FI102282B - Menetelmä O-glykosyloidun IGF-1:n valmistamiseksi - Google Patents
Menetelmä O-glykosyloidun IGF-1:n valmistamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI102282B FI102282B FI910795A FI910795A FI102282B FI 102282 B FI102282 B FI 102282B FI 910795 A FI910795 A FI 910795A FI 910795 A FI910795 A FI 910795A FI 102282 B FI102282 B FI 102282B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- igf
- glycosylated
- authentic
- analog
- mannose
- Prior art date
Links
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 title claims abstract description 113
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 title claims abstract 10
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 5
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 17
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 15
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 14
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 11
- 125000000311 mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 7
- SBKVPJHMSUXZTA-MEJXFZFPSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-5-amino-2-[[2-[[(2S)-1-[(2S)-6-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]acetyl]amino]-5-oxopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 SBKVPJHMSUXZTA-MEJXFZFPSA-N 0.000 claims description 6
- 108010038049 Mating Factor Proteins 0.000 claims description 6
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 4
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 claims description 2
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 abstract description 8
- 102000044162 human IGF1 Human genes 0.000 abstract description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 abstract description 3
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 100
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 16
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 11
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 11
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 11
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 11
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 5
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 230000002608 insulinlike Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 3
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 3
- 208000013016 Hypoglycemia Diseases 0.000 description 3
- 102000003939 Membrane transport proteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000301 Membrane transport proteins Proteins 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 3
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 3
- 230000002218 hypoglycaemic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000009061 membrane transport Effects 0.000 description 3
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 206010013883 Dwarfism Diseases 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-PVFLNQBWSA-N N-acetyl-alpha-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-PVFLNQBWSA-N 0.000 description 2
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 2
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 101150110188 30 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100025566 Chymotrypsin-like protease CTRL-1 Human genes 0.000 description 1
- GSXOAOHZAIYLCY-UHFFFAOYSA-N D-F6P Natural products OCC(=O)C(O)C(O)C(O)COP(O)(O)=O GSXOAOHZAIYLCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBSCHQHZLSJFNQ-QTVWNMPRSA-N D-Mannose-6-phosphate Chemical compound OC1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O NBSCHQHZLSJFNQ-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- 238000010268 HPLC based assay Methods 0.000 description 1
- 101000856199 Homo sapiens Chymotrypsin-like protease CTRL-1 Proteins 0.000 description 1
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 1
- 102000038455 IGF Type 1 Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010031794 IGF Type 1 Receptor Proteins 0.000 description 1
- 108010031792 IGF Type 2 Receptor Proteins 0.000 description 1
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 description 1
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 1
- 101150045458 KEX2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000019218 Mannose-6-phosphate receptors Human genes 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-DVKNGEFBSA-N alpha-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-DVKNGEFBSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PQMKYFCFSA-N alpha-D-mannose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PQMKYFCFSA-N 0.000 description 1
- 101150057950 aph gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- BGWGXPAPYGQALX-ARQDHWQXSA-N beta-D-fructofuranose 6-phosphate Chemical compound OC[C@@]1(O)O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O BGWGXPAPYGQALX-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000000459 effect on growth Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- 230000004110 gluconeogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000000344 gluconeogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005621 mannosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 1
- 230000001151 other effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000004526 pharmaceutical effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 208000003068 pituitary dwarfism Diseases 0.000 description 1
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 210000004896 polypeptide structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 101150023453 smc gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/30—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/65—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
102282
Menetelmä O-glykosyloidun IGF-l:n valmistamiseksi
Insuliinin kaltainen kasvutekijä (IGF-1) on 70 aminohapon yksittäisestä polypeptidiketjusta koostuva tekijä, 5 joka ilmentää suhteellisen korkeaa homologiaa proinsulii- nin kanssa. Sillä tiedetään olevan välittävä vaikutus kasvuhormonin toiminnassa ja sen myös osoittavan insuliinin kaltaisia ominaisuuksia. Ihmisruumiin tuottaessa sitä luonnossa se on glykosyloimaton.
10 IGF-1:llä on mahdollisia käyttötarkoituksia aivo- lisäkesyntyisen kääpiökasvuisuuden ja myös diabeteksen hoidossa. Jälkimmäisessä tapauksessa se olisi edullinen joko insuliinin korvikkeena tai insuliinin lisänä. Vaikka insuliini onkin diabeteksen perinteinen hoito, tyypin 2 15 diabeetikot ovat kehittäneet vastustuskyvyn insuliinille, mikä tarkoittaa sitä, että vaikka annetaan hyvin suuria insuliiniannoksia, potilaat voivat edelleen kärsiä hyper-glykemiasta. Lisäksi liialliset insuliiniannokset voivat johtaa epäsuotaviin sivuvaikutuksiin, kuten munuaisvaivoi-20 hin, liikalihavuuteen ja vesitasapainon häiriöihin.
Vaikka glykosyloimatonta IGF-1:tä voitaisiin käyttää insuliinin korvikkeena tai lisänä koetettaessa päästä joistakin näistä ongelmista, suurella osalla glykosyloimatonta IGF-1:tä on taipumus joutua verenkierrossa kiertä-. 25 vien spesifisten sitojaproteiinien kompleksoimaksi ja näin joudutaan antamaan suhteellisen korkeita IGF-l-annoksia, jotta saataisiin aikaan haluttu farmaseuttinen vaikutus.
Olemme nyt havainneet, että IGF-1:n ilmentäminen hiivasoluissa johtaa tavallisen glykosyloimattoman muodon 30 ohella IGF-1:n O-glykosyloidun analogin tuotantoon, esi- ; merkiksi analogin, jonka polypeptidiketjun Thr29-aminoha possa on kaksi mannoositähdettä. Testit ovat osoittaneet, että O-glykosyloidun IGF-1:n affiniteetti sitojaproteii-neihin on vähentynyt ja että veren sokeritason haluttu 35 lasku voidaan saada aikaan pienennetyllä annoksella IGF- 2 102282 1:tä normaaliin glykosyloimattomaan proteiiniin verrattuna. Tällä havaitulla affiniteetilla sitojaproteiiniin tulee olemaan syvällinen vaikutus profiiliin ja annosriip-puvuuteen. Toiset vaikutukset, vaikkakaan eivät niin sel-5 viä, ovat tärkeitä kliinisessä kokonaisvaikutuksessa.
Ilmaisu "O-glykosyloitu IGF-1" käsittää O-glykosy-loidut molekyylit, jotka sisältävät fragmentteja IGF-1:n koko polypeptidisekvenssistä, edellyttäen että nämä fragmentit ilmentävät kvalitatiivisesti IGF-1:n kasvuhormonin 10 vaikutusta välittävän vaikutuksen ja/tai IGF-1:n insulii nin kaltaiset ominaisuudet.
Keksinnön näkökulman mukaisesti annamme täten käyttöön O-glykosyloidun IGF-1:n, joka on olennaisesti vapaa glykosyloimattomasta IGF-l:stä. Tarkemmin ilmaistuna an-15 namme käyttöön O-glykosyloidun IGF-1:n, jossa on glykosy- loitu Thr29-aminohappo polypeptidiketjussa.
Vielä tarkemmin ilmaistuna annamme käyttöön O-glykosyloidun IGF-1:n analogin, jossa kaksi tai useampi man-noositähde on kiinnittynyt polypeptidiketjun Thr29- 2 0 aminohappoon.
Näin ollen esillä oleva keksintö kohdistuu menetelmään O-glykosyloidun IGF-1:n valmistamiseksi, jolla on 2 tai useampi mannoosiryhmä kiinnittyneenä IGF-1:n polypep-tidiketjun Thr29-aminohappoon. Keksinnön mukaiselle mene-.. 25 telmälle on tunnusomaista, että IGF-1 ilmennetään hii vasoluissa ja eristetään O-glykosyloitu IGF-1 alustasta.
Hiiva on edullisesti Saccharomvces cerevisiae.
IGF-1:n geeni on mieluiten liitetty DNA:han, joka koodaa erityssignaalisekvenssiä, esimerkiksi a-pariutumis-30 tekijän geenin erityssignaalisekvenssiä, niin että kypsä autenttinen IGF-1, joka on O-glykosyloitu, eritetään hiivasolujen sytoplasmasta.
α-pariutumistekijä on 13 aminohapon peptidi, jota a-pariutumistyypin hiivasolut erittävät edistääkseen solu-35 jen tehokasta konjugaatiota, jolloin muodostuu a_a-diploi- 3 102282 disoluja. o-pariutumistekijän rakennegeenin sekvenssidata osoittaa, että α-pariutumistekijä syntetoidaan alunperin 165 aminohapon esiasteena, joka sisältää 85 aminohapon signaalipeptidin ja neljä koodaavaa jaksoa, jotka kaikki 5 keskeyttää 8 aminohapon välipeptidi. 85 aminohapon sig- naalipolypeptidi sisältää 19 aminohapon signaalisekvenssin, joka on osallisena ohjaamassa esiastetta endoplasmaa-ttiselle membraanille.
Kuvaamme edelleen farmaseuttisen koostumuksen, joka 10 sisältää O-glykosyloitua IGF-l:tä, mutta ei merkittävästi glykosyloimatonta IGF-l:tä, ja farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan, laimentimen tai täyteaineen. Koostumus voi myös sisältää insuliinia.
Farmaseuttinen koostumus voidaan myös valmistaa se-15 koittamalla O-glykosyloitua IGF-l:tä ja glykosyloimatonta IGF-1:tä.
Plasmidi, jota hyödynnetään ilmennettäessä IGF-l:tä hiivassa, voi olla p539/l2, jonka konstruktio kuvaillaan seuraavassa esimerkissä. Muutkin hiivan ekspressioplas-20 midit olisivat myös sopivia.
Vain esimerkin vuoksi, prosessi jolla koostetaan plasmidi joka kantaa IGF-l:n geeniä, Saccharomvces cerevi-siaen transformaatio tällä plasmidilla, ja ihmisen kypsän O-glykosyloidun IGF-l:n ilmentäminen transformoituneissa ·· 25 hiivasoluissa kuvataan nyt yksityiskohtaisesti, viitaten liitteenä oleviin kuvioihin, joissa:
Kuvio 1 havainnollistaa IGF-l-ekspressioplasmidin p539/12 rakenteen;
Kuvio la on plasmidin p539/12 restriktiokartta; 30 Kuvio 2 näyttää polypeptidirakenteen a-pariutumis- ! tekijän signaalisekvenssin ja IGF-l:n välisestä fuusiosta;
Kuvio 3 näyttää kahden IGF-2:n muodon erottamisen HI-HPLC:ssä;
Kuvio 4 näyttää IGF-l:n rakenteen, jossa 35 poikkiviivat erottavat toisistaan tryptiset fragmentit; 4 102282
Kuvio 5 on tryptinen kartta, joka näyttää IGF-l:n molemmat muodot; ja
Kuvio 6 näyttää IGF-l:n O-glykosyloidun muodon Thr29:ään sitoutuneiden kahden mannoositähteen rakenteen.
5 Esimerkki IGF-l-geeni ekspressoitiin Saccharomvces cerevisiae -hiivassa käyttäen α-pariutumistekijän signaalipeptidi-IGF-l-ekspressioplasmidia p539/12.
Plasmidi ja hiivamutanttikanta: 10 Plasmidin 539/12 koosti tri J.F. Ernst (Biogen S.A, Ch-1227, Geneve, Sveitsi). Sen rakenne on seuraava. Plasmidi pJDB219/G koostettiin JDB219:stä (Beggs, J.D., kirjassa A. Benzon Symposium 16. toimittajat: D. von
Wettstein, J. Fries, M. Kielland-Brand & A. Stenderup, 15 Munksgaard, Kööpenhamina, 383 - 389, 1981) insertoimalla APH-geeniä Tn903 kantava 1,7 kb Sali- fragmentti (Ernst, J. F. ja R.C. Chan, J. Bacteriol. 163. 8-14. 1985) JDB219:n ainoaan Sali-kohtaan (täplitetty laatikko kuviossa 1) . Plasmidista p364/l peräisin oleva SMC-ekspressioyksikkö, 20 joka sisältää ACT-promoottorin, MF a 1 -signaalisekvenssin ja SMC-geenin siirrettiin 1,1 kb:n Bglll-BamHI-fragment-tina pJDB219/G:n ainoaan BamHI-kohtaan. Syntynyt plasmidi, p510/14, linearisoitiin osittaisdigestiolla HindIII:lla ja I, 1 kb Hindlll-fragmentti, joka sisälsi hiivan URA3-gee- 25 nin, joka oli peräisin YIp30-plasmidista (Botstein, D. et ai., Gene 8, 17 - 24, 1979), insertoitiin p510/14-plasmi-diin, jotta saatiin tehtyä p539/l2, joka kantaa markkerei-ta KanR G418R Ura3+ Leu 2+. Sen geneettisten elementtien pääpiirteet näytetään kuviossa la. IGF-l:n tuotanto suori-30 tettiin Saccharomvces cerevisiae -mutanttikannassa YE 449 : (Mat a leu 2. ura 3-52. prbl-1122, pep 4-3, cir 4°) .
Plasmidi on parannettu versio muista IGF-1 ekspres-sioplasmideista, joista on raportoitu aikaisemmin (Ernst J. F. (1986) DNA 5, 483 - 491). Koko aminohapposekvenssi 35 (155 aminohappoa) α-pariutumisteki jän signaalipeptidi-lGF- s 102282 1 -hybridiproteiinille näytetään kuviossa 2. α-pariutumis-tekijän signaalipeptidi sisältää ensimmäiset 85 tähdettä ja IGF-1 loput 70 tähdettä. IGF-l-sekvenssissä on läsnä useita mahdollisia O-sidoksellisia glykosylaatiokohtia.
5 Nämä on merkitty. Vastasyntetoitu 155 aminohapon pituinen α-pariutumistekijän signaalipeptidi-IGF-1-hybridiproteiini eritettiin ulos solusta kasvatusliuokseen. Tämän prosessin aikana hybridiproteiini katkaistiin hiivaperäisellä hiivan peptidaasilla (KEX2), jolloin syntyi autenttinen IGF-1-10 molekyyli, jossa oli oikea N-terminaalinen aminohappo (Gly). Kuitenkin ihmisen IGF-l:n autenttisen muodon lisäksi syntetoitiin ja eritettiin myös uutta analogia ihmisen IGF-1:stä.
Hiivan fermentointielatusaine sisälsi arviolta 50 % 15 autenttista ihmisen IGF-l:tä ja 50 % analogia. Nämä kaksi IGF-l-tuotetta eristettiin väliaineesta perinteisiä biokemiallisia eristystekniikoita käyttäen. Lopullinen IGF-1-analogin eristäminen autenttisesta ihmisen IGF-l:stä saatiin aikaan hydrofobiseen vuorovaikutukseen perustuvalla 20 kromatografiällä (HI-HPLC) käyttäen TSK-fenyyli-5PW-mat- riisia (kuvio 3). IGF-l-analogi eluoitui aikaisemmin kuin autenttinen IGF-1, mikä osoitti, että se on hieman hydro-fiilisempi.
Natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidigeeli-25 elektroforeesilla (SDS-PAGE) havaittiin, että autenttisen IGF-1:n molekyylipaino oli hieman pienempi kuin analogin ja analogin ilmentämä korkeampi molekyylipaino (noin 400) viittaa siihen, että tämän muodon polypeptidiketjuun on sitoutunut molekyylejä, todennäköisimmin eritysprosessin 30 aikana lisättyjä hiilihydraatteja.
* IGF-1-analogin aminohappokoostumus määritettiin ja se havaittiin identtiseksi autenttisen molekyylin kanssa. Täten IGF-1-analogin hieman suurempi hydrofi il isyys, kuten HI-HPLC-kokeesta pääteltiin, ei johdu muutoksesta polypep-35 tidirungossa vaan pikemminkin jostakin muusta rakenteelli sesta muokkauksesta.
6 102282
Hiivasolujen tiedetään sisältävän glykoproteiine-ja, ja tutkittiin mahdollisuutta että uusi analogi olisi IGF1:n glykosyloitu muoto.
ConA:ta on käytetty laajalti glykoproteiineja tut-5 kittaessa, koska sillä on korkea affiniteetti oligosakka- ridiketjuihin, jotka sisältävät kolme mannoositähdettä tai enemmän. Sen hiilihydraattispesifisyys on määritetty (a-D-Man > α-D-Glc > a-D-GlcNAc).
ConA-blottaus suoritettiin IGF-1-analogin ja ihmi-10 sen autenttisen IGF-l:n natriumdodekyylisulfaattipolyak- ryyliamidigeelielektroforeesin (SDS-PAGE) jälkeen (kuvio 4) . ConA:n havaittiin sitoutuvan IGF-1-analogiin, muttei autenttiseen muotoon, mikä osoitti, että se on glykopro-teiini.
15 IGF-l:n polypeptidirunkoon sitoutunut hiilihydraat- tiosa määritettiin kaasukromatografiamassaspektrometrialla (GC/MC) emäksisen hydrolyysin jälkeen (4M TFA, 120 °C, 15') ja sen jälkeisellä pelkistyksellä (NaBH) ja asetylaatiol-la. Huippu (7,7 minuuttia) havaittiin kaasukromatografian 20 jälkeen IGF-l-analogia analysoitaessa. Sellaista huippua ei havaittu autenttista IGF-l:tä analysoitaessa (ei näytetä) . 7,7 minuutin kohdalla eluoituva materiaali alistettiin edelleen massaspektrometria-analyysiin. Mannoosirefe-renssimassaspektrin kanssa identtinen spektri havaittiin, .. 25 mikä osoitti yksiselitteisesti, että IGF-l-analogi sisäl tää mannoosia. Mannoosisisällön kvantitointi kaasukromatografialla kalibroitua mannoosistandardia vastaan osoitti, että mannoosisisältö oli noin 2,1 % (w/w) . Mannoosia tai muitakaan hiilihydraatteja ei havaittu autenttisessa 30 IGF-1-muodossa.
Tryptisen kartan analysointi
GlcNAcm (N-asetyyliglukosamiini) on osoitettu olevan aina ensimmäinen hiilihydraattitähde N-sidoksellises-sa glykosylaatiossa. Koska IGF-1-analogissa ei havaittu 35 GlcNAc:tä, glykosylaation täytyi olla O-sidoksellista 7 102282 tyyppiä, joka voi ilmetä vain seriini- tai treoniinitähteissä. IGF-l sisältää 5 seriinitähdettä (Ser33; Ser34; Ser51, ja Ser69) ja 3 treoniinitähdettä (Thr4, Thr29; ja Thr41) . (Katso kuvio 2) .
5 Glykosyloitujen seriini- tai treoniinitähteiden identifioimiseksi IGF-l-analogi pilkottiin trypsiinillä (polypeptidiketju katkeaa Arg- tai Lys-tähteiden jälkeen) lyhyempien tryptisten palojen aikaansaamiseksi. Nämä eroteltiin tämän jälkeen RP-HPLCrllä ja niiden liikkuvuus 10 määritettiin niiden vastaavien vastinpalojen suhteen, jot ka oli saatu aikaan digestoimalla trypsiinillä autenttinen IGF-l. Mikä tahansa muutos suhteellisessa liikkuvuudessa standardiin (autenttinen IGF-l) nähden paljastaisi glyko-syloituneen tryptisen fragmentin.
15 Kuvio 4 näyttää autenttisen IGF-l:n tryptisen kar tan. 13 yksilöllistä fragmenttia erotettiin, eri palat näytetään poikkiviivojen erottamina. Näiden fragmenttien identiteetti määritettiin aminohappoanalyysillä. Nämä fragmentit sopivat yhteen seitsemän tryptisen katkaisukoh-20 dan kanssa (Arg, Lys) IGF-l:ssä sekä kolmen kymotrypsiinin kaltaisen katkaisun kanssa, jotka ovat myös tapahtuneet. Kun IGF-l-analogin tryptistä karttaa verrattiin autenttiseen ihmisen IGF-l:een, havaittiin vähäinen ero eluutio-ajassa tryptisille paloille 22 - 36 (kuvio 5). Mitään mui-25 ta eroja ei voitu havaita. Tämä osoittaa selvästi, että mannosylaatiokohta on tryptisten palojen 22 - 36 sisällä. Sen sekvenssin perusteella (-Gly-Phe-Tyr-Phe-Asn-Lys-Pro-Thr-Glv-Tvr-Ser-Ser-Ser-Ara-) läsnä on neljä mahdollista paikkaa O-sidokselliselle glykosylaatiolle eli Thr29; Ser33; 30 Ser34; Ser35.
: Tryptiset fragmentit 22 - 36 eristettiin IGF-l-ana- logista samoin kuin autenttisesta IGF-l*.stä. Nämä fragmentit analysoitiin proteiinisekvenssianalyysillä. Thr, joka oli läsnä IGF-l-analogin tryptisessä fragmentissa, oli ai-35 noa aminohappo joka liikkui poikkeavasti, mikä osoitti, 8 102282 että sitä oli muokattu. Mitään muita eroja koko sekvenssissä 22 - 36 ei havaittu kahden tryptisen fragmentin välillä. Mitään muokkausta ei havaittu kolmessa peräkkäisessä seriinitähteessä Ser33; Ser34; tai Ser35; mikä osoitti, 5 ettei näitä ollut glykosyloitu. Täten nämä tulokset osoit tavat yksiselitteisesti, että IGF-1-analogin Thr29 on ainoa mannoosia sitova aminohappo. Mikään muu seriini tai treo-niini ei ole ollut O-glykosyloitu.
Thr29:ään sitoutuneiden mannoositähteiden tarkan 10 luvun määrittämiseksi IGF-l-analogista eristetty tryptinen fragmentti analysoitiin massaspektrometrialla. Tämä osoitti mannosyloidun ja mannosyloimattoman fragmentin väliseksi molekyylipainoeroksi 324. Olettaen, että peptidiin sitoutuneen mannoosin molekyylipaino on 162, voidaan laskea 15 stoikiometria 2 mannoositähdettä per tryptinen fragmentti.
Näin ollen kukin IGF-1-molekyyli sisältää kaksi Thr29:ään sitoutunutta mannoositähdettä. IGF-l-analogimolekyylin Thr29:ään sitoutuneiden kahden mannoosi tähteen rakenne määritettiin H-NMR-spektroskopialla ja se näytetään kuviossa 20 15.
Biologinen aktiivisuus
Radioleimattuja IGF-1-muotoja inkuboitaessa osoittautui selvästi, että O-glykosyloitu IGF-1 sitoi huonommin korkean molekyylipainon sitomisproteiinia (150 K) sekä 25 normaalissa ihmisseerumissa että normaalissa rotan seeru missa, mutta seerumiprofiileilla ei havaittu eroja käytettäessä seerumia, joka oli otettu rotista, joiden aivolisäke oli poistettu. Suuren ja pienen molekyylipainon huippu-käyrien alainen alue osoitti, että vain 50-60 % O-glykosy-30 loidusta IGF-l:stä sitoutui suurimolekyylipainoiseen muo- : toon autenttiseen IGF-1:een verrattuna. Havaittiin pieni sitoutumisen lisääntyminen pienimolekyylipainoiseen muotoon, mutta lisäys ei ollut tarpeeksi suuri selittääkseen sitoutumissuhteen muutoksen suurien ja pienien kantajien 35 välillä, tässä järjestyksessä.
102282 9
Tuoreeltaan valmistetuissa rotan maksasoluissa IGF-1:n kahdella muodolla oli annosriippuvainen vaikutus siihen, miten solut kuljettivat sisäänsä ei-metaboloituvaa aminohappoa a-AIB. Tulokset osoittavat, että glykosyloitu 5 muoto oli hieman tehokkaampi käytetyssä korkeassa konsen- traatiossa (1 mooli/1) kun autenttinen IGF-1. Tulokset maksasolujen glukoneogeneesistä inkuboitaessa niitä jommankumman IGF-1:n tai insuliinin läsnä ollessa osoittivat, ettei mitään vaikutusta havaittu, kun lisättiin insuliinia 10 tai autenttista IGF-1:tä, mikä oli odotettavissakin. Kui tenkin O-glykosyloitua IGF-1:tä lisättäessä havaittiin odottamaton elatusaineesta tavatun glukoosin lisäys. Tämä vaikutus näyttää johtuvan IGF-1:een sitoutuneesta mannoo-sista, koska vastaavan mannoosikonsentraation lisäys yksin 15 . toi saman vaikutuksen. Vaikutukset olivat hieman alhaisempia kuin glukagonilla havaitut.
Akuutti insuliinin kaltainen vaikutus, joka mitattiin hypoglykemiana rotilla, joiden aivolisäke oli poistettu, voitiin osoittaa sekä O-glykosyloidulla että aut-20 enttisella IGF-1:llä. Annos 10 μg/rotta sai aikaan selvän hypoglykemian molemmilla peptideillä. Huippu havaittiin 30 - 45 minuutin kuluttua ja glukoositasot olivat palanneet alkuperäisiksi noin 2 tunnin kuluttua. O-glykosyloi-dun IGF-1:n vaikutus oli hieman suurempi kuin autenttisen 25 IGF-1:n samanlaisilla annoksilla, veren glukoosin maksimi- lasku ollen -27 % 45 minuutissa O-glykosyloidulla muodolla, verrattuna -14,4 %:iin 30 minuutissa autenttisella IGF-1:llä.
In vivo -membraanikuljetuksen tulokset osoittivat, 30 että maksimaalinen teho saavutettiin noin 2 tunnin kulut tua, jolloin havaittiin vaikutuksen tasaantuminen. Mitään merkittävää peptidien välistä eroa ei havaittu, vaikkakin O-glykosyloidulla IGF-1:llä oli taipumus olla hieman tehokkaampi .
10 102282 O-glykosyloidun (mannosyloidun) ja autenttisen IGF-l:n puoliintumisajat (T1/2) laskettiin alustavasti. Tämän tulos oli normaaleissa rotissa: α-faasin T1/2 3 minuuttia ja 4 minuuttia, tässä järjestyksessä, kun taas a-faa-5 sin puoliintumisajat rotilla, joiden aivolisäke oli pois tettu, olivat hieman pitempiä, eli 8 ja 11 minuuttia O-glykosyloidulle ja autenttiselle IGF-l:lle, tässä järjestyksessä. α-faasien puoliintumisajat olivat kuitenkin normaaleissa rotissa 3,5 tuntia ja 5,3 tuntia, tässä jär-10 jestyksessä, ja rotilla, joiden aivolisäke oli poistettu, 3,3 tuntia ja 3,5 tuntia, tässä järjestyksessä.
Yhteenvetona: O-glykosyloitua IGF-l:tä on verrattu autenttiseen IGF-l:een useissa eri biologisissa määrityksissä in vitro ja in vivo. Mitään merkittävää eroa ei ha-15 vaittu niiden spesifisessä aktiivisuudessa istukan resep- torimäärityksessä tai radioimmunomäärityksessä, mikä osoitti, ettei mannosyloitu aminohappo ole osallisena IGF-l:n reseptoriin sitoutumisessa eikä vasta-aineeseen sitoutuvassa kohdassa.
20 Tämä on myös ilmeistä kokeesta, joka osoittaa eri laisia vaikutuksia in vitro. Molemmat IGF-1-muodot ovat osoittaneet samanlaisia vaikutuksia (aminohappojen) mem-braanikuljetukseen maksasoluissa. Jos näihin reseptoreihin sitoutuminen olisi häiriintynyt, olisi havaittu ero kahden 25 muodon välillä.
Yksi odottamaton löydös havaittiin kuitenkin mak sasoluissa in vitro, nimittäin seikka, että O-glykosyloitu IGF-1 lisäsi glukoosin määrää elatusaineessa. Tämä vaikutus havaittiin myös lisäämällä pelkkää mannoosia. Tiede- 30 tään hyvin, että mannoosi voi joutua mukaan glukoneoge- neettiseen reittiin fruktoosi-6-fosfaattivaiheessa, kun fosfomannoisomeraasi on muuttanut sen. O-glykosyloidun IGF-1:n hieman lisääntynyt vaikutus membraanikuljetukseen voisi selittyä mahdollisuudella, että solut käyttävät man-35 noosia energiantuotossa.
11 102282
Hiljattain osoitettiin, että peptidihomologin, in-suliininkaltaisen kasvutekijä II:n (IGF-II) reseptori oli ilmeisesti yhtäläinen mannoosi-6-fosfaattireseptorin kanssa, joka on mukana kuljetuksen ohjauksessa lysosomeihin.
5 On edelleen osoitettu, että mannoosi-6-fosfaatin lisäys lisäsi kaksinkertaiseksi IGF-II:n sitoutumisen reseptoriinsa, mikä osoitti, että reseptorin modulaatiota saattaisi tapahtua.
Kahden IGF-l-muodon välinen ero sitoutumisessa suu-10 rimolekyylipainoiseen sitojaproteiiniin on hyvin tärkeä havainto. Verenkierrossa havaitaan vain hyvin pieni määrä vapaata endogeenista IGF-l:tä (< 1 %) ja peptidin enemmistö sitoutuu ainakin kahteen eri kantajaproteiiniin, suuri-molekyylipainoiseen muotoon, jota kasvuhormoni säätelee ja 15 joka puuttuu Laronin kääpiökasvuisuutta potevilta kääpi öiltä, GHDs-kasvuhormonia tuottamattomilta kääpiöiltä ja rotilta, joilta on poistettu aivolisäke, ja pienimolekyyl-ipainoiseen muotoon, joka on osittain insuliinin säätelem-ä. Tämän jäljemmän kantajaproteiinin määrä nousee diabete-20 spotilailla.
Koska on ehdotettu, että vapaa IGF-1 on vastuussa insuliinin kaltaisista vaikutuksista (esim. hypoglykemias-ta in vivo). voisi olla tärkeää lisätä vapaan IGF-1:n osuutta hyperglykemian hoitoa varten. Alustavat tutkimuk-25 set ovat osoittaneet, että IGF-1 voisi olla mahdollinen kandidaatti käyttää esim. potilailla, jotka ilmentävät insuliiniresistenssiä.
Lisäksi in vivo -kokeiden tulokset akuutin in-suliininkaltaisen vaikutuksen suhteen osoittavat myös, 30 että O-glykosyloidulla IGF-1:llä on syvällekäyvämpi vaiku tus kuin autenttisella IGF-l:llä veren glukoositason laskemisessa, kenties johtuen erosta kahden peptidin hydrofo-bisuudesta tai erosta kinetiikassa.
Alustavat farmakokineettiset tulokset osoittavat, 35 ettei O-glykosyloidulla ja autenttisella IGF-1:llä ole 12 102282 eroa kun niitä annetaan rotille, joiden aivolisäke on poistettu. Kuitenkin tulokset normaaleilla rotilla osoittavat, että IGF-1:n O-glykosyloidulla muodolla voi olla hieman lyhyempi α-faasin näkyvä puoliintumisaika. (3,5 5 tuntia verrattuna autenttisen IGF-l:n 5,3 tuntiin). Tämä voisi johtua erosta kantajaproteiineihin sitoutumisessa.
Claims (4)
1. Menetelmä O-glykosyloidun IGF-l:n valmistamiseksi, jolla on 2 tai useampi mannoosiryhmä kiinnittyneenä
5 IGF-1:n polypeptidiketjun Thr29-aminohappoon, tunnet- t u siitä, että IGF-1 ilmennetään hiivasoluissa ja eristetään O-glykosyloitu IGF-l alustasta.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hiiva on Saccharomvces cerevisiae.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA, joka koodittaa IGF-1:n, on toimivasti liitetty hiivan erityssignaalisekvenssiä koodittavaan DNA:han, niin että kypsä autenttinen IGF-1, joka on O-glykosyloitu, erittyy hiivasolujen sytoplasmas- 15 ta.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että erityssignaalisekvenssi on signaa-lisekvenssi alfa-pariutumistekijän geenille. 14 102282
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8819826 | 1988-08-20 | ||
| GB888819826A GB8819826D0 (en) | 1988-08-20 | 1988-08-20 | Glycosylated igf-1 |
| EP8900972 | 1989-08-17 | ||
| PCT/EP1989/000972 WO1990002198A1 (en) | 1988-08-20 | 1989-08-17 | O-glycosylated igf-1 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI910795A0 FI910795A0 (fi) | 1991-02-19 |
| FI102282B1 FI102282B1 (fi) | 1998-11-13 |
| FI102282B true FI102282B (fi) | 1998-11-13 |
Family
ID=10642464
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI910795A FI102282B (fi) | 1988-08-20 | 1991-02-19 | Menetelmä O-glykosyloidun IGF-1:n valmistamiseksi |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5273966A (fi) |
| EP (2) | EP0360411B1 (fi) |
| JP (1) | JP2543998B2 (fi) |
| AT (1) | ATE109206T1 (fi) |
| AU (1) | AU623675B2 (fi) |
| CA (1) | CA1335802C (fi) |
| DE (1) | DE68917061T2 (fi) |
| DK (1) | DK175360B1 (fi) |
| ES (1) | ES2060778T3 (fi) |
| FI (1) | FI102282B (fi) |
| GB (1) | GB8819826D0 (fi) |
| IE (1) | IE65096B1 (fi) |
| NO (1) | NO180636C (fi) |
| NZ (1) | NZ230383A (fi) |
| WO (1) | WO1990002198A1 (fi) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8920381D0 (en) * | 1989-09-08 | 1989-10-25 | Greater Glasgow Health Board | Treatment of insulin-resistant diabetes |
| US5612198A (en) * | 1990-09-04 | 1997-03-18 | The Salk Institute | Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells |
| US5231178A (en) * | 1991-01-16 | 1993-07-27 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Method for the purification of intact, correctly-folded insulin-like growth factor-1 |
| WO1992017595A1 (en) * | 1991-04-01 | 1992-10-15 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Genes which influence pichia proteolytic activity, and uses therefor |
| ES2097426T3 (es) * | 1992-12-02 | 1997-04-01 | Hoechst Ag | Procedimiento para la obtencion de proinsulina con puentes de cistina correctamente unidos. |
| SE9402332D0 (sv) * | 1994-07-01 | 1994-07-01 | Pharmacia Ab | Igf-1 |
| US7833513B2 (en) | 2004-12-03 | 2010-11-16 | Rhode Island Hospital | Treatment of Alzheimer's Disease |
| SI2032155T1 (sl) * | 2006-06-09 | 2015-04-30 | Novartis Ag | Stabilizirani polipeptidi inzulinu podobnega rastnega faktorja |
| EP2494050A4 (en) * | 2009-10-30 | 2013-10-30 | Merck Sharp & Dohme | FACTOR FOR STIMULATING GRANULOCYTES AND MONOCYTES PRODUCED IN GLYCOMODIFIED PICHIA PASTORIS |
| US20100172865A1 (en) * | 2010-03-18 | 2010-07-08 | Shantha Totada R | Methods of enhancing hair growth |
| US9238080B2 (en) | 2010-05-21 | 2016-01-19 | Merrimack Pharmaceuticals, Inc. | Bi-specific fusion proteins |
| CA2926173A1 (en) | 2013-10-02 | 2015-04-09 | Novartis Ag | Insulin-like growth factor mimetics for use in therapy |
| WO2017059231A1 (en) | 2015-10-02 | 2017-04-06 | Silver Creek Pharmaceuticals, Inc. | Bi-specific therapeutic proteins for tissue repair |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE95236T1 (de) * | 1983-04-25 | 1993-10-15 | Chiron Corp | Hybrid-dns-synthesis von reifen insulinaehnlichen wachstumsfaktoren. |
-
1988
- 1988-08-20 GB GB888819826A patent/GB8819826D0/en active Pending
-
1989
- 1989-08-17 AT AT89308348T patent/ATE109206T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-08-17 EP EP89308348A patent/EP0360411B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-08-17 AU AU40518/89A patent/AU623675B2/en not_active Ceased
- 1989-08-17 DE DE68917061T patent/DE68917061T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-08-17 WO PCT/EP1989/000972 patent/WO1990002198A1/en active IP Right Grant
- 1989-08-17 ES ES89308348T patent/ES2060778T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-08-17 JP JP1508585A patent/JP2543998B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1989-08-17 US US07/654,611 patent/US5273966A/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-08-17 EP EP89909182A patent/EP0429502A1/en active Pending
- 1989-08-18 IE IE265289A patent/IE65096B1/en not_active IP Right Cessation
- 1989-08-18 CA CA000608828A patent/CA1335802C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-08-22 NZ NZ230383A patent/NZ230383A/en unknown
-
1991
- 1991-02-19 NO NO910669A patent/NO180636C/no unknown
- 1991-02-19 FI FI910795A patent/FI102282B/fi not_active IP Right Cessation
- 1991-02-20 DK DK199100294A patent/DK175360B1/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0360411A1 (en) | 1990-03-28 |
| JPH05505514A (ja) | 1993-08-19 |
| GB8819826D0 (en) | 1988-09-21 |
| FI102282B1 (fi) | 1998-11-13 |
| FI910795A0 (fi) | 1991-02-19 |
| DK175360B1 (da) | 2004-09-13 |
| EP0360411B1 (en) | 1994-07-27 |
| NO180636C (no) | 1997-05-21 |
| DE68917061T2 (de) | 1994-11-17 |
| NO910669D0 (no) | 1991-02-19 |
| NO180636B (no) | 1997-02-10 |
| DK29491D0 (da) | 1991-02-20 |
| AU4051889A (en) | 1990-03-23 |
| US5273966A (en) | 1993-12-28 |
| ATE109206T1 (de) | 1994-08-15 |
| ES2060778T3 (es) | 1994-12-01 |
| CA1335802C (en) | 1995-06-06 |
| IE892652L (en) | 1990-02-20 |
| NZ230383A (en) | 1992-01-29 |
| EP0429502A1 (en) | 1991-06-05 |
| AU623675B2 (en) | 1992-05-21 |
| WO1990002198A1 (en) | 1990-03-08 |
| DE68917061D1 (de) | 1994-09-01 |
| NO910669L (no) | 1991-02-19 |
| DK29491A (da) | 1991-04-19 |
| JP2543998B2 (ja) | 1996-10-16 |
| IE65096B1 (en) | 1995-10-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI102282B (fi) | Menetelmä O-glykosyloidun IGF-1:n valmistamiseksi | |
| RUBIN et al. | Isolation and partial sequence analysis of rat basic somatomedin | |
| US6331414B1 (en) | Preparation of human IGF via recombinant DNA technology | |
| KR102213154B1 (ko) | 재조합 ｈｃｇ를 포함하는 약학 조제물 | |
| EP1935901A1 (en) | Analysis and separation of platelet-derived growth factor proteins | |
| KR100390325B1 (ko) | 높은 특이활성을 가진 에리트로포이에틴 | |
| JPH08269096A (ja) | エリスロポエチン類縁体 | |
| CN109851674B (zh) | 一种用于治疗儿童矮小症的重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白的制备纯化方法 | |
| POSNER et al. | Partial purification, characterization, and assay of a slightly acidic insulin-like peptide (ILAs) from human plasma | |
| EP1169349B1 (en) | Process for preparing gonadotropin compositions | |
| EP0227619A2 (en) | New protein and its use | |
| Combarnous et al. | Physico-chemical properties of pregnant mare serum gonadotropin | |
| EP0315118A2 (en) | DNA coding for endothelin and use thereof | |
| Strickland et al. | The common α subunit of bovine glycoprotein hormones: limited formation of native structure by the totally nonglycosylated polypeptide chain | |
| Clogston et al. | Glycosidase digestion, electrophoresis and chromatographic analysis of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor glycoforms produced in Chinese hamster ovary cells | |
| Balland et al. | Characterization of the microheterogeneities of PIXY321, a genetically engineered granulocyte‐macrophage colony‐stimulating factor/interleukin‐3 fusion protein expressed in yeast | |
| Morgan et al. | Chemistry of human chorionic gonadotropin | |
| Foster et al. | The biological significance of truncated and full-length forms of Mpl ligand | |
| Ding et al. | Expression of monomeric insulin precursor in Pichia pastoris and its conversion into monomeric B27 Lys destripeptide insulin by tryptic hydrolysis | |
| Fountoulakis | Apparent heterogeneity of recombinant interferon γ receptors produced in prokaryotic and eukaryotic expression systems | |
| WO1996001275A1 (en) | O-glycosylated authentic igf-i and truncated variants thereof, a method of preparation thereof and pharmaceutical compositions | |
| Calderón-Cacia et al. | Incomplete process of recombinant human platelet-derived growth factor produced in yeast and its effect on the biological activity |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| GB | Transfer or assigment of application |
Owner name: PHARMACIA & UPJOHN AKTIEBOLAG |
|
| HC | Name/ company changed in application |
Owner name: PHARMACIA & UPJOHN AKTIEBOLAG |
|
| MA | Patent expired |