinase, 베링거 만하임사)로 인산화시키고, 회합 반응(annealing)으로 이중쇄를 형성시켰다. 리가제(T4 DNA ligase, 베링거 만하임사)로 각각의 이중쇄 올리고뉴클레이티드를 연결시킨 후, 아가로스 겔 전기 영동하여 겔로부터 INUIA의 분비 시그날을 코딩하는 약 75염기쌍의 단편 2를 분리하였다. 단편 2의 5' 말단에는 EcoRI 및 BamHI 부위가, 3' 말단에는 BglⅡ 부위가 도입되었다.

(단계3)

상기 단계 1과 2에서 제조한 DNA 단편 1과 2를 EcoRI과 SalI으로 절단한 플라스미드 p블루스크립트 KS(pBluescript KS, Stratagene사 제품, 미국)와 연결하여 플라스미드 pBlue-InuAT(1)을 제작하였다. PCR로 얻은 인간 안티트립신-α-1 구조 유전자의 염기쌍오류를 제거하기 위하여, 플라스미드 pBlue-InuAT(1)를 BclI과 SalI으로 절단하여 얻은 단편을 pUC-AT(R) 플라스미드(이 등, Korean, J. Biochem., 22, 148-153 (1989))의 BclI/SalI 단편과 치환하였다(pBlue-InuAT(Ⅱ)).

(단계 4)

플라스미드 pBlue-InuAt(Ⅱ)를 EcoRI(부분 절단) 및 SalI으로 절단하여 1,300 염기쌍의 DNA 단편 3을 얻었다. 플라스미드 YEGα-HIR525(KCTC 851BP)를 EcoRI 및 SalI으로 절단하여 약 6,000 염기쌍의 DNA 단편을 분리한 후 단편 3과 연결하여 pYInu-AT 플라스미드를 제작하였다.

제1도에는 상기 pYInu-AT의 제작 과정을 도시하였다. pYInu-AT는 차례대로 GAL10 프로모터, 23개의 아미노산으로 구성된 이누리나제 시그날 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티, TCT 코돈으로 시작되는 인간 안티트립신-α-1 구조 유전자 및 GAL7 전사 종결자로 이루어져 있다.

이상에서 제작된 플라스미드들의 이누리나제 분비 시그날의 염기서열과 인간 안티트립신-α-1 구조 유전자의 염기서열은 생거(Sanger)등의 디데옥시(dideoxy) 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 5463-5476(1977)으로 확인하였다. 제2도에는 이누리나제 분비 시그날 서열의 뉴클레이티드 구성도(A)와 이누리나제 시그날과 인간 안티트립신-α-1 유전자의 연결 부분에 대한 뉴클레이티드 및 아미노산 서열(B)을 나타내었다.

[실시예 2]

형질전환된 재조합 효모의 제조

이토 등의 염화 리튬 방법(Ito 등, J. Bacteriol., 153, 163-168(1983))에 따라 실시예 1에서 제작한 플라스미드 pYInu-AT로 사카로마이세스 세레비지애 2805(MATα pep4:HIS3 prbl canl his3-200 ura3-52; Sohn 등, J. Microbiol. Biotechnol. 1, 266-273(1991))를 형질전환시켰다.

YPD 배지(1% 효모 추출물, 2%, 박토-펩톤, 2% 포도당) 10㎖에 사카로마이세스 세레비지애 2805를 접종하고 30℃에서 하룻밤 동안 진탕배양하였다. 배양액 100㎕를 다시 YPD배지 10㎖에 접종하여 600nm에서 배양액의 광학 밀도가 1.0될 때까지 30℃에서 진탕배양하였다.

10㎖의 배양액을 2,000rpm으로 5분간 원심분리하여 배지를 제거하고 세포 침전물을 얻은 후, 이를 TE완충액(10mM Tris-Cl pH8.0, 1mM EDTA) 5㎖로 세척하였다. 세포 침전물 을 0.5㎖의 TE 완충액과 0.5㎖의 0.2M 염화 리튬(시그마사 제품, 미국)에 현탁시킨 후, 30℃에서 1시간 진탕시켰다. 진탱액 100㎕를 에펜도르프 튜브에 옮기고 실시예1에서 준비한 플라스미드 pYInu-AT 용액 0.1㎍을 진탕액에 첨가하였다. 혼합물 30℃에서 30분간 진탕하고, 70% 폴리에틸글리콜 4,000용액 15㎕를 첨가하고, 생성된 용액을 30℃에서 1시간 진탕한 후, 48℃에서 10분간 열 충격을 가하였다. 생성물을 15,000rpm으로 1분간 원심분리하여 상층액을 버리고, 20㎎/ℓ의 앰피실린을 포함하는 식염수로 세포 침전물을 세척한 후 식염수 200㎕에 현탁하였다.

[실시예 3]

재조합 효모의 배양

실시예 2에서 선별한 재조합 효모, 사카로마이세스 세레비지애 2805/pYInu-AT를 사용하여 하기의 방법으로 유가배양을 수행하였다.

최소배지에서 전배양한 재조합 효모 배양액 100㎖을 1ℓ용량의 하기의 발효기본배지에 접종하고, 회분배양 5시간 이후에 하기의 농축기질액을 공급하면서 유가배양을 실시하였다. 이 때 최종 발효액 부피는 2ℓ로 하였다.

[실시예 4]

재조합 안티트립신-α-1 단백질의 발현 및 분비생산 결과

디몰더 등의 방법(Demolder 등, J. Biotechnol., 32, 179-189(1984)에 따라 실시예 3의 유가배양시 채취한 각 시료의 배양상등액 200㎕에 50㎕의 0.2%(w/v) 데옥시콜린산 나트륨(sodium deoxycholate; 시그마사 제품)을 가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 5분간 방치한 다음, 50㎕의 100%(w/v) 삼염화 초단(trichloroacetic acid; 시그마사 제품)을 첨가하였다. 생성된 용액을 0℃에서 30분간 방치하고, 15,000rpm으로 10분간 원심분리하여 단백질 침전물을 얻었다. 침전물을 100㎕의 아세톤으로 세척하고, 용해 완충액(lysis buffer; 50mM Tris-Cl pH 6.8, 100mM 디티오트레이톨(dithiothreitol), 2% SDS, 5% 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol), 0.1% 브로모페놀 블루(bromophenol blue), 10% 글리세롤) 50㎕에 용해시켜 100℃에서 5분간 가열하였다. 생성된 용액을 배양 배지 단백질 분획으로 명명하였다.

배양 배지 단백질 분획을 10㎕ 씩 5% 저장겔(stocking gel, pH 6.8, 가로 20cm, 세로 3.0cm, 두께 1mm)과 분리겔(separating gel, pH 8.8, 가로 20cm, 세로 10cm, 두께 1mm)로 이루어진 SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 100 내지 200 V, 30mA로 3시간 동안 전기영동(SDS-PAGE)하였다.

베네틀의 방ㅂ버(Burnetle, Anal. Biochem., 112, 195 (1981))에 따라, SDS-PAGE에 의해 분리된 단백질들을 쿠마시 염색하지 않은 채, 전기영동 전사장치(Hoefer사, tank transfer unit, 모델 TR-22)를 이용하여 150mA, 50V로 1시간 동안 니트로셀룰로스 막에 전사하였다. 막에 전사된 단백질들을 5,000배로 희석한 토끼의 항-안티트립신-α-1 폴리클로날 항체(시그마사 제품, 미국)와 30분간 반응시키고, 웨스턴 블록팅 AP 시스템(염소의 항 토끼 lgG{H+L 또는 Fc}-알칼리 포스페이트 결합체, 프로메가사, 미국)으로 안티트립신-α-1 단백질 밴드를 확인하였다.

그 결과는 제3도에 나타내었다. 제3도에서, 제1열은 실시예 3의 유가배양 5시간째의 배양 상등액이고,

제2열은 실시예 3의 유가배양 16시간째의 배양 상등액이고,

제3열은 실시예 3의 유가배양 19시간째의 배양 상등액이고,

제4열은 실시예 3의 유가배양 23시간째의 배양 상등액이고,

제5열은 실시예 3의 유가배양 28시간째의 배양 상등액이고,

제6열은 실시예 3의 유가배양 31시간째의 배양 상등액이고,

제7열은 실시예 3의 유가배양 37시간째의 배양 상등액이고,

제8열은 실시예 3의 유가배양 40시간째의 배양 상등액이고,

제9열은 실시예 3의 유가배양 46시간째의 배양 상등액이고,

제10열은 실0.5㎍의 정제된 안티트립신-α-1 단백질(시그마사 제품, 미국)이고,

제11열은 0.75㎍의 정제된 앝티트립신-α-1 단백질이고,

제12열은 1.0㎍의 정제된 앝티트립신-α-1 단백질이고,

상기 결과에서, 분비된 안트트립신-α-1 단백질(약 51킬로달톤)의 양은 배양 시간이 결과할수록 증가하며, 높은 분자량의 당단백질 형태로도 상당량이 배지로 발현 분비됨을 알 수 있다. 또한, 균체내 단백질을 웨스턴 블롯팅하여 발현된 안티트립신-α-1 단백질은 대부분 배지 내로 높은 효율로 분비됨을 알았다. 이 결과는 균체내에서 발현된 안티트립신-α-1 단백질이 이누리나제 분비 시그날에 의해 균체외 배지로 효율적으로 분비됨을 의미한다. 분비된 안티트립신-α-1 단백질의 양과 균체내 안티트립신-α-1 단백질양을 비교하여 분비효율은 약 80% 이상이었다.

[실시예 5]

재조합 안티트립신-α-1 단백질의 엘라스타제 활성 저해도의 측정

트래비스와 죤슨의 방법(Travis and Johnson, Meth. Enzym., 80, 754-756(1981)에 따라 상기 재조합 안티트립신-α-1 단백질의 엘라스타제(elastase) 활성 저해도를 측정하였다. 이때 N-숙시닐-(L-알라닐)3-p-니트로아닐리드(시그마사 제품, 미국)를 기질로 사용하였으며, 실시예 3의 유가배양에서 얻은 각 배양시간의 배양 상등액 시료를 사용하여 엘라스타제 활성을 50% 저해하는 상등액 부피를 조사하였다. 그결과, 배양 시간이 경과할수록 엘라스타제 활성을 50% 저해하는 상등액 부피는 급격히 감소하였는데(표 1), 이는 배양액 부피당 발현분비되는 안티트립신-α-1 양이 크게 증가함을 의미한다.

엘라스타제 활성을 50% 저해하는 천연 인간 안티트립신-α-1 단백질의 양을 기준으로 하여 계산하면 49 시간째의 배양 배지로 분비 생산된 최종 안티트립신-α-1 양은 약 75mg/ℓ였다. 따라서, 재조합 효모 사카로마이세스 세레비지애 2805/pYInu-AT로 부터 균체외로 분비된 안티트립신-α-1 단백질이 생물학적 활성을 갖는 형태로 생산됨을 알 수 있다.

본 발명은 상기의 특정 실시예에 의해 상세히 설명되었지만, 당 분야의 숙련자들에게 자명한, 효모에서의 인간 안티트립신-α-1 단백질 분비 생산에 사용될 분비 벡터의 다양한 변형 및 변화가 이루어질 수 있고, 이들 역시 특허청구범위에 정의된 본 발명의 범위에 포함된다.

Claims

이누리나제 분비 시그날 서열을 코딩하는 폴리뉴클레이티드와 연결된 안긴 안티트립신-α-1 구조 유전자를 포함하는 인간 안티트립신-α-1 발현 분비 벡터.
제1항에 있어서, 포르모터로서 갈락토스 유도성 GAL10 프로모터를 사용하는 벡터.
제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티가 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus)의 이누리나제 분비 시그날 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 벡터.
제1항에 있어서, 전사 종결 서열로서 GAL27 유전자 유래의 전사종결 서열을 사용하는 벡터
제1항에 있어서, 플라스미드 pYInu-AT(KCTC 0132 BP)
제1항 내지 제5항의 어느 한 항의 발현 분비 벡터로 형질전환된 재조합 효모.
제6항에 있어서, 사카로마이세스 세레비지애 2805/pYInu-AT(KCTC 0132 BP).
제6항의 재조합 효모 세포를 배양 배지 상에서 배양한 후, 상기 배양 배지로부터 인간 안티트립신-α-1 단백질을 회수함을 포함하는, 인간 안티트립신-α-1 단백질의 생산 방법.