JP2022551233A

JP2022551233A - 異なる構造のｇｌｐ－１アナログペプチド修飾二量体およびその調製方法のｉｉ型糖尿病の治療における用途

Info

Publication number: JP2022551233A
Application number: JP2022519333A
Authority: JP
Inventors: 松山唐; 群羅; 旭東張; ▲セイ▼▲ケン▼ 唐; 莉楊; 宏梅譚
Original assignee: 南京楓▲ケイ▼生物医薬科技有限公司
Priority date: 2019-10-12
Filing date: 2020-11-09
Publication date: 2022-12-08
Also published as: AU2020363561A1; CN112898406B; US20240150423A1; WO2021068986A1; CN112898406A; CN110845601A; GB202205324D0; GB2604251A; CN110845601B; CA3154519A1

Abstract

本発明は、ＩＩ型糖尿病の治療において膵臓保護または血糖降下効果における異なる構造の新規グルカゴンアナログペプチド-１脂肪酸修飾または非修飾二量体の用途を提供する。本発明の二量体は、システインを含有する２つのＧＬＰ-１単量体をシステイン酸化によって形成されたジスルフィド結合を介して接続することによって形成される。本発明のＨ型ＧＬＰ-１ホモ二量体（ペプチド鎖内にジスルフィド結合が形成される）は、活性を低下させることなくＧＬＰ-１二量体の血糖降下持続時間を顕著に増加させ、提供されるＧＬＰ-１アナログ二量体のインビボ持続活性は最大１９日であり、陽性対照薬であるリラグルチドの３日のインビボ活性、またはこれまでに報告されている長時間作用型ＧＬＰ－１アナログペプチドよりも顕著に延長し、長時間作用型ＧＬＰ－１薬の技術的進歩を大幅に促進し、それらの臨床的応用と普及に便利である。同時に、Ｕ型ホモ二量体（ペプチド鎖のＣ末端にジスルフィド結合が形成される）は血糖に影響を与えないが、膵臓腺房や脈管などの外分泌細胞を保護し、膵臓の機能を保護する。【選択図】なし

Description

本発明は、医薬学および生物学の分野に属し、具体的には、様々な新規のヒトＧＬＰ－１アナログペプチド単量体またはホモ二量体の調製および糖尿病治療における用途に関する。

プログルカゴンタンパク質由来のグルカゴンアナログペプチド－１（ＧＬＰ－１）は、栄養素を摂取すると腸内Ｌ細胞から放出される３０アミノ酸残基のインクレチンアナログペプチドである。膵臓のβ細胞インスリン分泌を増強し、インスリン発現および末梢グルコース利用を増加させ、β細胞アポトーシスを阻害し、満腹感およびβ細胞再生を促進し、グルカゴン分泌を減少させ、そして胃内容排出を遅らせる。これらの複数の効果により、ＧＬＰ－１受容体アゴニストは２型糖尿病の治療において重要になる。現在ＦＤＡが承認しているＧＬＰ-１アナログには、１日１回投与用のＬｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ（リラグルチド）、１日２回投与用のＥｘｅｎａｔｉｄｅおよび週１回投与用のＡｌｂｉｇｌｕｔｉｄｅ, Ｄｕｌａｇｌｕｔｉｄｅ, ＥｘｅｎａｔｉｄｅＬＡＲ, Ｌｉｘｉｓｅｎａｔｉｄｅ, Ｓｅｍａｇｌｕｔｉｄｅ, Ｔａｓｐｏｇｌｕｔｉｄｅが含まれている。

Ｅｘｅｎｄｉｎ-４はＨｅｌｏｄｅｒｍａｓｕｓｐｅｃｔｕｍ唾液から単離されたインクレチン類似体であり、３９アミノ酸が含まれ、ＧＬＰ-１と５３％の配列相同性がある。Ｅｘｅｎａｔｉｄｅは、Ｅｘｅｎｄｉｎ-４合成分子であり、半減期が長く（３．３～４．０時間）、長時間作用型の血糖降下効果を持ち、１日２回投与される。

Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅは、ネイティブのヒトＧＬＰ-１と９７％の相同性を持つＧＬＰ-１類似体である。それは、Ａｒｇ→^３４Ｌｙｓ置換と^２６Ｌｙｓに追加されたグルタミルパルミトイル鎖を含む。皮下注射後、最終的な排泄半減期は平均１３時間であり、１日１回の投与が可能であり、その薬物動態特性は年齢、性別、腎機能または肝機能の影響を受けない。

ＰＢ-１０５は、Ｅｘｅｎａｔｉｄｅの３９位でシステインを置換し、システイン特異性ポリエチレングリコール化修飾して、ＰＢ-１１０（ＰＥＧ５ｋｄ）、ＰＢ-１０６（ＰＥＧ２０ｋｄ）、ＰＢ-１０７（ＰＥＧ３０ｋｄ）、およびＰＢ-１０８（ＰＥＧ４０ｋｄ）を調製することによって調製される。ＰＢ-１０６の血漿Ｔ１／２はＰＢ-１０５の約１０倍であり、より良好な血糖降下効果を示しているが、ミリグラムあたりの血糖降下効果（比放射能）は９０％以上減少する。

Ｌｉｘｉｓｅｎａｔｉｄｅは、３８位にプロリンがなく、３９位に６つのリジン残基が付加されていることを除いて、構造がＥｘｅｎｄｉｎ-４と類似している４４アミノ酸を含む新規の長時間作用型ＧＬＰ-１Ｒアゴニストである。２４週間の臨床使用中、Ｌｉｘｉｓｅｎａｔｉｄｅの１日１回の注射は活性を有意に低下させ、Ｌｉｘｉｓｅｎａｔｉｄｅ群と対照群の間で有害事象の発生率（Ｌｉｘｉｓｅｎａｔｉｄｅ２．５％、プラセボ１．９％）、症候性低血糖の発生率（Ｌｉｘｉｓｅｎａｔｉｄｅ３．４％、プラセボ１．２％）が類似している。

ＢＰＩ-３０１６は、ヒトＧＬＰ-１の８位（Ａｌａ）と８～９位（ＧＬＵ）の間の結合（ＤＩＭ）を構造的に変更する。^８Ａｌａ中の-ＣＨ３側鎖が-ＣＦ３で置換され、結合中のカルボニル基がメチル基に変換され、パルミトイル化Ｌｙｓ→^２６Ａｒｇ置換とＣ端Ｇｌｙ増加を採用している。単回投与後、糖尿病性カニクイザルにおけるＢＰＩ-３０１６の半減期が９５時間を超え、１週間後ＦＰＧおよび食後血糖（ＰＰＧ）、肥満度指数（ＢＭＩ）、体脂肪が有意に減少し、耐糖能が改善され、インスリン増加効果が示されている。

Ａｌｂｉｇｌｕｔｉｄｅは、ヒトＧＬＰ-１遺伝子とヒトアルブミン遺伝子の２つのリンクされたコピーからなる組換え融合タンパク質である。Ｇｌｙ→^８Ａｌａ置換はＤＰＰ-４加水分解に対する耐性を付与し、週１回の投与が可能である。研究によると、Ａｌｂｉｇｌｕｔｉｄｅは血糖パラメータ（ＨｂＡ１ｃ、ＰＰＧ、ＦＰＧ）を低下させることによって、グルコース依存性のインスリン分泌を促進し、胃内容排出を遅らせることが示される。

Ｄｕｌａｇｌｕｔｉｄｅは、Ｆｃフラグメントに融合したＧＬＰ-１類似体であり、その構造はＧｌｙ^８Ｇｌｕ^２２Ｇｌｙ^３６-ＧＬＰ-１(７-３７)-(Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ)_３-Ａｌａ-Ａｌａ^{２３４,２３５}Ｐｒｏ^２２８-ＩｇＧ４-Ｆｃである。Ｄｕｌａｇｌｕｔｉｄｅは週に１回投与される。プラセボ、メトホルミン、インスリングラルギン、シタグリプチン、およびＥｘｅｎａｔｉｄｅと比較すると、Ｄｕｌａｇｌｕｔｉｄｅは比較的高いＨｂＡ１ｃ低下を示す。Ｄｕｌａｇｌｕｔｉｄｅは、Ｔ２Ｄの治療において体重減少、腎臓病進行の遅延、心筋梗塞の発生率低下、血圧降下など様々な治療効果がある。

Ｓｅｍａｇｌｕｔｉｄｅは、ＧＬＰ－１長時間作用型アナログペプチドであり、Ａｉｂ→^８Ａｌａ置換と^２６Ｌｙｓ長いリンカー(２ｘＡＥＥＡＣ-δ-ｇｌｕｔａｍｙｌ-α-ｏｌｅｉｃｄｉａｃｉｄ)を有する。それは９４％のＧＬＰ－１相同性を維持する。Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅと比較すると、Ｓｅｍａｇｌｕｔｉｄｅの活性が３倍低下するが、アルブミン結合力が増加し、１６５～１８４時間の半減期(７日間)があると推定される。ＳｅｍａｇｌｕｔｉｄｅはＨｂＡ１ｃと体重の有意な減少を示す。

Ｔａｓｐｏｇｌｕｔｉｄｅはα-アミノイソ酪酸Ａｉｂ→^８Ａｌａと^３５ＧｌｙのｈＧＬＰ-１(７-３６)ＮＨ_２を含む。ＴａｓｐｏｇｌｕｔｉｄｅはＧＬＰ-１Ｒに対して強い親和定数を持ち、アミノジペプチダーゼに対して完全に耐性がある。２４週間の臨床研究で、ＴａｓｐｏｇｌｕｔｉｄｅはＨｂＡ１ｃ、ＦＰＧと体重の有意な減少を示しているが、副作用は明らかである。

現在の長時間作用型アクチベーターは活性（ミリグラムあたりの血糖降下効果）、投与量、体重減少、および副作用の点でＬｉｒａｇｌｕｔｉｄｅまたはネイティブＧＬＰ－１よりも効果が低いことが示されているため、ＧＬＰ-１アナログ研究は依然として最適化する必要があり、例えば２６週間の試験では、Ａｌｂｉｇｌｕｔｉｄｅの体重減少が０．６ｋｇで、Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅは２．２ｋｇであり、Ｄｕｌａｇｌｕｔｉｄｅ群の体重減少が２．９ｋｇでＬｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ群は３．６ｋｇであった。げっ歯類動物では、Ｓｅｍａｇｌｕｔｉｄｅ用量および治療期間に依存する甲状腺Ｃ細胞腫瘍を引き起こす。臨床研究によると、５７．２％が正常な腎機能を持ち、３５．９％が軽度の障害を持ち、６．９％が中程度の障害を持っていることが示されている。悪心、嘔吐、下痢、腹痛、便秘などの胃腸の副作用は、プラセボ群よりもＳｅｍａｇｌｕｔｉｄｅを服用している患者でより頻繁に発生する（プラセボ群１５．３％、Ｓｅｍａｇｌｕｔｉｄｅ群０．５と１ｍｇ群３２．７％と３６．４％）。Ｓｅｍａｇｌｕｔｉｄｅをスルホニル尿素剤と併用した場合、０．８～１．２％の患者で重度の低血糖が発現され、注射部位の不快感と紅斑が０．２％で、患者の平均アミラーゼが１３％増加し、リパーゼが２２％増加した。胆石症の発生率がそれぞれ１．５％と０．４％であった。

本発明の目的は、上記の先行技術の欠点を克服して、グルカゴンアナログペプチド－１アナログペプチド単量体およびそのホモ二量体を提供することである。

本発明の第１目的は、グルカゴンアナログペプチド－１アナログペプチド単量体を提供することであり、前記グルカゴンアナログペプチド－１アナログペプチドのアミノ酸配列は以下の４つのいずれか１つである、

(１)Ｈｉｓ-Ｘ_８-Ｇｌｕ-Ｇｌｙ-Ｔｈｒ-Ｐｈｅ-Ｔｈｒ-Ｃｙｓ-Ａｓｐ-Ｖａｌ-Ｓｅｒ-Ｓｅｒ-Ｔｙｒ-Ｌｅｕ-Ｇｌｕ-Ｇｌｙ-Ｇｌｎ-Ａｌａ-Ａｌａ- Ｘ_２６-Ｇｌｕ-Ｐｈｅ-Ｉｌｅ-Ａｌａ-Ｔｒｐ-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-Ｘ_３４-Ｘ_３５-Ａｒｇ-Ｘ_３７；または

(２)Ｈｉｓ-Ｘ_８-Ｇｌｕ-Ｇｌｙ-Ｔｈｒ-Ｐｈｅ-Ｔｈｒ-Ｓｅｒ-Ａｓｐ-Ｖａｌ-Ｃｙｓ-Ｓｅｒ-Ｔｙｒ-Ｌｅｕ-Ｇｌｕ-Ｇｌｙ-Ｇｌｎ-Ａｌａ-Ａｌａ- Ｘ_２６-Ｇｌｕ-Ｐｈｅ-Ｉｌｅ-Ａｌａ-Ｔｒｐ-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-Ｘ_３４-Ｘ_３５-Ａｒｇ-Ｘ_３７；または

(３)Ｈｉｓ-Ｘ_８-Ｇｌｕ-Ｇｌｙ-Ｔｈｒ-Ｐｈｅ-Ｔｈｒ-Ｓｅｒ-Ａｓｐ-Ｖａｌ-Ｓｅｒ-Ｃｙｓ-Ｔｙｒ-Ｌｅｕ-Ｇｌｕ-Ｇｌｙ-Ｇｌｎ-Ａｌａ-Ａｌａ- Ｘ_２６-Ｇｌｕ-Ｐｈｅ-Ｉｌｅ-Ａｌａ-Ｔｒｐ-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-Ｘ_３４-Ｘ_３５-Ａｒｇ-Ｘ_３７；または

(４)Ｈｉｓ-Ｘ_８-Ｇｌｕ-Ｇｌｙ-Ｔｈｒ-Ｐｈｅ-Ｔｈｒ-Ｓｅｒ-Ａｓｐ-Ｖａｌ-Ｓｅｒ-Ｓｅｒ-Ｔｙｒ-Ｌｅｕ-Ｇｌｕ-Ｇｌｙ-Ｇｌｎ-Ａｌａ-Ａｌａ- Ｘ_２６-Ｇｌｕ-Ｐｈｅ-Ｉｌｅ-Ａｌａ-Ｔｒｐ-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-Ｘ_３４-Ｘ_３５-Ａｒｇ-Ｇｌｙ-Ｃｙｓ-ＯＨ；
ただし、Ｘ_８はＬ-α-アラニン（Ａｌａ）またはβ-アラニン（βＡｌａ）またはα-またはβ-アミノイソ酪酸（αまたはβＡｉｂ）であり、
Ｘ_２６はリジン、側鎖εアミノがアルカン酸グルタミルで修飾されたリジンまたは側鎖εアミノがアルカン酸基で修飾されたリジンであり、
Ｘ_３４はＡｒｇ、Ｌｙｓまたは側鎖εアミノがアルカン酸グルタミルで修飾されたリジンであり、
Ｘ_３５はＧｌｙまたはＡｌａまたはβ-アラニンまたはα-アミノイソ酪酸またはβ-アミノイソ酪酸であり、

Ｘ_３７はＧｌｙ-ＣＯＯＨ（グリシンカルボキシル末端）またはＧｌｙ-ＮＨ_２（グリシンアミド化末端）またはＮＨ_２（第３６位アルギニンアミド化末端）またはＯＨ（第３６位アルギニンカルボキシル末端）構造であり、またはアロステリックな第１目的によって提供される最初の７～３６位アミノ酸配列が同様の繰り返し配列のコピーで構成され、繰り返し配列中の第８位（Ｘ_８）アラニンがグリシンまたはα-またはβ-アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）で置換され、システインがセリンまたはグリシンで置換され、繰り返し配列中のＸ_２６がアルギニンであり、またはＣ末端アミド基とポリエチレングリコール分子が接続されてＰＥＧ化修飾を形成し、前記ＰＥＧ分子量が０．５～３０ＫＤである。

好ましくは、前記Ｘ_２６は側鎖εアミノがアルカン酸グルタミル［γ-Ｇｌｕ(Ｎ-α-アルカン酸基)］で修飾されたリジンである場合、その構造式が式１で示され、前記Ｘ_２６は側鎖εアミノがアルカン酸基で修飾されたリジンである場合、その構造式が式２で示され、式１、２においてｎ=１４または１６である。

本発明の第２目的は、グルカゴンアナログペプチド－１アナログペプチドホモ二量体を提供することであり、前記二量体は２つの前記の単量体をシステインによって形成されたジスルフィド結合を介して接続することによって形成され、Ｈ型またはＵ型グルカゴンアナログペプチド－１アナログペプチドホモ二量体を構成する。

好ましくは、前記二量体のアミノ酸配列は以下の４つのいずれか１つである、

ただし、Ｘ_８はＬ-α-アラニン（Ａｌａ）またはβ-アラニン（βＡｌａ）またはα-またはβ-アミノイソ酪酸（αまたはβＡｉｂ）であり、
Ｘ_２６はリジン、側鎖εアミノがアルカン酸グルタミルで修飾されたリジンまたは側鎖εアミノがアルカン酸基で修飾されたリジンであり、
Ｘ_３４はＡｒｇ、Ｌｙｓまたは側鎖εアミノがアルカン酸グルタミルで修飾されたリジンであり、
Ｘ_３５はＧｌｙまたはＡｌａまたはβ-アラニンまたはα-またはβ-アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）であり、
Ｘ_３７はＧｌｙ-ＣＯＯＨ（グリシンカルボキシル末端）またはＧｌｙ-ＮＨ_２（グリシンアミド化末端）またはＮＨ_２（第３６位アルギニンアミド化末端）またはＯＨ（第３６位アルギニンカルボキシル末端）構造であり、またはアロステリックな第１目的によって提供される最初の７～３６位アミノ酸配列が同様の繰り返し配列のコピーで構成され、繰り返し配列中の第８位（Ｘ_８）アラニンがグリシンまたはα-またはβ-アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）で置換され、システインがセリンまたはグリシンで置換され、繰り返し配列中のＸ_２６がアルギニンであり、またはＣ末端アミド基とポリエチレングリコール分子が接続されてＰＥＧ化修飾を形成し、前記ＰＥＧ分子量が０．５～３０ＫＤである。

本発明の第３目的は、上記の単量体のグルカゴンアナログペプチド－１アナログペプチド、または上記の二量体ＧＬＰ－１アナログペプチドのＩＩ型糖尿病の治療において膵臓保護または／および血糖降下薬物の調製における応用を提供することである。

本発明の第４目的は、膵臓保護またはＩＩ型糖尿病治療薬物を提供することであり、この薬物は上記の単量体のグルカゴンアナログペプチド－１アナログペプチド、または上記の二量体グルカゴンアナログペプチド－１アナログペプチドを活性成分として使用する。

本発明は以下の有利な効果を有する。本発明のＨ様ＧＬＰ-１アナログホモ二量体は、活性を低下させることなく、単量体ＧＬＰ-１ペプチドを保護する血糖降下効果の時間を有意に２～４倍延長し（つまり、二量体ペプチドは比活性を大幅に増加させる）、ＦＤＡに承認されたＦＤＡアクチベーター薬物も大幅に延長する。提供されるＧＬＰ-１アナログホモ二量体は、インビボの活性を最大１９日維持し、陽性薬であるＬｉｒａｇｌｕｔｉｄｅよりも顕著に延長し、明らかに技術の進歩を促進し、その臨床応用と市場普及を大幅に促進する。Ｕ様二量体は血糖値に影響を与えないが、明らかに膵臓腺房や脈管などの外分泌細胞を保護し、膵臓の機能を保護し、膵臓関連疾患の治療に使用できる。

単一ＯＧＴＴの血糖テスト結果の概略図。複数のＯＧＴＴ試験中の２Ｇ２～２Ｇ８の体重変化の概略図。２Ｇ３のＴ２Ｄモデル治療場合の体重変化の概略図。２Ｇ３のＴ２Ｄモデル治療中の血糖降下効果の概略図。Ｔ２Ｄモデルで治療された膵臓組織Ｈ-Ｅ染色結果の概略図。二量体２Ｇ３のＴ２Ｄモデル治療中のＫｉ６７タンパク質発現の概略図。二量体２Ｇ１のＴ２Ｄモデル治療中のＫｉ６７タンパク質発現の概略図。ＴＵＮＥＬ染色分析結果の概略図。ＧＬＰ-１Ｒ染色分析結果の概略図。ＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔによるＧＬＰ-１Ｒの分析結果の概略図。インスリン染色分析結果の概略図（Ａ：インスリン染色；Ｂ：インスリン染色分析；Ｃ：膵島数分析）。

本発明の技術的解決策、目的および利点をより簡潔かつ明確に説明するために、以下、具体的な実施例および添付の図面を参照して本発明をより詳しく説明する。
実施例１単量体ペプチドと二量体の調製

一、単量体ペプチド固相合成プロセス：手動固相ポリペプチド合成操作ステップ。
１、樹脂膨潤：ジクロロ樹脂（Ｃ末端カルボキシルはジクロロベンジル樹脂から由来）またはアミノ樹脂（Ｃ末端アミド化配列はアミノ樹脂から由来）（中国天津市南開合成科学技術有限責任会社から購入）を反応ポットに入れ、ジクロロメタン（ＤＣＭ、ＤｉｋｍａＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．）１５ｍｌ／ｇ樹脂を加え、３０分振動する。ＳＹＭＰＨＯＮＹ型１２チャンネルポリペプチドシンセサイザーを使用する(ＳＹＭＰＨＯＮＹ番号、ソフトウェアＶｅｒｓｉｏｎ．２０１、ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．)。

２、第１のアミノ酸の結合：サンドコア吸引ろ過によって溶媒を除去し、３倍モルのＣ端第１のＦｍｏｃ-ＡＡアミノ酸（すべてのＦｍｏｃ-アミノ酸が蘇州天馬医薬集団精細化学用品有限責任会社から提供される）を加え、１０倍モルの４-ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）和Ｎ,Ｎ'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を加え、最後にジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を加え（ＤｉｋｍａＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．から購入）溶解し、３０分振動。無水酢酸で密閉する。

３、脱保護：ＤＭＦを除去し、２０％ピペリジン-ＤＭＦ溶液(１５ｍｌ／ｇ)を加え、５分後溶媒を濾過して除去し、２０％ピペリジン-ＤＭＦ溶液(１５ｍｌ／ｇ)を加え、１５分を待つ。ピペリジンはＳｉｎｏｐｈａｒｍＳｈａｎｇｈａｉＣｈｅｍｉｃａｌＲｅａｇｅｎｔＣｏｍｐａｎｙから提供される。

４、検出：溶媒を除去する。１０個以上の樹脂を取り、エタノールで３回洗浄し、ニンヒドリン、ＫＣＮ、フェノール溶液を１滴ずつ加え、１０５～１１０℃で５分間加熱し、陽性反応として青色に変える。

５、樹脂洗浄：ＤＭＦ(１０ｍｌ／ｇ)で２回洗浄し、メタノール(１０ｍｌ／ｇ)で２回洗浄し、ＤＭＦ(１０ｍｌ／ｇ)で２回洗浄する。

６、縮合：具体的な合成条件に応じて、以下の方法をポリペプチド合成において単独または組み合わせて使用することができる。方法ａ：３倍量の保護アミノ酸と三倍量の２-(７-アゾベンゾトリアゾール)- テトラゾリウムメチル尿素ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ、蘇州天馬医薬集団精細化学品有限責任会社）を可能な限り少量のＤＭＦで溶解し、反応ポットに入れる。すぐに１０倍量のＮ-メチルモルホリン（ＮＭＭ、蘇州天馬医薬集団精細化工有限責任会社）を加え３０分反応した後、検出は陰性である。

方法ｂ：３倍量の保護アミノ酸ＦＭＯＣ-ＡＡと３倍量１-ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、蘇州天馬医薬集団精細化学品有限責任会社）を可能な限り少量のＤＭＦで溶解し、反応管に入れ、すぐに３倍量のＮ,Ｎ'-ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を加え３０分反応させ、検出は陰性である。

７、樹脂洗浄：ＤＭＦ(１０ｍｌ／ｇ)で１回洗浄し、メタノール(１０ｍｌ／ｇ)で２回洗浄し、ＤＭＦ(１０ｍｌ／ｇ)で２回洗浄する。

８、２～６の操作を繰り返し、表１中のアミノ酸の側鎖修飾のないＧＬＰ-１ペプチド、または側鎖修飾のあるＧＬＰ-１ペプチドに示すように、右から左に順番対応のアミノ酸が結合される。Ｋ_２６またはＫ_３４で修飾された場合は、以下の９方法で合成する。

９、Ｋ_２６および／またはＫ_３４［Ｎ-ε-(Ｎ-α-アルカン酸-Ｌ-γ-ｇｌｕｔａｍｙｌ)］の合成：１０ｍｌ２％ヒドリン水和物を加え３０分反応させ、Ｆｍｏｃ-Ｌｙｓ(Ｄｄｅ)-ＯＨの保護基Ｄｄｅを除去し、側鎖アミノを露出させ、ＤＭＦとメタノールで交互に６回洗浄し、ニンヒドリンで検出すると青色である。５５０ｍｇのＦｍｏｃ-ＧＬＵ-ＯＴＢＵ、２５０ｍｇのＨＯＢＴを秤量し、ＤＭＦで溶解し、０．３ｍｌのＤＩＣを加え、均一に混合した後、反応器に入れてリジン側鎖アミノと１ｈ反応させ、排出し、ＤＭＦで４回洗浄し、ニンヒドリンで検出すると無色である。反応器に５ｍｌ２０％ピペリジンＤＭＦ溶液を加え２０分間反応させ、Ｆｍｏｃ-ＧＬＵ-ＯＴＢＵのアミノ保護集団Ｆｍｏｃを除去し、ＤＭＦとメタノールで交互に６回洗浄し、ニンヒドリンで検出すると青色である、３００ｍｇのパルミチン酸、２５０ｍｇのＨＯＢＴを秤量し、ＤＭＦで溶解し、０．３ｍｌのＤＩＣを加え、均一に混合した後、反応器に入れて１ｈ反応させ、排出し、ＤＭＦで４回洗浄し、ニンヒドリンで検出すると無色である；メタノールで２回洗浄して排出する。Ｋ_２６および／またはＫ_３４［Ｎ-ε-(Ｎ-α-アルカン酸)］の合成：Ｋ［Ｎ-ε-(アルカン酸)］を合成する必要がある場合、上記Ｆｍｏｃ-γ-Ｇｌｕ(ｔｂｕ)-ＯＨ一の一連反応ステップを省略し、Ｄｄｅ-Ｌｙｓ(ｆｍｏｃ)でｆｍｏｃ基を脱出した後、直接にアルカン酸基を結合する。２％ヒドリン水和物で３０分間反応させて配列リジン保護基Ｄｄｅを除去し、ステップ８によってＫ_２６および／またはＫ_３４修飾残基を結合する。

１０、縮合されたポリペプチドをＤＭＦ(１０ｍｌ／ｇ)で２回洗浄し、ＤＣＭ(１０ｍｌ／ｇ)で２回洗浄し、ＤＭＦ(１０ｍｌ／ｇ)２回洗浄し、１０分間排出する。ニンヒドリンで検出すると陰性である。

１１、ペプチド鎖の最後Ｎ端アミノ酸のＦＭＯＣ保護基を脱出し、検出は陽性で、溶液を排出して用意する。

１２、以下の方法で樹脂を洗浄し、ＤＭＦ(１０ｍｌ／ｇ)で２回洗浄し、メタノール(１０ｍｌ／ｇ)で２回洗浄し、ＤＭＦ(１０ｍｌ／ｇ)で２回洗浄し、ＤＣＭ(１０ｍｌ／ｇ)で２回洗浄し、１０分間排出する。

１３、樹脂からポリペプチドを切断する：切断液（１０ｍｌ／ｇ）を用意し：ＴＦＡ９４．５％(Ｊ．Ｔ．ＢａｋｅｒＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ）；水２．５％、ｅｔｈａｎｅｄｉｔｈｉｏｌ(ＥＤＴ, Ｓｉｇｍａ-ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｓｔｒｙ)２．５％とｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｓｉｌａｎｅ(ＴＩＳ, Ｓｉｇｍａ-ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｓｔｒｙ)１％を準備する。切断時間：１２０分であった。

１４、単量体ペプチド-ＰＥＧで修飾されたアナログペプチドに対して、上記の方法で合成された側鎖のない単量体ペプチドでポリペプチドＣ末端がアミドに切断された場合、Ｆｍｏｃ-ＰＡＬ-ＰＥＧ-ＰＳ樹脂を使用して両者の化学固相合成を行う。合成後、得られた側鎖保護基のポリペプチド樹脂を熱分解して、ＰＥＧ修飾単量体ペプチドを取得し、ＰＥＧ分子量が０．５～３０ＫＤである。

１５、乾燥と洗浄：ライセートを窒素で可能な限り乾燥し、エーテルで６回洗浄した後、室温で蒸発させて乾燥する。

１６、以下の方法ＨＰＬＣでポリペプチドを精製し、同定して-２０℃で暗所で保管する。

二、単量体ペプチドの遺伝子組換え-化学修飾方法による調製:本明細書で保護されているいくつかの単量体ペプチドは上記の固相合成によって合成されるか、遺伝子組換えと化学修飾方法によって合成されることができ、Ｇ３とＧ９配列を例にすると：遺伝子組換え：遺伝子コード化能力のあるアロステリックＧ３単量体ペプチドまたは類似の１つまたは２つのコピー（Ｇ９ペプチド）のＤＮＡ配列をｐＭＤ-１８プラスミドに挿入し、ＫＰＮＩとＥｃｏＲＩ二重酵素で切断した後回収し、ｐＥＴ３２ａプラスミドについて同様に二重酵素で切断した後大きなセグメントを回収した。Ｔ４リガーゼの作用下で、標的ペプチド遺伝子セグメントとｐＥＴ３２ａセグメントを接続して、融合発現ベクターｐＥＴ３２ａ／Ｔｒｘ-ＥＫ-Ｇ３を得、ＣａＣｌ_２法で構築したプラスミドベクターを発現宿主株ＢＬ２１に形質転換した。０．５ｍＭＩＰＴＧによって誘導および発現されてＴＲＸ-ＥＫ-Ｇ３単量体ペプチド融合タンパク質を形成し、融合タンパク質をＮｉ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅでクロマトグラフィー精製した後、エンテロキナーゼ切断によってＴＲＸ-ＥＫ（チオレドキシン-ＥＫ）を除去し、組換え単量体ペプチドをＣ１８逆相カラムで精製し乾燥粉末に凍結乾燥した。側鎖リジン化学修飾：単量体ペプチド（単一^２６Ｌｙｓ構造のみ）凍結乾燥粉末（０．０１ｍｍｏｌ)を４℃の水(５ｍｌ)に溶解し、水酸化ナトリウム溶液でｐＨを１２．５に２分間調整した後、ＮＭＰ(５ｍｌ)とトリエチルアミン(２０μｌ)を加え、温度を１５℃に制御して１Ｍ酢酸溶液を加えｐＨを１０．５に調整した。Ｎ-パルミトイル（またはオレオイル）-Ｌ-グルタミン酸-５-スクシンイミジルエステル-１-メチルエステル(０．０１２ｍｍｏｌ)を加えた。２．５時間完全に反応させた後、水酸化ナトリウム溶液でｐＨを１２．８に調整し、１５℃で加水分解してメトキシ基を除去し、２時間反応させた後１Ｍ酢酸溶液でｐＨを６．８に調整した。上記の混合物をＣ４カラムで洗浄し、５％アセトニトリル-水溶液でＮＭＰを除去した後、５０％アセトニトリル-水溶液で溶出し、減圧下で回転しながら濃縮した後、ＲＰ-ＨＰＬＣで精製し、純度が９５％を超え、サンプルを凍結乾燥してパルミル化またはオレオイル化ＧＬＰ－１アナログペプチド単量体固体を得た。
検査方法は以下の通りである：

１、ＨＰＬＣでポリペプチドを精製する：粗ペプチドを純水または少量のアセトニトリルで溶解し、以下の条件で精製する：高速液体クロマトグラフィー(分析タイプ；ソフトウェアＣｌａｓｓ-ＶＰ．ＳｅｖｉａｌＳｙｓｔｅｍ；日本ＳＨＩＭＡＤＺＵ製)、ＶｅｎｕｓｉＭＲＣ-ＯＤＳＣ１８カラム（３０×２５０ｍｍ、天津Ｂｏｎｎａ-ＡｇｅｌａＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を使用した。移動相Ａ液：０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、移動相Ｂ液：０．１％トリフルオロ酢酸-９９．９％アセトニトリル溶液（アセトニトリルＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司から購入）であった。流速：１．０ｍｌ／分、サンプル量３０ μｌ、検出波長２２０ｎｍであった。溶出手順：０～５分：９０％Ａ液+１０％Ｂ液；５～３０分：９０％Ａ液／１０％Ｂ液→２０％Ａ液／８０％Ｂ液であった。

２、最後に精製した有効溶液を凍結乾燥機(凍結乾燥機ＦｒｅｅｚｏｎｅＰｌｕｓ６番号、ＬＡＢＣＯＮＣＯ製)で凍結乾燥し、完成品を得た。

３、同定：それぞれ少量の完成品ポリペプチドを秤量し、ＨＰＬＣでその純度を分析する：カラム（４．６ｘ１５０ｍｍ）であった。移動相Ａ液：０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、移動相Ｂ液：９９．９％アセトニトリル-０．１％トリフルオロ酢酸溶液、流速：１．０ｍｌ／分、サンプル量１０ μｌ、検出波長２２０ｎｍ。溶出手順：０～５分：１００％Ａ液；５～３０分：１００％Ａ液→２０％Ａ液／８０％Ｂ液であった。測定した純度が９５％を超える必要がある。具体的な方法は中国特許ＺＬ２０１４１０６１２３８２．３を参照する。

ＭＳ法によるポリペプチド分子量の同定: 適格な純度のポリペプチドを取り、水で溶解し、５％酢酸+８％アセトニトリル+８７水を加えて溶解し、エレクトロスプレーイオン化質量分析によって分子量を測定し、具体的な方法は中国特許ＺＬ２０１４１０６１２３８２．３を参照する。

４、粉末状のポリペプチドを密封してパッケージに入れ、-２０℃で暗所で保管する。

二量体の形成：濃度１ｍｇ／ｍｌの上記の最終的に調製されたＣ端またはペプチド鎖内部にユニークなシステインを持つ単量体ペプチドを、ｐＨ=９．５の水溶液で溶解し、３７℃で４時間保持して、１００％ホモ二量体ペプチドを形成し、二量体ペプチドをＳｅｐｈａｄｅｘＧ-２５でクロマトグラフィーし分離し、同定した（２×６０ｃｍＧ-２５クロマトグラフィーカラムと自然流速下で、二量体成分は第１のピークで、残りの不純物成分が第２のピークであった）。二量体ペプチドスルフヒドリル還元剤-メルカプトエタノールを使用せずに、ペプチドＰＡＧＥ電気泳動または質量分析によって同定され、具体的な方法は中国特許ＺＬ２０１４１０６１２３８２．３を参照する。

ＧＬＰ-１アナログペプチド単量体および二量体は本研究室と一部のペプチド委託商業会社によって合成され、発明者はＨＰＬＣ純度、ＥＳＩまたはレーザー飛行質量分析およびシステイン酸化によってそれらの構造を確認した。本発明によって合成されたＧＬＰ-１アナログペプチド単量体およびホモ二量体ペプチドのアミノ酸配列は表１と表２に示される。
実施例２本発明のＧＬＰ-１単量体およびホモ二量体（Ｇ２～９と２Ｇ２～９シリーズ）血糖降下効果の持続性：

１、実験方法：広東省動物中心から正常なＫＭマウスを購入し、経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）を行って薬物の血糖降下活性と持続性を確認するために使用される。未分化の空腹時血糖によると、雄の昆明マウス（５週齢）は複数群に分かれた（ＮａＣｌ-ＰＢ群, Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ群, 単量体Ｇ２-Ｇ９シリーズと二量体２Ｇ２～２Ｇ９シリーズ群）（ｎ=６）。２回の１４時間摂食-１０時間絶食の適応期を経った後、ＫＭマウスは１０時間の絶食の後すぐに経口ブドウ糖負荷試験を受けた。同用量の単量体または二量体ペプチドを背中に皮下注射してから３０分後、マウスに５％グルコース溶液を経口投与し、３５分で尾の血糖値を正確に測定した。血糖値計と血糖値テストストリップは、ＢａｙｅｒＨｅａｔｈＣａｒｅＬＬＣの製品である。各群の平均血糖値を判定基準とした：各群のＯＧＴＴの平均血糖値がブランク対照群の平均血糖値よりも２回連続して高い場合、測定値を停止し、期間中のブランク対照群よりも低い血糖の持続時間は、薬物効果の持続時間であった。

２、実験結果
２．１経口ブドウ糖負荷試験：単回投与、単回経口ブドウ糖投与後、０、１０、２０、４０、６０、および１２０分で血糖を測定するためにマウスの尾から血液を採取した。シングルショットＯＧＴＴの結果は、２Ｇ２または２Ｇ３群のグルコースピークが１０分以内であるのに対し、ＮａＣｌ-ＰＢ、Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ、Ｇ２とＧ３群には高いピークがなく、二量体が吸収を大幅に遅らせたことを示した。時間の延長に伴い、２Ｇ２または２Ｇ３の血糖降下効果は単一のＧ２またはＧ３の血糖降下効果よりも強かったが、有意差はなかった（図１）。

同じ用量（１．１２６ｎｍｏｌ）の単回投与後、複数日のＯＧＴＴテストを数日間実施した後、単量体Ｇ２～９および二量体２Ｇ２～９の血糖降下期間の結果を表１および２に示した。平均血糖値を判断基準として、Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ陽性薬の有効期間は３日、２Ｇ２シリーズは３～１３日、２Ｇ３シリーズは１４～１７日、２Ｇ４シリーズは１２～１８日、２Ｇ５シリーズは３～８日間のみ維持され、２Ｇ６は１６～１９日維持され、２Ｇ７シリーズでは２～７日、２Ｇ８シリーズでは２～８日、および２Ｇ９シリーズの場合は４～５日で、各単量体群の期間は対応する二量体群の約１ / ２～１ / ４であった。このテストでは、Ｇ９と２Ｇ９シリーズは、Ｃ末端の延長により、血糖降下比活性が大幅に低下し、同じ用量で持続時間が短くなった。ＮａＣｌ-ＰＢ群とＬｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ群と比較すると、２Ｇ４、２Ｇ５、２Ｇ７と２Ｇ８シリーズ群のマウスの体重増加が顕著であった(Ｐ<０．０５または０．０１、０．００１)（図２）。比較の結果、２Ｇ３と２Ｇ６シリーズの二量体ペプチドの持続時間が長く、最大１９日であった。２Ｇ３シリーズ中の２Ｇ３ペプチドは１４日の持続血糖降下活性を示すだけでなく、最も明らかなのは体重持続減少も示し、さらに、Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅを陽性対照薬として選択し、それらの配列の一貫性が最も高いため、２Ｇ３ペプチドを選択してインビボＩＩ型糖尿病（Ｔ２Ｄ）の治療および後続実験に使用する。

注：表中の²⁶Lys[N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl)]と²⁶Lys[N-ε-(N-α-oleoyl-L-γ-glutamyl)]は、側鎖εアミノがアルカン酸グルタミル［γ-Glu(N-α-アルカン酸基)］で修飾されたリジンを示し、³⁴Lys[N-ε-(N-α-Palmitoyl)]と³⁴Lys[N-ε-(N-α-oleoyl)]は、側鎖εアミノがアルカン酸基で修飾されたリジンを示し、PalmitoylとOleoylはそれぞれ１6と１8炭素のアルカン酸、PEG修飾単量体ペプチドC末端アミド基を示し、“”は二量体中の2つのシステイン間に形成されたジスルフィド結合を示し、表１、2中の“（G１ペプチド）、（G9ペプチド）、（G2ペプチド）、（G3ペプチド）、（2G１ペプチド）、（2G2ペプチド）、（2G3ペプチド）、（2G4ペプチド）、（2G5ペプチド）、（2G6ペプチド）、（2G7ペプチド）、（2G8ペプチド）”はこの配列ペプチドをこのシリーズ中の代表として選択して他の実験に使用し、これらの実験および図面中の名称に対応する。
実施例3 ２型糖尿病モデルに対する二量体の治療効果

一、２型糖尿病（T2D）マウスモデルの構築
C57Bl6／Jマウスを標準的な食餌でSPFレベル環境に置かれ、水を自由に摂取できる条件を設置した。すべての実験操作は実験動物の倫理および使用制度の指導原則に従って実施された。標準食で数日給餌した後、5週齢のC57B１6／J雄のマウスをNaCl-PB、T2Dモデル対照群、Liraglutiade、低中高二量体ペプチド2G3または2G１群の6群に分かれた。NaCl-PB群はブランク対照、T2Dモデル対照群はT2Dモデル対照群であり、NaCl-PB溶液を注射した。T2Dモデル群に実験の終了まで6０ kcal％の高脂肪食餌（D１2492, 常州鼠一鼠二生物技術有限責任会社）を給餌し、ブランク対照群に実験の終了まで標準食を給餌した。糖尿病モデルの構築方法：高脂肪をマウスに4週間給餌した後、75 mg / kgストレプトゾトシン（STZ、Sigma Chemical Company、USA）を腹腔内注射し、3日後に5０ mg / kgSTZを再注射し、3週間後血中グルコースが１１mMを超えたマウスを糖尿病マウスとみなした。これらの群には高脂肪給餌に加えて35日間の治療研究が行われた。

二、２型糖尿病の治療効果
１、ペプチドの溶解度：Aibアミノ酸を含まない単量体ペプチドは水に懸濁状態を示したが、それらで構成されるすべてのホモ二量体ペプチドは水に完全に溶解した、Aibアミノ酸を含む単量体ペプチドは水に完全に溶解し、それらによって形成されたペプチドは、水にわずかに溶けにくくなった。これらのペプチドの中で、C末端アミド化ペプチドはC末端COOHペプチドよりも不溶性であった。すべての二量体ペプチドをNaCl-PB（pH8．０）に溶解して高い溶解度を達成し、2G3または2G１ペプチドの異なる用量（低、中、高用量）をそれぞれNa₂HPO₄（pH8．０）緩衝生理食塩水（NaCl-PB）に溶解して動物注射を行った。単量体ペプチドを生理食塩水（pH 6．5）に溶解して注射した。

2、投与濃度設定：予備実験では、１．１26 nmolのリラグルチドがT2D糖尿病モデル（最大2０ mMの血糖値）の食後血糖値を9-１１mMに到達させることができることを示した。この臨界値では、陽性薬物リラグルチドとGLP－１二量体の効果と用量の関係が容易に観察された。ブドウ糖負荷試験では、正常な昆明マウスマウスの臀部に１．１26 nmolのリラグルチドまたは単量体ペプチドまたは二量体化ペプチドの単回投与を皮下注射し、毎朝午前9時に血糖値を測定し秤量した。2G3二量体の構造はリラグルチドと類似しており、そのとき中国で購入可能な陽性薬はリラグルチドであったため、リラグルチドを陽性対照として選択し、同時にリラグルチドの投与方式（１日１回）を選択した。T2D治療研究中、すべてのT2Dモデルマウスの臀部に１００μlの各用量を3０分以内に皮下注射し、実験マウスの血糖値を5日ごとに測定し、測定全体を4０分以内に完了した。二量体2G3または2G１ペプチドの高、中、低用量はそれぞれ3．378, １．１26, ０．375 nmol／１００μLであり、陽性薬物リラグルチドの用量は１．１26nmol／１００μLであり（4．225 μg／１００ μL、-2０℃で保管し、製品番号：No．8-9695-０3-2０１-１、ノボノルディスク、スイス）、35日間の実験が終了するまで１日１回注射した。

3、T2D治療後の体重変化：投与前、T2Dモデル体重はNaCl-PB群よりも少なくとも2g高く、T2Dモデル群間で体重に有意差がなかった。モデル対照群と比較すると、Liraglutide群の第5、2０、25、3０、35日目に体重が急速に減少した(P<０．０5)。各2G3ペプチド群の体重は用量依存的に減少し、H-2G3（高用量）群はLiraglutide群と類似していた(図3)。2G１はU型二量体としてモデルマウス体重に有意な影響を与えず、H型二量体としての2G3とは有意に異なった。

4、T2Dモデル治療における臓器重量への影響：T2D治療実験では、リラグルチドは心臓、腎臓、肝臓、脂肪組織などの体重減少を引き起こし、リラグルチドのより強力な食事調節のメカニズムを確認した。実験群2G3では体重が用量依存的に減少し、2G3高用量群はリラグルチド群と類似しているが、ある臓器、例えば左腎臓、右精巣および脂肪組織の重量が上昇した。2G3は肝臓と脾臓の重量を増加させた(表3)。Liraglutideまたは／およびNaCl-PBまたはT2Dモデル対照群と比較すると、各2G１群は肝臓、脾臓、脂肪組織の重量の有意な増加、または右精巣と膵臓の重量の減少を示した(P<０．０5, ０．０１または０．００１)(表3を参照)。

注：P<０．０5*、０．０１*、０．００１；a、b、c、d、eはそれぞれNaCl-PB、モデル対照群、Liraglutide、L-、M-の用量群との比較を示した。

5、T2D治療中の血糖降下効果：NaCl-PB群と比較すると、T2Dモデル群糖化ヘモグロビン（HbA１c）（P <０．０１または０．００１）およびFPG（P <０．００１）を有意に低下し、T2Dモデルの調製が成功したことを示した。T2Dモデル対照群と比較すると、Liraglutide群の空腹HbA１c低下（-29％)(P＜０．０１)またはFPG低下(-5０．2％)(P<０．０１)が有意に低くなり、2G3群のHbA１c低下(-8、-23、-32％ vs L-、M-、H-用量)(P<０．０5または０．０１)またはFPG値低下(-26．3、-46．9、-47．3％)(P<０．０１)が用量依存的に減少した。動的PPG変化結果(図4)によると、T2D群は投与前のPPGに有意差がなかった。Liraglutideまたは2G3ペプチドを注射した後、Liraglutide群のPPGレベルが明らかに低下し、血糖持続低下作用を維持し、投与回数が多ければ効果が良好であった。2G3群のPPG値が用量依存的に低下し、M-2G3群の血糖変化がLiraglutide群と類似した。35日のT2D治療試験では、Liraglutide群と比較すると、H-2G3群は第5日目と第25日目のPPGレベルが低く(P<０．００１)、L-2G3群は第１０～35日目のPPGレベルがLiraglutide群(P<０．０5、０．０１または０．００１)よりも有意に高かった。第１０、2０、25日目のM-2G3群と第１5、2０日目のH-2G3群のPPGレベルはいずれもL-2G3群(P<０．０5または０．０１)よりも低かった。PPGまたはFPG、HbA１cはT2D治療において同様の変化をもたらした。2G１はT2DMモデルに血糖降下効果を及ぼしなかった。

6、T2D治療中の血液生化学的指標検出：T2D治療実験では、血液生化学的指標が大幅に変化し(表4)、モデル対照群(０．625±０．23 ng／ml)とLiraglutide群(０．595±０．2１ ng／ml)の空腹インスリンレベルがNaCl-PB群(１．4１１±3．０１ ng／ml)よりもはるかに低かった。2G3群の空腹インスリンが用量依存的に増加し(０．626±０．23、１．１4１±０．66、１．568±１．79 ng／ml)、M-またはH-2G3群のインスリン含有量が2．38倍増加し、モデル対照群、Liraglutide群とL-2G3群(P<０．０5)よりも有意に高かった。L-またはH-2G3群の血小板がNaCl-PB群または／およびモデル対照群、Liraglutide群(P<０．０5または０．０１)よりも有意に多かった。H-2G3群Hb値がNaCl-PB群(P<０．０5)よりも低かったが、RBCとWBCに影響を及ぼしなかった。2G3群のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)またはアルカリホスファターゼ(ALP)は用量依存的に低下したが、ALPはLiraglutide群(P<０．０１または０．００１)よりも有意に高かった。M-またはH-2G3群のALPまたは／およびALTレベルはいずれもNaCl-PB群(P<０．０5または０．０１)よりも低く、H-2D3群のASTまたはALTはモデル対照群(P<０．０5)よりも低かった。NaCl-PB群と比較すると、T2D群のアルブミンが有意に低下した(P<０．００１)、2G3で用量依存的に増加した。T2Dモデル群の総コレステロール、高密度リポタンパク質または低密度リポタンパク質コレステロールがNaCl-PB群よりも有意に増加した(P<０．００１)。Liraglutide群と比較すると、各2G3群の総コレステロール(P<０．００１または０．０5)と高密度リポタンパク質コレステロール(HDL-C)はいずれも有意に増加した(P<０．０5)。Liraglutide群とH-2G3群の総コレステロールまたはトリグリセリドがいずれもモデル対照群よりも有意に低かった(P<０．０5)。NaCl-PB群と比較すると、モデル対照群、M-2G3群とH-2G3群のアミラーゼが有意に増加した(P<０．０5または０．０１)。

2G１群のインスリンは用量依存的に低下した(P>０．０5)。L-2G１群のALTレベルがNaCl-PB群とLiraglutide群よりも高く、M-2G１群のALTがモデル対照群とL-2G１群よりも低かった(P<０．０5または０．０１)。M-2G１群のASTがL-2G１群よりも有意に低く(P<０．０5)、H-2G１群のASTがM-2G１群よりも有意に高かった(P<０．０5)。NaCl-PBまたはL-2G１群と比較すると、M-2G１群のALPレベルが比較的に低かった(P<０．０5)。2G１群のアルブミンは用量依存的に低下し(P<０．０ 5、０．０１または０．００１)、モデル対照群アルブミンはNaCl-PB群よりも有意に低かった(P<０．０ 5)。2G１群の血清クレアチニンがNaCl-PBまたはLiraglutide群よりも低く、用量依存的に低下した(P<０．０ 5、０．０１または０．００１)。2G１群の総コレステロール(T-CHO)またはHDL-CHOは用量依存的に低下したが、Liraglutideまたは2G１群T-CHOまたは／およびHDL-CHO、LDL-CHOレベルがNaCl-PB群よりも有意に高かった(P<０．０１または０．００１)。L-とM-2G１群のT-CHOとHDL-C-CHOレベルがLiraglutide群よりも有意に高かった(P<０．０ 5または０．０１)、2G3と同様であり、2G１はHDL合成を有意に促進した。H-2G１群のHDL-CHOがモデル対照群よりも有意に低かった(P<０．０5)。各群間のトリグリセリド(TG)に有意差がなかった。興味深いことに、NaCl-PB群と比較すると、2G１群のアミラーゼが用量依存的に低下し(P<０．０5または０．０１)、膵臓外分泌細胞に対して有意な保護作用を示した（表4を参照）。

注：P<０．０5*、０．０１*、０．００１；a、b、c、d、eはそれぞれモデル対照群、Liraglutide、L-、M-、H-の用量群との比較を示した。
実施例4 T2Dモデル治療における二量体の病理学的検出：

１、H-E染色：T2Dモデル膵臓腺房はまばらで、明らかな核濃縮と多くの病理学的液胞が見られた。モデル対照群膵島細胞は、変形し、萎縮し、核濃縮した。Liraglutide群は強い好酸球染色を示し、細胞間空間が大きくなった。 2G3または2G１ペプチド群の腺房細胞は密集しており、NaCl-PB群と比較すると、腺房細胞には病理学的な空の大砲はなかった(図5)。

2、Ki 67タンパク質蛍光染色：抗Ki 67抗体で染色して、T2Dモデル膵臓組織におけるKi 67タンパク質の分布と位置を観察した。NaCl-PB群では、散在する陽性腺房細胞が、膵島の周囲または腺管上皮および腺管近くの腺房細胞に見られた。モデル対照群は、膵島および外分泌細胞の周囲に、腺房細胞および腺房細胞などの多くの陽性腺房細胞を有していた。Liraglutide群では、小葉腺房細胞は散在する陽性分布を示し、膵島の陽性細胞は少なく、腺管上皮細胞は陽性に染色されなかった。Liraglutide群のKi 67タンパク質がNaCl-PB群またはモデル対照群よりも有意に高かった(P<０．０5)。2G3群のKi 67は用量依存的に増加した。NaCl-PB群と比較すると、L-またはH-2G3群が有意に増加し(P<０．０5)、L-2G3群とLiraglutide群間に有意差があり(P<０．００１)、2G3は膵臓または膵島細胞の増殖を促進したことを示した（図6）。

モデル対照群、Liraglutide群、H-2G１群がNaCl-PB群よりも有意に高かった(P<０．０5または０．０１)。Liraglutide群、H-2G１群がモデル対照群またはM-2G１群と比較すると、有意差があり(P<０．０5)、M-2G１群のKi 67発現がLiraglutide群よりも低かった(P<０．０１)。これらは2G１が膵臓細胞の増殖を有意に促進したことを示した(図7)。

3、TUNEL染色：モデル対照群では、小葉腺房および管上皮に多数の陽性細胞が見られ、膵臓組織に散在する膵島およびいくつかの陽性細胞が見られた。Liraglutide群では、小葉腺房に明らかな陽性細胞があり、膵島に陽性細胞が散在していたが、陽性管細胞はないか、または少なかった。2G１群では、陽性の小葉細胞はほとんどないか散在しており、管細胞はほとんどないか陽性ではなかった。2G１群のTUNEL陽性率は用量依存的に低下した。Liraglutide群、M-2G１群とH-2G１群がNaCl-PBとモデル対照群よりも有意に低かった(P<０．０5、０．０１または０．００１)。H-2G１群のTUNEL陽性率がLiraglutide群とM-2G１群よりも低かった(P<０．０１)(図8)。これは、2G１ペプチドが膵臓細胞のアポトーシスを有意に保護することを示した。各2G3群はTUNEL陽性変化を示しなかった。
実施例5 グルカゴンアナログペプチド-１受容体（GLP-１R）分析

１、免疫組織化学的（IHC）染色：2G3群のGLP-１Rは用量依存的に増加した。モデル対照群と比較すると、Liraglutide群と2G3群が有意に増加した(P<０．０5と０．０１)。H-2G3群のGLP-１R発現がLiraglutide群よりも有意に高く、モデル対照群のGLP-１R発現がNaCl-PB群よりも低かった(P<０．０ 5)（図9）。

2、Western blot分析：モデル対照群と比較すると、Liraglutide群、L-2G2群またはH-2G3群が有意に増加した(P<０．０5)。モデル対照群のGLP-１R発現がNaCl-PB群よりも低かった(P<０．０5)(図１０)。
実施例6 インスリン免疫組織化学的分析

抗インスリン抗体を使用して、T2D膵島におけるインスリンの分布と位置を観察した(図１１)。モデル対照群と2G3群膵島のインスリン発現がいずれもNaCl-PB群よりも低かった(P<０．０5)。2G3群のインスリン染色強度と膵島数がいずれも用量依存的に増加した(P<０．０5または０．０１)。

結論：上記の実施例から以下の結論を得た。薬物効果の持続時間に基づく分類は、長時間作用型と短時間作用型の分子シグネチャーを明確に区別した。明らかに、本発明のホモ二量体2G3と2G6シリーズは最も長時間作用する分子に属し、2G3ペプチドに代表される二量体ペプチドは、GLP-１Rに結合してインスリン合成を誘導し、T2Dモデルで血糖低下作用を果たし、各試験で高活性GLP-１ホモ二量体の生物学的効果を評価した。これらの研究によると、二量体配列は最も長く続く血糖低下効果および体重減少および臓器毒性などの副作用の低下などの点で、げっ歯類モデルにおけるT2Dの最も有望な用途を示した。

構造-活性の関係から分かるように、アミノイソ酪酸Aibを含まない二量体は水への溶解性が最も高く、Aibアミノ酸構造を有する二量体はC末端アミド化構造があっても水への溶解性が低く、活性を長く維持できるのはわずかであった。これらの特性から分かるように、2G3ペプチドでは、⁸Ala配列を含むN-末端構造部分が二量体中の対称²⁶K-グルタミル脂肪酸鎖によって被覆され、親水性ポリペプチド鎖に囲まれた疎水性基のコアを形成する可能性があり、DPP 4によって容易に加水分解されず、より長い効果を維持した。Aibアミノ酸を含む配列はC末端アミド化構造があっても、そのAibとアミド化が露出し、水への溶解性が低くなる可能性があり、AibはDDP 4の基質ではないため、長い活性を維持できる。アミノイソ酪酸(Aib)とβ-AlaはL-α-AlaまたはGlyに類似しており、β-Aibとβ-Alaはヒトピリミジンヌクレオチドの正常な代謝物であり、ヒトでの忍容性が高く、これらの化合物の毒性応答が低いはずであるため、本発明ではこれらのアミノ酸で置換して血糖降下活性を有意に延長する。

正常なマウス血糖降下効果では、単一のOGTT実験の結果は、二量体が血液にゆっくりと吸収されることによって、より長い血糖降下効果を生み出すことを示した。複数回のOGTT実験結果から分かるように、長い持続時間効果はポリペプチド第8位アミノ酸、二量体中ジスルフィド結合位置、対称²⁶Lys脂肪酸修飾とC端アミド化に関係あって、同じ分子内の複数の部位のLys修飾には関係なかった。表2から分かるように、長い活性構造が⁸Aib、^１8Cys-Cysジスルフィド結合、対称オレオイル-L-γ-グルタミル基-²⁶LysとC末端アミド化を含む。これらの修飾は以下の特徴を有する。（１）αまたはβ-Aibまたはβ-Ala→⁸Ala置換はより長い活性を生み出し、その内にα-Aib置換の効果が最もよく；（2）他の脂肪酸修飾と比較すると、モノオレオイル-L-γ-グルタミル基-²⁶Lysが最良の結果を達成した；（3）C末端アミド化が活性を有意に延長した；（4）二量体分子中の第１8位ジスルフィド結合構造が最良の活性を示した；（5）PEG修飾が半減期を延長する同時に、比活性を大幅に短縮した（mgあたりの血糖降下持続時間）；（6）単量体ペプチド活性が対応の二量体の１／2～１／4であった。

T2D治療実験では、2G3群のHbA１c低下(-8、-23、-32％)またはFPG値低下(-26．3、-46．9、-47．3％)とLiraglutide空腹HbA１c低下(-29％)またはFPG 低下(-5０．2％)がいずれも有意な血糖降下効果があり、これは同じモル濃度の2G3ペプチドとLiraglutideはPPGまたはFPG、HbA１cに対して同様の低下作用を果たしたことを示した。

2G3群の体重は用量依存的に低下し、H-2G3群とLiraglutide群が同様の体重または脂肪組織の重量曲線を示し、食餌と脂肪代謝への影響がLiraglutideよりも少なかったことを提示した。T2D動物を準備する際の飲用水または食物中の統計データによっても確認されたが、ある臓器、例えば左腎臓、右精巣および脂肪組織の重量が増加したが、この二量体がリラグルチドと比較すると、食餌と脂肪代謝への影響が少ないことを示した。2G3は肝臓を重くし、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼおよびアルカリホスファターゼが用量依存的に低下し、薬物が肝臓と心臓に強い保護作用を持つことを示したが、2G3のアルカリホスファターゼレベルがリラグルチドよりも高く、より強い肝臓刺激を示した。血小板数と脾臓重量の増加は、2G3が止血効果を高めてT2Dモデル血管壁の完全性を保護できることを示した。2G3群中のアルブミンが用量依存的に増加し、リラグルチドと同様に、アルブミンに結合することによって輸送される可能性があることを示した。しかしながら,正常なNaCl-PB群と比較すると、すべてのT2Dモデル群のアルブミンが有意に減少し、高血糖によって引き起こされる高血圧、高脂血症、高血糖と、STZによって引き起こされるアルブミンの相対的な減少を示した。2G3はより多くの総コレステロール、低密度リポタンパク質コレステロールを誘導し、高密度リポタンパク質コレステロールはコレステロールの合成を増加できる。リラグルチド群と比較すると、2G3の低用量と中用量群の総コレステロールがより高く、中用量と高用量群の高密度リポタンパク質がより高く、2G3は高密度リポタンパク質の増加によりコレステロールの逆行性コレステロールを促進したことを示した。2G3の中用量と高用量群における膵臓肥大およびアミラーゼの有意な増加は、2G3は膵臓外分泌機能に一定の促進作用を有することを示した。2G3は腎臓、肺機能および白血球、赤血球、ヘモグロビン、クレアチニン、トリグリセリドに影響を与えなかった。

2G１群では肝臓、脾臓の重量が有意に増加し、アラニンアミノトランスフェラーゼおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼも増加し、アルカリホスファターゼおよびアルブミンレベルが低下し、それが響肝臓と脾臓機能に有意な影響を及ぼすことを示した。

2G3によるT2D治療実験では、正常なマウス(HbA１c 7．3±2．45mMとFPG 5．１7１±4．24mM)に正常なインスリンレベルを誘導し(１．4１１±3．０１ng／ml)、T2D対照鼠(HbA１c 2０±5．０3mMとFPG １4．１49±5．95mM)にインスリン値を誘導し(０．625±０．23ng／ml)、しかしながら、Liraglutide群(HbA１c １4．2±2．2０mMとFPG 7．０42±１．63mM)にインスリンを誘導し(０．595±０．2１ng／ml)、これは、T2Dがインスリン誘導耐性が有意に増加し、同時にLiraglutideは食餌を抑制するため、低いインスリンレベルを誘導した。2G3群のインスリン含有量(０．626±０．23、１．１4１±０．66、１．568±１．79ng／ml)は用量依存的に増加し、これらのインスリン値はLiraglutide群のパーセント増加量(+5．2、+9１．8、+１63．5％)に対応し、2G3はLiraglutideよりもインスリンレベルを強く誘導し、2G3はより良好な血糖降下効果を有することを示した。インスリン分泌量から血糖降下効果を評価すると、L-2G3群はLiraglutide群と生物学的同等であり、M-とH-2G3群の血糖降下効果は2倍以上であると推定されるが、M-2G3群は実際にLiraglutide群と同様の血糖降下効果を有し、血糖レベルが正常値に低下した場合、より高い用量であっても、2G3はより大きな血糖降下効果を誘導できず、低血糖を誘発する可能性がある。本実験では、8倍と68倍の低用量の2G3の使用は、投与後3時間内に１3時間飢餓状態の昆明マウス（n=6）のいずれにも低血糖効果を誘発することなく、これらの二量体ペプチドは低血糖を誘発することがないことを示した。

H-E染色結果によると、NaCl-PB群と比較すると、2G3または2G１は、より多くの膵臓腺房細胞を引き起こす可能性があり、病理学的液胞なし、まばらな腺房、複数の病理学的液胞、膵島細胞の変形、萎縮または核濃縮など、T2Dモデルによって引き起こされる病理学的損傷を救うことができ。2G3誘導Ki 67は用量依存的に増加し、2G3は膵臓細胞増殖を促進することを示した。2G１群のKi 67タンパク質発現がLiraglutide群よりも有意に高く、M-2G１群のKi 67発現がLiraglutide群よりも低く、2G１群の膵臓細胞増殖能力がLiraglutide群よりも低いことを示した。TUNEL染色によると、2G１群のTUNEL陽性率は用量依存的に低下し、H-2G１群のTUNEL陽性率がLiraglutide群とM-2G１群よりも低く、2G１が腺房や脈管などの膵臓細胞をSTZ毒性または病理学的損傷から明らかに保護できることを示した。2G3はGLP-１R発現の増加を有意に誘導し、インスリン染色強度と膵島数はいずれも用量依存的に増加し、2G3の血糖降下効果はGLP-１Rを仲介し、インスリン放出が増加し膵島数が増加したことを示した。

本発明の単量体または二量体ペプチドはGLP-１Rに結合することによってより多くのインスリン放出を誘導し、異なる血糖降下または膵臓保護作用をもたらすと結論付けた。

以上のように、前記実施例は本発明のいくつかの実施形態を具体的かつ詳細に示したが、本発明の範囲を限定するものではない。当業者は、本発明の概念から逸脱することなく加えた様々な変更や改善は、すべて本発明の保護範囲に含まれることに留意されたい。したがって、本発明の保護範囲は添付の特許請求の範囲に従うべきである。

Claims

単量体のグルカゴンアナログペプチド－１アナログペプチドであって、前記グルカゴンアナログペプチド－１アナログペプチドのアミノ酸配列が以下の４つのいずれか１つである。
(１)
Ｈｉｓ-Ｘ_８-Ｇｌｕ-Ｇｌｙ-Ｔｈｒ-Ｐｈｅ-Ｔｈｒ-Ｃｙｓ-Ａｓｐ-Ｖａｌ-Ｓｅｒ-Ｓｅｒ-Ｔｙｒ-Ｌｅｕ-Ｇｌｕ-Ｇｌｙ-Ｇｌｎ-Ａｌａ-Ａｌａ- Ｘ_２６-Ｇｌｕ-Ｐｈｅ-Ｉｌｅ-Ａｌａ-Ｔｒｐ-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-Ｘ_３４-Ｘ_３５-Ａｒｇ-Ｘ_３７；または
(２)
Ｈｉｓ-Ｘ_８-Ｇｌｕ-Ｇｌｙ-Ｔｈｒ-Ｐｈｅ-Ｔｈｒ-Ｓｅｒ-Ａｓｐ-Ｖａｌ-Ｃｙｓ-Ｓｅｒ-Ｔｙｒ-Ｌｅｕ-Ｇｌｕ-Ｇｌｙ-Ｇｌｎ-Ａｌａ-Ａｌａ- Ｘ_２６-Ｇｌｕ-Ｐｈｅ-Ｉｌｅ-Ａｌａ-Ｔｒｐ-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-Ｘ_３４-Ｘ_３５-Ａｒｇ-Ｘ_３７；または
(３)
Ｈｉｓ-Ｘ_８-Ｇｌｕ-Ｇｌｙ-Ｔｈｒ-Ｐｈｅ-Ｔｈｒ-Ｓｅｒ-Ａｓｐ-Ｖａｌ-Ｓｅｒ-Ｃｙｓ-Ｔｙｒ-Ｌｅｕ-Ｇｌｕ-Ｇｌｙ-Ｇｌｎ-Ａｌａ-Ａｌａ- Ｘ_２６-Ｇｌｕ-Ｐｈｅ-Ｉｌｅ-Ａｌａ-Ｔｒｐ-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-Ｘ_３４-Ｘ_３５-Ａｒｇ-Ｘ_３７；または
(４)
Ｈｉｓ-Ｘ_８-Ｇｌｕ-Ｇｌｙ-Ｔｈｒ-Ｐｈｅ-Ｔｈｒ-Ｓｅｒ-Ａｓｐ-Ｖａｌ-Ｓｅｒ-Ｓｅｒ-Ｔｙｒ-Ｌｅｕ-Ｇｌｕ-Ｇｌｙ-Ｇｌｎ-Ａｌａ-Ａｌａ- Ｘ_２６-Ｇｌｕ-Ｐｈｅ-Ｉｌｅ-Ａｌａ-Ｔｒｐ-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-Ｘ_３４-Ｘ_３５-Ａｒｇ-Ｇｌｙ-Ｃｙｓ-ＯＨ；
ただし、Ｘ_８はＬ-α-アミノイソ酪酸-アラニンまたはβ-アラニンまたはα-アミノイソ酪酸またはβ-アミノイソ酪酸であり、
Ｘ_２６はリジンまたは側鎖εアミノがアルカン酸グルタミルで修飾されたリジンまたは側鎖εアミノがアルカン酸基で修飾されたリジンであり、
Ｘ_３４はＡｒｇまたはＬｙｓまたは側鎖εアミノがアルカン酸グルタミルで修飾されたリジンであり、
Ｘ_３５はＧｌｙまたはＡｌａまたはβ-アラニンまたはα-アミノイソ酪酸またはβ-アミノイソ酪酸であり、
Ｘ_３７はＧｌｙ-ＯＨまたはＧｌｙ-ＮＨ_２またはＮＨ_２またはＯＨ構造であり、またはアロステリックな上記の最初の７～３６位のアミノ酸配列が同様の繰り返し配列のコピーで構成され、繰り返し配列中の第８位（Ｘ_８）アラニンがグリシンまたはα-またはβ-アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）で置換され、システインがセリンまたはグリシンで置換され、繰り返し配列中のＸ_２６がアルギニンであり、またはＣ末端アミド基とポリエチレングリコール分子が接続されてＰＥＧ化修飾を形成し、前記ＰＥＧ分子量が０．５～３０ＫＤである、ことを特徴とする単量体のグルカゴンアナログペプチド－１アナログペプチド。
前記Ｘ_２６は側鎖εアミノがアルカン酸グルタミル[γ-Ｇｌｕ(Ｎ-α-アルカン酸基)]で修飾されたリジンである場合、その構造式は式１に示され、または前記Ｘ_２６は側鎖εアミノがアルカン酸基で修飾されたリジンである場合、その構造式は式２に示され、式１、および式２において、ｎ=１４または１６である、ことを特徴とする請求項１に記載の単量体のグルカゴンアナログペプチド－１アナログペプチド。
グルカゴンアナログペプチド－１アナログペプチドホモ二量体であって、前記二量体は、請求項１～２のいずれか１項に記載の単量体をシステインによって形成されたジスルフィド結合を介して接続することによって形成され、Ｈ型またはＵ型グルカゴンアナログペプチド－１アナログペプチドホモ二量体を構成し、前記二量体のアミノ酸配列は以下の４つのいずれか１つである。

ただし、Ｘ_８はＬ-α-アラニン（Ａｌａ）またはβ-アラニン（βＡｌａ）またはα-またはβ-アミノイソ酪酸（αＡｉｂまたはβＡｉｂ）であり、
Ｘ_２６はリジンまたは側鎖εアミノがアルカン酸グルタミルで修飾されたリジンまたは側鎖εアミノがアルカン酸基で修飾されたリジンであり、
Ｘ_３４はＡｒｇまたはＬｙｓまたは側鎖εアミノがアルカン酸グルタミルで修飾されたリジンであり、
Ｘ_３５はＧｌｙまたはＡｌａまたはβ-アラニンまたはα-アミノイソ酪酸またはβ-アミノイソ酪酸であり、
Ｘ_３７はＧｌｙ-ＯＨまたはＧｌｙ-ＮＨ_２またはＮＨ_２またはＯＨ構造；またはアロステリックな請求項１に記載の最初の７～３６位のアミノ酸配列が同様の繰り返し配列のコピーで構成され、繰り返し配列中の第８位（Ｘ_８）アラニンがグリシンまたはα-またはβ-アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）で置換され、システインがセリンまたはグリシンで置換され、繰り返し配列中のＸ_２６がアルギニンであり、またはＣ末端アミド基とポリエチレングリコール分子が接続されてＰＥＧ化修飾を形成し、前記ＰＥＧ分子量が０．５～３０ＫＤである、ことを特徴とするグルカゴンアナログペプチド－１アナログペプチドホモ二量体。
前記Ｘ_２６は側鎖εアミノがアルカン酸グルタミル[γ-Ｇｌｕ(Ｎ-α-アルカン酸基)]で修飾されたリジンである場合、その構造式が式１で示され、または前記Ｘ_２６は側鎖εアミノがアルカン酸基で修飾されたリジンである場合、その構造式が式２で示され、式１、２においてｎ=１４または１６である、ことを特徴とする請求項３に記載のグルカゴンアナログペプチド－１アナログペプチドホモ二量体。
ＩＩ型糖尿病の治療において膵臓保護または／および血糖降下薬物の調製における請求項１～２のいずれか１項に記載の単量体のグルカゴンアナログペプチド－１アナログペプチド、または請求項３～４のいずれか１項に記載のグルカゴンアナログペプチド－１アナログペプチドホモ二量体の用途。
請求項１～２のいずれか１項に記載の単量体のグルカゴンアナログペプチド－１アナログペプチド、または請求項３～４のいずれか１項に記載のグルカゴンアナログペプチド－１アナログペプチドホモ二量体を活性成分として使用する、ことを特徴とする膵臓保護またはＩＩ型糖尿病の治療薬物。