RU1804480C - Способ экспрессии митогенного белка эндотелиальных клеток человека в ЕSснеRIснIа coLI - Google Patents
Способ экспрессии митогенного белка эндотелиальных клеток человека в ЕSснеRIснIа coLIInfo
- Publication number
- RU1804480C RU1804480C SU874203874A SU4203874A RU1804480C RU 1804480 C RU1804480 C RU 1804480C SU 874203874 A SU874203874 A SU 874203874A SU 4203874 A SU4203874 A SU 4203874A RU 1804480 C RU1804480 C RU 1804480C
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cdna
- clones
- mrna
- human
- dna
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 10
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 title claims description 4
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 title description 4
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 24
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 11
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 10
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 3
- 210000000133 brain stem Anatomy 0.000 claims description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 claims 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 claims 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 abstract description 5
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 abstract description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 abstract description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 abstract description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 abstract 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 14
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 8
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 8
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 5
- 101100263579 Bos taurus VEGFA gene Proteins 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 3
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 3
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700015497 Coturnix coturnix FGFR4 Proteins 0.000 description 2
- 101100334742 Coturnix coturnix FGFR4 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 2
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- POJWUDADGALRAB-UHFFFAOYSA-N allantoin Chemical compound NC(=O)NC1NC(=O)NC1=O POJWUDADGALRAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- POJWUDADGALRAB-PVQJCKRUSA-N Allantoin Natural products NC(=O)N[C@@H]1NC(=O)NC1=O POJWUDADGALRAB-PVQJCKRUSA-N 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 102000003971 Fibroblast Growth Factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- CUVBTVWFVIIDOC-YEPSODPASA-N Gly-Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)CN CUVBTVWFVIIDOC-YEPSODPASA-N 0.000 description 1
- 101000846416 Homo sapiens Fibroblast growth factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- RRVCZCNFXIFGRA-DCAQKATOSA-N Leu-Pro-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O RRVCZCNFXIFGRA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- MECSIDWUTYRHRJ-KKUMJFAQSA-N Phe-Asn-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MECSIDWUTYRHRJ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108091036407 Polyadenylation Proteins 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101150010882 S gene Proteins 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N acetic acid;zinc Chemical compound [Zn].CC(O)=O.CC(O)=O ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960000458 allantoin Drugs 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- -1 deoxyribonucleotide triphosphates Chemical class 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 125000003438 dodecyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 150000002337 glycosamines Chemical class 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 101150085823 hsdR gene Proteins 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000004246 zinc acetate Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
- C07K14/501—Fibroblast growth factor [FGF] acidic FGF [aFGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/12—Growth hormone, growth factor other than t-cell or b-cell growth factor, and growth hormone releasing factor; related peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относитс к генетической инженерии, в частности к синтезу митоген- ного эндотелиального белка методом ре- комбинантных ДНК. Конструируют рекомбинантные плазмидные ДНК, кодирующие фактор роста эндотелиальных клеток человека, трансформируют полученными ДНК штаммы реципиентов Е. coli, культивируют трансформанты в услови х, обеспечивающих экспрессию белка, и выдел ют целевой продукт.
Description
Изобретение относитс к генетической инженерии, в частности к синтезу митоген- ного эндотелиального белка методом ре- комбинантных ДНК.
Фактор роста эндотелиальных клеток (ФРЭК) вл етс митогеном эндотелиальных клеток in vitro.
ФРЭК выдел ют путем осаждени суль- фатом стрептомицина, гель - проникающей хроматографией, осаждени сульфатом аммони и аффинной хроматографией на гепа- рин-сефарозе.
Выделены многочисленные формы бычьего ФРЭК путем элюировани его линейным градиентом натрийхлорида из колонки на гепарин-сефарозе или обра- щенно-фазовой высокожидкостной хроматографией (ВЖХ). Два выделенных полипептида, обозначенные альфа- и бета- ФРЭК, имеют мол.м. 17000 и 20000. Использу указанную методику, бычий ФРЭК, содержащийс в 8500 мл выт жки из мозга быка (6,25 х 107суммарных единиц), концентрируют с выходом в сумме 6 мл альфаФРЭК (Зг,0 х 10 единиц) и 3 мл бета-ФРЭК (5,2 х 105 единиц).
Сущность изобретени состоит в получении ФРЭК и его фрагментов, не содержащих других белков человеческого происхождени . ФРЭК получают в клетках-реципиентах, при этом конструируют векторы экспрессии, : содержащие последовательность ДНК, кодирующую ФРЭК, трансформируют полученными рекомбинантами ДНК штаммы Е. coli клеток хоз ев, осуществл ют культивирование трансформаторов в услови х, обеспечивающих экспрессию ФРЭК, и выдел ют белок. Вектор экспрессии ФРЭК конструируют путем получени дн-кДНК из мРНК ФРЭК и введени дн-кДНК в вектор. мРНК обогащают поли(А)содержащим мРНК материалом посредством хроматографии на олиго(оЧ)целлюлозе или поли(у)сефарозе с последующим элюированием фракции мРНК, содержащей поли(А)последовательность.
Поли(А)содержащую мРНК используют дл синтеза комплементарной кДНК (он- кДНК), использу обратную транскриптазу.
Ё
00
о Јь
00
о
00
В результате синтеза ДНК у З -конца ДНК образуетс шпилечна петл , инициирующа синтез двунитевой ДНК. При соответствующих услови х эту шпилечную петлю используют дл осуществлени синтеза дн- кДНК в присутствии полимеразы и деокси- рибонуклеотидтрифосфатов.
Вектор экспрессии обрабатывают с помощью эндонуклеазы рестрикции, котора образует по крайней мере два тупых или липких конца. Дн-кДНК встраивают в вектор .
Клоны, содержащие полные последовательности ФРЭК, идентифицируют, использу в качестве зонда вставку кДНК рекомбинантов ФРЭК, выделенных во врем начального скриннинга библиотеки кДНК рекомбинантного фрагмента фага л мбда с олигонуклеотидами, специфическими к ФРЭК. Метод секвенировани нук- леотидов используют дл определени последовательности аминокислот, кодированных фрагментами кДНК. Эту информацию можно использовать дл определени клонов кДНК ФРЭК при сравнении с известной аминокислотой последовательностью аминоконца бычьего ФРЭК и пептида, выделенного в результате расщеплени ФРЭК бромидом цианогена.
Приме р. А. Получение тотальной РНК.
Тотальную РНК (матричную, рибосом- ную и транспортную) экстрагируют из выт жки ствола мозга человека двухдневной свежести. Клеточный осадок в пробирке после центрифугировани гомогенизируют в 5 объемах раствора, содержащего 4М тиоци- аната гаунидина и 25 мМ антивспенивател А, Гомогенат центрифугируют в роторе в течение 15 мин при скорости 6000 об/мин при 10°С, Надосадочную жидкость довод т до рН 5,0 при прибавлении уксусной кислоты и РНК, осажденной 0,75 объемами этано- ла при -20°С в течение 2 ч. РНК собирают центрифугированием и раствор ют в 7,5 М гидрохлорида гуанидина, содержащего 2 мМ цитрата натри и 5 мМ дитиотреитола. После двух дополнительных осаждений 0,5 объемами этанола оставшийс хлоргидрат гуанидина экстрагируют из преципитата абсолютным этанолом. РНК раствор ют в стерильной воде, центрифугированием удал ют нерастворимые вещества и осадок после центрифугировани повторно экстрагируют водой. РНК довод т до концентрации 0,2 М ацетата кали и осаждают при добавлении 2,5 объемов этанола в течение ночи при -20°С.
Б. Получение поли(А)содержащей РНК.
Преципитат тотальной РНК раствор ют в 20 мМ Hepes-буфера (рН 7,2), содержащего 10 мМ ЭДТА и 1% додецилсульфат-на три , нагревают до 65°С в течение 10 мин затем быстро охлаждают до 25°С. Раствор РНК затем разбавл ют равным объемом воды и прибавл ют NaCI дл доведени конечной концентрации до 300 мМ NaCI. Образцы, содержащие до 240 Аато единиц РНК, хроматографируют на поли(/)сефаро- зе. Поли(А)содержэщую РНК элюируют 70%
раствором формамида. состо щим из 1 мМ Hepes-буфера (рН 7.2) и 2 мМ ЭДТА. Элюат устанавливают до концентрации 0,24 М NaCI и полученную РНК осаждают 2,5 объемами этанола при -20°С.
5В. Конструирование клонов кДНК в фаге л мбда.
мРНК (20 мкг) копируют в дн-кДНК с помощью транскриптазы и ДНК-полимера- зы. дн-кДНК обессоливают на сефэдексе G0 50 и фракции с незаполненным объемом дополнительно очищают.на колонке в соответствии с инструкци ми изготовител . При инкубации с Sl-нуклеазой получают дн- кДНК с тупыми концами. Реакционную
5 смесь, состо щую из 0,2 М цитрата натри (рН 4,5), 0,4 М хлорида натри , 2,5 мМ ацетата цинка и 0,1 ед. Sl-нуклеазы на нг дн- нДНК, довод т до конечного реакционного объема 100 мкг, дн-дДНК инкубируют при
0 37°С в течение 1 ч, экстрагируют смесью фенол-хлороформ и затем обессоливают на сефадексе G-50.
Дн-кДНК затем обрабатывают метила- зой Е, coRI и фрагментом Кленова ДНК-пол5 имеразы 1. кДНК оп ть обессоливают на сефадексе G-50. а затем лигируют с 0,5 мкг фосфорилированных линкеров Е. coRI, использу Т4 ДНК-лигазу. Полученную смесь расщепл ют эндонуклеазой рестрикции Е.
0 coRI и фракционируют в 8% акриламидном геле в трис-боратном буфере. ДНК размером более 1 кб элюируют из гел и извлекают при св зывании с колонкой, элюируют 1 М NaCI, а затем собирают преципитацией
5 этанолом.
Фрагменты ДНК затем вставл ют в фрагмент gtn фага л мбда, расщепленного рестриктазой Е. coRI и обработанного фос- фатазой, использу ДНК-лигазу Т4. Получа0 ют библиотеку, состо щую из5,7х Юфагов, 65% которой составл ют рекомбинантные фаги. Библиотеку фагов амплифицируют продуцированием штоков при 42°С на штамме Е. coll Y1088(sup-E supFmtc В trp R
5 hsdR hsd M+ ton A 21 str A lac И 169 (ргос::Тп5). К важным генетическим признакам указанного штамма относ тс (1) sup F (необходимый дл супрессии амбер-мута- ции фаза по S-гену), (2) hsd R hsd M+, необходимые дл предотвращени рестрикции
чужеродной ДНК до модификации клетки- хоз ина и (3) lac И 169 (ргос.:: Тп 5). и (4) (pMC9)(Lac 1-несущее производное плазми- ды pBR 322, которое подавл ет в присутствии индуктора экспрессию чужеродных генов, которые могут разрушать фаг и/или подавл ть клеточный рост.
Г, Идентификаци клонов, содержащих ФРЭК-последовательности.
Дл скриннинга библиотеки кДНК ФРЭК. содержащей рекомбинантные фаги, клетки фагов с титром 1,5 х 10 высевают на чашке на газон штамма Е. coli У1090 А ас И 169 pro А Д Ion ara D139 str A sup F (trp С 22 ::Тп 10)(рМС 9) и инкубируют при 42°С в течение 6 ч. После охлаждени чашек в холодильнике в течение ночи их накрывают нитроцеллюлозным фильтром. Положение фильтра маркируют иголкой. Через минуту фильтр удал ют и дают просохнуть при ком- натной температуре. С каждой чашки получают двойной фильтр, кроме того, что фильтр оставл ют в контакте с чашкой в течение 5 мин. Затем готов т все фильтры дл гибридизации . Указанна методика включает де- натурацию ДНК в 0,5 М NaOH с 1,5 М NaCI, нейтрализацию в буфере 1М трис-HCI, рН 7,5, и 1,5 М NaCI и нагревание фильтров в течение 2 ч в вакууме при 80°С.
Дл скриннинга библиотеки кДНК ство- ла головного мозга человека дл получени клонов, содержащих ФРЭК-вставки, конструируют специфический олигонуклео тид. Указанный олигонуклеотид базируетс на анализе частичной аминокислотной после- довательности концевых аминогрупп ФРЭК. Бычий ФРЭК выдел ют в виде двух форм, обозначенных как альфа-и бета-ФРЭК, которые отличаютс только аминокислотами, обнаруженными у соответствующих амино- концов. Последовательность вывод т из масс-спектрального анализа с быстрой атомной, бомбардировкой и определ ют аминокислотный состав триптического пеп- тида с концевой аминогруппой. По-видимо- му, аминоконцева блокирующа группа йцетилирована. Если интактный бета-ФРЭК расщеплен трипсином, то, как определено, втора аминокислотна последовательность с аминоконцом, найденна в бета-, а не в альфа-ФРЭК, начинаетс с Phe Asn Leu... Данна последовательность также обнаружена у концевой аминогруппы кислого фибробластного фактора роста. Концева аминогруппа ФРЭК представл ет Asn Туг Lys ... и вл етс эквивалентом бета-ФРЭК без аминоконцевой элонгации.
Дл конструировани олигонуклеотида выбирают последовательность аминокислот lie Leu Pro Asn Gly Thr Val Asp Gly Т hi Lys, соответствующую 19 29 включени м аминокислот альфа-ФРЭК. Вместо созда- ни смеси из олигонуклеотидов. охватывающих все возможные кодирующие последовательности (вследствие деградации генетического кода), конструируют длинный уникальный олигонуклеотид. Такие олигонуклеотид-затравки, как показано ранее, вл ютс эффективными зондами при скриннинге комплекс-ДНК.
При конструировании ФРЭК-зонда используют три критери : (1) исключают ди- нуклеотидную пару CG. Данный подход основан на недостаточной встречаемости CG-nap динуклеотида в ДНК прокариота. В тех случа х, когда возможно, используют данные о предпочтительной утилизации ко- дона. Когда оба эти подхода не информативны , возможно необычное св зывание пар оснований. Этот подход основан на природной частотности пар оснований G:T, I:T, 1:А и 1:С, которое возникает при взаимодействии между антикодонами тРНК и кодонами мРНК.
Примерно 30 моль олигонуклеотида ра- диоактивно мет т путем инкубации с 32 р- гамма-АРТ и Т4 полинуклеотид-киназой. Полученные по методике, указанной выше, нитроцеллюлозные фильтры предварительно гибридизуют при 42°С в 6 х SSPE-буфере (1 xSSPE 0,18 М NaCI, 0,01 М(№НРСм)(рН 7,2), 0,001 М ЭДТА), 2 х Денхардт-раствора (1 х Денхардт-раствора содержит по 0,02% фикола, поливинилпирролидона, бычьего сывороточного альбумина), 5% растворе сульфата декстрана и 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосос . Через 4 ч ввод т 42 Р-меченый олигонуклеотид и гиб- ридизацию продолжают в течение ночи при 42°С, Негибридизованный зонд удал ют в результате последовательного промывани при 37°С в 2 х SSPE-буфере и 0,1 % растворе ДДС натри (SDS).
Из скриннированных 1,5 х 10 кланов 2 клона дают положительные радиравтогра- фические сигналы после экспозиции в течение ночи. Эти клоны очищают до гомогенного состо ни повторными циклами очистки, использу вышеуказанный олигонуклеотид в качестве гибридизационного зонда.
Два клона, которые выделены, клоны 1 и 29 ФРЭК, анализируют более детально. При переваривании с Е. coRI в клонах 1 и 29 обнаруживают кДНК-вставки длиной 2,2 кб и 0,3 кб соответственно. При н к-трансл - ции клонированной кДНК и последующем ее использовании в качестве радиомеченого зонда в блот-гибридизации по Саузерну обнаруживают , что клоны 1 и 29 представл ют собой св занные и перекрывающиес клоны .
Более детально клоны 1 и 29 ан.ализиру- ют по следующей методике. Конструируют два дополнительных олигонуклеотида на основе аминокислотной последовательности бычьего ФРЭК. Указанные олиго- нуклеотиды конструируют на основе таких же подходов, которые используют при конструировании олигонуклеотида, примен емого дл выделени клонов 1 и 29. Эти два нуклеотида, а также олиго(сП)18 радиоактивно мет т в киназной реакции, как указано выше, и затем используют в качестве гибридизационных зондов в блот-анали- зе по Саузерну. Полученные данные этого анализа показывают, что кДНК-вставка 0,3 кб клона 29 гибридизуётс с I и II олиго- нуклеотидами ФРЭК, а не с III или олиго(с)Т)1- 8-нуклеотидами; кДНК-вставка 2,2 кб клона 1 гибридизуётс с I, II, III олигонуклеотида- ми, а также с олиго()18-нуклеотидом.
Из этих данных и последующего определени нуклеотидной последовательности клонов 1 и 29 видно, что З -конец клона 1 заканчиваетс поли(А)-хвостом. При гибридизации клона 1 с олигонуклеотидом III ФРЭК, котора происходит на основе вырезани цианогенбромидом продукта бычьего ФРЭК, а также с олиго (оТ)18-нуклеотидом указанный клон, как предполагают, включает оставшуюс кодирующую последовательность дл альфа- и бета-форм ФРЭК, а также длинную (более 1 кб З -концевую фланкирующую последовательность.
Из клонов 1 и 29 выдел ют кДНК-встав- ки, субклонируют в М13 р18, а открытую рамку считывани , кодирующую ФРЭК, и .фланкирующиес области секвенируют по методу терминации цепи. При анализе нуклеотидной последовательности обнаруживают открытую рамку считывани из 464 нуклеотидов, кодирующую ФРЭК человека, Установлено, что 155 аминокислот ФРЭК человека фланкированы кодонами блокировки трансл ции. Аминокислотой с концевой NHa-группой бета-ФРЭК человека, выделенной из кДНК-последовательности, вл етс метионин, который, по всей веро тности , выступает в качестве остатка инициации трансл ции. На основе указанных данных, а также с негидрофобной природой первых 15-20 аминоконцевых остатков высказываетс предположение, что бета-ФРЭК человека синтезируют без сигнального пептида с концевой МН2-группой. Аминокислотна последовательность с концевой аминогруппой бычьего бета-ФРЭК, расщепленна трипсином, а также бычьего
альфа-ФРЭК идентична аминокислотной последовательности, выведенной из последовательности нуклеотидов клонов 1 и 29 л мбда ФРЭК. Полна гомологи между
двум указанными видами, как установлено, составл ет более 95%.
При Northern-блот-анализе устанавливают , что мРНК ФРЭК представл ет вид единичной молекулы, котора мигрирует
вместе с 28 S рРНК. С учетом допускаемой погрешности в расчетном размере 28 S рРНК приблизительный размер мРНК ФРЭК составл ет 4,8 ±1,4 кб. Последовательности , кодирующие зрелые формы как
альфа-, так и бета-ФРЭК, закодированы в пределах клонов 1 и 29 ФРЭК, которые вместе имеют размер примерно 2,3 кб. Таким образом, указанные данные демонстрируют , что область 5 и фланкирующа последовательности , кодирующие ФРЭК. довольно прот женные (примерно 2,5 ±1,4 кб).
Из клонов 1 и 20 вырезают кДНК-встав- ки посредством гидролиза Е coRI и субклонируют в pv08 у сайта Е coRI. Плазмиду,
сконструированную из клона 1, обозначают как pDH 13, а плазмиду, образованную из клона 29, как pD H14. Указанные плазмиды депонируют в Американской коллекции типовых культур, 12301 Parklawn Drive,
Rockvtll АТСС 20852. Плазмиде из клона 1, то есть pD H15, присваивают номер АТСС 53336, а плазмиде из клона 29. то есть pD Н14,-АТСС 53335.
Таким образом, указанный пример
представл ет экспериментальные методики , которые предусматривают получение фактора роста эндотелиальных клеток человека , не содержащих других белков челове- . ческого происхождени .
ФРЭК примен ют дл выращивани и амплификациии эндотелиальных клеток в культуре. В насто щее врем ФРЭК, используемый дл выращивани клеток, экстрагируют из бычьего мозга. Этот
неочищенный бычий ФРЭК вл етс мито- геном эндотели аллантоисной вены человека . Использование гепарина с ФРЭК и матрикса на основе фибропектина позвол ет получить стабильные клоны эндотелиальных клеток. Рекомендуема концентраци сырого бычьего ФРЭКдл использовани в качестве митогена in vitro составл ет 150 мкг на мл питательной среды.
Рекомбинантный ФРЭК человека, полученный таким образом, пригоден в качестве замены бычьего неочищенного ФРЭК при культивировании In vitro эндотелиальных клеток человека и других мезенхимных клеток дл научных исследований. Полагают , что активность ФРЭК человека в услови х роста эндотелиальных клеток така же или превосходит активность бычьего ФРЭК вследствие высокой гомологии в аминокислотных последовательност х обоих белков. Предполагаемый предел эффективной дозы дл усилени клеточного делени и роста In vitro составл ет 5-10 нг очищенного ФРЭК на 1 мл питательной среды.
Рекомбинантный ФРЭК человека также пригоден дл активации клеточного роста в протезном приспособлении, а не в скл нке или колбе дл культивировани тканей. Это приспособление может быть покрыто или не покрыто другими молекулами, которые дол- жны способствовать прикреплению эндотели к указанному устройству. Такие молекулы могут включать белки с внутриклеточным матриксом (например, фибронек- тин. ламинин или один из коллагенов), человеческий сывороточный альбумин гепа- рин или другие гликозамингликаны или инертные органические молекулы,. Эндоте- лиальные клетки культивируют на этих поверхност х с использованием эффективных доз ФРЭК в питательной среде, покрыва их монослоем эндотели . В результате этого получают поверхность, предупреждающую образование тромбов в приспособлении дл протезировани , тем самым уменьша опасность возможных случаев закупорки тромбами, которые угрожают жизни, вследствие имплантации этих протезов.
Так, разработан иммунологический анализ с помощью двойного антитела дл бычь- его ФРЭК. В этом анализе 96-луночные планшетки из поливинилхлоридэ покрывают антиФРЭК кролика и остающиес участки св зывани затем блокируют, использу 10%. стандартную сыворотку кролика. Да- лее образцы ФРЭК ввод т в лунки и инкубируют , После промывки прибавл ют ФРЭК с
моноклональными антителами мыши. После инкубации и нескольких промывок прибавл ют св занные пероксидазой IgG мыши с антителом из кролика. Реакционный продукт квэнтируют спектрофотометрически после конверсии 0-фенилендиамина в присутствии перекиси водорода. Аналогичный иммуноанализ можно использовать дл установлени дозировки ФРЭК в зависимости от состо ни болезни, котора воздействует на рост эндотелиальных клеток. Очищенный РЭК-продукт пригоден в качестве стандартного реагента дл количественного определени -неизвестных образцов ФРЭК.
ФРЭК также может быть потенциальным средством при лечении поврежденных или дл регенерации кров ных сосудов или других строений организма с покровом эндотелиальных клеток.
Claims (1)
- Формула изобретениСпособ экспрессии митогенного белка эндотелиальных клеток человека в Escherichia coli, заключающийс в том. что выдел ют нРНК из выт жки ствола мозга человека, получают из мРНК поли(А+)мРНК, синтезируют кДНК с помощью указанной мРНК, колонируют кДНК в вектор л мбда gt 10 или л мбда gt 11, отбирают клоны кДНК, кодирующие митогенный белок эндотелиальных клеток путем гибридизации указанных клонов с олигонуклеотидной пробой, имеющей следующую нуклеотидную последовательность:ATT TTT CCI GAT GGI ACI GTI GAT GGIACI ААА,субклонируют кДНК из отобранных клонов в плазмиду pU C8, выдел ют плазмидные ДНК pDH14 и pDH15,трансформируют полученными ДНК штамм-реципиент с последующим отбором трансформированных клонов и индукцией экспрессии целевого белка.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/835,594 US4868113A (en) | 1986-03-03 | 1986-03-03 | Recombinant DNA vector encoding human endothelial cell growth factor |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU1804480C true RU1804480C (ru) | 1993-03-23 |
Family
ID=25269917
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU874203874A RU1804480C (ru) | 1986-03-03 | 1987-11-02 | Способ экспрессии митогенного белка эндотелиальных клеток человека в ЕSснеRIснIа coLI |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4868113A (ru) |
| EP (1) | EP0259475B1 (ru) |
| JP (4) | JPS63502725A (ru) |
| KR (1) | KR960002874B1 (ru) |
| AT (1) | ATE110782T1 (ru) |
| AU (1) | AU617086B2 (ru) |
| DE (1) | DE3750451T2 (ru) |
| DK (1) | DK175807B1 (ru) |
| FI (1) | FI874819A (ru) |
| HK (1) | HK1002123A1 (ru) |
| IE (1) | IE66307B1 (ru) |
| NZ (1) | NZ219485A (ru) |
| PH (1) | PH24857A (ru) |
| RU (1) | RU1804480C (ru) |
| UA (1) | UA13321A (ru) |
| WO (1) | WO1987005332A1 (ru) |
Families Citing this family (41)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5401832A (en) * | 1984-12-24 | 1995-03-28 | Merck & Co., Inc. | Brain derived and recombinant acidic fibroblast growth factor |
| WO1989000198A1 (en) * | 1987-07-07 | 1989-01-12 | Biotechnology Research Associates, J.V. | Recombinant fibroblast growth factors |
| ATE222602T1 (de) * | 1985-09-12 | 2002-09-15 | Scios Inc | Rekombinante fibroblasten-wachstums-faktoren |
| US5827826A (en) | 1986-03-03 | 1998-10-27 | Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. | Compositions of human endothelial cell growth factor |
| US5552528A (en) * | 1986-03-03 | 1996-09-03 | Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. | Bovine b-endothelial cell growth factor |
| NZ220917A (en) * | 1986-07-11 | 1991-05-28 | Merck & Co Inc | Human and bovine acidic fibroblast growth factor vectors, hosts and compositions |
| US5312911A (en) * | 1987-10-22 | 1994-05-17 | Merck & Co., Inc. | Cysteine-modified acidic fibroblast growth factor |
| NZ226543A (en) * | 1987-10-22 | 1992-02-25 | Merck & Co Inc | Recombinant mutant acidic fibroblast growth factor |
| US5258287A (en) * | 1988-03-22 | 1993-11-02 | Genentech, Inc. | DNA encoding and methods of production of insulin-like growth factor binding protein BP53 |
| GB2223496B (en) * | 1988-08-08 | 1992-05-27 | British Bio Technology | Synthetic gene encoding mature human acid fibroblast growth factor |
| GB2223497B (en) * | 1988-08-08 | 1992-04-01 | British Bio Technology | Synthetic gene encoding human beta endothelial cell growth factor |
| US5656458A (en) * | 1988-11-04 | 1997-08-12 | Chiron Corporation | Expression and processing of amino terminus acetylated FGF's in yeast |
| ATE141643T1 (de) * | 1988-11-04 | 1996-09-15 | Chiron Corp | Expression und prozessierung von acetylierten fgfs in hefen |
| US5756686A (en) * | 1988-12-20 | 1998-05-26 | Ludwig Institute For Cancer Research | Peptides derived from endothelial cell growth factor |
| US5227302A (en) * | 1988-12-20 | 1993-07-13 | Ludwig Institute For Cancer Research | DNA encoding platelet derived endothelial cell growth factor (PD-ECGF) |
| US7026291B1 (en) | 1989-01-31 | 2006-04-11 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Epithelial cell specific growth factor, keratinocyte growth factor (KGF) |
| AU647732B2 (en) | 1989-01-31 | 1994-03-31 | Stuart A. Aaronson | DNA encoding a growth factor specific for epithelial cells |
| US5595887A (en) * | 1990-07-16 | 1997-01-21 | Bionebraska, Inc. | Purification directed cloning of peptides using carbonic anhydrase as the affinity binding segment |
| US5244460A (en) * | 1991-11-27 | 1993-09-14 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method to foster myocardial blood vessel growth and improve blood flow to the heart |
| US5348941A (en) * | 1992-04-01 | 1994-09-20 | Merck & Co., Inc. | Stabilizers for fibroblast growth factors |
| US5817485A (en) * | 1994-03-08 | 1998-10-06 | Human Genome Sciences, Inc. | Nucleic acids and cells for recombinant production of fibroblast growth factor-10 |
| US20050019824A1 (en) * | 1994-03-08 | 2005-01-27 | Human Genome Sciences, Inc. | Fibroblast Growth Factor-10 |
| DE69533176T2 (de) * | 1994-03-08 | 2005-09-15 | Osteosa Liquidation Trust, San Diego | Verwendung von fibroblastwachstumsfaktoren zur stimulierung des knochenwachstums |
| US5656598A (en) * | 1994-03-08 | 1997-08-12 | Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. | Use of fibroblast growth factors to stimulate bone growth |
| US6551618B2 (en) | 1994-03-15 | 2003-04-22 | University Of Birmingham | Compositions and methods for delivery of agents for neuronal regeneration and survival |
| US6605441B1 (en) * | 1995-06-05 | 2003-08-12 | Human Genome Sciences, Inc. | Antibodies against fibroblast growth factor 11 |
| US6110893A (en) * | 1995-06-05 | 2000-08-29 | Human Genome Sciences, Inc. | Fibroblast growth factor 11 |
| EP0832215A4 (en) * | 1995-06-05 | 2000-05-17 | Human Genome Sciences Inc | FIBROBLAST GROWTH FACTOR 11 |
| JPH11507697A (ja) * | 1995-06-09 | 1999-07-06 | エヌ． ドロハン，ウィリアム | キチンヒドロゲル、それらの製造方法及び利用 |
| US5876730A (en) * | 1997-08-07 | 1999-03-02 | Childrens Hospital Research Foundation | Heparin-binding growth factor (HBGF) polypeptides |
| US6645947B1 (en) | 1999-05-20 | 2003-11-11 | Chitogenics, Inc. | Adhesive N, O-carboxymethylchitosan coatings which inhibit attachment of substrate-dependent cells and proteins |
| US6719805B1 (en) * | 1999-06-09 | 2004-04-13 | C. R. Bard, Inc. | Devices and methods for treating tissue |
| ATE470448T1 (de) | 2000-10-20 | 2010-06-15 | Amylin Pharmaceuticals Inc | Behandlung von hypoaktivem myokard und diabetischer herzmyopathie mit einem glp-1 peptid |
| US6982170B1 (en) | 2001-12-17 | 2006-01-03 | Maine Medical Center Research Institute | Compositions, methods and kits relating to thrombin degradation resistant fibroblast growth factor-1 |
| US7265097B2 (en) * | 2002-08-20 | 2007-09-04 | Chitogenics, Inc. | Methods of drug delivery using sulphated chitinous polymers |
| EP1634877B1 (en) * | 2004-08-17 | 2011-06-22 | Simpson Biotech Co., Ltd. | Mixture and compounds from mycelia of antrodia camphorata and use thereof |
| US8256429B2 (en) * | 2005-05-18 | 2012-09-04 | Cooltouch Incorporated | Treatment of cellulite and adipose tissue with mid-infrared radiation |
| US8276590B2 (en) | 2005-05-18 | 2012-10-02 | Cooltouch Incorporated | Thermally mediated tissue molding |
| US8357146B2 (en) * | 2005-05-18 | 2013-01-22 | Cooltouch Incorporated | Treatment of cellulite and adipose tissue with mid-infrared radiation |
| US20070134204A1 (en) * | 2005-12-09 | 2007-06-14 | Henrich Cheng | Method for treating nerve injury and vector construct for the same |
| JP2011121882A (ja) * | 2009-12-09 | 2011-06-23 | Eu Sol Biotech Co Ltd | ヒト酸性繊維芽細胞増殖因子の改変ペプチド |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE222602T1 (de) * | 1985-09-12 | 2002-09-15 | Scios Inc | Rekombinante fibroblasten-wachstums-faktoren |
-
1986
- 1986-03-03 US US06/835,594 patent/US4868113A/en not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-03-02 UA UA4203874A patent/UA13321A/ru unknown
- 1987-03-02 JP JP62502073A patent/JPS63502725A/ja active Pending
- 1987-03-02 KR KR1019870701012A patent/KR960002874B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1987-03-02 AT AT87902208T patent/ATE110782T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-03-02 EP EP87902208A patent/EP0259475B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-03-02 DE DE3750451T patent/DE3750451T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-03-02 WO PCT/US1987/000425 patent/WO1987005332A1/en active IP Right Grant
- 1987-03-02 AU AU72012/87A patent/AU617086B2/en not_active Expired
- 1987-03-03 PH PH34950A patent/PH24857A/en unknown
- 1987-03-03 NZ NZ219485A patent/NZ219485A/xx unknown
- 1987-03-03 IE IE53587A patent/IE66307B1/en not_active IP Right Cessation
- 1987-11-02 DK DK198705724A patent/DK175807B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-11-02 RU SU874203874A patent/RU1804480C/ru active
- 1987-11-02 FI FI874819A patent/FI874819A/fi not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-12-12 JP JP34940895A patent/JP3273354B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-07-08 JP JP8177653A patent/JPH09294590A/ja active Pending
-
1997
- 1997-12-03 JP JP33251897A patent/JP3372464B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-02-17 HK HK98101233A patent/HK1002123A1/xx not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Science, 1984, v. 225, p. 923-935. J. Biol. Chem. 1985. вып. 26, p. 11389- 11392. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3273354B2 (ja) | 2002-04-08 |
| UA13321A (ru) | 1997-02-28 |
| US4868113A (en) | 1989-09-19 |
| HK1002123A1 (en) | 1998-07-31 |
| DE3750451D1 (de) | 1994-10-06 |
| JPH09294590A (ja) | 1997-11-18 |
| WO1987005332A1 (en) | 1987-09-11 |
| DK572487A (da) | 1987-11-02 |
| DE3750451T2 (de) | 1994-12-22 |
| IE66307B1 (en) | 1995-12-27 |
| FI874819A0 (fi) | 1987-11-02 |
| FI874819A (fi) | 1987-11-02 |
| IE870535L (en) | 1987-09-03 |
| PH24857A (en) | 1990-12-26 |
| AU7201287A (en) | 1987-09-28 |
| EP0259475A1 (en) | 1988-03-16 |
| KR960002874B1 (ko) | 1996-02-27 |
| DK175807B1 (da) | 2005-03-07 |
| JP3372464B2 (ja) | 2003-02-04 |
| JPH10175999A (ja) | 1998-06-30 |
| NZ219485A (en) | 1990-02-26 |
| AU617086B2 (en) | 1991-11-21 |
| JPH09135690A (ja) | 1997-05-27 |
| ATE110782T1 (de) | 1994-09-15 |
| KR880700858A (ko) | 1988-04-12 |
| DK572487D0 (da) | 1987-11-02 |
| EP0259475B1 (en) | 1994-08-31 |
| JPS63502725A (ja) | 1988-10-13 |
| EP0259475A4 (en) | 1989-10-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU1804480C (ru) | Способ экспрессии митогенного белка эндотелиальных клеток человека в ЕSснеRIснIа coLI | |
| Furutani et al. | Cloning and sequencing of the cDNA for human monocyte chemotactic and activating factor (MCAF) | |
| KR970009936B1 (ko) | lgE 수용체 α-서브유니트 또는 그의 단편, 이들을 암호화하는 DNA 및 이 DNA를 포함하는 벡터 | |
| JPH09506774A (ja) | マクロファージ炎症蛋白質−３、−４および−１▲下γ▼ | |
| JPH04504105A (ja) | フォリスタチンおよびその精製法 | |
| JPH09510869A (ja) | 造血成熟因子 | |
| JPH02501112A (ja) | 免疫親和性による精製方法 | |
| US5332804A (en) | High molecular weight human angiogenic basic fibroblast growth factors | |
| US5731167A (en) | Autotaxin: motility stimulating protein useful in cancer diagnosis and therapy | |
| WO1986006079A1 (en) | Purified protein having angiogenic activity and methods of preparation | |
| AU680714B2 (en) | Human circulating cytokine CC-1 | |
| EP0708112B1 (en) | RPDL protein and DNA encoding the same | |
| US7282481B2 (en) | Heparin-binding proteins modified with sugar chains, method of producing the same and pharmaceutical compositions containing same | |
| US5328990A (en) | Isolation of macrophage migration inhibition factor from ocular lens | |
| JPH06339381A (ja) | ヒト顆粒球コロニー刺激因子をコードする遺伝子 | |
| JPH04500603A (ja) | クローン化腎炎抗原 | |
| US5188943A (en) | Method of producing high molecular weight human fibroblast growth factors | |
| IL81879A (en) | Purification of minactivin for homogeneity, production of minactivin as recombinant techniques, and uses of homogeneous or recombinant minactivin | |
| JP2829397B2 (ja) | フィブリン結合活性ポリペプチド | |
| JP2598061B2 (ja) | シグナルペプチドをコードしているｄｎａ | |
| JP2564536B2 (ja) | 改良されたタンパク質分泌促進能を有するシグナルペプチドをコ−ドしているｄｎａ配列 | |
| JP2623807B2 (ja) | セリンプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼ遺伝子 | |
| KR920001746B1 (ko) | 인간 종양괴사인자(TNF-α) 발현벡터[pYLBC-A/G-TNF-α]와 그의 제조방법 | |
| JP2598024B2 (ja) | シグナルペプチドをコードしているｄｎａ | |
| KR0121322B1 (ko) | 백혈병 억제 인자 제조를 위한 재조합 dna 분자 및 숙주 세포 |