JP7483040B2 - インクレチン類似物とその調製方法及び使用 - Google Patents
インクレチン類似物とその調製方法及び使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7483040B2 JP7483040B2 JP2022561670A JP2022561670A JP7483040B2 JP 7483040 B2 JP7483040 B2 JP 7483040B2 JP 2022561670 A JP2022561670 A JP 2022561670A JP 2022561670 A JP2022561670 A JP 2022561670A JP 7483040 B2 JP7483040 B2 JP 7483040B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- incretin
- dmf
- fatty acid
- acid
- added
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- MGXWVYUBJRZYPE-YUGYIWNOSA-N incretin Chemical class C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 MGXWVYUBJRZYPE-YUGYIWNOSA-N 0.000 title claims description 64
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 31
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 61
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethylformamide Substances CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 50
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 31
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 29
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 29
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 28
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 28
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 27
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 27
- 108010088406 Glucagon-Like Peptides Proteins 0.000 claims description 26
- 150000004668 long chain fatty acids Chemical group 0.000 claims description 23
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 22
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 20
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 20
- 108010063919 Glucagon Receptors Proteins 0.000 claims description 16
- 102100040890 Glucagon receptor Human genes 0.000 claims description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 16
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 claims description 15
- 229940123993 Incretin mimetic Drugs 0.000 claims description 14
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims description 13
- 235000012631 food intake Nutrition 0.000 claims description 13
- 230000037406 food intake Effects 0.000 claims description 13
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 claims description 13
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 13
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims description 12
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims description 12
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims description 12
- 102100039997 Gastric inhibitory polypeptide receptor Human genes 0.000 claims description 11
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 11
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 11
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 11
- 208000016097 disease of metabolism Diseases 0.000 claims description 11
- 108010036598 gastric inhibitory polypeptide receptor Proteins 0.000 claims description 11
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 11
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 claims description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 10
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 208000008338 non-alcoholic fatty liver disease Diseases 0.000 claims description 10
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 claims description 10
- -1 carbon fatty acid Chemical class 0.000 claims description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 7
- 208000031226 Hyperlipidaemia Diseases 0.000 claims description 6
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 6
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 claims description 6
- JJOJFIHJIRWASH-UHFFFAOYSA-N icosanedioic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O JJOJFIHJIRWASH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- BNJOQKFENDDGSC-UHFFFAOYSA-N octadecanedioic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O BNJOQKFENDDGSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000001603 reducing effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 6
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 6
- 208000001145 Metabolic Syndrome Diseases 0.000 claims description 5
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 5
- CMWYAOXYQATXSI-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylformamide;piperidine Chemical compound CN(C)C=O.C1CCNCC1 CMWYAOXYQATXSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 206010053219 non-alcoholic steatohepatitis Diseases 0.000 claims description 5
- 208000004930 Fatty Liver Diseases 0.000 claims description 4
- 206010019708 Hepatic steatosis Diseases 0.000 claims description 4
- 101001015516 Homo sapiens Glucagon-like peptide 1 receptor Proteins 0.000 claims description 4
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 claims description 4
- 201000000690 abdominal obesity-metabolic syndrome Diseases 0.000 claims description 4
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 claims description 4
- 208000010706 fatty liver disease Diseases 0.000 claims description 4
- 231100000240 steatosis hepatitis Toxicity 0.000 claims description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 4
- LQQXBYSAGYOQJW-ZAQUEYBZSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-6-[[(4s)-4-(hexadecanoylamino)-5-[(2-methylpropan-2-yl)oxy]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CCCCNC(=O)CC[C@H](NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)C(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 LQQXBYSAGYOQJW-ZAQUEYBZSA-N 0.000 claims description 3
- JDDWRLPTKIOUOF-UHFFFAOYSA-N 9h-fluoren-9-ylmethyl n-[[4-[2-[bis(4-methylphenyl)methylamino]-2-oxoethoxy]phenyl]-(2,4-dimethoxyphenyl)methyl]carbamate Chemical compound COC1=CC(OC)=CC=C1C(C=1C=CC(OCC(=O)NC(C=2C=CC(C)=CC=2)C=2C=CC(C)=CC=2)=CC=1)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 JDDWRLPTKIOUOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 208000002705 Glucose Intolerance Diseases 0.000 claims description 3
- 238000008214 LDL Cholesterol Methods 0.000 claims description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 3
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 3
- 102000056448 human GLP1R Human genes 0.000 claims description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 3
- 201000009104 prediabetes syndrome Diseases 0.000 claims description 3
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 3
- 238000003746 solid phase reaction Methods 0.000 claims description 3
- ZPGDWQNBZYOZTI-SFHVURJKSA-N (2s)-1-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonyl)pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 ZPGDWQNBZYOZTI-SFHVURJKSA-N 0.000 claims description 2
- REITVGIIZHFVGU-IBGZPJMESA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-[(2-methylpropan-2-yl)oxy]propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](COC(C)(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 REITVGIIZHFVGU-IBGZPJMESA-N 0.000 claims description 2
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 claims description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 claims description 2
- 208000006575 hypertriglyceridemia Diseases 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 239000013585 weight reducing agent Substances 0.000 claims description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims 1
- 150000002763 monocarboxylic acids Chemical class 0.000 claims 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 57
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 34
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 33
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 27
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 24
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 22
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 21
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 18
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 17
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- YSDQQAXHVYUZIW-QCIJIYAXSA-N Liraglutide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCNC(=O)CC[C@H](NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 YSDQQAXHVYUZIW-QCIJIYAXSA-N 0.000 description 14
- 108010019598 Liraglutide Proteins 0.000 description 14
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N dichloromethane Natural products ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 13
- 229960002701 liraglutide Drugs 0.000 description 12
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 11
- 108010005794 dulaglutide Proteins 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229960005175 dulaglutide Drugs 0.000 description 9
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 9
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 9
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 9
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 9
- DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N Glucagon-like peptide 1 Chemical class C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N 0.000 description 8
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 108010086246 Glucagon-Like Peptide-1 Receptor Proteins 0.000 description 7
- 102000007446 Glucagon-Like Peptide-1 Receptor Human genes 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- 101710198884 GATA-type zinc finger protein 1 Proteins 0.000 description 6
- 102100040918 Pro-glucagon Human genes 0.000 description 6
- DLSWIYLPEUIQAV-UHFFFAOYSA-N Semaglutide Chemical compound CCC(C)C(NC(=O)C(Cc1ccccc1)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(CCCCNC(=O)COCCOCCNC(=O)COCCOCCNC(=O)CCC(NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O)C(O)=O)NC(=O)C(C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(Cc1ccc(O)cc1)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(O)=O)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(NC(=O)C(Cc1ccccc1)NC(=O)C(NC(=O)CNC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C)(C)NC(=O)C(N)Cc1cnc[nH]1)C(C)O)C(C)O)C(C)C)C(=O)NC(C)C(=O)NC(Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O DLSWIYLPEUIQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 108010060325 semaglutide Proteins 0.000 description 6
- 229940089838 Glucagon-like peptide 1 receptor agonist Drugs 0.000 description 5
- NFHFRUOZVGFOOS-UHFFFAOYSA-N Pd(PPh3)4 Substances [Pd].C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1.C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1.C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1.C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 NFHFRUOZVGFOOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 239000000859 incretin Substances 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- GNZCSGYHILBXLL-UHFFFAOYSA-N n-tert-butyl-6,7-dichloro-3-methylsulfonylquinoxalin-2-amine Chemical compound ClC1=C(Cl)C=C2N=C(S(C)(=O)=O)C(NC(C)(C)C)=NC2=C1 GNZCSGYHILBXLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229950011186 semaglutide Drugs 0.000 description 5
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 4
- 108010004460 Gastric Inhibitory Polypeptide Proteins 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 4
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 4
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 230000010030 glucose lowering effect Effects 0.000 description 4
- 238000003468 luciferase reporter gene assay Methods 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 3
- 102100039994 Gastric inhibitory polypeptide Human genes 0.000 description 3
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 description 3
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 150000002762 monocarboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 239000002417 nutraceutical Substances 0.000 description 3
- 235000021436 nutraceutical agent Nutrition 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 3
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- JFLSOKIMYBSASW-UHFFFAOYSA-N 1-chloro-2-[chloro(diphenyl)methyl]benzene Chemical compound ClC1=CC=CC=C1C(Cl)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 JFLSOKIMYBSASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WDUQJXKBWRNMKI-UHFFFAOYSA-N 18-[(2-methylpropan-2-yl)oxy]-18-oxooctadecanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WDUQJXKBWRNMKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XQPYRJIMPDBGRW-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)ethoxy]ethoxy]acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)NCCOCCOCC(=O)O)C3=CC=CC=C3C2=C1 XQPYRJIMPDBGRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JUCDAUSILDWYOA-UHFFFAOYSA-N 20-[(2-methylpropan-2-yl)oxy]-20-oxoicosanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O JUCDAUSILDWYOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000031648 Body Weight Changes Diseases 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000837845 Homo sapiens Transcription factor E3 Proteins 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YASAKCUCGLMORW-UHFFFAOYSA-N Rosiglitazone Chemical compound C=1C=CC=NC=1N(C)CCOC(C=C1)=CC=C1CC1SC(=O)NC1=O YASAKCUCGLMORW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102100028507 Transcription factor E3 Human genes 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000004579 body weight change Effects 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 235000020925 non fasting Nutrition 0.000 description 2
- 125000001312 palmitoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- HYAFETHFCAUJAY-UHFFFAOYSA-N pioglitazone Chemical compound N1=CC(CC)=CC=C1CCOC(C=C1)=CC=C1CC1C(=O)NC(=O)S1 HYAFETHFCAUJAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- XUFXOAAUWZOOIT-SXARVLRPSA-N (2R,3R,4R,5S,6R)-5-[[(2R,3R,4R,5S,6R)-5-[[(2R,3R,4S,5S,6R)-3,4-dihydroxy-6-methyl-5-[[(1S,4R,5S,6S)-4,5,6-trihydroxy-3-(hydroxymethyl)-1-cyclohex-2-enyl]amino]-2-oxanyl]oxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-2-oxanyl]oxy]-6-(hydroxymethyl)oxane-2,3,4-triol Chemical compound O([C@H]1O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O)[C@H]1O)N[C@@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)C(CO)=C1)O)C)[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O XUFXOAAUWZOOIT-SXARVLRPSA-N 0.000 description 1
- GOPWHXPXSPIIQZ-FQEVSTJZSA-N (4s)-4-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-5-[(2-methylpropan-2-yl)oxy]-5-oxopentanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)OC(C)(C)C)C3=CC=CC=C3C2=C1 GOPWHXPXSPIIQZ-FQEVSTJZSA-N 0.000 description 1
- DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 1,1-ethanedithiol Chemical compound CC(S)S DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BOVGTQGAOIONJV-BETUJISGSA-N 1-[(3ar,6as)-3,3a,4,5,6,6a-hexahydro-1h-cyclopenta[c]pyrrol-2-yl]-3-(4-methylphenyl)sulfonylurea Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)NC(=O)NN1C[C@H]2CCC[C@H]2C1 BOVGTQGAOIONJV-BETUJISGSA-N 0.000 description 1
- LLJFMFZYVVLQKT-UHFFFAOYSA-N 1-cyclohexyl-3-[4-[2-(7-methoxy-4,4-dimethyl-1,3-dioxo-2-isoquinolinyl)ethyl]phenyl]sulfonylurea Chemical compound C=1C(OC)=CC=C(C(C2=O)(C)C)C=1C(=O)N2CCC(C=C1)=CC=C1S(=O)(=O)NC(=O)NC1CCCCC1 LLJFMFZYVVLQKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 229940118148 Aldose reductase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 229940123208 Biguanide Drugs 0.000 description 1
- XNCOSPRUTUOJCJ-UHFFFAOYSA-N Biguanide Chemical compound NC(N)=NC(N)=N XNCOSPRUTUOJCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010011459 Exenatide Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 101150089905 Gcgr gene Proteins 0.000 description 1
- 101150020692 Gipr gene Proteins 0.000 description 1
- FAEKWTJYAYMJKF-QHCPKHFHSA-N GlucoNorm Chemical compound C1=C(C(O)=O)C(OCC)=CC(CC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C=2C(=CC=CC=2)N2CCCCC2)=C1 FAEKWTJYAYMJKF-QHCPKHFHSA-N 0.000 description 1
- 102000004366 Glucosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010056771 Glucosidases Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101100505047 Homo sapiens GCG gene Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- IBAQFPQHRJAVAV-ULAWRXDQSA-N Miglitol Chemical compound OCCN1C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1CO IBAQFPQHRJAVAV-ULAWRXDQSA-N 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N O-phosphoryl-L-serine Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102400000319 Oxyntomodulin Human genes 0.000 description 1
- 101800001388 Oxyntomodulin Proteins 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229940100389 Sulfonylurea Drugs 0.000 description 1
- RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N Trifluoroethanol Chemical compound OCC(F)(F)F RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- FZNCGRZWXLXZSZ-CIQUZCHMSA-N Voglibose Chemical compound OCC(CO)N[C@H]1C[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O FZNCGRZWXLXZSZ-CIQUZCHMSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 229960002632 acarbose Drugs 0.000 description 1
- XUFXOAAUWZOOIT-UHFFFAOYSA-N acarviostatin I01 Natural products OC1C(O)C(NC2C(C(O)C(O)C(CO)=C2)O)C(C)OC1OC(C(C1O)O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(O)C(O)C1O XUFXOAAUWZOOIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- 239000003288 aldose reductase inhibitor Substances 0.000 description 1
- RZJRJXONCZWCBN-UHFFFAOYSA-N alpha-octadecene Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCC RZJRJXONCZWCBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GCUCIFQCGJIRNT-UHFFFAOYSA-N alrestatin Chemical compound C1=CC(C(N(CC(=O)O)C2=O)=O)=C3C2=CC=CC3=C1 GCUCIFQCGJIRNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950010242 alrestatin Drugs 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000883 anti-obesity agent Substances 0.000 description 1
- 239000003855 balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 1
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- JUFFVKRROAPVBI-PVOYSMBESA-N chembl1210015 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO[C@]3(O[C@@H](C[C@H](O)[C@H](O)CO)[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C3)C(O)=O)O2)O)[C@@H](CO)O1)NC(C)=O)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 JUFFVKRROAPVBI-PVOYSMBESA-N 0.000 description 1
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000009693 chronic damage Effects 0.000 description 1
- YZFWTZACSRHJQD-UHFFFAOYSA-N ciglitazone Chemical compound C=1C=C(CC2C(NC(=O)S2)=O)C=CC=1OCC1(C)CCCCC1 YZFWTZACSRHJQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950009226 ciglitazone Drugs 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008094 contradictory effect Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 229950006137 dexfosfoserine Drugs 0.000 description 1
- 238000013118 diabetic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 229940127004 drugs for type 2 diabetes Drugs 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- CHNUOJQWGUIOLD-NFZZJPOKSA-N epalrestat Chemical compound C=1C=CC=CC=1\C=C(/C)\C=C1/SC(=S)N(CC(O)=O)C1=O CHNUOJQWGUIOLD-NFZZJPOKSA-N 0.000 description 1
- 229950010170 epalrestat Drugs 0.000 description 1
- CHNUOJQWGUIOLD-UHFFFAOYSA-N epalrestate Natural products C=1C=CC=CC=1C=C(C)C=C1SC(=S)N(CC(O)=O)C1=O CHNUOJQWGUIOLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 229960001519 exenatide Drugs 0.000 description 1
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004580 glibenclamide Drugs 0.000 description 1
- 229960001764 glibornuride Drugs 0.000 description 1
- RMTYNAPTNBJHQI-LLDVTBCESA-N glibornuride Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)NC(=O)N[C@H]1[C@H](C2(C)C)CC[C@@]2(C)[C@H]1O RMTYNAPTNBJHQI-LLDVTBCESA-N 0.000 description 1
- 229960000346 gliclazide Drugs 0.000 description 1
- 229960004346 glimepiride Drugs 0.000 description 1
- WIGIZIANZCJQQY-RUCARUNLSA-N glimepiride Chemical compound O=C1C(CC)=C(C)CN1C(=O)NCCC1=CC=C(S(=O)(=O)NC(=O)N[C@@H]2CC[C@@H](C)CC2)C=C1 WIGIZIANZCJQQY-RUCARUNLSA-N 0.000 description 1
- 229960001381 glipizide Drugs 0.000 description 1
- ZJJXGWJIGJFDTL-UHFFFAOYSA-N glipizide Chemical compound C1=NC(C)=CN=C1C(=O)NCCC1=CC=C(S(=O)(=O)NC(=O)NC2CCCCC2)C=C1 ZJJXGWJIGJFDTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003468 gliquidone Drugs 0.000 description 1
- ZNNLBTZKUZBEKO-UHFFFAOYSA-N glyburide Chemical compound COC1=CC=C(Cl)C=C1C(=O)NCCC1=CC=C(S(=O)(=O)NC(=O)NC2CCCCC2)C=C1 ZNNLBTZKUZBEKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003345 hyperglycaemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 102000005861 leptin receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010019813 leptin receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 238000013227 male C57BL/6J mice Methods 0.000 description 1
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229960003105 metformin Drugs 0.000 description 1
- XZWYZXLIPXDOLR-UHFFFAOYSA-N metformin Chemical compound CN(C)C(=N)NC(N)=N XZWYZXLIPXDOLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHNSRFWQBVXBSK-UHFFFAOYSA-N methanol;2,2,2-trifluoroacetic acid Chemical compound OC.OC(=O)C(F)(F)F UHNSRFWQBVXBSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001110 miglitol Drugs 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- PXZWGQLGAKCNKD-DPNMSELWSA-N molport-023-276-326 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)[C@@H](C)O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 PXZWGQLGAKCNKD-DPNMSELWSA-N 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 229960000698 nateglinide Drugs 0.000 description 1
- OELFLUMRDSZNSF-BRWVUGGUSA-N nateglinide Chemical compound C1C[C@@H](C(C)C)CC[C@@H]1C(=O)N[C@@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 OELFLUMRDSZNSF-BRWVUGGUSA-N 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940038384 octadecane Drugs 0.000 description 1
- 238000007410 oral glucose tolerance test Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229960003243 phenformin Drugs 0.000 description 1
- ICFJFFQQTFMIBG-UHFFFAOYSA-N phenformin Chemical compound NC(=N)NC(=N)NCCC1=CC=CC=C1 ICFJFFQQTFMIBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N phosphoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- USRGIUJOYOXOQJ-GBXIJSLDSA-N phosphothreonine Chemical compound OP(=O)(O)O[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O USRGIUJOYOXOQJ-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- DCWXELXMIBXGTH-UHFFFAOYSA-N phosphotyrosine Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=C(OP(O)(O)=O)C=C1 DCWXELXMIBXGTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229960005095 pioglitazone Drugs 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N preproglucagon 78-108 Chemical group C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002354 repaglinide Drugs 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 229960004586 rosiglitazone Drugs 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229940118080 saxenda Drugs 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000008247 solid mixture Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N sulfonylurea Chemical class OC(=N)N=S(=O)=O YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N thioanisole Chemical compound CSC1=CC=CC=C1 HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- LUBHDINQXIHVLS-UHFFFAOYSA-N tolrestat Chemical compound OC(=O)CN(C)C(=S)C1=CC=CC2=C(C(F)(F)F)C(OC)=CC=C21 LUBHDINQXIHVLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003069 tolrestat Drugs 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 239000013559 triple agonist Substances 0.000 description 1
- DCXXMTOCNZCJGO-UHFFFAOYSA-N tristearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC DCXXMTOCNZCJGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- GXPHKUHSUJUWKP-UHFFFAOYSA-N troglitazone Chemical compound C1CC=2C(C)=C(O)C(C)=C(C)C=2OC1(C)COC(C=C1)=CC=C1CC1SC(=O)NC1=O GXPHKUHSUJUWKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001641 troglitazone Drugs 0.000 description 1
- GXPHKUHSUJUWKP-NTKDMRAZSA-N troglitazone Natural products C([C@@]1(OC=2C(C)=C(C(=C(C)C=2CC1)O)C)C)OC(C=C1)=CC=C1C[C@H]1SC(=O)NC1=O GXPHKUHSUJUWKP-NTKDMRAZSA-N 0.000 description 1
- 229940013051 trulicity Drugs 0.000 description 1
- 229940007428 victoza Drugs 0.000 description 1
- 229960001729 voglibose Drugs 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/605—Glucagons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
- A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
- A61K47/542—Carboxylic acids, e.g. a fatty acid or an amino acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
- A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Diabetes (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Hematology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Child & Adolescent Psychology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本発明は、バイオテクノロジー分野に関し、より具体的に、本発明は、インクレチン類似物とその調製方法及び使用に関する。
高血糖は、インスリンの分泌欠陥又は生物学的作用の傷害、或いはこれら両者により引き起こされる。臨床において、一般的に、糖尿病は１型糖尿病と２型糖尿病等に分けられる。糖尿病では、長期的に高血糖症状が存在する。また、深刻な高血糖時には、特に、目、腎臓、心臓、血管、神経といった各種組織に慢性的な損傷や機能障害が生じ、人間の健康を脅かす。とりわけ、生活様式の変化や高齢化の加速に伴って、糖尿病とその合併症は人間の健康にとってますます重大な脅威となっている。
従来技術における２型糖尿病の臨床治療薬の種類には、主に、ビグアナイド系糖尿病薬（メトホルミン又はフェンホルミン）、スルホニルウレア系糖尿病薬（グリベンクラミド、グリピジド、グリクラジド、グリボルヌリド、グリメピリド又はグリキドン）、グルコシダーゼ阻害剤系薬（アカルボース、ボグリボース又はミグリトール）、インスリン感受性促進系薬（シグリタゾン、トログリタゾン、ロシグリタゾン又はピオグリタゾン）、アルドースレダクターゼ阻害剤系薬（アレスタチン（Ａｌｒｅｓｔａｔｉｎ）、エパルレスタット、ポナクレスタット（ｐｏｎａｋｒｅｓｔａｔ）又はトルレスタット）、インスリン分泌促進系薬（レパグリニド又はナテグリニド）がある。すでに多くの種類の糖尿病治療薬が開発されてはいるが、薬物の応用を制約する多くのマイナス因子も存在している。
現在上市しているタンパク質系薬のうち、２型糖尿病の治療に用いられるのは主にヒトグルカゴン様ペプチド－１受容体（ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ－１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＧＬＰ－１Ｒ）作動薬であり、例えば、リラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ、商品名：ＳＡＸＥＮＤＡ（登録商標）及びＶｉｃｔｏｚａ（登録商標））、セマグルチド（Ｓｅｍｅｇｌｕｔｉｄｅ、商品名：Ｏｚｅｍｐｉｃ（登録商標））等がある。リラグルチドは、化学的に修飾されたＧＬＰ－１類似物であり、脂肪酸（パルミチン酸）がγ－Ｇｌｕを介してＧＬＰ－１のタンパク質骨格における２６位のリシンに接続されている。脂肪酸は血清アルブミンと結合可能なため、臨床では、１日１回投薬することで、血糖低下及び体重減少という２つの適応症に用いられる。セマグルチドは、構造的に見ると、ＧＬＰ－１（７－３７）鎖上の８位のＡｉｂでＡｌａを置換し、３４位のＡｒｇでＬｙｓを置換し、２６位のＬｙｓにオクタデカン脂肪酸鎖を接続させている。リラグルチドと比べ、セマグルチドは脂肪酸鎖が長く、血清アルブミンとの親和性がより高い。よって、臨床では１週間に１回の皮下注射が行われる。
一般的に、糖尿病患者は肥満であり、体重減少によって糖尿病は著しく改善される。そのため、ＧＬＰ－１類似物にとって、体重減少は重要な指標となる。リラグルチドは肥満治療への適用が認可されているが、実際の体重減少は約５．６ｋｇにすぎない。また、臨床において、セマグルチド（０．５ｍｇ）治療群及びセマグルチド（１．０ｍｇ）治療群の平均的な体重減少は４．２ｋｇ及び５．５ｋｇとなっている。現在、肥満用薬物による体重減少は、一般的に５～１０％程度である（プラセボとの比較）。即ち、全体として、平均的な体重減少割合は患者の体重の１０％以下である（Ｒｕｄｏｌｐｈ Ｌ．Ｌｅｉｂｅｌほか，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，６４（７）：２２９９－２３０９，２０１５）。
現在、多くの製薬会社や科学研究機関が天然のインクレチン配列をベースとする多重特異性薬物を開発中であるが、今のところ、臨床において効果に優れた薬物は見られない。よ
って、当該分野では、この面での更なる研究及び開拓が必要とされている。
って、当該分野では、この面での更なる研究及び開拓が必要とされている。
本発明の目的は、インクレチン類似物とその調製方法及び使用を提供することである。
本発明は、第一の局面において、インクレチン類似物を提供する。当該インクレチン類似物は、グルカゴン様ポリペプチド、及びこれに接続される長鎖脂肪酸を含む。前記グルカゴン様ポリペプチドのアミノ酸配列は、式（Ｉ）の通りである。
ＹＳＥＧＴＦＴＳＤＸ１０ＳＫＹＬＤＳＱＡＡＱＤＦＶＱＷＬＬＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＸ４０（Ｉ）；
式（Ｉ）のうち、Ｘ１０はアミノ酸Ｋであり、Ｘ４０はＯＨ基又はＮＨ２基から選択される。
式（Ｉ）のうち、Ｘ１０はアミノ酸Ｋであり、Ｘ４０はＯＨ基又はＮＨ２基から選択される。
好ましい例において、前記長鎖脂肪酸は、１４～２０個の炭素を含む脂肪酸であり、好ましくは、１６～１８個の炭素を含む脂肪酸である。より好ましくは、前記長鎖脂肪酸は直鎖飽和モノカルボン酸であり、より好ましくは、前記長鎖脂肪酸はパルミチン酸である。
別の好ましい例において、前記長鎖脂肪酸は、前記グルカゴン様ポリペプチドのペプチド鎖のアミノ酸Ｋに接続され、好ましくは、Ｘ１０のアミノ酸に接続される。好ましくは、前記接続は架橋である。
好ましい例において、前記グルカゴン様ポリペプチドと前記長鎖脂肪酸は、アダプターを介して接続される。好ましくは、前記アダプターは、アミノ酸Ｋと反応可能であり、且つ長鎖脂肪酸の活性基と反応可能なアダプターである。
好ましい例において、前記アダプターは、少なくとも１単位（例えば、１～６単位）の－γグルタミル－（－γＧｌｕ－）を含むアダプターである。
好ましい例において、前記インクレチン類似物の構造は式（ＩＩ）の通りである。
本発明は、他の局面において、前記インクレチン類似物の、組成物の調製における使用を提供する。前記組成物は、ヒトグルカゴン様ペプチド－１受容体（ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ－１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＧＬＰ－１Ｒ）、グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド受容体（ＧＩＰＲ）及び／又はグルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）の活性化、代謝性疾患の予防、緩和又は治療、或いは、食物摂取の減少、脂肪減少、体重減少又は血糖低下に用いられる。
好ましい例において、前記食物摂取の減少、脂肪減少、体重減少又は血糖低下は、非治療目的の場合であってもよい。
好ましい例において、前記代謝性疾患には、高血糖に関連する代謝性疾患、又は高脂血症に関連する代謝性疾患が含まれる。
別の好ましい例において、前記高血糖に関連する代謝性疾患には、糖尿病、或いは糖尿病に関連するメタボリックシンドロームが含まれる。好ましくは、前記糖尿病に関連するメタボリックシンドロームには、インスリン抵抗性、耐糖能異常が含まれる。
別の好ましい例において、前記高脂血症に関連する代謝性疾患には、肥満、高脂血症、脂肪肝、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、低ＨＤＬコレステロール、高ＬＤＬコレステロールが含まれる。好ましくは、前記脂肪肝には、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）が含まれ、より好ましくは、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）が含まれる。
本発明は、他の局面において、上述したインクレチン類似物及びベクターを含む組成物を提供する。前記ベクターは、薬学的、食品学的又は栄養補助食品学的に許容可能なベクターである。
好ましい例において、前記インクレチン類似物は有効量とする。
別の好ましい例において、前記組成物には、薬物組成物、食物組成物又は栄養補助食品組成物等が含まれるが、これらに限らない。
本発明は、他の局面において、請求項１で記載するインクレチン類似物を調製するためのグルカゴン様ポリペプチドを提供する。当該グルカゴン様ポリペプチドのアミノ酸配列は、式（Ｉ）の通りである。
ＹＳＥＧＴＦＴＳＤＸ１０ＳＫＹＬＤＳＱＡＡＱＤＦＶＱＷＬＬＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＸ４０（Ｉ）；
式（Ｉ）のうち、Ｘ１０はアミノ酸Ｋであり、Ｘ４０はＯＨ基又はＮＨ２基から選択される。
式（Ｉ）のうち、Ｘ１０はアミノ酸Ｋであり、Ｘ４０はＯＨ基又はＮＨ２基から選択される。
本発明は、他の局面において、前記グルカゴン様ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び／又は、前記ポリヌクレオチドを含む組換え細胞を提供する。
本発明は、他の局面において、前記インクレチン類似物を調製する方法を提供する。当該方法は、前記グルカゴン様ポリペプチドと長鎖脂肪酸を接続することを含む。
本発明は、他の局面において、非治療的に食物摂取の減少、脂肪減少、体重減少又は血糖低下を行う方法を提供する。当該方法は、食物摂取の減少、脂肪減少、体重減少又は血糖低下を要する被検者に対し、前記インクレチン類似物又は前記組成物を与えることを含む。
本発明は、他の局面において、前記インクレチン類似物、又は、前記組成物を含む薬剤キットを提供する。
本発明のその他の局面については、本文中の開示内容から当業者にとって自明である。
従来技術におけるインクレチン系薬には依然としていくつかの欠点が存在することに鑑みて、本発明の発明者は、更なる研究を元に、ＧＬＰ－１Ｒ／ＧＩＰＲ／ＧＣＧＲアゴニスト活性を兼ね備えるトリプルアゴニストであり、血糖低下、脂肪減少及び体重減少における効果が顕著なインクレチン類似物を提供する。本発明は、更に、その調製方法及び使用を提供する。
インクレチン類似物及びその調製
本発明は、グルカゴン様ポリペプチド、及びこれに接続される長鎖脂肪酸を含むインクレチン類似物を提供する。
本発明は、グルカゴン様ポリペプチド、及びこれに接続される長鎖脂肪酸を含むインクレチン類似物を提供する。
前記インクレチン類似物を構築するためのグルカゴン様ポリペプチドの配列は次の通りである（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）。
ＹＳＥＧＴ ＦＴＳＤＸ１０ＳＫＹＬＤ ＳＱＡＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＬＡＧＧ ＰＳＳＧＡ ＰＰＰＳＸ４０（Ｉ）
そのうち、Ｘ１０＝Ｋ、Ｘ４０はＯＨ又はＮＨ２である。
そのうち、Ｘ１０＝Ｋ、Ｘ４０はＯＨ又はＮＨ２である。
本発明のグルカゴン様ポリペプチドは、組換えポリペプチド、合成ポリペプチドとすることができる。当該グルカゴン様ポリペプチドは、化学的に合成した産生物としてもよいし、組換え技術によって、原核又は真核宿主（例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫及び哺乳動物の細胞）から生成してもよい。
本発明は、更に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるグルカゴン様ポリペプチドの断片、誘導体及び類似物を含む。本文中で使用する「断片」、「誘導体」及び「類似物」との用語は、当該グルカゴン様ポリペプチドと同様の生物学的機能又は活性を基本的に維持するポリペプチドのことである。前記ポリペプチドの断片、誘導体又は類似物は、以下とすることができる。
（ｉ）１又は複数（例えば、１～５個、１～３個又は１～２個）の保守的又は非保守的なアミノ酸残基（好ましくは、保守的なアミノ酸残基）が置換されたポリペプチド。このような置換されるアミノ酸残基は、遺伝暗号でコードされていてもよいし、コードされていなくてもよい。
或いは、（ｉｉ）１又は複数（例えば、１～５個、１～３個又は１～２個）のアミノ酸残基に置換基を有するポリペプチド。
或いは、（ｉｉｉ）追加のアミノ酸配列をそのポリペプチド配列に融合して形成されるポリペプチド（例えば、リーダー配列、又は分泌配列、又は、そのポリペプチドを精製するための配列、又は前駆タンパク質配列、又は融合タンパク質）。
本文中の定義に基づき、これらの断片、誘導体及び類似物は、当業者にとって公知の範囲に属する。
（ｉ）１又は複数（例えば、１～５個、１～３個又は１～２個）の保守的又は非保守的なアミノ酸残基（好ましくは、保守的なアミノ酸残基）が置換されたポリペプチド。このような置換されるアミノ酸残基は、遺伝暗号でコードされていてもよいし、コードされていなくてもよい。
或いは、（ｉｉ）１又は複数（例えば、１～５個、１～３個又は１～２個）のアミノ酸残基に置換基を有するポリペプチド。
或いは、（ｉｉｉ）追加のアミノ酸配列をそのポリペプチド配列に融合して形成されるポリペプチド（例えば、リーダー配列、又は分泌配列、又は、そのポリペプチドを精製するための配列、又は前駆タンパク質配列、又は融合タンパク質）。
本文中の定義に基づき、これらの断片、誘導体及び類似物は、当業者にとって公知の範囲に属する。
本発明では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるグルカゴン様ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７５％（好ましくは、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％）の配列同一性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有し、且つ当該グルカゴン様ポリペプチドの機能を有するポリペプチドも含む。
本発明では、ポリペプチドの安定性、半減期、促進効果を向上させるために、１又はいくつかのアミノ酸を修飾して構成される修飾形式のポリペプチド（通常は一次構造を変えない）も含む。修飾には、インビボ又はインビトロにおけるポリペプチドの化学的誘導形式（例えば、アセチル化又はカルボキシル化）が含まれる。また、修飾には、更にグリコシル化が含まれる。修飾形式には、更に、リン酸化アミノ酸残基（例えば、リン酸化チロシン、ホスホセリン、ホスホトレオニン）を有する配列が含まれる。更に、修飾により、耐加水分解性が向上するか、溶解性が最適化されたポリペプチドを含む。
本発明は、更に、本発明におけるグルカゴン様ポリペプチド又はその保守的変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ形式であってもよいし、ＲＮＡ形式であってもよい。ＤＮＡは、コード鎖であってもよいし、非コード鎖であってもよい。即ち、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであってもよいし、追加のコード配列及び／又は非コード配列を含むポリヌクレオチドであってもよい。
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び、前記発現ベクター又はグルカゴン様ポリペプチドのコード配列を用いて遺伝子工学で生成される宿主細胞、及び、組換え技術によって前記ポリペプチドを生成する方法にも関する。
本発明は、更に、本発明における上記のインクレチン類似物を調製するための前記グルカゴン様ポリペプチドの応用を提供する。
前記インクレチン類似物を構築するための長鎖脂肪酸は、１４～２０個の炭素を含む脂肪
酸であり、好ましくは、１６～１８個の炭素を含む脂肪酸である。本発明では、前記長鎖脂肪酸のエステル、エーテル又は誘導体も含み、且つ、前記長鎖脂肪酸の塩（例えば、ナトリウム塩）も含む。本発明の好ましい方式において、前記長鎖脂肪酸は直鎖飽和モノカルボン酸である。
酸であり、好ましくは、１６～１８個の炭素を含む脂肪酸である。本発明では、前記長鎖脂肪酸のエステル、エーテル又は誘導体も含み、且つ、前記長鎖脂肪酸の塩（例えば、ナトリウム塩）も含む。本発明の好ましい方式において、前記長鎖脂肪酸は直鎖飽和モノカルボン酸である。
本発明の好ましい方式において、前記接続は化学架橋である。化学架橋の目的を実現するために、本発明の発明者は、ポリペプチドの元の配列をベースに、アミノ酸Ｋ又はＣを導入するとともに、脂肪酸をＫ又はＣに架橋した。
前記グルカゴン様ポリペプチドと長鎖脂肪酸を架橋したあと、活性は明らかに向上し、且つ生体内における薬物の半減期が顕著に延長された。好ましくは、１０位のＹをＫに突然変異させることで（式ＩにおいてＸ１０＝Ｋ）、Ｋを介して脂肪酸鎖をインクレチン類似物のポリペプチド断片に架橋可能とする。
本発明の好ましい実施形態において、本発明で提供するインクレチン類似物中の前記脂肪酸鎖はパルミチン酸（Ｃ１６）であって、直鎖モノカルボン酸であり、その化学構造式は下記の基からなる。
本発明で提供するインクレチン類似物において、前記グルカゴン様ポリペプチド断片と長時間作用型ベクターの間にアダプターを更に設置してもよい。通常、前記アダプターは、グルカゴン様ポリペプチド断片上のリシン残基Ｋ及び／又はシステイン残基Ｃ、及び、長時間作用型ベクター上の活性基（例えば、アダプターがカルボキシル基、マレイミド基等の活性基を含んでもよい）とそれぞれ反応可能である。これにより、アダプターの両端は、それぞれ、長時間作用型ベクター及びインクレチン類似物のポリペプチド断片に接続されて、長時間作用型ベクターとインクレチン類似物のポリペプチド断片との架橋（例えば、各種タイプの縮合反応としてもよい）が実現される。
前記アダプターは、当該分野におけるインクレチン類似物のポリペプチド断片と長時間作用型ベクターとの接続に適した各種アダプターとすることができる。本発明のいくつかの具体的実施例において、前記アダプターは、－γＧｌｕ－（－γ－グルタミル－）である。また、化学構造式は下記に示す基からなる。
上述したように、本発明で提供するインクレチン類似物のＣ末端のアミノ酸は修飾可能であり、例えばアミド化が可能である。通常、前記アミド化とは、Ｃ末端の－ＣＯＯＨ基を
－ＣＯＮＨ２基に変換することを意味する。例えば、式（Ｉ）ではＸ４０がＮＨ２となる。
－ＣＯＮＨ２基に変換することを意味する。例えば、式（Ｉ）ではＸ４０がＮＨ２となる。
本発明のいくつかの具体的実施例において、前記インクレチン類似物の具体的配列は、表１のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で示す通りである。表１では、前記ポリペプチド断片と、グルカゴン（Ｇｌｕｃａｇｏｎ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＧＣＧと略称）、ＧＬＰ－１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）及びＧＩＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）の配列の比較も示している。
表１において、－γＥ－とは、－γＧｌｕ（－γ－グルタミル－）のことであり、「γＥ－Ｃ１６」とは、パルミトイル基が－γ－グルタミル－アダプターを介してリシンのε窒素に結合されたことを示す。また、「２ｘＯＥＧ」とは、２つの－ＯＥＧ－（－２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）アセチル－）の接続を示す。
本発明は、更に、前記インクレチン類似物の調製方法を提供する。当該方法は、前記グルカゴン様ポリペプチドと長鎖脂肪酸を接続することを含む。
前記調製方法は、化学合成方法により前記インクレチン類似物を調製することを含み得る。前記調製方法は、更に以下を含み得る。即ち、適切な条件で適切な宿主細胞を培養し、当該宿主細胞に前記インクレチン類似物のポリペプチド断片を発現させ、分離、精製によって前記インクレチン類似物のポリペプチド断片を取得する。次に、前記長時間作用型ベクターを前記インクレチン類似物のポリペプチド断片に化学架橋する。本発明のインクレチン類似物は、標準的なペプチド合成方法で調製可能である。例えば、標準的な固相法又は液相法によって、段階的又は断片を利用して組み上げるとともに、最終的なインクレチン類似物のポリペプチド断片、インクレチン類似物の産生物を分離及び精製するか、組換え及び合成方法で任意に組み合わせる。
インクレチン類似物の応用
本発明は、更に、前記インクレチン類似物の、代謝性疾患を治療するためのＧＬＰ－１Ｒ／ＧＩＰＲ／ＧＣＧＲマルチアゴニスト薬の調製における使用を提供する。前記代謝性疾患は、具体的に、糖尿病、肥満、血中脂質異常、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）／非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、糖尿病に関連するその他のメタボリックシンドローム（高トリアシルグリセロール、低ＨＤＬコレステロール及び高ＬＤＬコレステロール、インスリン抵抗性、肥満症又は耐糖能異常等を含む）から選択可能である。
本発明は、更に、前記インクレチン類似物の、代謝性疾患を治療するためのＧＬＰ－１Ｒ／ＧＩＰＲ／ＧＣＧＲマルチアゴニスト薬の調製における使用を提供する。前記代謝性疾患は、具体的に、糖尿病、肥満、血中脂質異常、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）／非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、糖尿病に関連するその他のメタボリックシンドローム（高トリアシルグリセロール、低ＨＤＬコレステロール及び高ＬＤＬコレステロール、インスリン抵抗性、肥満症又は耐糖能異常等を含む）から選択可能である。
本発明は、更に、本発明の第１の局面で提供するインクレチン類似物を個体に投与するステップを含む疾患の治療方法を提供する。随時血糖測定試験において、本発明のインクレチン類似物を投与された糖尿病モデルマウスは、血糖低下効果及び体重減少効果が対照群サンプルよりも明らかに優れていた。
疾患の予防、緩和又は治療的局面への応用以外に、本発明のインクレチン類似物はいくつかの非治療的局面にも応用可能である。本発明の実施例における一部の結果から明らかなように、前記インクレチン類似物は、食物摂取の減少、脂肪減少、体重減少又は血糖低下を非常に顕著に実現可能である。そのため、今のところ体に疾患の特徴は見られないものの、食物摂取の制限や脂肪の減少、体重減少が必要な被検者に対しても、本発明のインクレチン類似物は応用可能である。
従来技術において、当該分野ではすでに複数のアゴニスト活性を有する分子が研究開発されている。しかし、理想的なこの種類の薬物を得ようとすれば、実際のところは非常に困難である。まずは、安全性の問題、特に免疫原性の問題がある。血糖低下・体重減少系の薬物は長期的な使用を要するため、安全性に対する要求が極めて高い。複数の高いアゴニスト活性を有し、且つ生体内で安定的なポリペプチドを設計及び取得するために、従来の技術方案では、往々にして多くの突然変異部位が導入され、且つ、非天然アミノ酸及びその他の修飾を導入することが多い。これらの突然変異及び非天然アミノ酸の導入は、いずれも潜在的な免疫原性リスクを増加させる。これに対し、糖尿病や肥満といった疾患を治療するための薬物は、安全性が極めて重要となる。また、ＧＬＰ－１やグルカゴンといった約３０アミノ酸の長さを有する低分子ペプチドの場合、配列の変化によって活性が極めて敏感に変化する。これに対し、複数活性ポリペプチドの場合には、複数の異なる受容体の活性化に関与するため、変化がより複雑となり、どのアミノ酸の変更が受容体のアゴニスト活性にどのような結果を及ぼすのかを予測できない。例えば、Ｊｏｓｅｐｈ Ｃｈａｂｅｎｎｅらの報告によれば（Ｊｏｓｅｐｈ Ｃｈａｂｅｎｎｅほか，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，３：２９３－３００，２０１４）、ＧＣＧに対しアラニンスキャン（Ａｌａ ｓｃａｎ）を実施し、ＧＣＧの各部位を個々にアラニンで置換したところ、相対的な残存活性の維持幅は０．２～１００％であった。また、ＧＣＧの１位、２位、３位、４位、６～１２位、１４位、１５位、２２位、２３位、２５～２７位、２９位の突然変異は、ＧＣＧＲのアゴニスト活性を大幅に低減させた（文章中の表４）。ところが、別の報告では、上記部位から１又はいくつかの部位を取って同時に突然変異させ、その他のアミノ酸で置換した場合、活性の変化は必ずしもアラニンスキャンの結果と一致しなかったとしている。例えば、Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｗ Ｄａｙら（Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｗ Ｄａｙほか，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：７４９－７５７，２００９）の報告によれば、ＧＣＧの１６位について、１６Ｓ→Ｇ、１６Ｓ→Ｔ、１６Ｓ→Ｈ、１６Ｓ→Ｅ等の異なる突然変異を実施したところ、ＧＣＧＲのアゴニスト活性はむしろ上昇したという。これは、Ｊｏｓｅｐｈ Ｃｈａｂｅｎｎｅのアラニンスキャンの結果と完全に矛盾している。また、Ｊｏｓｅｐｈ Ｃｈａｂｅｎｎｅは、研究の結果、２３位をアラニンで置換した場合に、ＧＣＧＲのアゴニスト活性がほぼ完全に失われるとみなした（１．１％のみ維持）。これに対し、Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｗ Ｄａｙらは、２３位をＩｌｅに
突然変異させても、ＧＣＧ活性は低下しなかったとしている。更に、例えば、アラニンスキャンの結果、２位のＳはＧＣＧ活性の維持にとって非常に重要とみなされている（Ａｌａに突然変異した場合の活性は１／３しか維持されなかった）。しかし、Ｂｒｉａｎ Ｆｉｎａｎら（Ｆｉｎａｎ Ｂほか，Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１５；２１：２７－３６．）の報告では、ＧＣＧの２位のアミノ酸を、それぞれ、２Ｓ→Ａｉｂ、２Ｓ→ｄＳｅｒ、２Ｓ→Ｇ、２Ｓ→ｄＡｌａに置換して突然変異させてから、その他の部位の突然変異と組み合わせたところ、ＧＣＧＲの相対的なアゴニスト活性はむしろ２００～６４０％に上昇したとしている。本発明の発明者は、研究の過程で、ＧＬＰ－１、ＧＣＧ又はＧＩＰ活性の向上に有利ないくつかの突然変異を組み合わせて導入すると、多くの場合に、その効果は単一部位の突然変異時と全く異なることを発見した。且つ、ＧＬＰ－１、Ｅｘｅｎｄｉｎ－４、ＧＣＧ又はＧＩＰといったポリペプチドは、Ｎ末端及びＣ末端にアミノ酸を追加する場合又は減少させる場合のいずれにおいても、生物学的活性が影響を受ける。例えば、Ｎ末端から１又は２つのアミノ酸を除去すると、ＧＬＰ－１、ＧＣＧ等のアゴニスト活性は完全に失われる。また、例えば、オキシントモジュリン（Ｏｘｙｎｔｏｍｏｄｕｌｉｎ）は、グルカゴンのＣ末端よりもＫＲＮＲＮＮＩＡという８つのアミノ酸が多く、そのＧＣＧＲアゴニスト活性は約９０％が失われる（Ａｌｅｓｓａｎｄｒｏ Ｐｏｃａｉほか，Ｄｉａｂｅｔｅｓ；５８（１０）：２２５８－２２６６，２００９、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ＳＪほか，Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｏｂｅｓ Ｍｅｔａｂ，２０１６）。
突然変異させても、ＧＣＧ活性は低下しなかったとしている。更に、例えば、アラニンスキャンの結果、２位のＳはＧＣＧ活性の維持にとって非常に重要とみなされている（Ａｌａに突然変異した場合の活性は１／３しか維持されなかった）。しかし、Ｂｒｉａｎ Ｆｉｎａｎら（Ｆｉｎａｎ Ｂほか，Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１５；２１：２７－３６．）の報告では、ＧＣＧの２位のアミノ酸を、それぞれ、２Ｓ→Ａｉｂ、２Ｓ→ｄＳｅｒ、２Ｓ→Ｇ、２Ｓ→ｄＡｌａに置換して突然変異させてから、その他の部位の突然変異と組み合わせたところ、ＧＣＧＲの相対的なアゴニスト活性はむしろ２００～６４０％に上昇したとしている。本発明の発明者は、研究の過程で、ＧＬＰ－１、ＧＣＧ又はＧＩＰ活性の向上に有利ないくつかの突然変異を組み合わせて導入すると、多くの場合に、その効果は単一部位の突然変異時と全く異なることを発見した。且つ、ＧＬＰ－１、Ｅｘｅｎｄｉｎ－４、ＧＣＧ又はＧＩＰといったポリペプチドは、Ｎ末端及びＣ末端にアミノ酸を追加する場合又は減少させる場合のいずれにおいても、生物学的活性が影響を受ける。例えば、Ｎ末端から１又は２つのアミノ酸を除去すると、ＧＬＰ－１、ＧＣＧ等のアゴニスト活性は完全に失われる。また、例えば、オキシントモジュリン（Ｏｘｙｎｔｏｍｏｄｕｌｉｎ）は、グルカゴンのＣ末端よりもＫＲＮＲＮＮＩＡという８つのアミノ酸が多く、そのＧＣＧＲアゴニスト活性は約９０％が失われる（Ａｌｅｓｓａｎｄｒｏ Ｐｏｃａｉほか，Ｄｉａｂｅｔｅｓ；５８（１０）：２２５８－２２６６，２００９、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ＳＪほか，Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｏｂｅｓ Ｍｅｔａｂ，２０１６）。
本発明で提供するインクレチン類似物は、きわめて高いＧＬＰ－１Ｒ、及びＧＩＰＲアゴニスト活性、及びやや弱いＧＣＧＲアゴニスト活性を有している。驚くことに、インクレチン類似物のポリペプチドは、脂肪酸との架橋前後において、インビトロ活性に著しい変化が発生する。
以下に、特定の具体的実施例を通じて、本発明の実施形態につき説明する。なお、当業者であれば、本明細書で開示する内容から本発明のその他の利点及び効果を容易に理解可能である。更に、本発明は、その他の異なる具体的実施形態によっても実施又は応用可能である。また、本明細書の各詳細は、異なる視点及び応用に基づき、本発明の精神を逸脱しないことを前提に各種の補足又は変更が可能である。
組成物
本発明は、更に、有効量の本発明における上記インクレチン類似物及びベクターを含む組成物を提供する。前記ベクターは、薬学的、食品学的又は栄養補助食品学的に許容可能なベクターである。前記組成物には、薬物組成物、食物組成物又は栄養補助食品組成物等が含まれるが、これらに限らない。
本発明は、更に、有効量の本発明における上記インクレチン類似物及びベクターを含む組成物を提供する。前記ベクターは、薬学的、食品学的又は栄養補助食品学的に許容可能なベクターである。前記組成物には、薬物組成物、食物組成物又は栄養補助食品組成物等が含まれるが、これらに限らない。
本発明において、前記薬物組成物は、重量比で０．０１～９５％（例えば０．１％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、５０％、８０％等）の前記インクレチン類似物を含有し得る。
本文中で使用する「薬学的、食品学的又は栄養補助食品学的に許容可能な」成分とは、過度の望ましくない副反応（例えば、毒性、刺激及びアレルギー反応）を生じることなく、ヒト及び／又は動物に適用されるもののことである。即ち、合理的な利益／リスク比を有する物質のことであり、例えば、当該分野で常用される薬物ベクター又は賦形剤である。
本文中で使用される「有効量」又は「有効投与量」とは、ヒト及び／又は動物に対して機能又は活性を発生可能であり、且つ、ヒト及び／又は動物が許容可能な量のことである。
本発明における上記の薬物組成物の剤形は多種多様とすることが可能であり、活性成分を
有効に哺乳動物の体に到達させられる剤形であればよい。例えば、ゲル剤、エアロゾル剤、タブレット、カプセル、粉末、顆粒、シロップ、溶液、又は懸濁液から選択可能である。本発明の化合物で治療する疾患のタイプによって、当業者は使用しやすい剤形を選択すればよい。
有効に哺乳動物の体に到達させられる剤形であればよい。例えば、ゲル剤、エアロゾル剤、タブレット、カプセル、粉末、顆粒、シロップ、溶液、又は懸濁液から選択可能である。本発明の化合物で治療する疾患のタイプによって、当業者は使用しやすい剤形を選択すればよい。
適切な薬学的に許容可能なベクターとは、当業者が熟知するものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．，１９９１）から、薬学的に許容可能なベクターについての十分な説明を得ることができる。組成物における薬学的に許容可能なベクターには、例えば、水、リン酸塩緩衝液、リンガー（ｒｉｎｇｅｒ）液、生理食塩水、平衡塩溶液、グリセリン又はソルビトール等の液体が含有され得る。そのほか、これらのベクターには、更に、例えば、滑沢剤、流動化剤、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質及び安定剤（例えば、アルブミン等）の補助的物質も存在し得る。
調製及び投薬のしやすさから考えて、好ましくは、薬物組成物は固形組成物とし、特に、タブレット、及び固体充填又は液体充填のカプセルとする。本発明の化合物又はその薬物組成物は、注射又は点滴に適した消毒済み器具に充填してもよい。
本発明における上記のインクレチン類似物は、投薬形式や治療対象の疾患の重症度に応じて、活性成分としての有効投与量を変更可能であり、例えば、１日あたり約０．００００１～１０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で投与する。また、薬品の使用時間を調整してもよい。例えば、徐放形式で投薬する場合には、１日置きや数日置きに１回投与してもよい。また、最適な治療応答を提供するために、投与量の方案を調節してもよい。
前記組成物を大型動物や患者に適用する場合には、小型動物への適用投与量に基づき、対応する専用の換算式を使用して、大型動物又はヒトへの有効適用投与量を換算可能である（固形又は液状の投与量換算を含む）。本発明の具体的実施例では、動物（例えば、ネズミ）に対する投薬方案を提供する。動物（例えば、ネズミ）への投与量からヒトに適した投与量に換算することは、当業者にとって容易である。例えば、Ｍｅｅｈ－Ｒｕｂｎｅｒの式に基づいて算出可能である。
Ｍｅｅｈ－Ｒｕｂｎｅｒの式：Ａ＝ｋ×（Ｗ２／３）／１０，０００。
式中のＡは体表面積であり、ｍ２で計算する。また、Ｗは体重であり、ｇで計算する。Ｋは定数であり、動物の種類によって異なる。一般的に、マウスとラットは９．１、モルモットは９．８、ウサギは１０．１、猫は９．９、犬は１１．２、サルは１１．８、ヒトは１０．６である。理解すべき点として、薬物及び臨床状況の違いに応じて、経験のある薬剤師の評価に基づき、投与量の換算を変更してもよい。
Ｍｅｅｈ－Ｒｕｂｎｅｒの式：Ａ＝ｋ×（Ｗ２／３）／１０，０００。
式中のＡは体表面積であり、ｍ２で計算する。また、Ｗは体重であり、ｇで計算する。Ｋは定数であり、動物の種類によって異なる。一般的に、マウスとラットは９．１、モルモットは９．８、ウサギは１０．１、猫は９．９、犬は１１．２、サルは１１．８、ヒトは１０．６である。理解すべき点として、薬物及び臨床状況の違いに応じて、経験のある薬剤師の評価に基づき、投与量の換算を変更してもよい。
本発明は、更に、前記インクレチン類似物、又は前記薬物組成物を含む薬剤キット又は試薬キットを提供する。臨床応用に都合がよいよう、本発明の薬剤キット又は試薬キットには、例えば注射器等のその他の補助パーツが更に含まれていてもよい。前記薬剤キット又は試薬キットには、当業者が正しい方式で使用し得るよう、取扱説明書が更に含まれていてもよい。
本発明の具体的実施形態について更に述べる前に、本発明の保護の範囲は下記で特定する具体的実施方案に限らないことを理解すべきである。また、本発明の実施例で使用する用語は特定の具体的実施方案を記載するためのものであって、本発明の保護の範囲を制限するものではないことを理解すべきである。
実施例で数値範囲を示している場合には、本発明において別途説明している場合を除き、各数値範囲の２つの端点及び２つの端点間の任意の数値をいずれも選択可能であると解釈すべきである。また、別途定義している場合を除き、本発明で使用するあらゆる技術用語及び科学用語は、当業者により一般的に理解される意味と等しい。更に、実施例で使用している具体的方法、デバイス、材料のほかに、当業者による従来技術の理解及び本発明の記載に基づいて、本発明の実施例で述べる方法、デバイス、材料と類似又は同等の従来技術における任意の方法、デバイス及び材料を用いて本発明を実現してもよい。
別途説明している場合を除き、本発明で開示する実験方法、検出方法、作製方法は、いずれも当該分野において一般的な分子生物学、生化学、クロマチン構造及び分析、分析化学、細胞培養、組換えＤＮＡ技術及び関連分野における一般的技術を用いている。これらの技術については、既存の文献で十分に説明されている。具体的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋほか，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９ ａｎｄ Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１、Ａｕｓｕｂｅｌほか，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７ ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ、ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９８、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ ａｎｄ Ａ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９９、及び、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｄ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９等を参照すればよい。
実施例で言及する略語の意味は、具体的に次の通りである。
ＲＴ：室温
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
Ｆｍｏｃ：９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニル
Ｔｒｔ：トリチル
Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル
ＨＯＢｔ：１－ヒドロキシベンゾトリアゾール
ｔＢｕ：ｔｅｒｔ－ブチル
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＢＬＫ：２０％Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドピペリジン
ＤＩＣ：Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド
ＭｅＯＨ：メタノール
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｐａｌ－Ｇｌｕ－ＯｔＢｕ）－ＯＨ：Ｎα－フルオレンメトキシカルボニル－（Ｎε-（γ－グルタミル（Ｎα－ヘキサデカン，α－ｔｅｒｔ－ブチルエステル）））リシン
－γＥ－：－γ－グルタミル－
－ＯＥＧ－：－２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ基）アセチル－
ＤＩＥＡ：Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
ＭＴＢＥ：メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル
ＴＦＥＡ：２，２，２－トリフルオロエタノール
Ｐｄ（ＰＰｈ３）４：テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム
Ａｌｌｏｃ：アリルオキシカルボニル基
ＲＴ：室温
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
Ｆｍｏｃ：９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニル
Ｔｒｔ：トリチル
Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル
ＨＯＢｔ：１－ヒドロキシベンゾトリアゾール
ｔＢｕ：ｔｅｒｔ－ブチル
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＢＬＫ：２０％Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドピペリジン
ＤＩＣ：Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド
ＭｅＯＨ：メタノール
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｐａｌ－Ｇｌｕ－ＯｔＢｕ）－ＯＨ：Ｎα－フルオレンメトキシカルボニル－（Ｎε-（γ－グルタミル（Ｎα－ヘキサデカン，α－ｔｅｒｔ－ブチルエステル）））リシン
－γＥ－：－γ－グルタミル－
－ＯＥＧ－：－２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ基）アセチル－
ＤＩＥＡ：Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
ＭＴＢＥ：メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル
ＴＦＥＡ：２，２，２－トリフルオロエタノール
Ｐｄ（ＰＰｈ３）４：テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム
Ａｌｌｏｃ：アリルオキシカルボニル基
実施例で言及する商業的に取引される各アミノ酸及びアミノ酸断片、及び商業的に取引される各樹脂のメーカー及び商品型番は下記の通りである。
Ｆｍｏｃ保護基アミノ酸原料、２－ＣＴＣ樹脂及びＲｉｎｋ ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂は、いずれも一般的に市販されている試薬である（保護アミノ酸メーカー：成都鄭源生化科技有限公司、樹脂メーカー：天津南開和成科技有限公司）。
有機溶媒及びその他の原料の入手元は、いずれも市販品である（メーカー：シノファーム化学試剤有限公司。化学的純度）。
そのほか、ＨＰＬＣ及び質量分析法の条件、使用する機器の型番及びメーカーの説明は下記の通りである。
計器：ＨＰＬＣ ＵｌｔｉＭａｔｅ３０００、検出条件は表２の通りとした。
分取液体：北京創新通恒、ＬＣ３０００。
質量分析法：計器型番は５８００ ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＴＯＦ（エービー・サイエックス社）、分析ソフトはＴＯＦ／ＴＯＦ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ、Ｄａｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒとした。また、ＭＳには、Ｒｅｆｌｅｃｔｏｒ Ｐｏｓｉｔｉｖｅパラメータとして、ＣＩＤ（ＯＦＦ）、ｍａｓｓ ｒａｎｇ（７００－６５００Ｄａ）Ｆｏｃｕｓ Ｍａｓｓ（１２００Ｄａ）Ｆｉｘｅｄ ｌａｓｅｒ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（５６００）Ｄｉｇｉｔｉｚｅｒ：Ｂｉｎ Ｓｉｚｅ（０．５ｎｓ）を使用した。
インクレチン類似物の調製
１．インクレチン類似物Ｐ３ＹＥＬＡＮの調製
インクレチン類似物Ｐ３ＹＥＬＡＮの構造は下記の通りである。
１．インクレチン類似物Ｐ３ＹＥＬＡＮの調製
インクレチン類似物Ｐ３ＹＥＬＡＮの構造は下記の通りである。
即ち、ＹＳＥＧＴＦＴＳＤＸ１０ＳＫＹＬＤ ＳＱＡＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＬＡＧＧＰＳＳＧＡ ＰＰＰＳ－ＮＨ２
Ｘ１０＝Ｋ（パルミトイル基－γＥ）
Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｒｉｎｋ ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂の合成：
置換度０．３８ｍｍｏｌ／ｇのＲｉｎｋ ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂（天津南開和成科技有限公司）を２．６５ｇ計量して固相反応カラムに投入し、１０ｍＬのＤＣＭを加えて樹脂を３０分間膨潤させたあと、ＤＭＦで３回（毎回１０ｍＬ）洗浄した。次に、反応カラムに１５ｍＬのＤＢＬＫ溶液を加え、５分間反応させてから吸引濾過した。続いて、２０ｍＬのＤＭＦで１回洗浄してから、１５ｍＬのＤＢＬＫ溶液を加え、１０分間反応させたところ、カイザー（Ｋａｉｓｅｒ）テストで陽性となった。これを吸引濾過し、ＤＭＦで３回（毎回２０ｍＬ）洗浄した。
置換度０．３８ｍｍｏｌ／ｇのＲｉｎｋ ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂（天津南開和成科技有限公司）を２．６５ｇ計量して固相反応カラムに投入し、１０ｍＬのＤＣＭを加えて樹脂を３０分間膨潤させたあと、ＤＭＦで３回（毎回１０ｍＬ）洗浄した。次に、反応カラムに１５ｍＬのＤＢＬＫ溶液を加え、５分間反応させてから吸引濾過した。続いて、２０ｍＬのＤＭＦで１回洗浄してから、１５ｍＬのＤＢＬＫ溶液を加え、１０分間反応させたところ、カイザー（Ｋａｉｓｅｒ）テストで陽性となった。これを吸引濾過し、ＤＭＦで３回（毎回２０ｍＬ）洗浄した。
上記とは別に、１．９１ｇのＦｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ及び０．８１ｇのＨＯＢｔを計量し、１０ｍＬのＤＭＦで溶解した。これに５～８℃下で０．６９ｇのＤＩＣを加え、５ｍｉｎ活性化させたあと、上記の樹脂が充填されている反応カラムに投入して２時間反応させた。そして、カイザーテストで陰性となってから、次のペプチド樹脂の合成に直接使用した。
ペプチド樹脂の合成：
上記のＦｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｒｉｎｋ ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂（１．０ｍｍｏｌ）を計量し、反応カラムに投入して、２０ｍＬのＤＣＭで３０分間膨潤させたあと、ＤＭＦで３回（毎回２０ｍＬ）洗浄した。洗浄の完了後、反応カラムに１０ｍＬのＤＢＬＫ溶液（２０％ピペリジン／ＤＭＦ（Ｖ／Ｖ））を加え、５分間反応させてから吸引濾過した。そして、２０ｍＬのＤＭＦで１回洗浄したあと、１０ｍＬのＤＢＬＫ溶液（２０％ピペリジン／ＤＭＦ（Ｖ／Ｖ））を加えて１０分間反応させたところ、カイザーテストで陽性となった。これを吸引濾過し、ＤＭＦで３回（毎回２０ｍＬ）洗浄した。また、上記とは別に、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ（１．６９ｇ、５．０ｅｑ）、ＨＯＢｔ（０．８１ｇ、６．０ｅｑ）を計量し、１０ｍＬのＤＭＦに投入して溶解した。続いて、５～８℃下でＤＩＣ（０．６９ｇ、５．５ｅｑ）を加えて５ｍｉｎ活性化させたあと、反応カラムに投入して１時間反応させた。そして、カイザーテストで陰性となり、完全に反応してから、ＤＭＦで３回（毎回２０ｍＬ）洗浄した。上記の保護及びカップリング操作を繰り返し、ペプチドの配列に従ってその他のアミノ酸のカップリングを順次完了した。Ｘ１０には、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｐａｌ－Ｇｌｕ－ＯｔＢｕ）－ＯＨ（成都鄭源生化科技有限公司）を用いてカップリングを行った。最後のアミノ酸のカップリングが完了したあと、上記の保護方法で保護し、完全に保護されてから、順に、ＤＭＦ洗浄を２回、ＭｅＯＨ洗浄を２回、ＤＣＭ洗浄を２回、ＭｅＯＨ洗浄を２回行った。なお、洗浄溶媒は毎回２０ｍＬとした。そして、材料を回収し、常温で減圧乾燥させて目標のペプチド樹脂を取得した。
上記のＦｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｒｉｎｋ ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂（１．０ｍｍｏｌ）を計量し、反応カラムに投入して、２０ｍＬのＤＣＭで３０分間膨潤させたあと、ＤＭＦで３回（毎回２０ｍＬ）洗浄した。洗浄の完了後、反応カラムに１０ｍＬのＤＢＬＫ溶液（２０％ピペリジン／ＤＭＦ（Ｖ／Ｖ））を加え、５分間反応させてから吸引濾過した。そして、２０ｍＬのＤＭＦで１回洗浄したあと、１０ｍＬのＤＢＬＫ溶液（２０％ピペリジン／ＤＭＦ（Ｖ／Ｖ））を加えて１０分間反応させたところ、カイザーテストで陽性となった。これを吸引濾過し、ＤＭＦで３回（毎回２０ｍＬ）洗浄した。また、上記とは別に、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ（１．６９ｇ、５．０ｅｑ）、ＨＯＢｔ（０．８１ｇ、６．０ｅｑ）を計量し、１０ｍＬのＤＭＦに投入して溶解した。続いて、５～８℃下でＤＩＣ（０．６９ｇ、５．５ｅｑ）を加えて５ｍｉｎ活性化させたあと、反応カラムに投入して１時間反応させた。そして、カイザーテストで陰性となり、完全に反応してから、ＤＭＦで３回（毎回２０ｍＬ）洗浄した。上記の保護及びカップリング操作を繰り返し、ペプチドの配列に従ってその他のアミノ酸のカップリングを順次完了した。Ｘ１０には、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｐａｌ－Ｇｌｕ－ＯｔＢｕ）－ＯＨ（成都鄭源生化科技有限公司）を用いてカップリングを行った。最後のアミノ酸のカップリングが完了したあと、上記の保護方法で保護し、完全に保護されてから、順に、ＤＭＦ洗浄を２回、ＭｅＯＨ洗浄を２回、ＤＣＭ洗浄を２回、ＭｅＯＨ洗浄を２回行った。なお、洗浄溶媒は毎回２０ｍＬとした。そして、材料を回収し、常温で減圧乾燥させて目標のペプチド樹脂を取得した。
粗ペプチドの切断：
上記のペプチド樹脂を５．０２ｇ計量し、２０～３０℃で６０ｍＬの破砕液（トリフルオロ酢酸：チオアニソール：アニソール：エタンジチオール＝９０：５：３：２）にゆっくりと加え、更に２時間反応させた。反応完了後、樹脂を濾過により除去した。そして、激しく攪拌しながら、濾液を事前に冷却しておいたメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（６００ｍＬ）に投入し、取得した混合溶液を冷蔵庫に投入して２時間沈降させた。その後、上清液を除去し、予め冷却しておいたメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルを用いて５回（毎回４００ｍＬ）遠心分離洗浄した。完了後に材料を回収し、常温で減圧乾燥させて粗ペプチド２．２３ｇを取得した。
上記のペプチド樹脂を５．０２ｇ計量し、２０～３０℃で６０ｍＬの破砕液（トリフルオロ酢酸：チオアニソール：アニソール：エタンジチオール＝９０：５：３：２）にゆっくりと加え、更に２時間反応させた。反応完了後、樹脂を濾過により除去した。そして、激しく攪拌しながら、濾液を事前に冷却しておいたメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（６００ｍＬ）に投入し、取得した混合溶液を冷蔵庫に投入して２時間沈降させた。その後、上清液を除去し、予め冷却しておいたメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルを用いて５回（毎回４００ｍＬ）遠心分離洗浄した。完了後に材料を回収し、常温で減圧乾燥させて粗ペプチド２．２３ｇを取得した。
粗ペプチドの精製：
分取液体（北京創新通恒、ＬＣ３０００）を使用して、複数のステップで粗ペプチドを精製した。
第１ステップ：固定相をＣ１８（ダイソーゲル：ｓｐ－１２０－４０／６０－Ｃ１８－ＲＰＳ）とし、移動相を０．１％ＴＦＡ、アセトニトリルとした。
第２ステップ：固定相をＣ８（ダイソーゲル：ｓｐ－１２０－１０－Ｃ８－Ｐ）とし、移動相を０．５％リン酸、アセトニトリルとした。
第３ステップ：固定相をＣ８（ダイソーゲル：ｓｐ－１２０－１０－Ｃ８－Ｐ）とし、移動相を５０ｍＭの酢酸アンモニウム、０．３％酢酸、アセトニトリルとした。
最後に、凍結乾燥させて（凍結乾燥機：北京博医康社、ＦＤ－２Ａ）、精製ペプチド（９８．０％）を取得した。最終的に、ＭＳにより精製ペプチドの精密分子量を測定したところ、ｍ／ｚ４４５５．６９（Ｍ＋Ｈ）＋であった。また、ＭＳは図１に示す通りとなった。
分取液体（北京創新通恒、ＬＣ３０００）を使用して、複数のステップで粗ペプチドを精製した。
第１ステップ：固定相をＣ１８（ダイソーゲル：ｓｐ－１２０－４０／６０－Ｃ１８－ＲＰＳ）とし、移動相を０．１％ＴＦＡ、アセトニトリルとした。
第２ステップ：固定相をＣ８（ダイソーゲル：ｓｐ－１２０－１０－Ｃ８－Ｐ）とし、移動相を０．５％リン酸、アセトニトリルとした。
第３ステップ：固定相をＣ８（ダイソーゲル：ｓｐ－１２０－１０－Ｃ８－Ｐ）とし、移動相を５０ｍＭの酢酸アンモニウム、０．３％酢酸、アセトニトリルとした。
最後に、凍結乾燥させて（凍結乾燥機：北京博医康社、ＦＤ－２Ａ）、精製ペプチド（９８．０％）を取得した。最終的に、ＭＳにより精製ペプチドの精密分子量を測定したところ、ｍ／ｚ４４５５．６９（Ｍ＋Ｈ）＋であった。また、ＭＳは図１に示す通りとなった。
２．グルカゴン誘導体Ｐ５ＹＥＬＡＮの調製
グルカゴン誘導体Ｐ５ＹＥＬＡＮの構造式は下記の通りである。
グルカゴン誘導体Ｐ５ＹＥＬＡＮの構造式は下記の通りである。
即ち、ＹＳＥＧＴＦＴＳＤＸ１０ＳＫＹＬＤ ＳＱＡＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＬＡＧＧＰＳＳＧＡ ＰＰＰＳ－ＮＨ２
Ｘ１０＝Ｋ（（（オクタデカン二酸モノアシル基）－γＥ）－２ｘＯＥＧ）
分枝鎖を有する保護アミノ酸Ｗ１：Ａｌｌｏｃ－Ｌｙｓ（（Ｏｃｔａｄｅｃａｎｅｄｉｏｉｃ Ａｃｉｄ ｍｏｎｏ－ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌｅｓｔｅｒ）－Ｇｌｕ－ＯｔＢｕ）－ＯＥＧ－ＯＥＧ）－ＯＨを固相法で合成した。構造は下記の通りである。
Ｗ１の合成：
置換度１．０ｍｍｏｌ／ｇの２－ＣＴＣ樹脂を２０ｇ計量し、固相反応カラムに投入してＤＭＦで１回洗浄した。ＤＭＦで樹脂を３０間膨潤させたあと、８．５３ｇのＡｌｌｏｃ－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）－ＯＨ（２０ｍｍｏｌ）を計量し、ＤＭＦで溶解した。続いて、氷水浴しつつ、７．５ｍｌのＤＩＥＡ（４５ｍｍｏｌ）を加えて活性化させてから、上記の樹脂が充填されている反応カラムに投入した。そして、２時間反応させたあと、３０ｍｌの無水メタノールを加えて１時間ブロッキングし、ＤＭＦで３回洗浄した。次に、ＤＭＦ：ピリジンの体積比が４：１の混合溶液を用いてＦｍｏｃの保護を解除してから、ＤＭＦで６回洗浄した。次に、１５．４２ｇの［２－［２－（Ｆｍｏｃ－アミノ）エトキシ］エトキシ］酢酸と、５．４１ｇのＨＯＢｔを計量し、ＤＭＦに加えて溶解した。そして、氷水浴しつつ、６．２ｍｌのＤＩＣを加えて活性化させたあと、上記の樹脂が充填されている反応カラムに投入し、室温下で２時間反応させた。上記のＦｍｏｃの保護解除及び対応材料を加えてカップリングするステップを繰り返し、分枝鎖断片の順序に従って、［２－［２－（Ｆｍｏｃ－アミノ）エトキシ］エトキシ］酢酸、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ－ＯｔＢｕ、オクタデカン二酸モノ－ｔｅｒｔ－ブチルを順に完成させた。カップリングの完了後、樹脂をＤＭＦで３回洗浄し、ＭｅＯＨで５回洗浄してから乾燥させた。次に、樹脂を４００ｍｌのＴＦＥＡ／ＤＣＭ＝１：４に加え、室温で４ｈ反応させた。そして、樹脂を濾過したあと、濾液からＤＣＭを遠心除去し、５００ｍｌのＭＴＢＥに加えて沈降させた。これを遠心乾燥して目標とする化合物を１９．４３ｇ（ｍ／Ｚ１２４２．５１（Ｍ＋Ｈ）＋）取得した。
置換度１．０ｍｍｏｌ／ｇの２－ＣＴＣ樹脂を２０ｇ計量し、固相反応カラムに投入してＤＭＦで１回洗浄した。ＤＭＦで樹脂を３０間膨潤させたあと、８．５３ｇのＡｌｌｏｃ－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）－ＯＨ（２０ｍｍｏｌ）を計量し、ＤＭＦで溶解した。続いて、氷水浴しつつ、７．５ｍｌのＤＩＥＡ（４５ｍｍｏｌ）を加えて活性化させてから、上記の樹脂が充填されている反応カラムに投入した。そして、２時間反応させたあと、３０ｍｌの無水メタノールを加えて１時間ブロッキングし、ＤＭＦで３回洗浄した。次に、ＤＭＦ：ピリジンの体積比が４：１の混合溶液を用いてＦｍｏｃの保護を解除してから、ＤＭＦで６回洗浄した。次に、１５．４２ｇの［２－［２－（Ｆｍｏｃ－アミノ）エトキシ］エトキシ］酢酸と、５．４１ｇのＨＯＢｔを計量し、ＤＭＦに加えて溶解した。そして、氷水浴しつつ、６．２ｍｌのＤＩＣを加えて活性化させたあと、上記の樹脂が充填されている反応カラムに投入し、室温下で２時間反応させた。上記のＦｍｏｃの保護解除及び対応材料を加えてカップリングするステップを繰り返し、分枝鎖断片の順序に従って、［２－［２－（Ｆｍｏｃ－アミノ）エトキシ］エトキシ］酢酸、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ－ＯｔＢｕ、オクタデカン二酸モノ－ｔｅｒｔ－ブチルを順に完成させた。カップリングの完了後、樹脂をＤＭＦで３回洗浄し、ＭｅＯＨで５回洗浄してから乾燥させた。次に、樹脂を４００ｍｌのＴＦＥＡ／ＤＣＭ＝１：４に加え、室温で４ｈ反応させた。そして、樹脂を濾過したあと、濾液からＤＣＭを遠心除去し、５００ｍｌのＭＴＢＥに加えて沈降させた。これを遠心乾燥して目標とする化合物を１９．４３ｇ（ｍ／Ｚ１２４２．５１（Ｍ＋Ｈ）＋）取得した。
ポリペプチドの合成では、Ｐ３ＹＥＬＡＮと同様に、Ｘ１０にＷ１を用いてカップリングを行うとともに、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４を用いてＡｌｌｏｃ基を除去した。取得した粗ペプチドはＲＰ－ＨＰＬＣで精製し、最後に凍結乾燥させて精製ペプチド（９６．５％）を取得した。そして、ＭＳで精製ペプチドの精密分子量を測定したところ、ｍ／ｚ４８０４．１３（Ｍ＋Ｈ）＋であった。
３．グルカゴン誘導体Ｐ９ＹＥＬＡＮの調製：
グルカゴン誘導体Ｐ９ＹＥＬＡＮの構造式は下記の通りである。
グルカゴン誘導体Ｐ９ＹＥＬＡＮの構造式は下記の通りである。
即ち、ＹＳＥＧＴ ＦＴＳＤＸ１０ＳＫＹＬＤ ＳＱＡＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＬＡＧＧ ＰＳＳＧＡ ＰＰＰＳ－ＮＨ２、
Ｘ１０＝Ｋ（（（エイコサン二酸モノアシル基）－γＥ）－２ｘＯＥＧ）
分枝鎖を有する保護アミノ酸をＰ５ＹＥＬＡＮと合成しした。まず、分枝鎖を有する保護アミノ酸Ｗ２：Ａｌｌｏｃ－Ｌｙｓ（（Ｅｉｃｏｓａｎｅｄｉｏｉｃ Ａｃｉｄ ｍｏｎｏ－ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌｅｓｔｅｒ）－Ｇｌｕ－ＯｔＢｕ）－ＯＥＧ－ＯＥＧ）－ＯＨを固相法で合成した（脂肪酸のカップリングには２０－（ＴＥＲＴ－ブチルトキシ）－２０－オキソイコサン酸を使用した）。構造は下記の通りである。
次に、ポリペプチドの合成を行った。ポリペプチドの合成では、Ｐ３ＹＥＬＡＮと同様に、Ｘ１０にＷ２を用いてカップリングを行うとともに、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４を用いてＡｌｌｏｃ基を除去した。取得した粗ペプチドはＲＰ－ＨＰＬＣで精製し、精製ペプチド（９７．１％）を取得した。そして、ＭＳで精製ペプチドの精密分子量を測定したところ、ｍ／ｚ４８３２．５０（Ｍ＋Ｈ）＋であった。
インビトロ細胞活性測定
（一）ＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性測定
ＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性測定には、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを使用した（Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｗ Ｄａｙほか：Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２００９ Ｏｃｔ；５（１０）７４９－５７）。ヒト由来ＧＬＰ－１Ｒ遺伝子を哺乳動物細胞の発現プラスミドｐＣＤＮＡ３．１にクローニングし、組換え発現プラスミドｐＣＤＮＡ３．１－ＧＬＰ－１Ｒを作製した。また、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）全長遺伝子をｐＣＲＥプラスミドにクローニングし、ｐＣＲＥ－Ｌｕｃ組換えプラスミドを取得した。次に、ｐＣＤＮＡ３．１－ＧＬＰ－１ＲとｐＣＲＥ－Ｌｕｃプラスミドをモル比１：１０の比率でＣＨＯ－Ｋ１細胞にトランスフェクションし、安定トランスフェクション発現株をスクリーニングした。
（一）ＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性測定
ＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性測定には、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを使用した（Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｗ Ｄａｙほか：Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２００９ Ｏｃｔ；５（１０）７４９－５７）。ヒト由来ＧＬＰ－１Ｒ遺伝子を哺乳動物細胞の発現プラスミドｐＣＤＮＡ３．１にクローニングし、組換え発現プラスミドｐＣＤＮＡ３．１－ＧＬＰ－１Ｒを作製した。また、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）全長遺伝子をｐＣＲＥプラスミドにクローニングし、ｐＣＲＥ－Ｌｕｃ組換えプラスミドを取得した。次に、ｐＣＤＮＡ３．１－ＧＬＰ－１ＲとｐＣＲＥ－Ｌｕｃプラスミドをモル比１：１０の比率でＣＨＯ－Ｋ１細胞にトランスフェクションし、安定トランスフェクション発現株をスクリーニングした。
９ｃｍの細胞培養シャーレ内で、１０％ＦＢＳ及び３００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いて細胞を培養した。そして、コンフルエンシーが９０％程度となった時点で培養上清を捨て、２ｍｌのパンクレアチンを加えて３ｍｉｎ間消化したあと、１０％ＦＢＳ及び３００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含有する２ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を加えて中和し、１５ｍｌの遠沈管に移した。これを１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ間遠心分離したあと上清を捨て、１０％ＦＢＳ及び３００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含有する２ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を加えて再懸濁し、カウントした。続いて、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いて細胞を１×１０５／ｍｌまで希釈し、９６ウェルマイクロプレートに１ウェルあたり１００μｌ（即ち、１×１０４／ウェル）でプレーティングした。これにより、単層培養したあと、０．２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に交換して培養した。そして、９６ウェルマイクロプレートにプレーティングした細胞から上清を捨てたあと、精製したグルカゴン誘導体（陽性対照群：デュラグルチド（Ｄｕｌａｇｌｕｔｉｄｅ、商品名Ｔｒｕｌｉｃｉｔｙ（登録商標））を、１％ＢＳＡを含有する
ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で一連の指定濃度まで希釈してから、細胞培養ウェルに１００μｌ／ウェルで加え、６ｈ刺激したあと測定した。測定は、ルシフェラーゼレポーターアッセイキット（Ｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、Ｃａｔ：６８－ＬｕｃｉＲ－Ｓ２００）の説明書に従って行った。各サンプルの活性測定は３回繰り返した。
ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で一連の指定濃度まで希釈してから、細胞培養ウェルに１００μｌ／ウェルで加え、６ｈ刺激したあと測定した。測定は、ルシフェラーゼレポーターアッセイキット（Ｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、Ｃａｔ：６８－ＬｕｃｉＲ－Ｓ２００）の説明書に従って行った。各サンプルの活性測定は３回繰り返した。
（二）ＧＩＰＲアゴニスト活性の測定方法
ＧＩＰＲアゴニスト活性測定にも同様に、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを使用した。ヒト由来ＧＩＰＲ遺伝子を哺乳動物細胞の発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１にクローニングし、組換え発現プラスミドｐＣＤＮＡ３．１－ＧＩＰＲを作製した。ＣＨＯ－Ｋ１へのトランスフェクション及び安定トランスフェクション細胞株のスクリーニングについては上記と同様とした。また、活性測定のステップは上記と同様とし（陽性対照群：天然型ヒト由来ＧＩＰペプチド）、各サンプルの活性測定を３回繰り返した。
ＧＩＰＲアゴニスト活性測定にも同様に、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを使用した。ヒト由来ＧＩＰＲ遺伝子を哺乳動物細胞の発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１にクローニングし、組換え発現プラスミドｐＣＤＮＡ３．１－ＧＩＰＲを作製した。ＣＨＯ－Ｋ１へのトランスフェクション及び安定トランスフェクション細胞株のスクリーニングについては上記と同様とした。また、活性測定のステップは上記と同様とし（陽性対照群：天然型ヒト由来ＧＩＰペプチド）、各サンプルの活性測定を３回繰り返した。
（三）ＧＣＧＲアゴニスト活性の測定方法
ＧＣＧＲアゴニスト活性測定にも同様に、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを使用した。ヒト由来ＧＣＧＲ遺伝子を哺乳動物細胞の発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１にクローニングし、組換え発現プラスミドｐＣＤＮＡ３．１－ＧＣＧＲを作製した。ＣＨＯ－Ｋ１へのトランスフェクション及び安定トランスフェクション細胞株のスクリーニングについては上記と同様とした。また、活性測定のステップは上記と同様とし（陽性対照群：天然型ヒト由来ＧＣＧペプチド）、各サンプルの活性測定を３回繰り返した。
ＧＣＧＲアゴニスト活性測定にも同様に、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを使用した。ヒト由来ＧＣＧＲ遺伝子を哺乳動物細胞の発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１にクローニングし、組換え発現プラスミドｐＣＤＮＡ３．１－ＧＣＧＲを作製した。ＣＨＯ－Ｋ１へのトランスフェクション及び安定トランスフェクション細胞株のスクリーニングについては上記と同様とした。また、活性測定のステップは上記と同様とし（陽性対照群：天然型ヒト由来ＧＣＧペプチド）、各サンプルの活性測定を３回繰り返した。
（四）活性測定の結果
図２、図３、図４は、それぞれ、ＧＬＰ－１Ｒ、ＧＩＰＲ及びＧＣＧＲのアゴニスト活性の結果を示す図である。また、具体的なＥＣ５０は表３に示す通りであった。
図２、図３、図４は、それぞれ、ＧＬＰ－１Ｒ、ＧＩＰＲ及びＧＣＧＲのアゴニスト活性の結果を示す図である。また、具体的なＥＣ５０は表３に示す通りであった。
上記の結果は、本発明におけるＰ３ＹＥＬＡＮが高いＧＬＰ－１Ｒ及びＧＩＰＲアゴニスト活性を有するとともに、顕著なＧＣＧＲアゴニスト活性も有することを意味している。しかし、同じペプチド配列を有するＰ５ＹＥＬＡＮ及びＰ９ＹＥＬＡＮは、接続した脂肪酸鎖が異なっていたため、細胞のアゴニスト活性が大幅に低下した。
血清安定性
本実施例では、以下のステップによってインクレチン類似物Ｐ３ＹＥＬＡＮの血清安定性を測定した。
本実施例では、以下のステップによってインクレチン類似物Ｐ３ＹＥＬＡＮの血清安定性を測定した。
（１）５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．５、０．０２％のＴＷＥＥＮ－８０溶液で、インクレチン類似物Ｐ３ＹＥＬＡＮ、ＹＥＬＡＮ及び対照品（デュラグルチド）を濃度１．０ｍｇ／ｍｌの溶液に調製した。これを除菌濾過（０．２２μｍ、ミリポア社 ＳＬＧＰ０３３ＲＢ）したあと、ラット血清で１０倍に希釈し、均一に混合してから、滅菌遠沈管に分配した。
（２）上記のサンプルをそれぞれ３本取り、－２０℃で凍結保存して対照とした。また、残りは３７℃のインキュベータに投入し、０時間後、１２時間後、２４時間後及び７２時間後にサンプリングして活性を測定した。
（３）ＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性を測定した。相対活性：０時間の活性値を１００％とし、その後の各時点で測定した値を１００％に対する比率で取得した。
図５は、インクレチン類似物Ｐ３ＹＥＬＡＮの残存活性の経時変化の結果である。結果より、ＹＥＬＡＮ及びデュラグルチドと比較して、Ｐ３ＹＥＬＡＮは長時間にわたり高いＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性を維持することが示された。
ｄｂ／ｄｂマウスへの投薬後の随時血糖の測定
レプチン受容体欠失２型糖尿病（ｄｂ／ｄｂ）マウスの血糖低下実験を行った。主に、体重、非空腹時血糖、投与前ＯＧＴＴ反応の３つの指標に従って、ｄｂ／ｄｂマウスをスクリーニングし、均等に群分けした。各群は６匹とし、大きすぎる個体や小さすぎる個体は除外した。また、非空腹時血糖は１５ｍＭよりも大きいこととした。Ｐ３ＹＥＬＡＮは、５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）、５％ソルビトール、０．０２％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ－８０に溶解した。そして、デュラグルチド又はＰ３ＹＥＬＡＮを皮下注射した（複数回投与）。デュラグルチドの投与量は１０ｎｍｏｌ／ｋｇ／４ｄとし、Ｐ３ＹＥＬＡＮには、低投与量（１ｎｍｏｌ／ｋｇ／ｄ）、中投与量（３ｎｍｏｌ／ｋｇ／ｄ）、高投与量（６ｎｍｏｌ／ｋｇ／ｄ）を採用した。ｄａｙ０～ｄａｙ４までは、全ての動物の随時血糖を毎日モニタリングした。また、その後は、４日に１度随時血糖を測定した。このとき、測定日は、ｄａｙ６、ｄａｙ１０、ｄａｙ１４、ｄａｙ１８、ｄａｙ２２、ｄａｙ２６、ｄａｙ３０、ｄａｙ３４とした。
レプチン受容体欠失２型糖尿病（ｄｂ／ｄｂ）マウスの血糖低下実験を行った。主に、体重、非空腹時血糖、投与前ＯＧＴＴ反応の３つの指標に従って、ｄｂ／ｄｂマウスをスクリーニングし、均等に群分けした。各群は６匹とし、大きすぎる個体や小さすぎる個体は除外した。また、非空腹時血糖は１５ｍＭよりも大きいこととした。Ｐ３ＹＥＬＡＮは、５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）、５％ソルビトール、０．０２％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ－８０に溶解した。そして、デュラグルチド又はＰ３ＹＥＬＡＮを皮下注射した（複数回投与）。デュラグルチドの投与量は１０ｎｍｏｌ／ｋｇ／４ｄとし、Ｐ３ＹＥＬＡＮには、低投与量（１ｎｍｏｌ／ｋｇ／ｄ）、中投与量（３ｎｍｏｌ／ｋｇ／ｄ）、高投与量（６ｎｍｏｌ／ｋｇ／ｄ）を採用した。ｄａｙ０～ｄａｙ４までは、全ての動物の随時血糖を毎日モニタリングした。また、その後は、４日に１度随時血糖を測定した。このとき、測定日は、ｄａｙ６、ｄａｙ１０、ｄａｙ１４、ｄａｙ１８、ｄａｙ２２、ｄａｙ２６、ｄａｙ３０、ｄａｙ３４とした。
血糖の変化傾向は図６に示す通りとなった。結果から明らかなように、投与量が３ｎｍｏｌ／ｋｇ／ｄ又は６ｎｍｏｌ／ｋｇ／ｄの場合、Ｐ３ＹＥＬＡＮを投与した被検動物の血糖レベルは、デュラグルチド（１０ｎｍｏｌ／ｋｇ／４ｄ）の場合よりも遥かに低かった。
食事誘発性肥満（ＤＩＯ）マウスにおける体重減少実験
ＤＩＯマウスモデルの作製：約７週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに高脂質飼料（６０％ｋｃａｌ ｆｒｏｍ ｆａｔ）を与えて約１６週間飼育を続け（合計２３週間）、体重が約４５ｇとなった時点で実験を行った。ＤＩＯマウスはランダムに群分けし、各群を６匹とした。また、基礎体重に差はなく、毎日計量した。各マウスにＰ３ＹＥＬＡＮ、リラグルチド又はＰＢＳを皮下注射した。リラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）の投与量は４０ｎｍｏｌ／ｋｇ／ｄとし、グルカゴン誘導体には、低投与量（５ｎｍｏｌ／ｋｇ／ｄ）及び高投与量（２０ｎｍｏｌ／ｋｇ／ｄ）を採用した。まず、投薬日から体重の計測
を開始し、実験が終了するＤａｙ３０まで継続した。また、食物摂取の記録と計量を毎日行い、維持した。そして、実験終了後に血中脂質と空腹時血糖を測定した。Ｄａｙ２８の夜は絶食とし、Ｄａｙ２９に空腹時血糖を測定した。
ＤＩＯマウスモデルの作製：約７週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに高脂質飼料（６０％ｋｃａｌ ｆｒｏｍ ｆａｔ）を与えて約１６週間飼育を続け（合計２３週間）、体重が約４５ｇとなった時点で実験を行った。ＤＩＯマウスはランダムに群分けし、各群を６匹とした。また、基礎体重に差はなく、毎日計量した。各マウスにＰ３ＹＥＬＡＮ、リラグルチド又はＰＢＳを皮下注射した。リラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）の投与量は４０ｎｍｏｌ／ｋｇ／ｄとし、グルカゴン誘導体には、低投与量（５ｎｍｏｌ／ｋｇ／ｄ）及び高投与量（２０ｎｍｏｌ／ｋｇ／ｄ）を採用した。まず、投薬日から体重の計測
を開始し、実験が終了するＤａｙ３０まで継続した。また、食物摂取の記録と計量を毎日行い、維持した。そして、実験終了後に血中脂質と空腹時血糖を測定した。Ｄａｙ２８の夜は絶食とし、Ｄａｙ２９に空腹時血糖を測定した。
被検動物の体重変化の測定結果は図７の通りとなった。結果から明らかなように、２つの投与量群のうち、Ｐ３ＹＥＬＡＮはいずれも被検動物の体重を顕著に低下させることができ、体重減少効果はリラグルチドよりも優れていた。
被検動物の食物摂取測定の結果は図８の通りであった。結果から明らかなように、２つの投与量群のうち、Ｐ３ＹＥＬＡＮはいずれも被検動物の食物摂取量を顕著に減少させることができ、食物摂取量の減少効果はリラグルチドよりも優れていた。
被検動物の空腹時血糖の測定結果は図９の通りであった。結果から明らかなように、２つの投与量群のうち、Ｐ３ＹＥＬＡＮはいずれも被検動物の空腹時血糖を顕著に低下させることができ、空腹時血糖の低下効果はリラグルチドよりも優れていた。
以上述べたように、本発明のＰ３ＹＥＬＡＮペプチドは、従来技術におけるいくつか技術的欠点を解消しており、良好な産業上の利用価値を有する。
上記の実施例は本発明の原理と効果を例示的に説明するものにすぎず、本発明を制限するものではない。本技術を熟知する者であれば、本発明の精神及び範囲を逸脱しないことを前提に、上記の実施例を補足又は変形可能である。従って、当業者が本発明で開示した精神及び技術的思想から逸脱することなく完成させるあらゆる等価の補足又は変形もまた本発明の特許請求の範囲に含まれる。
Claims (15)
- グルカゴン様ポリペプチド及びこれに接続される長鎖脂肪酸を含むインクレチン類似物であって、
前記グルカゴン様ポリペプチドのアミノ酸配列は、式（Ｉ）の通りであり、
ＹＳＥＧＴＦＴＳＤＸ１０ＳＫＹＬＤＳＱＡＡＱＤＦＶＱＷＬＬＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＸ４０（Ｉ）
式（Ｉ）のうち、Ｘ１０はアミノ酸Ｋであり、Ｘ４０はＯＨ基又はＮＨ２基から選択され、
前記長鎖脂肪酸は、１６～２０個炭素の脂肪酸であり、
前記長鎖脂肪酸は、アダプターを介して、Ｘ １０ のアミノ酸Ｋに接続され、
前記アダプターは、－γグルタミル－である、
インクレチン類似物。 - 前記長鎖脂肪酸は、１６～２０個炭素の直鎖飽和モノカルボン酸であることを特徴とする請求項１に記載のインクレチン類似物。
- 前記長鎖脂肪酸は、１６個炭素の脂肪酸、１８個炭素の脂肪酸、又は２０個炭素の脂肪酸であることを特徴とする請求項１に記載のインクレチン類似物。
- 前記長鎖脂肪酸は、パルミチン酸、オクタデカン二酸、又はエイコサン二酸であることを特徴とする請求項１に記載のインクレチン類似物。
- 構造は式（ＩＩ）の通りであることを特徴とする請求項１に記載のインクレチン類似物。
- 請求項１～５のいずれか１項に記載のインクレチン類似物の、組成物の調製における使用であって、前記組成物は、
ヒトグルカゴン様ペプチド－１受容体、グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド受容体、及び／又はグルカゴン受容体の活性化、
代謝性疾患の予防、緩和又は治療、或いは、
食物摂取の減少、脂肪減少、体重減少又は血糖低下に用いられる使用。 - 前記代謝性疾患には、高血糖に関連する代謝性疾患、又は高脂血症に関連する代謝性疾患が含まれることを特徴とする請求項６に記載の使用。
- 前記高血糖に関連する代謝性疾患には、糖尿病、或いは糖尿病に関連するメタボリックシンドロームが含まれ、前記高脂血症に関連する代謝性疾患には、肥満、高脂血症、脂肪肝、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、低ＨＤＬコレステロール、高ＬＤＬコレステロールが含まれることを特徴とする請求項７に記載の使用。
- 前記糖尿病に関連するメタボリックシンドロームには、インスリン抵抗性、耐糖能異常が含まれ、前記脂肪肝には、非アルコール性脂肪肝疾患又は非アルコール性脂肪肝炎が含まれることを特徴とする請求項８に記載の使用。
- 請求項１～５のいずれか１項に記載のインクレチン類似物及びベクターを含む組成物であって、前記ベクターは、薬学的、食品学的又は栄養補助食品学的に許容可能なベクターである組成物。
- 請求項１～５のいずれか１項に記載のインクレチン類似物を調製する方法であって、
請求項１～５のいずれか１項に記載のインクレチン類似物におけるグルカゴン様ポリペプチドと長鎖脂肪酸を接続させることを含む方法。 - 前記長鎖脂肪酸はパルミチン酸、オクタデカン二酸、又はエイコサン二酸であり、前記接続は架橋である、請求項１１に記載の方法。
- 請求項５に記載のインクレチン類似物Ｐ３ＹＥＬＡＮを調製する方法であって、以下の工程を含む、方法。
工程１：Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｒｉｎｋ ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂の合成：
置換度０．３８ｍｍｏｌ／ｇのＲｉｎｋ ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂（天津南開和成科技有限公司）を２．６５ｇ計量して固相反応カラムに投入し、１０ｍＬのＤＣＭを加えて樹脂を３０分間膨潤させたあと、ＤＭＦで３回（毎回１０ｍＬ）洗浄する；次に、反応カラムに１５ｍＬのＤＢＬＫ溶液を加え、５分間反応させてから吸引濾過する；続いて、２０ｍＬのＤＭＦで１回洗浄してから、１５ｍＬのＤＢＬＫ溶液を加え、１０分間反応させたところ、カイザー（Ｋａｉｓｅｒ）テストで陽性となる；これを吸引濾過し、ＤＭＦで３回（毎回２０ｍＬ）洗浄する；上記とは別に、１．９１ｇのＦｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－
ＯＨ及び０．８１ｇのＨＯＢｔを計量し、１０ｍＬのＤＭＦで溶解する；これに５～８℃下で０．６９ｇのＤＩＣを加え、５ｍｉｎ活性化させたあと、上記の樹脂が充填されている反応カラムに投入して２時間反応させる；そして、カイザーテストで陰性となってから、次のペプチド樹脂の合成に直接使用する；
工程２：ペプチド樹脂の合成：
上記のＦｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｒｉｎｋ ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂（１．０ｍｍｏｌ）を計量し、反応カラムに投入して、２０ｍＬのＤＣＭで３０分間膨潤させたあと、ＤＭＦで３回（毎回２０ｍＬ）洗浄する；洗浄の完了後、反応カラムに１０ｍＬのＤＢＬＫ溶液（２０％ピペリジン／ＤＭＦ（Ｖ／Ｖ））を加え、５分間反応させてから吸引濾過する；そして、２０ｍＬのＤＭＦで１回洗浄したあと、１０ｍＬのＤＢＬＫ溶液（２０％ピペリジン／ＤＭＦ（Ｖ／Ｖ））を加えて１０分間反応させたところ、カイザーテストで陽性となる；これを吸引濾過し、ＤＭＦで３回（毎回２０ｍＬ）洗浄する；また、上記とは別に、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ（１．６９ｇ、５．０ｅｑ）、ＨＯＢｔ（０．８１ｇ、６．０ｅｑ）を計量し、１０ｍＬのＤＭＦに投入して溶解する；続いて、５～８℃下でＤＩＣ（０．６９ｇ、５．５ｅｑ）を加えて５ｍｉｎ活性化させたあと、反応カラムに投入して１時間反応させる；そして、カイザーテストで陰性となり、完全に反応してから、ＤＭＦで３回（毎回２０ｍＬ）洗浄する；上記の保護及びカップリング操作を繰り返し、ペプチドの配列に従ってその他のアミノ酸のカップリングを順次完了する；Ｘ１０には、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｐａｌ－Ｇｌｕ－ＯｔＢｕ）－ＯＨ（成都鄭源生化科技有限公司）を用いてカップリングを行う；最後のアミノ酸のカップリングが完了したあと、上記の保護方法で保護し、完全に保護されてから、順に、ＤＭＦ洗浄を２回、ＭｅＯＨ洗浄を２回、ＤＣＭ洗浄を２回、ＭｅＯＨ洗浄を２回行う；なお、洗浄溶媒は毎回２０ｍＬとする；そして、材料を回収し、常温で減圧乾燥させて目標のペプチド樹脂Ｐ３ＹＥＬＡＮを取得する - 請求項１～５のいずれか１項に記載のインクレチン類似物、又は請求項１０に記載の組成物の、食物摂取の減少、脂肪減少、体重減少又は血糖低下のための医薬品の製造における使用。
- 請求項１～５のいずれか１項に記載のインクレチン類似物、又は、
請求項１０に記載の組成物を含む、薬剤キット。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010269596.0 | 2020-04-08 | ||
| CN202010269596.0A CN113493503B (zh) | 2020-04-08 | 2020-04-08 | 一种肠促胰岛素类似物及其制备方法和用途 |
| PCT/CN2021/078194 WO2021203864A1 (zh) | 2020-04-08 | 2021-02-26 | 一种肠促胰岛素类似物及其制备方法和用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2023525467A JP2023525467A (ja) | 2023-06-16 |
| JP7483040B2 true JP7483040B2 (ja) | 2024-05-14 |
Family
ID=77995754
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2022561670A Active JP7483040B2 (ja) | 2020-04-08 | 2021-02-26 | インクレチン類似物とその調製方法及び使用 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20230218721A1 (ja) |
| EP (1) | EP4119572A4 (ja) |
| JP (1) | JP7483040B2 (ja) |
| CN (1) | CN113493503B (ja) |
| AU (1) | AU2021251791B2 (ja) |
| WO (1) | WO2021203864A1 (ja) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012530145A (ja) | 2009-06-16 | 2012-11-29 | インディアナ・ユニバーシティ・リサーチ・アンド・テクノロジー・コーポレーション | Ｇｉｐ受容体活性グルカゴン化合物 |
| JP2016501256A (ja) | 2012-12-11 | 2016-01-18 | メディミューン リミテッド | 肥満を治療するためのグルカゴン／ｇｌｐ−１アゴニスト |
| WO2019101035A1 (zh) | 2017-11-24 | 2019-05-31 | 浙江道尔生物科技有限公司 | 一种治疗代谢疾病的胰高血糖素类似物 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SI2864350T1 (en) * | 2012-06-21 | 2018-08-31 | Indiana University Research And Technology Corporation | GLUCAGON ANALOGUE ANALOGUE WITH ACTIVITY OF GIP RECEPTOR |
| JOP20200119A1 (ar) * | 2015-01-09 | 2017-06-16 | Lilly Co Eli | مركبات مساعد مشترك من gip وglp-1 |
| SG11201806342SA (en) * | 2016-03-10 | 2018-08-30 | Medimmune Ltd | Glucagon and glp-1 co-agonists for the treatment of obesity |
| CN116143939A (zh) * | 2017-11-24 | 2023-05-23 | 浙江道尔生物科技有限公司 | 一种治疗代谢疾病的多重活性蛋白 |
-
2020
- 2020-04-08 CN CN202010269596.0A patent/CN113493503B/zh active Active
-
2021
- 2021-02-26 AU AU2021251791A patent/AU2021251791B2/en active Active
- 2021-02-26 EP EP21784999.1A patent/EP4119572A4/en active Pending
- 2021-02-26 US US17/916,169 patent/US20230218721A1/en active Pending
- 2021-02-26 WO PCT/CN2021/078194 patent/WO2021203864A1/zh unknown
- 2021-02-26 JP JP2022561670A patent/JP7483040B2/ja active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012530145A (ja) | 2009-06-16 | 2012-11-29 | インディアナ・ユニバーシティ・リサーチ・アンド・テクノロジー・コーポレーション | Ｇｉｐ受容体活性グルカゴン化合物 |
| JP2016501256A (ja) | 2012-12-11 | 2016-01-18 | メディミューン リミテッド | 肥満を治療するためのグルカゴン／ｇｌｐ−１アゴニスト |
| WO2019101035A1 (zh) | 2017-11-24 | 2019-05-31 | 浙江道尔生物科技有限公司 | 一种治疗代谢疾病的胰高血糖素类似物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20230218721A1 (en) | 2023-07-13 |
| EP4119572A1 (en) | 2023-01-18 |
| CN113493503B (zh) | 2022-08-05 |
| WO2021203864A1 (zh) | 2021-10-14 |
| JP2023525467A (ja) | 2023-06-16 |
| CN113493503A (zh) | 2021-10-12 |
| AU2021251791B2 (en) | 2023-09-07 |
| AU2021251791A1 (en) | 2022-11-10 |
| EP4119572A4 (en) | 2024-04-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100593348B1 (ko) | 글루카곤-유사 펩티드-1 유사체 | |
| EP1294757B1 (en) | Glucagon-like peptide-1 analogs | |
| CN109836488B (zh) | 一种治疗代谢疾病的胰高血糖素类似物 | |
| CN111253475B (zh) | Glp-1激动多肽化合物及其盐与合成方法及用途 | |
| CN111349155B (zh) | 一种胰高血糖素类似物及其制备方法和用途 | |
| JP7324530B2 (ja) | 新型ポリペプチド及びその治療用途 | |
| JP2022551233A (ja) | 異なる構造のｇｌｐ－１アナログペプチド修飾二量体およびその調製方法のｉｉ型糖尿病の治療における用途 | |
| CN113429471B (zh) | 长效glp-1多肽类似物及其制备方法和应用 | |
| KR20210110252A (ko) | 폴리펩티드를 포함하는 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 | |
| JP2008546816A (ja) | エキセンディン４ポリペプチドフラグメントおよびその使用 | |
| KR20240013798A (ko) | 다중 작용제 및 이의 사용 | |
| CN113105561A (zh) | 一种双靶点融合蛋白的制备方法和应用 | |
| JP7483040B2 (ja) | インクレチン類似物とその調製方法及び使用 | |
| WO2015149627A1 (zh) | 结构修饰的glp-1类似物及其制备方法 | |
| CN114981294B (zh) | 一种长效胰高血糖素衍生物 | |
| KR20120116942A (ko) | 폴리펩티드 접합체 | |
| US20230183310A1 (en) | Polypeptide Compounds and Use Thereof in the Prevention or Treatment of Diabetes or Diabetic Complications | |
| CN114685642B (zh) | 一种肠促胰岛素类似物药学上可接受盐及制备方法和用途 | |
| CN116589536B (zh) | 一类长效glp-1/gip受体双重激动剂及其应用 | |
| CN113754752B (zh) | 一种多肽及其制备方法与应用 | |
| RU2773242C2 (ru) | Ацилированное производное GLP-1 | |
| CN114106194A (zh) | 一种用于治疗糖尿病和/或肥胖症的融合蛋白 | |
| TW202411244A (zh) | Ｇｌｐ－１／ｇｉｐ雙激動劑及其製備方法和用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20221011 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230913 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20231212 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20240213 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20240403 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20240430 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7483040 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |