JPH05505514A

JPH05505514A - Ｏ―グリコシル化ｉｇｆ―１

Info

Publication number: JPH05505514A
Application number: JP89508585A
Authority: JP
Inventors: スクノットナールンディン・アンナ; フライクルンド・リンダ; ゲレルフォルス・ペル
Original assignee: カビ　ファルマシア　アクティエボラーグ
Priority date: 1988-08-20
Filing date: 1989-08-17
Publication date: 1993-08-19
Anticipated expiration: 2011-10-16
Also published as: CA1335802C; DE68917061D1; EP0429502A1; EP0360411B1; NO910669D0; NO180636C; DE68917061T2; DK29491A; AU4051889A; IE65096B1; DK175360B1; EP0360411A1; FI910795A0; GB8819826D0; JP2543998B2; ES2060778T3; AU623675B2; WO1990002198A1; NZ230383A; NO910669L

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】０−グリコジル化ＩＧＦ−１インシュリン様成長因子（ＩＧＦ−１）は７０個のアミノ酸単鎖ポリペプチド鎖因子であり、プロインシュリンと比較的高い相同関係を示す。成長ホルモンの働きに間接的な影響を与え、またインシュリン様の性質を示すことが知られている。人体で自然に生成する場合にはグリコジル化していない。

ｒＣ；Ｆ−１は製薬剤として下垂体性小人症と共に糖尿病の治療に用いることが可能である。後者の治療の場合、インシュリンの代わりに或いはインシュリンに添加しても使用される。インシュリンは糖尿病に対する伝統的な治療法であるが、タイプ２の糖尿病患者はインシュリンに耐性を示し、これはインシュリンを大量に投与しても患者はまだ高血糖症に病むことを意味する。さらに、インシュリンを過剰に投与すると、腎臓病、肥満症、水調節障害等の望ましくない副作用を生ずる。

これらの問題の若干を解決するためにグリコジル化していないＩＧＦ−１をインシュリンの代わりに或いは添加剤として試用できるが、グリコジル化していないＩＧＦ−１の割合が高くなると血流中を循環する蛋白質に特異的に結合して腐骨を形成する傾向があり、ＩＣＦ−１を比較的大量に投与するには望ましい製薬上の効果が得られるように投与する必要がある。

酵母細胞内のＩＧＦ−１の発現は、通常のグリコジル化していない形態と共に、ＩＣＦ−１のＯ−グリコジル化類似体、例えばポリペプチド鎖のＴｈｒ　ｔ　＊アミノ酸上の２個のマンノース残基を運ぶ類似体を生成することになることを我々は見出した。この結合する蛋白質に対する観察された親和性は、大略の投与傾向に充分な効果を与えるであろう。他の効果は未だ述べていないが臨床効果全体においては重要である。試験によってＯ−グリコジル化ＩＧＦ−１は結合する蛋白質に対する親和性が少なく、通常のグリコジル化していない蛋白質と比較して少ない投与量のＯ−グリコジル化ＩＧＦ−１によって、血糖値の所要量の減少を達成することができることが判った。

［Ｏ−グリコジル化ＩＧＦ−Ｈの表現は、全ＩＣＦ−１ポリペプチド配列のフラグメントが質的にＩＧＦ−１の成長ホルモン媒介効果及び／又はインシュリン様性質を示すとすれば、これらのフラグメントからなる０−グリコジル化分子を含む。

従って、本発明の一つは、グリコジル化していないＩ　ＣＦ−１を本質的に含まない０−グリコジル化ＩＧＦ−１を提供する。

本発明の他の一つは、ポリペプチド鎖のＴｈｒｔ　＊アミノ酸にてグリコジル化する０−グリコジル化ｔＧＦ−１を提供する。

さらに本発明は、グリコジル化がＩＧＦ−１のポリペプチド鎖の同じトレオニン残基に結合する２個又はそれ以上のマンノース残基からなる０−グリコジル化ＩＣ；Ｆ−１を提供する。

さらに他の本発明は、２個又はそれ以上のマンノース残基がポリペプチド鎖のＴｈｒ　！　Ｉアミノ酸に結合するＩＧＦ−１の０−グリコジル化類似体を提供する。

さらにまた別の本発明は、酵母細胞内のＩＣＦ−１の発現によってＯ−グリコジル化ＩＧＦ−１を得る方法、及び媒質からＯ−グリコジル化ＩＣＦ−１を単離する方法を提供する。好ましくはｒＧＦ−１に対する遺伝子は好ましくは分泌シグナル配列に対してコードするＤＮＡ、例えばα−交配因子に対する遺伝子のそれに結合し、その結果、０−グリコジル化していた成熟標品ＩＧＦ−１か酵母細胞の細胞質から分泌される。

このα−交配因子は、α−二倍体細胞を形成する細胞の有効な接合を促進するα −交配盟の酵母細胞によって分泌される１３−アミノ酸ペプチドである。α−交配因子構造遺伝子の配列データーは、α−交配因子が８５アミノ酸リーダーペプチドと、８アミノ酸スペーサーペプチドによって各々が割り込まれた４個のコード領域とを含む１６５アミノ酸前駆体として最初に合成されることを示している。この８５アミノ酸リーダーポリペプチドは、小胞体膜に前駆体をターゲットする際に伴う１９アミノ酸シグナル配列を含むさらに０−グリコジル化ＩＧＦ−１を含むが、実質的にグリコジル化していないＴＧＦ−１を含まず、及び製薬上許容されるキャリア、希釈剤、又は賦形剤を含有する製薬組成物を提供する。

この組成物はインシュリンを含むこともできる。

さらに他の発明は、０−グリコジル化ＩＣＦ−１及びグリコジル化していないＩＣＦ−１の両方からなり、酵母細胞の培養により発現される、０−グリコジル化及びグリコジル化していないＩＧＦ−１の混合物におけるよりも、○−グリコジル化ＩＧＦ−１の割合がより高い製薬組成物を提供する。

酵母内の［ＧＦ−１の発現に使用されるプラスミドはｐ５３９／１２であることができ、その作成は次の実施例で述べる。他の酵母発現プラスミドも適当である。

実施例によってのみ、ＩＣＦ−１に対する遺伝子を運ぶプラス転換された酵母細胞からの成人０−グリコジル化ＩＧＦ−１の発現を、図面を参照しながら以下に詳細に述べる。

第１図は、ＩＧＦ−１発現プラスミドル５３９／１２の作成を示す図であり；第１ａ図はプラスミドｐ５３９／１２の制限マツプであり；第２図はα−交配因子リーダー配列とＩＧＦ−１との間の融合のポリペプチド構造を示す図であり：第３図はＨｒ−ＨＰＬＣによるＩＧＦ−２の２個の蟹の分離を示す図であり；第４図は横線によって分離されたトリプシンフラグメントをもつＩＧＦ−１の構造を示す図であり；第５図はＩＧＦ−１の両方の型を示すトリプシンマツプであり：及び第６図はＩＧＦ−１の０−グリコジル化形態におけるＴｈｒｔｅに結合した２個のマンノース残基の構造を示す図である。

実施例ＩＣＦ−１遺伝子をα−交配因子リすダーベブチドーＩＧＦ−１発現プラスミド、９５３９／１２を用いて、サブ力ロミセス・セレイヴイシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）内に発現させた。

プラスミド及び酵母変異体株ニプラスミドｐ５３９／１２はスイス国ジュネーブ、Ｃｈ−１２２７、ビオジエン・ニス・エイのジエイ・エフ・エルンスト博士によって作成された。その作成は次の通りである。プラスミドＩ）ＪＤＢ２１９／Ｇを、ＡＰＨ遺伝子Ｔｎ９０３　（エルンスト・ジエイ・エフ及びアール・ソデイ・ヴすン・ウェットスタイン、ジエイ・フライス、エム・キーランド−ブランド　アンド　エイ・ステンデルブ、ムンクスガード、コペンハーゲン、３８３−３８９．１９８１）から構築した。ＡＣＴプロモーターを包含するプラスミドｐ３４６／１からのＳＭＣ発現単位、ＭＦａｌリーダー配列及びＳＭＣ遺伝子は、１．　ｌｋｂ　Ｂｇｌ　ｌｌ− Ｂａを用いる部分消化によって線状になり、Ｙ■ｐ３０（ホトスタイン・ディら、ジーン８．１７−２４　、１９７９）から誘導された酵母ＵＲＡ３遺伝子を運ぶ１．１ｋｂ　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩフラグメントをｐ５１０／１４に挿入し、マーカーｋａｎ　”　Ｇ４１８’　Ｕｒａ３＋　ＬＥＤ”十　を運ぶｐ５３９／１２を生成する。そ体株ＹＥ　４４９（Ｍａｔ　ａｌｅｕ　２．　ｕｒａ　３−５２．　ｐｒｂｌ−１１２２，ｐｅｐ　４−３．　ａｉｒ４１′）内で行われた。

このプラスミドは、以前に報告（エルンスト・ジエイ・エフ、（１９８６）、ＤＮＡ　５．４８３−４９１）された他のＩＣＦ−１発現プラスミドを改良したものである。α−交配因子リーダーペプチド−ＩＣＦ−１バイブリド蛋白質に対する全アミノ酸配列（１５５アミノ酸）を第２図に示す。α−交配因子リーダーペプチドは最初の８５残基及びＩＧＦ−１からなり、残りは７０残基である。複数の可能な〇−結合グリコシル化部位はＥＧＦ−１配列内にある。これらは示しである。新しく合成した１５５アミノ酸長α−交配因子リーダーベブチド−ＩＧＦ −１バイブリド蛋白質は細胞から媒質内に分泌される。この過程の間にバイブリド蛋白質は、標品のＩＣＦ−１分子とその修正Ｎ−末端アミノ酸（Ｇｌｙ）を生じる内因性酵母ペプチダーゼ（ＫＥＸ２）によって開裂された。しかし、ヒトＩＣＦ−１の標品形態の他に、ヒトＩＣＦ−１の新しい類似体も合成されて分泌された。

酵素発酵媒質は約５０％の標品ヒトＩＧＦ−１と５０％の類似体を含んでいた。

これら２種類の１ＧＦ−１は従来の生化学的分離技術を用いて媒質から単離された。標品ヒトＩＧＦ−１からのＩＣＦ−１類似体の最終分離は、ＴＳＫ−フェニル−５ＰＷマトリツクスを用いる疎水的相互作用クロマトグラフィー（Ｈｌ−ＨＰＬＣ）によって行った（第３図）。このＩＧＦ−１類似体は標品！ＧＦ−１よりも速く溶出したが、より僅かに親水性であることを示している。

ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって、標品ＩＧＦ−１が類似体よりも僅かに分子量が小さいことが判った。

また類似体によって示されたこのより高い分子量（約４００）ダルトン（ｄａｌ　ｔｏｎｓ）は、この形態ではポリペプチド鎖に結合した分子を有し、分泌過程の間に炭水化物が付加されたらしいことを示唆している。

ＩＧＦ−１類似体のアミノ酸組成は標品分子のそれと同一であることが測定され認められた。従って、ＩＧＦ−１類似体か僅かにより親水性である性質は、Ｈｌ −ＨＰＬＣ実験から導き出されたように、ポリペプチドバックボーンの変化によるものではなく、むしろ他の構造上の変化によるものである。

酵母細胞は糖蛋白質を含んでいることが知られており、新しい類似体がＩＧＦ− １のグリコジル化形態である可能性を調べた。

ＣｏｎＡは、３個又はそれ以上のマンノース残基を含むオリゴ糖鎖に対する高い親和性によって糖蛋白質の研究に広く使用されてきた。その炭水化物特異性は決定されている（α−Ｄ−Ｍａｎ＞α−Ｄ−Ｇｌｃ＞α−ＤＧ１ｃＮＡｃ）。

ＣｏｎＡプロ７テイング（ｂｌｏｔｔｉｎｇ）は、ＩＧＦ−１類似体と標品ヒトＩＧＦ−１のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ −ＰＡＧＥ）の後に行われた（第４図）　。ＣｏｎＡＩＧＦ−１ポリペプチドパツクグラウンドに結合した炭水化物部分は、アルカリ加水分解（４Ｍ　ＴＦＡ、　１２０℃、１５°）及び続く還元（ＮａＢＨ）及びアセチル化の後にガスクロマトグラフィ、マススペクトロメトリイ（ＧＣ／ＭＣ）によって同定した。ピーク（７，７分）はＩＧＦ−１類似体を分析した際にガスクロマトグラフィの後に認められた。標品ｒＧＦ−１を分析した際にはこのようなピークは認められなかった（図には示していない）。７．７分で溶出する物質をさらにマススペクトロメトリイ分析にかけた。

マンノース参照マススペクトルと同一のマススペクトルはＩＣＦ−１類似体がマンノースを含んでいることを明白に示していることが判った。マンノース標準較正値に対するガスクロマトグラフィによるマンノース含量の定量は、マンノース含量が約２．１％（Ｗ／Ｗ）であることを示した。標品ＩＧＦ−１形態にはマンノース或いは他の炭水化物は認められなかった。

トリプシンマツプ分析ＧｌｃＮＡｃ　（Ｎ−アセチルグルコサミン）は常にＮ−結合グリコシル化の最初の炭水化物残基であることが示された。ＧｌｃＮＡｃはＩＧＦ−１類似体に認められなかったのでグリコジル化はセリン又はトレオニン残基にのみ生じる〇− 結合タイブのものでなければならない。ＩＧＦ−１は５個のセリン残基（Ｓｅｒｔｓ；　５ｅｒｓａ：　５ｅｒｓ１及び５ｅｒｏ）及び３個のトレオニン残基（Ｔｈｒａ；　Ｔｈｒｔ＊及びＴｈｒａＩ）を含む（第２図参照）。

グリコジル化セリン又はトレオニン残基を同定するために、■ＣＦ−１類似体をトリプシンで消化して（ポリペプチド鎖はＡｒｇ及びＬｙｓ残基の後に分解する）、より短いトリプシンフラグメントを生成した。次にこれらをＲＰ−ＨＰＬＣによって分離し、それらの移動度を標品ＩＧＦ−１のトリプシン消化によって生成した対応する対照物と比較した。標準（標品ＩＣＦ−１）に関してどの移動度の変化もグリコジル化トリプシンフラグメントを示していた。

第４図は標品ＩＧＦ−１のトリプシンマツプを示している。

１３個の独特なフラグメントが分離され、異なるフラグメントは横線で分離して示されている。これらのフラグメントの同定はアミノ酸分析によって決定した。

これらのフラグメントはＩＧＦ−１の７個のトリプシン切断点（Ａｒｇ、　Ｌｙｓ）と、やはり起こる３個のキモトリプシン様切断点と一致していた。ＩＧＦ− １類似体のトリブシンマツプを標品ヒトＩＧＦ−１と比較すると、トリプシンフラグメント２２−３６に対する溶出時間に僅かな相違が認められた（第５図参照）。他の相違点は認められなかった。これは明らかにマンノシル化部位がトリプシンフラグメント２２−３６内にあることを示している。この配列（−Ｇｌｙ− Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−ＧＬｙ−Ｔｙｒ− ３ｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ　−Ａｒｇ−）に基づいて４個の可能な〇−結合グリコシル化部位が存在する、例えばＴｈｒｔｓ；　５ｅｒｓｓ；　５ｅｒｘ４：　５ｅｒｓｓトリプシンフラグメント２２−３６はＩＣＦ−１類似体並びに標品ＩＧＦ−１から単離された。これらのフラグメントを蛋白質配列分析によって分析した。ＩＧＦ−１類似体からのトリプシンフラグメントに存在するＴｈｒは、修飾されたことを異常に示す移動した唯一のアミノ酸であった。配列２２−３６全体では２個のトリプシンフラグメントの間に他の相違は認められなかった。３個の連続したセリン残基５ｅｒｓｅ、　５ｅｒｓａ：又は５ｅｒｆｓには変化は認められず、これらがグリコジル化していないことを示している。従って、これらの結果はＩＧＦ−１類似体のＴｈｒｔｓがマンノースに結合する唯一のアミノ酸であることを明白に示していることになる。他のセリン又はトレオニンは０−グリコジル化されていなかった。

Ｔｈｒｔｓに結合したマンノース残基の数を正しく決定するためにＩＣ；Ｆ−１類似体から単離されたトリプシンフラグメント２２−３６をマススペクトロメトリイによって分析した。これは３２４のマンノシル化されたフラグメントとマンノシル化されていないフラグメントとの間の分子量差を示した。マンノースに結合したペプチドの分子量を１６２とすると、トリプシンフラグメントにつき２個のマンノース残基の値を計算できる。従って、各ＩＣＦ−１ＣモーＴｈｒ□に結合したマンノース残基を２個含む。ＴＧＦ−１類似体内のＴｈｒｔｓに結合した２個のマンノース残基の構造は、Ｈ−ＮＭＲスペクトロスコピイによって決定し、第１５図に示した。

生体活性ＩＧＦ−１のラジオ標識形態を用いてインキュベートした後、０−グリコジル化ＩＣＦ−１は通常のヒト血清と通常のラット血清中の高い分子量結合蛋白質（１５０Ｋ）にあまり良く結合していないが、下垂体切除したラットからの血清を使用した場合には血清プロフィルの差が得られないことが明らかに示された。高分子量と低分子量のピークの曲線下の領域は、５０〜６０％の０−グリコジル化ＩＧＦ−１のみが標品ＩＣＦ−１に比べて大きい分子量形態に結合していることを示した。低分子量形態に結合する際に小さい増加が認められたが、それぞれ高いキャリアと低いキャリアへの結合の間の割合の変化を説明するに充分な大きさの増加はなかった。

新しく調製されたラット肝細胞では、ＩＧＦ−１の２つの形態が新陳代謝できないアミノ酸α−ＡＩＢの細胞に移送する際の投与量依存効果をもっていた。その結果は、標品ＩＧＦ−１よりも、高濃度使用で（１ｗｈｏｌｅ／　Ｉｌ　）グリコジル化形態が僅かにより効果的であることを示している。ＩＧＦ−１又はインシュリンのいずれかを用いてインキュベートした後の肝細胞内の糖新生の結果は、インシュリン又は標品ＩＧＦ−１を添加した際に期待されるどんな効果も認められないことを示した。しかし、０−グリコジル化ＩＧＦ−１の添加によって、媒質内に見られるグルコースの量に予期しない増加が認められた。この結果は、等量濃度のマンノース単独の添加と同じ結果となるので、ＩＣＦ−１に結合したマンノースによるものと思われる。その結果はグルカゴン（ｇｌｕｃａｇｏｎ）を用いて観察したものよりも僅かに低かった。

下垂体切除したラットに生じた低血糖として測定された鋭敏なインシュリン様活性は、○−グリコジル化と標品の両方のＩＧＦ−１について示すことができた。

ＩＯμｇ／ラットの投与量は両方のペプチドで明白な低血糖を誘発させた。３０〜４５分で最下点が観察されてグルツースレベルは約２時間後に初期値に戻った。０−グリコジル化ＩＧＦ−１の効果は、同じ投与量で標品ＩＣＦ−１のそれよりも僅かに大きく、血液グルコースにおける最高減少値は、標品ＩＧＦ−１では３０分で−１４，４％であるのに比べて、０−グリコジル化形態では４５分で一２７％であった。

イン・ヴイヴオ膜輸送の結果は、約２時間後に最高の効果に達し、安定状態が認められることを示した。ペプチド間の著しい差は観察されなかったが、○−グリコジル化ＩＧＦ−１が僅かにより効果的である傾向があった。

０−グリコジル化（マンノシル化）及び標品のＩＧＦ−１の半減期（Ｔ、７りの予備計算を行った。これは通常のラットでは、それぞれα−相のＴ、７．が３分と４分となったが、下垂体切除したラットのα−相の半減期は僅かに長く、即ち、０−グリコジル化と標品のＩＧＦ−１についてはそれぞれ８分と１１分であった。しかし、α−相の半減期は通常のラットではそれぞれ３．５時間と５゜３時間であったが、下垂体切除したラットではそれぞれ３．３時間と３．５時間であった。

要約すると、０−グリコジル化ＩＧＦ−１がイン・ヴイトロとイン・ヴイヴすにおける複数の異なる生体アッセイにおいて標品ＩＧＦ−１と比較された。胎盤リセブタアッセイ又はラジオイムノアッセイによる特異的活性では顕著な差か認められず、マンノノル化アミノ酸が、ＩＧＦ−１リセプタ又は抗体に結合する部位のいずれかに対する結合に含まれていないことを示している。

これはまたイン・ヴイトロの異なる作用を示す実験からも明らかである。両方のＩＧＦ−１形態は肝細胞内の膜輸送（アミノ酸）に同様の作用を示した。これらのリセブタへの結合を妨害すると、２個の形態間に差が認められた。

しかし、肝細胞内のイン・ヴイトロに予期しない一つの発見、即ち、０−グリコジル化ＩＣＦ−１が媒質内のグルコースの量を増加したという事実が認められた。この結果はまた、マンノースのみの添加によっても見出された。マンノースは、フすスフすマンノイソメラーゼによるコンバージョンの後に、フルクトース− ６−燐酸のステップで糖新生経路に入ることができることが良く知られている。

膜輸送での０−グリコジル化ＩＧＦ−１の僅かに増加した活性は、細胞がエネルギーを発生するためマンノースを使用するという可能性によって説明できる。

最近、ペプチド類似体インシュリン様成長因子Ｉ　Ｉ　（ＩＧＦ−１１）に対するリセプタは、リソソームターゲット（ｌｙｓｏｓｏａ＋ａｌ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）に含まれるマンノース−６−燐酸リセブタに明らかに等しいことが示された。さらに、マンノース−６−燐酸の添加はそのリセブタに対してＩＧＦ−［１の結合を２倍に増加したことが示され、リセブタの変化が生じたことを示している。

ＩＧＦ−１の２個の形態の間での高分子量結合蛋白質への結合の差は極めて重要な観察である。循環ではフリーの内在ＩＧＦ−１の極少量のみが見出され（＜１％）、ペプチドの大部分は少なくとも２個の異なったキャリア蛋白質に結合しており、その一つは成長ホルモンによって制御され、ラロン矯小体躯症、ＣＨＤ成長ホルモン欠乏矯小体躯症及び下垂体切除したラットに不足している高分子量形態であり、もう一つは一部インシュリンによって制御される低分子量形態である。後者のキャリア蛋白質の量は糖尿病患者において増加する。

の治療についてはＩＧＦ−１のフリーのフラクシヨンを増加することが重要であると思われる。予備研究では、ＩＣＦ−１が例えばインシュリン耐性を示す患者に使用する候補として可能性があることを示した。

さらに、鋭敏なインシュリン様活性に関するイン・ヴイヴオ研究からの結果でも、０−グリコジル化ＩＣＦ−１が血糖を下げる際に標品ＩＧＦ−１よりも著しい効果があることを示しており、恐らく２個のペプチドの疏水性の差、又は速動性の差によるものであろう。

薬物動態学の予備結果は、下垂体切除を行ったラットに与えた場合、０−グリコジル化及び標品のＩＣＦ−１の間に差はないことを示している。しかし、通常のラットの結果では、ＩＣＦ−１の０−グリコジル化形態はα−相の半減期が明らかに僅かに短いことを示している（標品１ＧＦ−１の５．３時間と比較して３．５時間）。これはキャリア蛋白質への結合の差によるものであろう。

第１図 ■ 第２図潜在性り一結合グリコジル化部位に下線を引く第５図グリコジル化したＩＧＦ−１とグリコジル化し°Ｑ　ｓｆＬいＩＧＦ−１のトリプシンマツプ第６図Ｍ０°（１−２二Ｍ−ｎ１−Ｔｈ「２９補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成３年２月２０日瞭庁長官植松　敏　殿１、特許出願の表示　ＰＣＴ／ＥＰ　８９１００９７２２、発明の名称　○−グリコジル化）ＧＦ−１３、特許出願人住　所　スウェーデン玉国　ウプサラ　Ｓ−７５１８２名称　カビ　ファルマシア　アクティエボラーグ（共同代表者　ジエプソン　イングヴアル　ラルス、共同代表者　リドガルド　オ口）　マグヌス　マッツ）国　籍　スウェーデン王国４、代理人　〒１０５住所　東京都港区虎ノ門１丁目１７番３号第１２森ビル　６階電話３５８０−８９３１番５、補正書の提出年月日　１９９０年７月４日６、補正の対象　「特許請求の範囲」、「明細書」７、補正の内容　明細書の第１頁〜４罠第７瓦第１３Ｊｊ、及び特許請求の範囲をそれぞれ別紙の通り訂正する。

８、添付書類の目録（１）証昏ｌ暑文　１週明　細　書０−グリコジル化ＩＣＦ−１インシュリン様成長因子（ＩＧＦ−１）は７０個のアミノ酸単鎖ポリペプチド鎖因子であり、プロインシュリンと比較的高い相同関係を示す。成長ホルモンの働きに間接的な影響を与え、またインシュリン様の性質を示すことが知られている。人体で自然に生成する場合にはグリコジル化していない。

ＩＣ；Ｆ−１は製薬剤として下垂体性小人症と共に糖尿病の治療に用いることが可能である。後者の治療の場合、インシュリンの代わりに或いはインシュリンに添加しても使用される。インシュリンは糖尿病に対する伝統的な治療法であるが、タイプ２の糖尿病患者はインシュリンに耐性を示し、これはインシュリンを大量に投与しても患者はまだ高血糖症に病むことを意味する。さらに、インシュリンを過剰に投与すると、腎臓病、肥満症、水調節障害等の望ましくない副作用を生ずる。

これらの問題の若干を解決するためにグリコジル化していないＩＧＦ−１をインシュリンの代わりに或いは添加剤として試用できるが、グリコジル化していないＩＧＦ−１の割合が高くなると血流中を循環する蛋白質に特異的に結合して腐骨を形成する傾向があり、ＩＧＦ−１を比較的大量に投与するには望ましい製薬上の効果が得られるように投与する必要がある。

酵母細胞内のＩＧＦ−１の発現は、通常のグリコジル化していない形態と共に、ＩＧＦ−１の０−グリコジル化類似体、例えばポリペプチド鎖のＴｈｒ□アミノ酸上の２個のマンノース残基を運ぶ類似体を生成することになることを我々は見出した。試験によってＯ−グリコジル化ＩＣＦ−１は結合する蛋白質に対する親和性が少なく、通常のグリコジル化していない蛋白質と比較して少ない投与量のＯ−グリコジル化ＩＧＦ−１によって、血糖値の所要量の減少を達成することができることが判った。この結合する蛋白質に対する観察された親和性は、大略の投与傾向に充分な効果を与えるであろう。他の効果は未だ述べていないが臨床効果全体においては重要である。。

「０−グリコジル化ＩＧＦ−ＩＪの表現は、全［ＧＦ−１ポリペプチド配列のフラグメントが質的にＩＧＦ−１の成長ホルモン媒介効果及び／又はインシュリン様性質を示すとすれば、これらのフラグメントからなる０−グリコジル化分子を含む。

従って、本発明の一つは、グリコジル化していないＩＧＦ−１を本質的に含まないＯ−グリコジル化ＩＧＦ−１を提供する。

本発明の他の一つは、ポリペプチド鎖のＴｈｒｘ＊アミノ酸にてグリコジル化する０−グリコジル化ＩＣＦ−１を提供する。

さらに本発明は、グリコジル化がＩＧＦ−１のポリペプチド鎖の同じトレオニン残基に結合する２個又はそれ以上のマンノース残基からなる０−グリコジル化ｒＧＦ−１を提供する。

さらに池の本発明は、２個又はそれ以上のマンノース残基がポリペプチド鎖のＴｌ１ｒｔｓアミノ酸に結合するＩＧＦ−１の０−グリコジル化類似体を提供する。

さらにまた別の本発明は、酵母細胞内のＩＧＦ−１の発現によってＯ−グリコジル化ＩＧＦ−１を得る方法、及び媒質から０−グリコジル化ＩＧＦ−１を単離する方法を提供する。好ましくはＩＣＦ−１に対する遺伝子は好ましくは分泌シグナル配列に対してコードするＤＮＡ、例えばα−交配因子に対する遺伝子のそれに結合し、その結果、０−グリコジル化していた成熟標品■ＧＦ−１が酵母細胞の細胞質から分泌される。

このα−交配因子は、α−二倍体細胞を形成する細胞の有効な接合を促進するα −交配型の酵母細胞によって分泌される１３−アミノ酸ペプチドである。α−交配因子構造遺伝子の配列データーは、α−交配因子が８５アミノ酸リーダーペプチドと、８アミノ酸スペーサーペプチドによって各々が割り込まれた４個のコード領域とを含む１６５アミノ酸前駆体として最初に合成されることを示している。この８５アミノ酸リーダーポリペプチドは、小胞体膜に前駆体をターゲットする際に伴う１９アミノ酸シグナル配列を含むさらに０−グリコジル化ＩＧＦ−１を含むが、実質的にグリコジル化していないＩＧＦ−１を含まず、及び製薬上許容されるキャリア、希釈剤、又は賦形剤を含有する製薬組成物を提供する。

この組成物はインシュリンを含むこともできる。

さらに他の発明は、０−グリコジル化ＩＣＦ−１及びグリコジル化していないＩＣＦ−１を混合してなる製薬組成物を調整する方法を提供する。

酵母内のＩＣ，Ｆ−１の発現に使用されるプラスミドはｐ５３９／１２であることができ、その作成は次の実施例で述べる。他の酵母発現プラスミドも適当である。

実施例によってのみ、ＩＧＦ−１に対する遺伝子を運ぶプラスミドの作成方法、前記プラスミドを用いるサツカロミセス・セレイヴイシア（ＳａｃｃｈａｒｏＩＩＩｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の形質転換、及び形質転換された酵母細胞からの成人Ｏ−グリコジル化ＩＣＦ−１の発現を、図面を参照しながら以下に詳細に述べる。

第１図は、ＩＧＦ−１発現プラスミドル５３９／１２の作成を示す図であり：第１ａ図はプラスミドｐ５３９／１２の制限マツプであり；第２図はα−交配因子リーダー配列とＩＣＦ−１との間の融合のポリペプチド構造を示す図であり：第３図はＨｌ−ＨＰＬＣによるＩＣＦ−２の２個の型の分離を示す図であり：第４図は横線によって分離されたトリプシンフラグメントをもつＩＧＦ−１の構造を示す図であり：第５図はＩＧＦ−１の両方の型を示すトリプシンマツプであり：及び第６図はＩＣＦ−１の０−グリコジル化形態におけるＴｈｒｔ＊に結合した２個のマンノース残基の構造を示す図である。

実施例ＩＧＦ−１遺伝子をα−交配因子リすダーペプチドーＩＧＦ−により親水性である性質は、Ｈｌ−ＨＰＬＣ実験から導き出されたように、ポリペプチドバックボーンの変化によるものではなく、むしろ他の構造上の変化によるものである。

ＣｏｎＡは、３個又はそれ以上のマンノース残基を含むオリゴ糖鎖に対する高い親和性によって糖蛋白質の研究に広（使用されてきた。その炭水化物特異性は決定されている（α−Ｄ−Ｍａｎ＞α−Ｄ−ＧＩＣ＞α−ＤＧｌｃＮＡｃ）。

ＣｏｎＡブロッティング（ｂｌｏｔｔｉｎｇ）は、ＩＧＦ−１類似体と標品ヒトＩＧＦ−１のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ −ＰＡＧＥ）の後に行われた（第４図）　ｏ　ＣｏｎＡ結合はＩＣ；Ｆ−１類似体に観察されたが、標品形態には観察圭±ユず、これは糖蛋白質であることを示している。

ＩＧＦ−１ポリペプチドバツクグラウンドに結合した炭水化物部分は、アルカリ加水分解（４Ｍ　ＴＦＡ、　１２０℃、１５′）及び続く還元（ＮａＢＨ）及びアセチル化の後にガスクロマトグラフィ、マススペクトロメトリイ（ＧＣ／ＭＣ）によって同定した。ピーク（７，７分）はＩＧＦ−１類似体を分析した際にガスクロマトグラフィの後に認められた。標品ＩＣＦ−１を分析した際にはこのようなピークは認められなかった（図には示していない）。７．７分で溶出する物質をさらにマススベクトロメトリイ分析にかけた。

マンノース参照マススペクトルと同一のマススペクトルはＩＧＦ−１類似体がマンノースを含んでいることを明白に示していることが判った。マンノース標準較正値に対するガスクロマトグラフくとも２個の異なったキャリア蛋白質に結合しており、その一つは成長ホルモンによって制御され、ラロン矯小体躯症、ＣＨＤ成長ホルモン欠乏矯小体躯症及び下垂体切除したラットに不足している高分子量形態であり、もう一つは一部インシュリンによって制御される低分子量形態である。後者のキャリア蛋白質の量は糖尿病患者において増加する。

フリーのＩＧＦ−１がインシュリン様作用（例えば、イン・ヴイヴすの低血糖症）に対して応答することを示したが、過血糖症の治療についてはＩＧＦ−１のフリーのフラクションを増加することが重要であると思われる。予備研究では、ＩＧＦ−１が例えばインシュリン耐性を示す患者に使用する候補として可能性があることを示した。

さらに、鋭敏なインシュリン様活性に関するイン・ヴイヴオ研究からの結果でも、０−グリコジル化ＩＣＦ−１が血糖を下げる際に標品ＩＧＦ−１よりも著しい効果があることを示しており、恐らく２個のペプチドの疏水性の差、又は連動性の差によるものであろう。

薬物動態学の予備結果は、下垂体切除を行ったラットに与えた場合、Ｏ−グリコジル化及び標品のＩＣＦ−１の間に差はないことを示している。しかし、通常のラットの結果では、ＩＧＦ−１の０−グリコジル化形態はα−相の半減期が明らかに僅かに短いことを示している（標品ＩＧＦ−１の５．３時間と比較して３．５時間）。これはキャリア蛋白質への結合の差によるものであろう。

請求の範囲１．グリコジル化していないＩＧＦ−１を本質的に含まない０−グリコジル化ＩＣＦ−１゜２、ポリペプチド鎖のＴｈｒｚｓアミノ酸にてグリコジル化する請求項１記載の０−グリコジル化ＩＧＦ−１゜３、グリコジル化がＩＧＦ−１のポリペプチド鎖の同じトレオニン残基に結合する２個又はそれ以上のマンノース残基からなる請求項［記載の０−グリコジル化ＩＧＦ−１゜４．２個又はそれ以上のマンノース残基がＩＣ；Ｆ−１，０ポリペプチド鎖のＴｈｒｚ＊アミノ酸に結合する０−グリコジル化ＩＧＦ−１５、酵母細胞内のＩＧＦ−１の発現によってＯ−グリコジル化■ＧＦ−１を得て、媒質から０−グリコジル化ＩＧＦ−１を単離する方法。

７．１ＣＦ−１に対してコードするＤＮＡを、酵母分泌シグナル配列に対してコードするＤＮＡに結合し、その結果Ｏ−グリコジル化していた成熟標品ＩＧＦ− １が酵母細胞の細胞質から分泌される請求項６記載の方法。

８、分泌シグナル配列がα交配因子に対する遺伝子のソゲナル配列である請求項７記載の方法。

９．０−グリコジル化ＩＧＦ−１を含むが、実質的にグリコジル化していないｒＧＦ−１を含まず、さらに製薬上許容できるキャリア、希釈剤又は賦形剤を含有する製薬組成物。

１０、さらにインシュリンを含む請求項９記載の製薬組成物。

１１、０−グリコジル化ＩＣＦ−１及びグリコジル化していないＩＧＦ−１を混合してなる製薬組成物を調整する方法。

国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．グリコシル化していないＩＧＦ−１を本質的に含まないＯ−グリコシル化１ＧＦ−１。
２．ポリペプチド鎖のＴｈｒ２９アミノ酸にてグリコシル化する請求項１記載のＯ−グリコシル化１ＧＦ−１。
３．グリコシル化がＩＧＦ−１のポリペプチド鎖の同じトレオニン残基に結合する２個又はそれ以上のマンノース残基からなる請求項１記載のＯ−グリコシル化１ＧＦ−１。
４．２個又はそれ以上のマンノース残基がＩＧＦ−１のポリペプチド鎖のＴｈｒ２９アミノ酸に結合するＯ−グリコシル化ＩＧＦ−１。
５．酵母細胞内のＩＧＦ−１の発現によってＯ−グリコシル化ＩＧＦ−１を得て、媒質からＯ−グリコシル化ＩＧＦ−１を単離する方法。
６．酵母はサッカロミセス・セレィヴィシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である請求項５記載の方法。
７．ＩＧＦ−１に対してコードするＤＮＡを、酵母分泌シグナル配列に対してコードするＤＮＡに結合し、その結果Ｏ−グリコシル化していた成熟標品ＩＧＦ− １が酵母細胞の細胞質から分泌される請求項６記載の方法。
８．分泌シグナル配列がα交配因子に対する遺伝子のシグナル配列である請求項７記載の方法。
９．Ｏ−グリコシル化ＩＧＦ−１を含むが、実質的にグリコシル化していないＩＧＦ−１を含まず、さらに製薬上許容できるキャリア、希釈剤又は賦形剤を含有する製薬組成物。
１０．さらにインシュリンを含む請求項９記載の製薬組成物。
１１．Ｏ−グリコシル化ＩＧＦ−１及びグリコシル化していないＩＧＦ−１の両方からなり、酵母細胞の培養により発現されるような、Ｏ−グリコシル化及びグリコシル化していないＩＧＦ−１の混合物におけるよりも、Ｏ−グリコシル化ＩＧＦ−１の割合がより高い製薬組成物。