JP2543998B2 - Ｏ―グリコシル化ｉｇｆ―１ - Google Patents

Ｏ―グリコシル化ｉｇｆ―１

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Description

【発明の詳細な説明】 インシュリン様成長因子（IGF−１）は70個のアミノ
酸単鎖ポリペプチド鎖因子であり、プロインシュリンと
比較的高い相同関係を示す。成長ホルモンの働きに間接
的な影響を与え、またインシュリン様の性質を示すこと
が知られている。人体で自然に生成する場合にはグリコ
シル化していない。
IGF−１は製薬剤として下垂体性小人症と共に糖尿病
の治療に用いることが可能である。後者の治療の場合、
インシュリンの代わりに或いはインシュリンに添加して
も使用される。インシュリンは糖尿病に対する伝統的な
治療であるが、タイプ２の糖尿病患者はインシュリンに
耐性を示し、これはインシュリンを大量に投与しても患
者はまだ高血糖症に病むことを意味する。さらに、イン
シュリンを過剰に投与すると、腎臓病、肥満症、水調節
障害等の望ましくない副作用を生ずる。
これらの問題の若干を解決するためにグリコシル化し
ていないIGF−１をインシュリンの代わりに或いは添加
剤として試用できるが、グリコシル化していないIGF−
１の割合が高くなると血流中を循環する蛋白質に特異的
に結合して腐骨を形成する傾向があり、IGF−１を比較
的大量に投与するには望ましい製薬上の効果が得られる
ように投与する必要がある。
酵母細胞内のIGF−１の発現は、通常のグリコシル化
していない形態と共に、IGF−１のＯ−グリコシル化類
似体、例えばポリペプチド鎖のThr29アミノ酸上の２個
のマンノース残基を運ぶ類似体を生成することになるこ
とを我々は見出した。試験によってＯ−グリコシル化IG
F−１は結合する蛋白質に対する親和性が少なく、通常
のグリコシル化していない蛋白質と比較して少ない投与
量のＯ−グリコシル化IGF−１によって、血糖値の所要
量の減少を達成することができることが判った。この結
合する蛋白質に対する観察された親和性は、大略の投与
傾向に充分な効果を与えるであろう。他の効果は未だ述
べていないが臨床効果全体においては重要である。。
「Ｏ−グリコシル化IGF−１」の表現は、全IGF−１ポ
リペプチド配列のフラグメントが質的にIGF−１の成長
ホルモン媒介効果及び／又はインシュリン様性質を示す
とすれば、これらのフラグメントからなるＯ−グリコシ
ル化分子を含む。
従って、本発明の一つは、グリコシル化していないIG
F−１を本質的に含まないＯ−グリコシル化IGF−１を提
供する。
本発明の他の一つは、ポリペプチド鎖のThr29アミノ
酸にてグリコシル化するＯ−グリコシル化IGF−１を提
供する。
さらに本発明は、グリコシル化がIGF−１のポリペプ
チド鎖の同じトレオニン残基に結合する２個又はそれ以
上のマンノース残基からなるＯ−グリコシル化IGF−１
を提供する。
さらに他の本発明は、２個又はそれ以上のマンノース
残基がポリペプチド鎖のThr29アミノ酸に結合するIGF−
１のＯ−グリコシル化類似体を提供する。
さらにまた別の本発明は、酵母細胞内のIGF−１の発
現によってＯ−グリコシル化IGF−１を得る方法、及び
媒質からＯ−グリコシル化IGF−１を単離する方法を提
供する。好ましくは、酵母はサッカロミセス・セレィヴ
ィシア（Saccharomyces cerevisiae）である。
IGF−１に対する遺伝子は好ましくは分泌シグナル配
列に対してコードするDNA、例えばα−交配因子に対す
る遺伝子のそれに結合し、その結果、Ｏ−グリコシル化
していた成熟標品IGF−１が酵母細胞の細胞質から分泌
される。
このα−交配因子は、α−二倍体細胞を形成する細胞
の有効な接合を促進するα−交配型の酵母細胞によって
分泌される13−アミノ酸ペプチドである。α−交配因子
構造遺伝子の配列データーは、α−交配因子が85アミノ
酸リーダーペプチドと、８アミノ酸スペーサーペプチド
によって各々が割り込まれた４個のコード領域とを含む
165アミノ酸前駆体として最初に合成されることを示し
ている。この85アミノ酸リーダーポリペプチドは、小胞
体膜に前駆体をターゲットする際に伴う19アミノ酸シグ
ナル配列を含む。
さらにＯ−グリコシル化IGF−１を含むが、実質的に
グリコシル化していないIGF−１を含まず、及び製薬上
許容されるキャリア、希釈剤、又は賦形剤を含有する製
薬組成物を提供する。この組成物はインシュリンを含む
こともできる。
さらに他の発明は、Ｏ−グリコシル化IGF−１及びグ
リコシル化していないIGF−１を混合してなる製薬組成
物を調整する方法を提供する。
酵母内のIGF−１の発現に使用されるプラスミドはp53
9/12であることができ、その作成は次の実施例で述べ
る。他の酵母発現プラスミドも適当である。
実施例によってのみ、IGF−１に対する遺伝子を運ぶ
プラスミドの作成方法、前記プラスミドを用いるサッカ
ロミセス・セレィヴィシア（Saccharomyces cerevisia
e）の形質転換、及び形質転換された酵母細胞からの成
人Ｏ−グリコシル化IGF−１の発現を、図面を参照しな
がら以下に詳細に述べる。
第１図は、IGF−１発現プラスミドp359/12の作成を示
す図であり； 第1a図はプラスミドp539/12の制限マップであり； 第２図はα−交配因子リーダー配列とIGF−１との間
の融合のポリペプチド構造を示す図であり： 第３図はHI−HPLCによるIGF−２の２個の型の分離を
示す図であり； 第４図は横線によって分離されたトリプシンフラグメ
ントをもつIGF−１の構造を示す図であり； 第５図はIGF−１の両方の型を示すトリプシンマップ
であり；及び 第６図はIGF−１のＯ−グリコシル化形態におけるThr
29に結合した２個のマンノース残基の構造を示す図であ
る。
実施例 IGF−１遺伝子をα−交配因子リーダーペプチド−IGF
−１発現プラスミド、p539/12を用いて、サッカロミセ
ス・セレィヴィシア（Saccharomyces cerevisiae）内に
発現させた。
プラスミド及び酵母変異体株： プラスミドp539/12はスイス国ジュネーブ、Ch−122
7、ビオジェン・エス・エイのジェイ・エフ・エルンス
ト博士によって作成された。その作成は次の通りであ
る。プラスミドpJDB219/Gを、APH遺伝子Tn903（エルン
スト・ジェイ・エフ及びアール・シー・チャン、ジャー
ナル・オブ・バクテリオロジイ、163,8−14,1985）を運
ぶ1.7Kb SallフラグメントをJDB219のシングルSall部位
（第１図の斑点部）に挿入することによって、JDB219
（ベッグス・ジェイ・デイ、ア・ベンゾン・シンポジウ
ム16、著者：デイ・ヴォン・ウェットスタイン、ジェイ
・フライス、エム・キーランドーブランド アンド エ
イ・ステンデルプ、ムンクスガード、コペンハーゲン、
383−389、1981）から構築した。ACTプロモーターを包
含するプラスミドp346/1からのSMC発現単位、MFα１リ
ーダー配列及びSMC遺伝子は、1.1kb Bg III−Bam HIフ
ラグメントとしてpJDB219/GのシングルBamHI部位にトラ
ンスファーされた。得られたプラスミドp510/14は、Hin
d IIIを用いる部分消化によって線状になり、YIp30（ボ
トスタイン・デイら、ジーン８、17−24、1979）から誘
導された酵母URA3遺伝子を運ぶ1.1kb Hind IIIフラグメ
ントをp510/14に挿入し、マーカーkanRG418RUra3＋ LE
U2＋を運ぶp539/12を生成する。その遺伝子要素の概略
を第1a図に示す。IGF−１の生成はサッカロミセス・セ
レィヴィシア（Saccharomyces cerevisiae）変異体株YE
449（Mat αleu2,ura3−52,prbl−1122,pep4−3,cir
40）内で行われた。
このプラスミドは、以前に報告（エルンスト・ジェイ
・エフ、（1986）、DNA5,483−491）された他のIGF−１
発現プラスミドを改良したものである。α−交配因子リ
ーダーペプチド−IGF−１ハイブリド蛋白質に対する全
アミノ酸配列（155アミノ酸）を第２図に示す。α−交
配因子リーダーペプチドは最初の85残基及びIGF−１か
らなり、残りは70残基である。複数の可能なＯ−結合グ
リコシル化部位はIGF−１配列内にある。これらは示し
てある。新しく合成した155アミノ酸長α−交配因子リ
ーダーペプチド−IGF−１ハイブリド蛋白質は細胞から
媒質内に分泌される。この過程の間にハイブリド蛋白質
は、標品のIGF−１分子とその修正Ｎ−末端アミノ酸（G
ly）を生じる内因性酵母ペプチダーゼ（KEX2）によって
開裂された。しかし、ヒトIGF−１の標品形態の他に、
ヒトIGF−１の新しい類似体を合成されて分泌された。
酵素発酵媒質は約50％の標品ヒトIGF−１と50％の類
似体を含んでいた。これら２種類のIGF−１は従来の生
化学的分離技術を用いて媒質から単離された。標品ヒト
IGF−１からのIGF−１類似体の最終分離は、TSK−フェ
ニル−5PWマトリックスを用いる疏水的相互作用クロマ
トグラフィー（HI−HPLC）によって行った（第３図）。
このIGF−１類似体は標品IGF−１よりも速く溶出した
が、より僅かに親水性であることを示している。
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気
泳動（SDS−PAGE）によって、標品IGF−１が類似体より
も僅かに分子量が小さいことが判った。また類似体によ
って示されたこのより高い分子量（約400）ダルトン（d
altons）は、この形態ではポリペプチド鎖に結合した分
子を有し、分泌過程の間に炭水化物が付加されたらしい
ことを示唆している。
IGF−１類似体のアミノ酸組成は標品分子のそれと同
一であることが測定され認められた。従って、IGF−１
類似体が僅かにより親水性である性質は、HI−HPLC実験
から導き出されたように、ポリペプチドバックボーンの
変化によるものではなく、むしろ他の構造上の変化によ
るものである。
酵母細胞は糖蛋白質を含んでいることが知られてお
り、新しい類似体がIGF−１のグリコシル化形態である
可能性を調べた。
ConAは、３個又はそれ以上のマンノース残基を含むオ
リゴ糖鎖に対する高い親和性によって糖蛋白質の研究に
広く使用されてきた。その炭水化物特異性は決定されて
いる（α−Ｄ−Man＞α−Ｄ−Glc＞α−ＤGlcNAc）。
CanAブロッティング（blotting）は、IGF−１類似体
と標品ヒトIGF−１のドデシル硫酸ナトリウムポリアク
リルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）の後に行われた
（第４図）。ConA結合はIGF−１類似体に観察された
が、標品形態には観察されず、これは糖蛋白質であるこ
とを示している。
IGF−１ポリペプチドバックグラウンドに結合した炭
水化物部分は、アルカリ加水分解（4M TFA、120℃、1
5′）及び続く還元（NaBH）及びアセチル化の後にガス
クロマトグラフィ、マススペクトロメトリィ（GC/MC）
によって同定した。ピーク（7.7分）はIGF−１類似体を
分析した際にガスクロマトグラフィの後に認められた。
標品IGF−１を分析した際にはこのようなピークは認め
られなかった（図には示していない）。7.7分で溶出す
る物質をさらにマススペクトロメトリィ分析にかけた。
マンノース参照マススペクトルと同一のマススペクトル
はIGF−１類似体がマンノースを含んでいることを明白
に示していることが判った。マンノース標準較正値に対
するガスクロマトグラフィによるマンノース含量の定量
は、マンノース含量が約2.1％（W/W）であることを示し
た。標品IGF−１形態にはマンノース或いは他の炭水化
物は認められなかった。
トリプシンマップ分析 GlcNAc（Ｎ−アセチルグルコサミン）は常にＮ−結合
グリコシル化の最初の炭水化物残基であることが示され
た。GlcNAcはIGF−１類似体に認められなかったのでグ
リコシル化はセリン又はトレオニン残基にのみ生じるＯ
−結合タイプのものでなければならない。IGF−１は５
個のセリン残基（Ser33;Ser34;Ser51及びSer69）及び３
個のトレオニン残基（Thr4;Thr29及びThr41）を含む
（第２図参照）。
グリコシル化セリン又はトレオニン残基を同定するた
めに、IGF−１類似体をトリプシンで消化して（ポリペ
プチド鎖はArg及びLys残基の後に分解する）、より短い
トリプシンフラグメントを生成した。次にこれらをRP−
HPLCによって分離し、それらの移動度を標品IGF−１の
トリプシン消化によって生成した対応する対照物と比較
した。標準（標品IGF−１）に関してどの移動度の変化
もグリコシル化トリプシンフラグメントを示していた。
第４図は標品IGF−１のトリプシンマップを示してい
る。13個の独特なフラグメントが分離され、異なるフラ
グメントは横線で分離して示されている。これらのフラ
グメントの同定はアミノ酸分析によって決定した。これ
らのフラグメントはIGF−１の７個のトリプシン切断点
（Arg,Lys）と、やはり起こる３個のキモトリプシン様
切断点と一致していた。IGF−１類似体のトリプシンマ
ップを標品ヒトIGF−１と比較すると、トリプシンフラ
グメント22−36に対する溶出時間に僅かな相違が認めら
れた（第５図参照）。他の相違点は認められなかった。
これは明らかにマンノシル化部位がトリプシンフラグメ
ント22−36内にあることを示している。この配列（−Gl
y−Phe−Tyr−Phe−Asn−Lys−Pro−Thr−GLy−Tyr−Se
r−Ser−Ser−Arg−）に基づいて４個の可能なＯ−結合
グリコシル化部位が存在する、例えばThr29;Ser33;Ser
34;Ser35。
トリプシンフラグメント22−36はIGF−１類似体並び
に標品IGF−１から単離された。これらのフラグメント
を蛋白質配列分析によって分析した。IGF−１類似体か
らのトリプリンフラグメントに存在するThrは、修飾さ
れたことを異常に示す移動した唯一のアミノ酸であっ
た。配列22−36全体では２個のトリプシンフラグメント
の間に他の相違は認められなかった。３個の連続したセ
リン残基Ser33;Ser34;又はSer35には変化は認められ
ず、これらがグリコシル化していないことを示してい
る。従って、これらの結果はIGF−１類似体のThr29がマ
ンノースに結合する唯一のアミノ酸であることを明白に
示していることになる。他のセリン又はトレオニンはＯ
−グリコシル化されていなかった。
Thr29に結合したマンノース残基の数を正しく決定す
るためにIGF−１類似体から単離されたトリプシンフラ
グメント22−36をマススペクトロメトリィによって分析
した。これは324のマンノシル化されたフラグメントと
マンノシル化されていないフラグメントとの間の分子量
差を示した。マンノースに結合したペプチドの分子量を
162とすると、トリプシンフラグメントにつき２個のマ
ンノース残基の値を計算できる。従って、各IGF−１分
子はThr29に結合したマンノース残基を２個含む。IGF−
１類似体内のThr29に結合した２個のマンノース残基の
構造は、Ｈ−NMRスペクトロスコピィによって決定し、
第15図に示した。
生体活性 IGF−１のラジオ標識形態を用いてインキュベートし
た後、Ｏ−グリコシル化IGF−１は通常のヒト血清と通
常のラット血清中の高い分子量結合蛋白質（150K）にあ
まり良く結合していないが、下垂体切除したラットから
の血清を使用した場合には血清プロフィルの差が得られ
ないことが明らかに示された。高分子量と低分子量のピ
ークの曲線下の領域は、50〜60％のＯ−グリコシル化IG
F−１のみが標品IGF−１に比べて大きい分子量形態に結
合していることを示した。低分子量形態に結合する際に
小さい増加が認められたが、それぞれ高いキャリアと低
いキャリアへの結合の間の割合の変化を説明するに充分
な大きさの増加はなかった。
新しく調製されたラット肝細胞では、IGF−１の２つ
の形態が新陳代謝できないアミノ酸α−AIBの細胞に移
送する際の投与量依存効果をもっていた。その結果は、
標品IGF−１よりも、高濃度使用で（1mole/）グリコ
シル化形態が僅かにより効果的であることを示してい
る。IGF−１又はインシュリンのいずれかを用いてイン
キュベートした後の肝細胞内の糖新生の結果は、インシ
ュリン又は標品IGF−１を添加した際に期待されるどん
な効果も認められないことを示した。しかし、Ｏ−グリ
コシル化IGF−１の添加によって、媒質内に見られるグ
ルコースの量に予期しない増加が認められた。この結果
は、等量濃度のマンノース単独の添加と同じ結果となる
ので、IGF−１に結合したマンノースによるものと思わ
れる。その結果はグルカゴン（glucagon）を用いて観察
したものよりも僅かに低かった。
下垂体切除したラットに生じた低血糖として測定され
た鋭敏なインシュリン様活性は、Ｏ−グリコシル化と標
品の両方のIGF−１について示すことができた。10μg/
ラットの投与量は両方のペプチドで明白な低血糖を誘発
させた。30〜45分で最下点が観察されてグルコースレベ
ルは約２時間後に初期値に戻った。Ｏ−グリコシル化IG
F−１の効果は、同じ投与量で標品IGF−１のそれよりも
僅かに大きく、血液グルコースにおける最高減少値は、
標品IGF−１では30分で−14.4％であるのに比べて、Ｏ
−グリコシル化形態では45分で−27％であった。
イン・ヴィヴォ膜輸送の結果は、約２時間後に最高の
効果に達し、安定状態が認められることを示した。ペプ
チド間の著しい差は観察されなかったが、Ｏ−グリコシ
ル化IGF−１が僅かにより効果的である傾向があった。
Ｏ−グリコシル化（マンノシル化）及び標品のIGF−
１の半減期（Ｔ1/2）の予備計算を行った。これは通常
のラットでは、それぞれα−相のＴ1/2が３分と４分と
なったが、下垂体切除したラットのα−相の半減期は僅
かに長く、即ち、Ｏ−グリコシル化と標品のIGF−１に
ついてはそれぞれ８分と11分であった。しかし、α−相
の半減期は通常のラットではそれぞれ3.5時間と5.3時間
であったが、下垂体切除したラットではそれぞれ3.3時
間と3.5時間であった。
要約すると、Ｏ−グリコシル化IGF−１がイン・ヴィ
トロとイン・ヴィヴォにおける複数の異なる生体アッセ
イにおいて標品IGF−１と比較された。胎盤リセプタア
ッセイ又はラジオイムノアッセイによる特異的活性では
顕著な差が認められず、マンノシル化アミノ酸が、IGF
−１リセプタ又は抗体に結合する部位のいずれかに対す
る結合に含まれていないことを示している。
これはまたイン・ヴィトロの異なる作用を示す実験か
らも明らかである。両方のIGF−１形態は肝細胞内の膜
輸送（アミノ酸）に同様の作用を示した。これらのリセ
プタへの結合を妨害すると、２個の形態間に差が認めら
れた。
しかし、肝細胞内のイン・ヴィトロに予期しない一つ
の発見、即ち、Ｏ−グリコシル化IGF−１が媒質内のグ
ルコースの量を増加したという事実が認められた。この
結果はまた、マンノースのみの添加によっても見出され
た。マンノースは、フォスフォマンノイソメラーゼによ
るコンバージョンの後に、フルクトース−６−燐酸のス
テップで糖新生経路に入ることができることが良く知ら
れている。膜輸送でのＯ−グリコシル化IGF−１の僅か
に増加した活性は、細胞がエネルギーを発生するためマ
ンノースを使用するという可能性によって説明できる。
最近、ペプチド類似体インシュリン様成長因子II（IG
F−II）に対するリセプタは、リソソームターゲット（l
ysosomal targeting）に含まれるマンノース−６−燐酸
リセプタに明らかに等しいことが示された。さらに、マ
ンノース−６−燐酸の添加はそのリセプタに対してIGF
−IIの結合を２倍に増加したことが示され、リセプタの
変化が生じたことを示している。
IGF−１の２個の形態の間で高分子量結合蛋白質への
結合の差は極めて重要な観察である。循環ではフリーの
内在IGF−１の極少量のみが見出され（＜１％）、ペプ
チドの大部分は少なくとも２個の異なったキャリア蛋白
質に結合しており、その一つは成長ホルモンによって制
御され、ラロン矮小体躯症、GHD成長ホルモン欠乏矮小
体躯症及び下垂体切除したラットに不足している高分子
量形態であり、もう一つは一部インシュリンによって制
御される低分子量形態である。後者のキャリア蛋白質の
量は糖尿病患者において増加する。
フリーのIGF−１がインシュリン様作用（例えば、イ
ン・ヴィヴォの低血糖症）に対して応答することを示し
たが、過血糖症の治療についてはIGF−１のフリーのフ
ラクションを増加することが重要であると思われる。予
備研究では、IGF−１が例えばインシュリン耐性を示す
患者に使用する候補として可能性があることを示した。
さらに、鋭敏なインシュリン様活性に関するイン・ヴ
ィヴォ研究からの結果でも、Ｏ−グリコシル化IGF−１
が血糖を下げる際に標品IGF−１よりも著しい効果があ
ることを示しており、恐らく２個のペプチドの疏水性の
差、又は速動性の差によるものであろう。
薬物動態学の予備結果は、下垂体切除を行ったラット
に与えた場合、Ｏ−グリコシル化及び標品のIGF−１の
間に差はないことを示している。しかし、通常のラット
の結果では、IGF−１のＯ−グリコシル化形態はα−相
の半減期が明らかに僅かに短いことを示している（標品
IGF−１の5.3時間と比較して3.5時間）。これはキャリ
ア蛋白質への結合の差によるものであろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭59−205997（ＪＰ，Ａ) Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｌｃｈｅ ｍ．，Ｖｏｌ．56，Ｐ．915−944 （1987)

Claims (8)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】２個又はそれ以上のマンノース残基がIGF
    −１のポリペプチド鎖のThr29アミノ酸に結合するＯ−
    グリコシル化IGF−１。
  2. 【請求項２】酵母細胞内のIGF−１の発現によって、２
    個又はそれ以上のマンノース残基がIGF−１のポリペプ
    チド鎖のThr29アミノ酸に結合するＯ−グリコシル化IGF
    −１を得て、媒質からＯ−グリコシル化IGF−１を単離
    する方法。
  3. 【請求項３】酵母はサッカロミセス・セレィヴィシア
    （Saccharomyces cerevisiae）である請求項２記載の方
    法。
  4. 【請求項４】IGF−１に対してコードするDNAを、酵母分
    泌シグナル配列に対してコードするDNAに結合し、その
    結果Ｏ−グリコシル化していた成熟標品IGF−１が酵母
    細胞の細胞質から分泌される請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】分泌シグナル配列がα交配因子に対する遺
    伝子のシグナル配列である請求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】２個又はそれ以上のマンノース残基がIGF
    −１のポリペプチド鎖のThr29アミノ酸に結合するＯ−
    グリコシル化IGF−１を含むが、実質的にグリコシル化
    していないIGF−１を含まず、さらに製薬上許容できる
    キャリア、希釈剤又は賦形剤を含有する血糖値減少用製
    薬組成物。
  7. 【請求項７】さらにインシュリンを含む請求項６記載の
    血糖値減少用製薬組成物。
  8. 【請求項８】２個又はそれ以上のマンノース残基がIGF
    −１のポリペプチド鎖のThr29アミノ酸に結合するＯ−
    グリコシル化IGF−１及びグリコシル化していないIGF−
    １を混合してなる血糖値減少用製薬組成物を調整する方
    法。
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