DK175360B1

DK175360B1 - O-glycosyleret IGF-1 og farmaceutisk sammensætning indeholdende O-glycosyleret IGF-1 samt fremgangsmåder til fremstilling af begge

Info

Publication number: DK175360B1
Application number: DK199100294A
Authority: DK
Inventors: Anna Skottner-Lundin; Linda Fryklund; Paer Gellerfors
Original assignee: Pharmacia Ab
Priority date: 1988-08-20
Filing date: 1991-02-20
Publication date: 2004-09-13
Also published as: EP0360411A1; JPH05505514A; GB8819826D0; FI102282B1; FI910795A0; FI102282B; EP0360411B1; NO180636C; DE68917061T2; NO910669D0; NO180636B; DK29491D0; AU4051889A; US5273966A; ATE109206T1; ES2060778T3; CA1335802C; IE892652L; NZ230383A; EP0429502A1

Description

DK 175360 B1

Insulin-lignende vækstfaktor (IGF-1) er en 70 aminosyre enkeltkædet polypeptidfaktor, som udviser forholdsvis høj homologt med proinsulin. Den er kendt for at besidde en medierende virkning på væksthormons virkning, og også for at udvise insulin-lignende egenskaber. Når den via naturen 5 produceres af det menneskelige legeme, er den uglycosyleret.

IGF-1 besidder potentiel anvendelse som et farmaceutisk middel både ved behandling af "hypofyse dværgvækst" og også diabetes. I sidstnævnte tilfælde vil den være anvendelig enten som en erstatning for insulin eller som ίο et supplement til insulin. Selvom insulin er den traditionelle behandling af diabetes, har type-2 diabetikere udviklet resistens over for insulin, som betyder, at selvom der indgives meget høje insulindoser, kan patienterne stadig lide af hyperglykæmi. Endvidere kan for store insulindoser fører til uønskede bivirkninger, såsom nyrelidelser, obesitet og forstyrret vandbalan-15 ce.

Selvom der kan anvendes uglycosylseret IGF-1 som en erstatning eller supplement til insulin i forsøg på at løse nogle af disse problemer, har en høj del af uglycosysleret IGF-1 en tendens til at blive sekvestreret af specifikke 20 bindingsproteiner, som cirkulerer i blodstrømmen, og det er således nødvendigt at indgive forholdsvis høje IGF-1-doser for at opnå den ønskede c farmaceutiske virkning.

Det har nu vist sig, at ekspression af IGF-1 i gærceller medfører produktion 25 af en O-glycosyleret analog af IGF-1, f.eks. en analog, som bærer to mannoseenheder på Thrjg-aminosyren i polypeptidkæden, sammen med den normale uglycosylerede form. Forsøg har vist, at O-glycosyleret IGF-1 har en reduceret affinitet til bindingsproteinerne, og at der kan opnås en ønsket

I DK 175360 B1 I

I 2 I

I reduktion i blodsukkemiveauet med en reduceret dosis O-glycosyleret IGF-1 I

I i sammenligning med et normalt uglycosyleret protein. Denne observerede I

I affinitet til bindingsproteinet vil have en indgående virkning på profilen og I

I dosisafhængigheden. De andre virkninger er, selvom de ikke er så udtalte, I

I 5 betydningsfulde for den samlede kliniske virkning. I

I Udtrykket "O-glycosyleret IGF-1" omfatter O-glycosylerede molekyler, som I

I omfatter fragmenter af hele IGF-1 -polypeptidsekvensen, under den I

I forudsætning, at disse fragmenter kvalitativt udviser den væksthormon I

I io medierende virkning og/eller insulin-lignende egenskaber af IGF-1. I

I Ifølge et aspekt af opfindelsen tilvejebringes der en O-glycosyleret analog til I

I IGF-1, i hvilken to eller flere mannoseenheder er fæstnet til Thr29-aminosyren I

I i polypeptidkæden. I

I I

I I henhold til endnu et yderligere aspekt af opfindelsen tilvejebringes der en I

I fremgangsmåde til opnåelse af O-glycosyleret IGF-1 ved ekspression af IGF- I

I 1 i gærceller og isolering af O-glycosyleret IGF-1 fra mediet. Gæren er I

I fortrinsvis Saccharomvces cerevisiae. I

I 20 I

I IGF-1-genet er fortrinsvis bundet til DNA, som koder for en sekretorisk I

I signalsekvens, f.eks. den til genet for α-parrende faktor, således at modent I

I autentisk IGF-1, som er blevet O-glycosyleret, secerneres fra gærcellernes I

cytoplasma. I

1 25 I

I Den α-parrende faktor er et peptid på 13 aminosyrer, som secerneres af I

I gærceller af a-parringstypen til fremmelse af effektiv konjugation af en celle I

I til dannelse af α-diploide celler. Sekvensdata for strukturgenet for α- I

DK 175360 B1 3 parringsfaktoren viser, at α-parringsfaktoren indledningsvis syntetiseres som et forstadie på 165 aminosyrer indeholdende et lederpeptid på 85 aminosyrer og fire kodende områder, som hver især er adskilt af et spacer-peptid på otte aminosyrer. Lederpolypeptidet på 85 aminosyrer indeholder 5 en signalsekvens på 19 aminosyrer, som er involveret i målretning af forstadiet til den endoplasmatiske membran.

Der tilvejebringes endvidere en farmaceutisk sammensætning indeholdende O-glycosyleret IGF-1, men i alt væsentligt intet uglycosyleret IGF-1, samt en ίο farmaceutisk acceptabel bærer, fortyndingsmiddel eller ekscipiens. Sammensætningen kan også omfatte insulin.

Ifølge en anden egenskab ved opfindelsen tilvejebringes der er fremgangsmåde til fremstilling af en farmaceutisk sammensætning 15 omfattende mere end ca. 50 % O-glycosyleret IGF-1 og som omfatter en blanding af O-glycosyleret IGF-1 og uglycosyleret IGF-1.

Det plasmid, som anvendes til at udtrykke IGF-1 i gær, kan være p539/12, hvis konstruktion er beskrevet i nedenstående eksempel. Andre 20 gærekspressionsplasmider kan også være egnede.

I det følgende beskrives der kun som eksemplificering en fremgangsmåde til konstruktion af et plasmid, som bærer genet for IGF-1, transformation af Saccharomyces cerevisiae med plasmidet og ekspression af modent human-25 O-glycosyleret IGF-1 fra transformerede gærceller under henvisning til de tilhørende tegninger, hvor figur 1 viser konstruktion af IGF-1 ekspressionsplasmid p539/12, I DK 175360 B1

I I

figur 1 a viser et restriktionskort over plasmid p539/12, I

I figur 2 viser polypeptidstrukturen af fusionen mellem α -parringsfaktorens I

I 5 ledersekvens og IGF-1, I

I figur 3 viser adskillelse af to IGF-1 -former ved HI-HPLC, I

figur 4 viser strukturen af IGF-1, hvor de tryptiske fragmenter er adskilt ved I

I io tværgående linier, I

I figur 5 viser et tryptisk kort, som viser begge IGF-1 -former, og I

I figur 6 viser strukturen af de to mannoseenheder, som er bundet til Thr^ i I

I 15 den O-glycosylerede form af IGF-1. I

I Eksempel I

I IGF-1-genet blev udtrykt i Saccharomyces cerevisiae under anvendelse af et I

I 20 α-parringsfaktor lederpeptid-IGF-1 ekspressionsplasmid, p539/12. I

I Plasmid og gærmutantstamme I

I Plasmid p539/12 blev konstrueret af dr. J.F. Ernst hos Biogen S.A. Ch-1227, I

I 25 Geneve, Schweitz. Den blev konstueret som følger. Plasmid pJDB219/G I

I blev konstrueret ud fra JDB219 (Beggs, J.D., i:A. Benson Symposium 16. I

I redaktører: D. von Wettstein, J. Fries, M. Kielland-Brand & A. Stenderup, I

I Munksgaard, København, 383-389, 1981) ved at indføje et 1,7 kb Sall- I

. --i^zssm^^ss^mmms-^mi..·.sr?a,"^:.^.-^~~~· ·" ~ ~ '?. "'Γ-:_ τβ^μβτμγ •^ν,τ"" - '^;W

DK 175360 Β1 5 fragment, som bærer APH-genet Tn903 (Emst J.F. og R.C. Chan, J.

Bacteriol. 163. 8-14, 1985) i det enkle Sall-1-sted på JDB219 (prikket boks i figur 1). SMC-ekspressionsenheden fra plasmid p364/1, som omfatter ACT-promotoren, MF α 1-ledersekvensen og SMC-genet, blev overført som et 1,1 5 kb Bqlll-BamHI-fragment til det enkle BamHI-sted i pJDB219/G. Det resulterede plasmid p510/14 blev gjort lineært ved delvis fordøjelse med Hindlll og et 1,1 kb Hindi Il-fragment som bærer URA3-gærgenet. som er afledt fra Ylp30 (Botstein, D. et al., Gene 8, 17-24, 1979), og blev indsat i p510/14 til frembringelse af p539/12, som bærer markørerne KanR G418R 10 Ura3+ Leu2+. En skitse af de genetiske elementer er vist i figur 1a. Produktionen af IGF-1 blev udført i Saccharomyces cerevisiae mutantstamme YE 449 (Mat a leu 2, ura 3-52, prbl-1122, pep 4-3, cir 4°).

Plasmidet er en forbedret udgave af andre IGF-1 ekspressionsplasmider, 15 som tidligere er beskrevet (Ernst J.F. (1986) DNA 5, 483-491). Den totale aminosyresekvens (155 aminosyrer) for α -parringsfaktorlederpeptid-IGF-1 hybrindproteinet er vist i figur 2. α -Parringsfaktorlederpeptidet udgør de første 85 enheder og IGF-1 de resterende 70 enheder. Der er flere mulige O-forbundne glycosyleringssteder til stede i IGF-1 sekvensen. Disse er angivet.

20 Det nyligt syntetiserede 155 aminosyrer lange α -parringsfaktorlederpeptid-IGF-1 hybridprotein blev secerneret ud fra cellen til mediet. Under denne proces blev hybridproteinet spaltet med en endogen gærpeptidase (KEX2) frembringende det autentiske IGF-1-molekyle med dens korrekte N-terminale aminosyrer (Gly). Udover den autentiske form for human IGF-1 blev der også 25 syntetiseret og secerneret en ny analog til human IGF-1.

Gærfermenteringsmediet indeholdt ca. 50% autentisk human IGF-1 og 50% af analogen. Disse to IGF-1-former blev isoleret fra mediet under anvendelse

I DK 175360 B1 I

I 6 I

I af traditionelle biokemiske adskillelsesmetoder. Den endelige adskillelse af I

I IGF-1-analogen fra autentisk human IGF-1 blev opnået ved hydrofob I

I interaktionskromatografi (HI-HPLC) under anvendelse af en TSK-phenyl- I

I 5PW matrix (figur 3). IGF-1 -analogen eluerede tidligere en autentisk IGF-1, I

I 5 hvilket antyder, at den er lidt mere hydrofil. I

I Det viste sig ved natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektroforese (S DS- I

I PAGE), at autentisk IGF-1 havde en lidt lavere molekylvægt end analogen, I

og de højere molekylvægte (ca. 400 dalton), som analogen udviser, antyder, I

I ίο at denne form har molekyler bundet til polypeptidkæden, højst sandsynligt I

I kulhydrater tilføjet under secemeringsprocessen. I

Aminosyresammensætningen af IGF-1-analogen blev bestemt og viste sig at I

I være identisk med den af det autentiske molekyle. Den lidt mere hydrofile I

I 15 egenskab af IGF-1-analogen, som det vises ved HI-HPLC-forsøget, skyldes I

I således ikke en ændring i polypeptidrygraden, men snarere nogle andre I

I strukturelle modifikationer. I

Gærceller er kendt for at indeholde glycoproteiner og muligheden for at ny I

I 20 analog var en glycosyleret af IGF-1 blev undersøgt. I

I ConA er blevet udbredt anvendt ved undersøgelse af glycoproteiner på I

I grund af dens høje affinitet over for oligosaccharidkæder indeholdende tre I

I eller flere mannoseenheder. Dens kulhydratspecifisitet er blevet bestemt (α - I

I 25 D-Man > a -D-Glc > <x DGIcNAc). I

I ConA-blotting blev udført efter natriumdodecylsulfatpolyacrylamid- I

I gelelektroforese (SDS-PAGE) af IGF-1-analogen og autentisk human IGF-1 I

.......'·"- - _ - -ΜΗ»'-.-"’·«·«: ^¾¾.^¾¾¾ DK 175360 B1 7 (figur 4). ConA-binding blev observeret til IGF-1-analogen, men ikke til den autentiske form, hvilket antyder, at denne er et glycoprotein.

Den kulhydratenhed, som er bundet til IGF-1 -polypeptidbaggrunden, blev 5 identificeret ved gaskromatografi/massespektrometri (GC/MC) efter alkalihydrolyse (4M TFA, 120 °C, 15') og efterfølgende reduktion (NaBH) og acetylering. En top (7,7 minutter) blev fundet efter gaskromatografi, når IGF- 1-analogen blev analyseret. Der blev ikke observeret en sådan top, når autentisk IGF-1 blev analyseret (ikke vist). Det materiale, som elueredes ved ίο 7,7 minutter blev yderligere underkastet massespektrometrianalyse. Der blev fundet et massespektrum, som var identisk til et mannosereference-massespektrum, hvilket entydigt viser, at IGF-1-analogen indeholder mannose. Kvantificering af mannoseindholdet ved gaskromatografi mod en kalibreret mannosestandard viste, at mannoseindholdet var ca. 2,1 % 15 (vægt/vægt). Der blev ikke fundet mannose eller andre kulhydrater i den autentiske IGF-1-form.

Tryptisk kortanalyse 20 GIcNAc (N-acetylglucosamin) har altid vist sig at være den første kulhydratenhed i N-forbundet glycosylering. Idet der ikke blev fundet GIcNAc i IGF-1-analogen, må glycosyleringen være af den O-bundne type, som kun kan forekomme til serin- eller treoninenheder. IGF-1 indeholder 5 serinenheder (Ser^, Ser·*, Ser51 og Ser69), og 3 treoninenheder (Thr4, Thr^ 25 og Thr41) (jvf. figur 2).

For at identificere den glycosylerede serin- eller treoninenhed (enheder) blev IGF-1-analogen fordøjet med trypsin (polypeptidkæden spaltes efter Arg- og I DK 175360 B1 I 8

Lys-enheder) for at frembringe kortere tryptiske fragmenter. Disse blev I

efterfølgende adskilt ved RP-HPLC og deres mobilitet blev sammenlignet I

I med deres tilsvarende moddele frembragt ved trypsinfordøjelse af autentisk I

I IGF-1. Enhver ændring i mobilitet i forhold til standarden (autentisk IGF-1) I 5 ville afsløre det glycosylrede tryptiske fragment.

I Figur 4 viser det tryptiske kort af autentisk IGF-1. Tretten unikke fragmenter I blev fraskilt, hvor de forskellige fragmenter er vist ved tværgående linier.

Identiteten af disse fragmenter blev bestemt ved aminosyreanalyse. Disse I io fragmenter passer til de syv tryptiske spaltningssteder (Arg, Lys) i IGF-1 I samt de tre chymotryptin-lignende spaltninger, som også er forekommet. Når det tryptiske fragment af IGF-1-analogen blev sammenlignet med autentisk human IGF-1, blev der observeret en svag forskel i elueringstid for tryptiske I fragmenter 22-36 (figur 5). Der kunne ikke påvises andre forskelle. Dette 15 viser tydeligt, at mannosyleringsstedet ligger inden for de tryptiske fragmenter 22-36. Baseret på sekvensen (-Gly-Phe-Tyr-Phe-Asn-Lys-Pro-

Thr-Gly-Tyr-Ser-Ser-Ser-Arg-) er der fire mulige O-forbundne I glycosyleringssteder til stede, f.eks. Thr^, Ser33 Ser^, Ser^.

I 20 De tryptiske fragmenter 22-36 blev isoleret fra IGF-1-analogen såvel som fra I autentisk IGF-1. Disse fragmenter blev analyseret ved I proteinsekvensanalyse. Thr, som er til stede i de tryptiske fragmenter fra I IGF-1-analogen, var den eneste aminosyrer, som migrerede unormalt, I hvilket viser, at den er blevet modificeret. Der blev ikke fundet nogen andre I 25 forskelle i hele sekvensen 22-36 mellem de to tryptiske fragmenter. Der blev I ikke observeret modifikationer i de tre på hinanden følgende serinenheder ' I Ser^, Ser34 eller Ser35, hvilket viser, at disse ikke er blevet glycosyleret.

I Resultaterne viser således utvetydigt, at Th^ i IGF-1-analogen er den 9 DK 175360 B1 eneste aminosyre, som binder mannose. Ingen andre serin- eller treoninen-heder er blevet O-glycosylerede.

For at fastlægge nøjagtigheden af antallet af mannoseenheder bundet til 5 Thr29 blev det tryptiske fragment 22-36 isoleret fra IGF-1-analogen ved masssespektrometri. Dette viste en molekylvægtsforskel mellem det mannosylerede og ikke-mannosylerede fragment på 324. Når det antages, at en molekylvægt for peptidbundet mannose på 162, kan der beregnes en støkiometri på 2 mannoseenheder pr. tryptisk fragment. Følgelig indeholder ίο hvert IGF-1-molekyle to mannoseenheder bundet til Thr^. Strukturen af de to mannoseenheder, som er bundet til Thr^ i IGF-1-analogmolekylet blev bestemt ved H-NMR-spektroskopi og er vist på figur 15.

Biologisk aktivitet 15

Det fremgik tydeligt efter inkubering med radioaktivt mærkede former af IGF-1, at den O-glycosylerede IGF-1 bandt mindre godt til det højmolekylvægtige bindingsprotein (150. K) i både normal humanserum og normal rotteserum, men der blev ikke observeret forskelle i serumprofiler, når der blev anvendt 20 serum fra hypofysektomiserede rotter. Arealet under kurverne for toppe for høje og lave molekylvægte antyder, at kun mellem 50 og 60 % af det O-glycosylerede IGF-1 var bundet til formen med den høje molekylvægt i forhold til autentisk IGF-1. Der blev observeret en lille øgning i binding til formen med lav molekylvægt, men øgningen var ikke stor nok til at forklare 25 ændringen i forhold mellem binding til høje henholdsvis lave bærere.

I nyligt fremstillede rottehepatocyter havde de to IGF-1-former en dosisafhængig virkning på transporten ind i cellerne af ikke-metaboliserbar I DK 175360 B1 I 10

I aminosyre α -AIB. Resultaterne antyder, at den glycosylerede form var lidt I

I mere effektiv ved den anvendte høje koncentration {1 mol/l) end det I

autentiske IGF-1. Resultaterne på gluconeogenese i hepatocyter efter I

inkubation med enhver af IGF-1'eme eller insulin viste, at der ikke blev I

I s observeret nogen virkning, når insulin eller autentisk IGF-1 blev tilsat, hvilket I

er hvad der kan forventes. Ved tilsætning af det O-glycosylerede IGF-1 blev I

H der imidlertid observeret en uventet øgning i mængden af glycose, som I

H findes i mediet. Denne virkning synes at skyldes den mannose, der er I

H bundet til IGF-1, idet tilsætning af den ækvivalente mannosekoncentration I

ίο alene resulterede i samme virkning. Virkningerne var lidt lavere end den, I

som observeres med glucagon. I

En akut insulin-lignende aktivitet bestemt som hypoglykæmi induceret i I

I hypofysektomiserede rotter kunne vises for både O-glycosyleret og autentisk I

15 IGF-1. En dosis på 10 pg/rotte inducerede en udtalt hypoglykæmi med I

I begge peptider. Lavpunktet blev observeret ved 30-45 minutter, og I

I glucoseniveaueme var returneret til det oprindelige efter ca. 2 timer. O- I

I glycosyleret IGF-1's virkning var lidt større end den af det autentiske IGF-1 I

I ved tilsvarende doser, hvor det maksimale fald i blodglueose var -27 % ved I

I 20 45 minutter for den O-glycosylerede form i sammenligning med -14,4 % ved I

I 30 minutter for autentisk IGF-1. I

I Resultaterne for in vivo membrantransport viste, at den maksimale virkning I

I blev nået efter ca. 2 timer, hvor der blev observeret et plateau. Der blev ikke I

25 observeret nogen væsentlig forskel mellem peptiderne, selvom der var en I

I tendens til, at det O-glycosylerede IGF-1 var lidt mere effektivt. I

^r? ·- — ίη-'ΒΤΐ,-ΤΤ.- . . · ·: a——<r~ i ' DK 175360 B1 11

Indledningsvise beregninger af halveringstiden (Ty2) for det O-glycosylerede (mannosylerede) og autentiske IGF-1 blev udført. Dette resulterede i Ty2 for α -fasen på tre minutter henholdsvis fire minutter i normale rotter, hvorimod halveringstiden for α -fasen i hypofysektomiserede rotter var lidt længere, det 5 vil sige otte henholdsvis elleve minutter for O-glycosyleret og autentisk IGF- 1. Halveringstiden for α -faserne var i normale rotter imidlertid 3,5 timer henholdsvis 5,3 timer og i hypofysektomiserede rotter 3,3 timer henholdsvis 3,5 timer.

ίο Sammenfattet er det O-glycosylerede IGF-1 blev sammenlignet med det autentiske IGF-1 i flere forskellige biologiske analyser in vitro og in vivo. Der blev ikke observeret nogen væsentlig forskel med hensyn til deres specifikke aktivitet ifølge placentalreceptoranalyse eller radioimmunoanalyse, hvilket antyder, at den mannosylerede aminosyre ikke er involveret i binding til 15 hverken IGF-1-receptoren eller stedbindingen til antistoffet.

Dette fremgår også af forsøg, som viser forskellige virkninger in vitro. Begge IGF-1-former udviste tilsvarende virkninger på membrantransport (aminosyrer) i hepatocyter. Hvis binding til disse receptorer var blevet 20 forstyrret, var der blevet observeret en forskel mellem de to former.

En uventet opdagelse blev imidlertid observeret in vitro i hepatocyter, nemlig det faktum, at O-glycosyleret IGF-1 øgede glucosemængden i mediet.

Denne virkning blev også vist ved tilsætning af mannose alene. Det er 25 velkendt, at mannose kan indgå i den gluconeogenetiske reaktionsvej i trinnet med fruktose-6-phosphat efter omdannelse med phosphoman-noisomerase. Den svagt øgede aktivitet af O-glycosyleret IGF-1 på I DK 175360 B1 I 12

I membrantransport kan forklares ved den mulighed, at cellerne anvender I

I mannose til frembringelse af energi. I

I Det blev nyligt vist, at receptoren for en peptidhomolog insulin-lignende I

5 vækstfaktor II (IGF-II) tilsyneladende svarede til mannose-6-phosphat- I

receptoren, som er involveret i lysosomalmålmærkning. Det er yderligere blevet vist, at tilsætning af mannose-6-phosphat øgede binding af IGF-II til I dens receptor to gange, hvilket antyder, at der kan forekomme modulering af I receptoren.

I 10 H Forskellen i binding til bindingsproteinet med høj molekylvægt mellem de to IGF-1 -former er en meget vigtig opdagelse. I kredsløbet findes der kun en I meget lille mængde af frit endogent IGF-1 (<1 %) og hovedparten af peptidet er bundet til mindst to forskellige bæreproteiner, en høj molekylær form, som 15 reguleres af væksthormon og mangler i Laron-dværge, I væksthormondeficiente (GHD) dværge og hypofysektomiserede rotter, og en form med lille molekylvægt, som delvis reguleres af insulin. Mængden af sidstnævnte bæreprotein øges i diabetiske patienter.

I 20 Siden det er blevet foreslået, at det frie IGF-1 er ansvarlig for de insulin- lignende virkninger (f.eks. hypoglykæmi in vivo) kan det være vigtigt at øge den frie fraktion af IGF-1 til behandling af hyperglykæmi. Indledningsvise I undersøgelser antyder, at IGF-1 vil være en mulig kandidat til anvendelse, f.eks. til patienter, som udviser insulinresistens.

I 25 I Resultaterne fra in vivo undersøgelsen angående akut insulin-lignende I aktivitet antyder endvidere også, at det O-glycosylerede IGF-1 besidder en I mere udtalt virkning end autentisk IGF-1 med hensyn til sænkning af ---“—----_;__. ^ ·· .»ane -«--hm DK 175360 B1 13 blodglucoseniveauet, muligvis på gaind af forskelle i hyd rof o bie it et for de to peptider eller på grund af en forskel i kinetik.

Indledningsvise undersøgelser af farmakokinetik antyder, at der ikke er 5 nogen forskel mellem det O-glycosylerede og det autentiske IGF-1, når de gives til hypofysektomiserede rotter. Resultaterne i normale rotter antyder imidlertid, at den O-glycosylerede form af IGF-1 kan have en lidt kortere tilsyneladende halveringstid for α -fasen (3,5 timer i sammenligning med 5,3 timer for autentisk IGF-1). Dette kan skyldes en forskel i binding til ίο bæreproteineme.

Claims

2. Fremgangsmåde til opnåelse af O-glycosyleret IGF-, ifølge krav 1, ken- detegnetved, at IGF-1 udtrykkes i gærceller, og at O-glycosyleret IGF- I 1 isoleres fra mediet. io 3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at gæren er Saccharomyces cerevisiae.
4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at DNA, som I koder for IGF-1, på operativ måde er forbundet til DNA, som koder for en H 15 secernerende gærsignalsekvens, således at moden autentisk IGF-1, som er I blevet O-glycosyleret, secerneres fra cytoplasmaet i gærcellen.
5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at den I sekretoriske signalsekvens er signalsekvensen til genet for α -paringsfaktor.
6. Farmaceutisk sammensætning, kendetegnet ved, at den indeholder O-glycosyleret IGF-1 ifølge krav 1, men i alt væsentligt intet uglycosyleret IGF-1 og en farmaceutisk acceptabel bærer, for- I tyndingsmiddel eller ekscipiens.
7. Farmaceutisk sammensætning ifølge krav 6, kendetegnet ved, at I den også omfatter insulin. DK 175360 B1 I
8. Fremgangsmåde til fremstilling af en farmaceutisk sammensætning I omfattende mere end ca. 50 % af O-glycosyleret IGF-1 ifølge krav 1, som I omfatter at O-glycosyleret IGF-1 og uglycosyleret IGF-1 blandes. I