JPH09506774A - マクロファージ炎症蛋白質−３、−４および−１▲下γ▼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒトマクロファージ炎症蛋白質−３、ヒトマクロファージ炎症蛋白質−４、ヒトマクロファージ炎症蛋白質−１_γポリペプチドおよびこのポリペプチドをコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）を開示する。組換え技術によるこれらポリペプチドの製法およびこれらのポリペプチドに対する抗体の製法も提供する。本発明ではこれらポリペプチドの機能を阻止するものであるこれらポリペプチドに対する拮抗剤／阻害剤も提供する。本発明の別の側面では種々の関連疾患の処置のために治療的有効量のポリペプチドを提供するために本発明のポリペプチドと適当な医薬的担体との組合せを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 マクロファージ炎症蛋白質−３、−４および−１_γ この発明は新規に確認したポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドがコード するポリペプチド、これらポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用法、なら びにこれらポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製法に関する。さらに特定的 には、本発明のポリペプチドはヒトのマクロファージ炎症蛋白質−３（ＭＩＰ− ３）、マクロファージ炎症蛋白質−４（ＭＩＰ−４）およびマクロファージ炎症 蛋白質−１_γである。本発明はこのようなポリペプチドの作用の阻止にも関連す る。 マクロファージ炎症蛋白質（ＭＩＰ類）は、たとえばグラム陰性菌、リポ多糖 類およびコンカナバリンＡのような、刺激に反応して、例えばマクロファージお よびリンパ球など、ある種の哺乳類細胞によって生産される蛋白質である。そこ で、ＭＩＰ分子は感染症、癌、炎症、造血機能障害、および自己免疫疾患の検出 および処置のために診断的および治療的有用性を持つであろう。ネズミＭＩＰ− １は、リポ多糖類で刺激されたネズミマクロファージ腫瘍細胞系ＲＡＷ２６４． ７からの主要な分泌蛋白質である。これは精製され、関連蛋白質２種、ＭＩＰ− １αおよびＭＩＰ−１βから構成されることが発見された。 いくつかの研究グループがＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βのヒト同族体であ るらしいものをクローニングしている。これら全ての場合に、ｃＤＮＡは活性化 Ｔ細胞ＲＮＡに対して製造したライブラリーから分離された。 マクロファージ炎症蛋白質（ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１β）はプロ炎症的 性質を示すことが証明されている。ＭＩＰ−１αはヒト好酸球および単球に遊走 および活性化を誘発し、またマクロファージに化学走化性を誘発できる。これに 加え、ネズミＭＩＰ−１αはヒトの造血幹細胞の増殖に抑制的効果を示すが、ネ ズミＭＩＰ−１βはＭＩＰ−１αの阻止効果を消去できる。最後に、ＭＩＰ−１ 蛋白質は早期傷害炎症細胞に検出でき、傷害線維芽細胞からのＩＬ−１とＩＬ− ６との生産を誘導することが証明されている。 ＭＩＰ−１類はケモカイン族の一部であり炎症または傷害の治癒、免疫抑制に 関連する多数の機能を示し、また多数の疾患状態において活発な役割を演じる。 さらに、ＭＩＰ−１は造血器官の強化効果を示すことが発見されている。Ｂｒｏ ｘｍｅｙｅｒ，Ｈ．Ｅ．など、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７０巻：１５８３〜９ ４頁（１９８９年）およびＢｒｏｘｍｅｙｅｒ，Ｈ．Ｅ．など、Ｂｌｏｏｄ、７ ６巻：１１１０〜６頁（１９９０年）。 ＭＩＰ−１の生物活性の定義は広範に研究され、天然ＭＩＰ−１および、極く 最近には組換えＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βを使用されてきた。精製天然Ｍ ＩＰ−１（ＭＩＰ−１、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βポリペプチドを含む） はマウスの足蹠に皮下注射するか、またはウサギの脳脊髄液に脳槽内注射すると （ＷｏｌｐｅとＣｅｒａｍｉ、１９８９年、ＦＡＳＥＢ・Ｊ．、３巻：２５６５ 〜７３頁）、急性の炎症を起こす。直接的または間接的でありうるＭＩＰ−１の これらプロ炎症的性質に加え、無菌傷害房を採用する実験マウスモデルにおける 傷害治癒の早期炎症相の間にＭＩＰが回収されている（Ｆａｈｅｙなど、１９９ ０年、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、２巻：９２頁）。例えば、Ｃｈｉｒｏｎ社が出願した ＰＣＴ出願・米国９１／０６４８９は、酵母における哺乳類マクロファージ炎症 蛋白質（ＭＩＰ類）のための鋳型として活性なＤＮＡ分子を開示している。 ネズミのＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βは別物だが、近縁のサイトカインで ある。この蛋白質２種の部分的に精製した混合物は好中球の機能に影響を与え、 局所的な炎症と発熱とを起こす。ＭＩＰ−１αの特殊な性質は造血幹細胞増殖の 阻止に一致するものとして確認されている。ＭＩＰ−１αは酵母細胞中に発現さ れ、均質まで精製されている。構造的分析ではＭＩＰ−１αは血小板第４因子お よびインターロイキン８に非常に類似した第二次および第三次構造を示すが、配 列の相同性は限定されたものであることが確認されている。ＭＩＰ−１αは試験 管内で幹細胞を阻止する性質を示すことが発見されている。また、ＭＩＰ−１α は後続する試験管内でのトリチオ化チミジンによる殺細胞作用からマウスの幹細 胞を生体内で保護することについて活性なことが証明されている。ＭＩＰ−１α が顆粒球のマクロファージコロニー刺激因子に反応して前駆顆粒球マクロファー ジコロニー形成細胞の増殖を強化することも証明されている。Ｃｌｅｍｅｎｓ， Ｊ．Ｍ．など、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、４巻：７６〜８２頁（１９９２年）。 ＭＩＰ−１αは６〜８ｋｄの、リポ多糖類誘発性の単球、好中球および好酸球 の化学走化性蛋白質である。ＭＩＰ−１αはヒトの好酸性顆粒球の遊走および活 性化も誘発できる。ＭＩＰ−１αは急性的および慢性的炎症において重要である かもしれない。肺臓肉芽腫形成の間に起きる同期化マンソン住血吸虫におけるネ ズミＭＩＰ−１αの逐次的生産、起源、および生体内の寄与が測定されている。 Ｌｕｋａｃｓ，Ｎ．Ｗ．など、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７７巻：１５５１〜９ 頁（１９９３年）。 本発明の一側面に従えば、ＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４、ＭＩＰ−１_γ、ならびに それらの類縁体および誘導体である新規成熟ポリペプチドが提供される。本発明 のＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４、およびＭＩＰ−１_γはヒト起源である。 本発明のさらに別の側面に従えば、このようなポリペプチドをコードするポリ ヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が提供される。 本発明のなお別の側面に従えば、このようなポリペプチドを組換え技術によっ て製造する方法が提供される。 本発明のさらに別の側面に従えば、これらポリペプチド、またはこれらポリペ プチドをコードするポリヌクレオチドを、例えば、炎症活性、造血およびリンパ 球輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）を含む免疫制御、骨髄幹細胞コロニー形成の 阻止、乾癬、固形癌の処置および耐性慢性感染症に対する宿主防御の強化など、 治療目的のために利用する方法が提供される。 本発明のさらに別の側面に従えば、これらのポリペプチドに対する抗体が提供 される。 本発明のさらに別の側面に従えば、例えば動脈硬化症、自己免疫性および慢性 炎症および感染性疾患、ヒスタミン介在アレルギー反応、好酸球増加症候群、珪 肺症、類肉腫症状、肺臓炎症性疾患、ＩＬ１およびＴＮＦの阻害、再生不良性貧 血、および骨髄形成異常症候群などにおける処置において、これらポリペプチド の作用を阻止するために使用しうる、これらポリペプチドに対する拮抗剤／阻害 剤が提供される。 本発明のこれらおよびその他の側面はここに教示するものから当業者には明瞭 となる筈である。 下記の図面は本発明の態様の例示であって、請求項によって包含される本発明 範囲の限定を意味するものではない。 図１はＭＩＰ−３をコードするｃＤＮＡ配列およびそれに対応する演繹された アミノ酸配列を図示する。最初のアミノ酸４５個は演繹された推測上のリーダー 配列を示す。 図２はＭＩＰ−４をコードするｃＤＮＡ配列およびそれに対応する演繹された アミノ酸配列を図示する。最初のアミノ酸１９個は演繹された推測上のリーダー 配列を示す。 図３はＭＩＰ−１αの部分に照準を合わせたＭＩＰ−３の演繹されたアミノ酸 配列の一部に対応する。上段の配列はヒトのＭＩＰ−３アミノ酸配列であり、下 段の配列はヒトのＭＩＰ−１αである（ヒトの扁桃腺白血球ＬＤ７８ベータ蛋白 質前駆体）。 図４はアミノ酸配列２個を図示し、上段の配列はヒトＭＩＰ−４アミノ酸配列 であり、下段の配列はヒトのＭＩＰ−１αである（ヒトの扁桃腺白血球ＬＤ７８ ベータ蛋白質前駆体）。 図５は大腸菌の細菌発現系内での発現後に精製したＭＩＰ−４蛋白質に対応す る蛋白質バンドを示す。 図６はＭＩＰ−４のノーザンブロット分析であって、この蛋白質が最も共通に 存在する細胞を示す。 図７はｐＱＥ−９ベクターの模式図である。 図８はＭＩＰ−１_γをコードするｃＤＮＡ配列およびそれに対応する演繹され たアミノ酸配列を図示する。最初のアミノ酸２４個は演繹されたリーダー配列を 示す。 図９はヒトＭＩＰ−１蛋白質の部分アミノ酸配列２個を図示する。上段の配列 はヒトのＭＩＰ−１_γであり、下段の配列はヒトのＭＩＰ−１αである（ヒトの 扁桃腺白血球ＬＤ７８ベータ蛋白質前駆体）。 図１０は細菌発現系における発現および精製後のＭＩＰ−１_γ蛋白質に対応す るレーン５における蛋白質バンドを示す。 図１１はＭＩＰ−１_γのＣＯＳ発現に対応する蛋白質バンドを示す。 図１２はＭＩＰ−１_γのノーザンブロット分析であって、この蛋白質が最も共 通に存在する組織を示す。 本発明の一側面に従えば、図１、２および８の演繹されたアミノ酸配列を持つ 成熟ポリペプチドをコードするか、または１９９４年２月９日にＡＴＣＣ寄託番 号７５６７６として寄託したクローンのｃＤＮＡがコードする成熟ＭＩＰ−３ポ リペプチド、および１９９４年２月９日にＡＴＣＣ寄託番号７５６７５として寄 託したクローンのｃＤＮＡがコードする成熟ＭＩＰ−４ポリペプチド、および１ ９９３年１０月１３日にＡＴＣＣ寄託番号７５５７２として寄託したクローンの ｃＤＮＡがコードする成熟ＭＩＰ−１_γポリペプチド、をコードする単離された 核酸（ポリヌクレオチド）が提供される。 本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは構造的にはサイトカイ ンまたはケモカイン族内にあるプロ炎症超遺伝子「インタークリン（ｉｎｔｅｒ ｃｒｉｎｅ）」に関連する。ＭＩＰ−３およびＭＩＰ−４はともにＭＩＰ−１の 同族体であって、ＭＩＰ−１βよりもＭＩＰ−１αに相同的である。ＭＩＰ−３ をコードするポリヌクレオチドは大動脈内皮のｃＤＮＡライブラリーから誘導さ れたもので、アミノ酸残基１２１個のポリペプチドをコードするオープン読み枠 を含み、これはケモカイン多数に明瞭な相同性を示す。最高の一致はヒトのマク ロファージ炎症蛋白質１αへのものであって、３６％の同一性と６６％の類似性 とを示す（図３）。 ＭＩＰ−４をコードするポリヌクレオチドは成人肺臓のｃＤＮＡライブラリー から誘導されたもので、アミノ酸残基８９個のポリペプチドをコードするオープ ン読み枠を含み、これはケモカイン多数に明瞭な相同性を示す。最高の同一性は ヒトの扁桃腺白血球ＬＤ７８β蛋白質へのものであって、６０％の同一性と８９ ％の類似性を示す（図４）。その上、特徴的モチーフとして全ケモカインに存在 するシステイン残基４個は両クローンに保存されている。我々の遺伝子では最初 のシステイン２個が隣接する位置にあるという事実は、これをケモカインの「Ｃ −Ｃ」またはβ−サブファミリーに分類する。「ＣＸＣ」またはαサブファミリ ーと呼ばれる別種のサブファミリーでは、最初のシステイン残基２個はアミノ酸 １個だけ隔離されている。 ＭＩＰ−１_γをコードするポリヌクレオチドはアミノ酸残基９３個のポリペプ チドをコードするオープン読み枠を含み、ヒトのマクロファージおよび霊長類の 蛋白質−αにはアミノ酸８０個の長さにわたって４８％の同一性と７２％の類似 性とを示す明瞭な相同性を示し、マウスのＭＩＰ−１βにはアミノ酸８２個の領 域にわたって４６％の同一性と６７％の類似性とを示す明瞭な相同性を示す。さ らに、特徴的モチーフを含むシステイン残基４個が保存されている。 本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡの形またはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、およ び合成ＤＮＡを含むＤＮＡの形でありうる。このＤＮＡは２本鎖または１本鎖で ありうるし、およびもし一本鎖ならコード鎖または非コード鎖（アンチセンス） 鎖でもありうる。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は図１および図２に 示すコード配列または寄託したクローンのものと同一でありうるし、またはその コード配列が重複性または縮退性の結果として、図１および図２のＤＮＡまたは 寄託したｃＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドをコードする、相異なるコード配列で もありうる。 図１、図２および図８の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまた は寄託したｃＤＮＡがコードする成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ ドには：成熟ポリペプチドのコード配列のみ、成熟ポリペプチドのコード配列お よびたとえばリーダー配列または分泌配列またはプロ蛋白質配列のような付加的 コード配列、成熟ポリペプチドのコード配列（および、要すれば付加的コード配 列）およびたとえばイントロンまたは非コード配列のような非コード配列、成熟 ポリペプチド用コード配列の５’および／または３’を包含しうる。 このようにして、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」はその ポリペプチド用コード配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびに付加的コード 配列および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。 本発明はさらに、図１、図２および図８の演繹されたアミノ酸配列を持つポリ ペプチドまたは寄託したクローンのｃＤＮＡがコードするポリペプチドの断片、 同族体および誘導体をコードする前記ポリヌクレオチドの変異体にも関連する。 このポリヌクレオチドの変異体はポリヌクレオチドの天然起源対立遺伝子変異体 またはポリヌクレオチドの非天然起源変異体でもありうる。 このように、本発明は図１、２および８に示すものと同一の成熟ポリペプチド または寄託したクローンのｃＤＮＡがコードする同一の成熟ポリペプチドをコー ドするポリヌクレオチドならびに図１、２および８のポリペプチドの断片、誘導 体または同族体または寄託したクローンのｃＤＮＡがコードするポリペプチドを コードするこれらポリヌクレオチドの変異体を包含する。そのようなヌクレオチ ド変異体は欠失、変異、置換変異体および付加または挿入変異体を包含する。 ここに示すように、このポリヌクレオチドは図１、図２および図８に示すコー ド配列または寄託したクローンのコード配列の天然起源対立遺伝子変異体である コード配列を持ちうる。当分野で公知の通り、対立遺伝子変異体はポリヌクレオ チド配列の別型であって、ヌクレオチドがコードするポリペプチドの機能を実質 的に変化しない置換、欠失または付加１個またはそれ以上を持ちうる。 本発明はまた、例えば細胞からのポリペプチド輸送を制御するための分泌配列 として機能するリーダー配列など、宿主細胞でのポリペプチドの発現および分泌 を援助するポリヌクレオチド配列に成熟ポリペプチド用のコード配列が同一読み 枠内で融合しているポリヌクレオチドを包含する。リーダー配列を持つポリペプ チドはプレ蛋白質であって、成熟型ポリペプチドを形成するために宿主細胞によ り切断されるリーダー配列を持ちうる。このポリヌクレオチドはまた成熟蛋白質 プラス付加的５’アミノ酸残基であるプロ蛋白質をコードしうる。プロ配列を持 つ成熟蛋白質はプロ蛋白質であって、蛋白質の不活性型である。このプロ配列が 切断されると活性な成熟蛋白質が生成する。 このようにして、例えば本発明のポリヌクレオチドは成熟蛋白質、またはプロ 配列を持つ蛋白質、またはプロ配列とプレ配列（リーダー配列）との両方を持つ 蛋白質をコードしうる。 本発明のポリヌクレオチドはまた本発明のポリペプチドの精製のための標識配 列に枠内で融合したコード配列を持ちうる。標識配列は細菌宿主の場合に標識に 融合した成熟ポリペプチドを精製するためにｐＱＥ−９ベクターが供給するヘキ サヒスチジンタグでありうるし、または、例えば標識配列はたとえばＣＯＳ−７ 細胞など哺乳類宿主を使用する時にはヘマグルチニン（ＨＡ）タグでありうる。 ＨＡタグは流行性感冒ヘマグルチニン蛋白質から誘導したエピトープに対応する （Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．など、Ｃｅｌｌ、３７巻：７６７頁（１９８４年））。 本発明はさらにもし前記配列との間に少なくとも５０％、好ましくは７０％の 同一性があれば前記配列にハイブリド化したポリヌクレオチドに関する。本発明 は殊に前記ポリヌクレオチドに緊密条件下にハイブリド化するポリヌクレオチド に関する。ここで使用する用語「緊密条件」は両配列間に少なくとも９５％、好 ましくは少なくとも９７％の同一性があればハイブリッド化を起こすことを意味 する。好適な態様での前記ポリヌクレオチドにハイブリッド化するポリヌクレオ チドは図１のｃＤＮＡまたは寄託したｃＤＮＡがコードする成熟ポリペプチドと 実質的に同じ生物学的機能または活性を維持するポリペプチドをコードする。 ここに参照する寄託物は特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタ ペスト条約の規定に従って維持することになっている。これらの寄託物は当業者 の便宜のためにのみ提供するものであって、米国特許法１１２条の規定が求める 寄託であるとの容認ではない。寄託物内に含まれるポリヌクレオチドの配列、な らびにこれらがコードするポリペプチドのアミノ酸配列は参考のために引用する ものであって、本文記載の配列に何らかの争いが生じた場合に対照とするもので ある。寄託した材料を製造、使用または販売するためには実施許諾が必要になり うるし、ここではそのような実施許諾を保証するものではない。 本発明はさらに図１、図２および図８の演繹されたアミノ酸配列を持つか、ま たは寄託したｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列を持つＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４ およびＭＩＰ−１_γポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドの断片、同 族体および誘導体に関する。 図１、図２および図８または寄託したｃＤＮＡを参照する時、用語「断片」、 「誘導体」および「同族体」はそれらポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能 または活性を保持するポリペプチドを意味する。そこで、同族体はプロ蛋白質部 分の切断により活性成熟ポリペプチドを生産して活性化されることのできるプロ 蛋白質を包含する。 本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成 ポリペプチドでありうるが、好ましくは組換えポリペプチドである。 図１、図２および図８のポリペプチドまたは寄託したｃＤＮＡがコードするポ リペプチドの断片、誘導体または同族体は（ｉ）アミノ酸残基１個またはそれ以 上が保存または非保存アミノ酸残基で置換されており（好ましくは保存アミノ酸 残基）、そのような置換アミノ酸残基が遺伝子コードによりコードされていても いなくてもよいもの、または（ｉｉ）アミノ酸残基１個またはそれ以上が置換基 を含むもの、または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが、たとえばポリペプチドの半 減期を増加する化合物（例えばポリエチレングリコールなど）のような他の化合 物と融合しているもの、または（ｉｖ）成熟ポリペプチドにリーダー配列または 分泌配列または成熟ポリペプチドまたはプロ蛋白質配列の精製に採用する配列の ような付加的アミノ酸が融合しているもの、でありうる。そのような断片、誘導 体および同族体はここでの教示から当該技術範囲内にあると見做される。 本発明のポリペプチドは好ましくは分離した型で提供され、好ましくは均質に なるまで精製される。 用語「分離」はその物質がその起源の環境（たとえば、もし天然起源であれば 天然環境）から移動されていることを意味する。例えば、生きている動物に存在 する天然起源ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは分離されていないが、同じ ポリヌクレオチドまたはＤＮＡまたはポリペプチドでも天然システム内で共存す る物質のいくつかまたは全てから離されていれば、分離されている。そのような ポリヌクレオチドはベクターの一部であることができ、および／またはそのよう なポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であることができるが、 そのようなベクターまたは組成物は、その天然環境の一部ではないという点で、 なお分離されているものである。 本発明はまた本発明のポリヌクレオチドを含有するベクター、本発明のベクタ ーで遺伝子工学的に処理した宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペ プチドの生産法に関する。 宿主細胞は、例えばクローニングベクターでも発現ベクターでもありうるが、 この発明のベクターで遺伝子工学的に処理（形質導入またはまたは形質転換また は遺伝子移入）される。このベクターは、例えばプラスミド、ウイルス粒子、フ ァージなどでありうる。遺伝子工学的に処理した宿主細胞はプロモーターの活性 化、形質転換体の選択またはＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４、およびＭＩＰ−１_γ遺伝 子の増幅に適当なように修正した通常の栄養培地中で培養できる。たとえば、温 度、ｐＨ、その他のような培養条件は以前に発現用に選択した宿主細胞について 使用されたものであって、通常の専門家には明白である。 本発明のポリヌクレオチドは組換え技術によるポリペプチド生産用に採用しう る。そこで、例えばそのポリヌクレオチド配列を発現伝達体多数のどれか一つ、 殊にポリペプチドの発現用ベクターまたはプラスミド、に含有させうる。そのよ うなベクターには染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、たとえばＳＶ４０の 誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、酵母プラスミド、プラスミドとファ ージＤＮＡ、たとえば天然痘、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬 病のようなウイルスＤＮＡとの結合で誘導されたベクターを包含する。しかしな がら、宿主中で複製でき、利用できる限り、いかなる他種プラスミドまたはベク ターも使用しうる。 適当なＤＮＡ配列は種々の操作法の一つによってベクター内に挿入されうる。 一般に、ＤＮＡ配列は当該分野で公知の操作法により適当な単数または複数の制 限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。そのような操作法その他は当技術分野 の範囲内にあると見做される。 発現ベクター中のＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成を指向する適当な発現制御配列 （プロモーター）に作動可能に結合する。そのようなプロモーターの代表例とし ては：ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、大腸菌のｌａｃまたはｔｒｐ、ファ ージラムダＰ_Lプロモーター、および原核生物、真核生物またはそのウイルス中 の遺伝子発現を制御することが公知なその他のプロモーターを指摘しうる。発現 ベクターはまた翻訳開始用リボソーム結合部位および転写終結部位も含有する。 ベクターはまた発現増幅用に適当な配列も含有しうる。 これに加え、発現ベクターは真核生物にはたとえばジヒドロ葉酸還元酵素また はネオマイシン耐性のような、また、大腸菌にはたとえばテトラサイクリン耐性 またはアンピシリン耐性のような形質転換体宿主細胞に選択の表現型特性を提供 する遺伝子を含むものが好ましい。 前記の適当なＤＮＡ配列ならびに適当なプロモーターまたは制御配列を含むベ クターを採用して適当な宿主を形質転換して宿主に蛋白質を発現させうる。 適当な宿主の代表例としては：たとえば大腸菌、ストレプトマイセス菌、サル モネラ・ティフィリウム菌のような細菌細胞、たとえば酵母のようなカビ細胞、 キイロショウジョウバエ属およびＳｆ９のような昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳまた はＢｏｗｅｓ黒色腫のような動物細胞；植物細胞、その他を指摘しうる。適当な 宿主の選択はここでの教示を基にすれば当技術範囲内にあると見做される。 さらに具体的には、本発明は広義には前記したような配列１個またはそれ以上 を含む組換え構築物も含有する。この構築物は正方向または逆方向に本発明の配 列を挿入した、たとえばプラスミドまたはウイルスベクターのような、ベクター を含む。この態様の好適な側面では、この構築物はさらに、例えば該配列に作動 可能に結合するプロモーターなど、制御配列を含む。適当なベクターおよびプロ モーター多数が当業者に公知であり、商業的に購入できる。下記ベクターを例示 する。細菌ではｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｕｉａｇｅｎ社）、ｐ ｂｓ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒ ｉｐｔ・ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２３３−３、ｐＫ Ｋ２２３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、真核生物 ではｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａ ｔａｇｅｎｅ社）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａ ｃｉａ社）。しかしながら、その他のいかなるプラスミドまたはベクターもそれ らが宿主中で複製可能で利用可能である限り使用しうる。 プロモーター領域はＣＡＴ（クロラムフェニコール転移酵素）ベクターまたは その他の選択マーカーを持つベクターを使用していかなる所望の遺伝子からも選 択できる。適当なベクター２個は、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。殊 に有名な細菌性プロモーターにはｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラ ムダＰ_R、Ｐ_Lおよびｔｒｐを包含する。真核生物プロモーターには、ＣＭＶ即時 早期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、早期および後期ＳＶ４０、レトロウイルスのＬ ＴＲ、およびマウスのメタロチオネイン−Ｉを包含する。適当なベクターおよび プロモーターの選択は十分に当分野の通常熟練の水準内にある。 別の態様では本発明は前記構築物を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、たと えば哺乳類細胞のような高等真核生物細胞、または、たとえば酵母細胞のような 低級真核生物細胞であることができ、または、宿主細胞はたとえば細菌細胞のよ うな原核生物細胞であることができる。宿主細胞への構築物の導入は燐酸カルシ ウム遺伝子移入、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介遺伝子移入または電気穿孔法によ って達成することもできる。（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．、Ｄｉｂｎｅｒ，Ｍ．、Ｂａｔ ｔｅｙ，Ｉ．、「分子生物学における基礎的手法（Ｂａｓｉｃ・Ｍｅｔｈｏｄｓ ・ｉｎ・Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｂｉｏｌｏｇｙ」、（１９８６年））。 宿主細胞中の構築物は組換え配列がコードする遺伝子生成物を生産するための 通常の方法で使用できる。あるいは、本発明のポリペプチドは通常のペプチド合 成機によって合成的に生産できる。 成熟蛋白質は適当なプロモーターの制御下に哺乳類細胞、酵母、細菌、または その他の細胞中で発現できる。無細胞翻訳システムを採用して本発明のＤＮＡ構 築物から誘導したＲＮＡを使用してそのような蛋白質を生産できる。原核生物お よび真核生物宿主で使用する適当なクローニングベクターおよび発現ベクターは Ｓａｍｂｒｏｏｋなど、「分子クローニング：実験室便覧（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ・Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａｌ）」、第２版、Ｃ ｏ ｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ社、Ｎ．Ｙ．、（１９８９年）に記載があり 、これを参考のためにここに引用する。 高等真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写はベクタ ーにエンハンサー配列を挿入することによって増加する。エンハンサーはＤＮＡ のシス作用要素であって、通常約１０から３００ｂｐまでで、プロモーターに作 用して転写を増加する。この例にはｂｐ１００から２７０の複製開始点の後期側 にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハン サー、複製開始点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイル スエンハンサーを包含する。 一般に、組み替え発現ベクターは複製開始点および、たとえば大腸菌のアンピ シリン耐性遺伝子および酵母のＴＲＰ１遺伝子などの宿主細胞の形質転換を許す 選択標識、および下流の構造配列転写を指向する高度に発現された遺伝子から誘 導したプロモーターを包含するであろう。このようなプロモーターは、殊にたと えば３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、α−因子、酸性ホスファター ゼ、または熱ショック蛋白質のような、解糖酵素をコードするオペロンから誘導 できる。異種構造配列を適当なフェーズ中で翻訳の開始および終結配列および、 好ましくは細胞質周辺空隙または細胞外媒体への翻訳した蛋白質の分泌を指向す ることのできるリーダー配列と結合する。要すれば、異種配列は、たとえば、発 現した組換え生成物の安定化または精製単純化など、所望の性質を与えるＮ−末 端認識ペプチドを含む融合蛋白質をコードできる。 細菌での使用に有用な発現ベクターは所期蛋白質をコードする構造ＤＮＡ配列 を機能性プロモーターを持つ作動可能な読み枠中の適当な翻訳開始および終結シ グナルとともに挿入することによって構築する。ベクターはベクターの維持を確 保し、および、もし所望なら、宿主内での増幅を提供するために表現型選択標識 １個またはそれ以上および複製開始点を含むであろう。形質転換のために適当な 原核生物宿主には大腸菌、枯草菌、サルモネラ・ティフィムリウム、およびシュ ードモナス、ストレプトマイセスおよびアタフィロコッカス属の様々な菌種を含 むが、その他のものも選択の対照としうる。 代表的であるが限定性のない実例として、細菌で使用する有用な発現ベクター は選択マーカーおよびよく知られたクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣ Ｃ３７０１７）の遺伝子的要素を含み、商業的に購入可能なプラスミドから誘導 した細菌の複製開始点を含有できる。この商業的ベクターには、例えばｐＫＫ２ ２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ・Ｆｉｎｅ・Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、Ｕｐｐｓａ ｌａ、スエーデン）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ・Ｂｉｏｔｅｃ社、Ｍａｄ ｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）などを含む。これらｐＢＲ３２２「バックボーン」部 分を適当なプロモーターおよび発現すべき構造配列と結合する。適当な宿主株の 形質転換および適当な細胞密度までの宿主株の生育後、選択したプロモーターを 適当な方法により誘導し（たとえば温度変化または化学的誘導）、細胞を付加的 期間培養する。 典型的には細胞を遠心分離によって収穫し、物理的または化学的方法によって 破砕し、得られる粗製の抽出物をさらなる精製のために保存する。 蛋白質の発現に採用する微生物細胞は、いずれも当業者によく公知の方法であ る凍結−解凍の循環、超音波処理、機械的崩壊、または細胞溶解剤の使用を含む 便利な方法のいずれかにより崩壊する。 様々な哺乳類細胞培養システムを組換え蛋白質発現のために採用できる。哺乳 類発現システムの例にはＧｌｕｚｍａｎがＣｅｌｌ、２３巻：１７５頁（１９８ １年）に記載したサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系および適応性あるベクター を発現することができるその他の細胞系、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、 ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞系などを含む。哺乳類発現ベクターは複製開始点、適 当なプロモーターおよびエンハンサー、およびまた必要なリボソーム結合部位、 ポリアデニル化部位、スプライスのドナーおよびアクセプター部位、転写終結配 列、および５’−隣接非転写配列のいずれかをも含むであろう。ＳＶ４０スプラ イスから誘導されるＤＮＡ配列およびポリアデニル化部位は必要な非転写遺伝子 要素を提供するために使用しうる。 ＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４およびＭＩＰ−１_γは硫酸アンモニウムまたはエタノ ール沈降、酸性抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホ セルロースクロマトグラフィー、親水性相互作用クロマトグラフィー、親和性ク ロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチン クロマトグラフィーを含む方法により組換え細胞培養物から回収し、精製する。 精製の間に存在するカルシウムイオンを低濃度（約０．１５〜５ｍＭ）にするこ とが好ましい。（Ｐｒｉｃｅなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４４巻：９１ ７頁（１９６９年））。必要に応じて、成熟蛋白質の立体配置を完成するために 蛋白質再折りたたみ段階を使用できる。最後に、最終的な精製段階用に高速液体 クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を採用できる。 本発明のポリペプチドは、天然品精製生産物または化学合成的操作の生産物、 または原核生物または真核生物宿主（例えば、培養中の細菌、酵母、高等植物、 昆虫および哺乳類細胞による）から組換え技術により生産したものでありうる。 組換え生産操作に採用する宿主に依存して、本発明のポリペプチドは哺乳類また はその他の真核生物炭水化物でグリコシル化、または非グリコシル化されうる。 本発明のポリペプチドはイニシャルメチオニンアミノ酸残基を含有しうる。 本発明のポリペプチドは様々な免疫制御および炎症機能、また多数の疾患で使 用しうる。ＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４およびＭＩＰ−１_γはケモカイン族に属し、 そのためこれらは白血球（たとえば単球、好中球、Ｔリンパ球、好酸球、好塩基 球、など）の化学誘引剤である。従って、ＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４およびＭＩＰ −１_γは標的免疫細胞の傷害領域への浸透を制御することによって傷害の治癒を 促進するために使用できる。同様な様式で、本発明のポリペプチドは殺微生物白 血球の誘引および活性化を通して、たとえばマイコバクテリアなどの慢性感染症 に対する宿主の防御を強化できる。 さらに、本発明のポリペプチドは、例えばカポジ肉腫の処置において、腫瘍に 注射されたケモカイン発現細胞は腫瘍の縮退を起こす証拠があるので抗腫瘍療法 において有用である。また、ＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４およびＭＩＰ−１_γは、た とえば細胞毒性Ｔ細胞およびマクロファージなど、宿主防御（殺腫瘍）細胞の侵 襲および活性化を刺激するので、この様にして固形癌の処置に使用しうる。 このポリペプチドはまた白血病で骨髄幹細胞のコロニー形成を阻止するため、 および腫瘍化学療法の間に造血幹細胞の付随的保護処置としても使用しうる。 本発明のポリペプチドのもう一つの使用は、例えば自己免疫疾患およびリンパ 球白血病などでの、ＩＬ−２生合成の阻止を経るＴ細胞増殖の阻止である。 ＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４およびＭＩＰ−１_γは皮内ケラチノサイト増殖を阻止 するためにも使用しうるし、皮膚内のランゲルハンス細胞はＭＩＰ−１αを生産 することが発見されているので乾癬（ケラチノサイト増殖過剰症）での有用性が ある。 ＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４およびＭＩＰ−１_γは破砕物の除去と結合組織促進性 炎症細胞の補充との双方を通して、またＴＧＦβ−媒介の過剰線維症制御の可能 性により傷害治癒の間の瘢痕予防に使用しうる。これに加え、これらポリペプチ ドはＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４およびＭＩＰ−１_γは血管透過性を増強するので、 発作、血栓血球症、肺塞栓および骨髄増殖性疾患の処置に有用でありうる。 これらポリペプチドは、しばしば「遺伝子治療」と呼ばれる、生体内における これらポリペプチドの本発明に従った生体内における発現に採用できる。 すなわち、例えば患者からの細胞を生体外でポリペプチドをコードするポリヌ クレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を遺伝子工学的に処理し、次に処理した細胞 をそのポリペプチドで処理すべき患者に戻す。このような方法は当業者によく公 知である。例えば、細胞を当業界で公知の操作法により本発明のポリペプチドを コードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を使用して処理しうる。 同様にして、例えば当業者公知の操作法により、ポリペプチドの生体内発現用 に生体内で処理しうる。当業界で公知のように、本発明のポリペプチドをコード するＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を生産するための生産細胞を患者に投与し て、生体内で細胞を処理し、生体内でそのポリペプチドを発現する。かかる方法 により本発明のポリペプチドを投与するための前記およびその他の方法は本発明 の教示から当業者には明白である。例えば、細胞を工学的に処理するための発現 ビヒクルは、例えば適当な送達ビヒクルと結合した後に生体内で細胞を遺伝子工 学的に処理するために使用しうるアデノウイルスなど、レトロウイルス以外であ りうる。 本発明のポリペプチドは適当な医薬的担体と組合せて使用しうる。このような 組成物には治療的有効量の蛋白質、および医薬的に許容しうる担体または添加剤 を包含する。このような担体にはこれに限定するものではないが、食塩水、緩衝 食塩水、デキストロース、水、グリセリン、およびこれらの組合せを包含する。 剤型は投与態様に適合さすべきである。 本発明は本発明の医薬的組成物の成分１個またはそれ以上を充填した容器１個 またはそれ以上からなる医薬的パックまたはキットも提供する。このような容器 に伴って、医薬的または生物学的生産物の製造、使用または販売を規制する政府 機関が規定する形式でヒト投与用製造、使用または販売の機関による承認を反映 する注意書も添付する。これに加え、本発明のポリペプチドは他の治療用化合物 とともに採用しうる。 この医薬的組成物は、たとえば経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内 または皮内経路のような常用の様式で投与しうる。被投与者に投与するＭＩＰ− ３、ＭＩＰ−４およびＭＩＰ−１_γの用量と投与法とは、たとえば投与様式、処 理すべき状態の性質および処方する医師の判断のような因子多数に依存する。一 般的に言えば、例えば少なくとも約１０μｇ／体重ｋｇの治療的有効用量で投与 し、および殆どの場合に約ｍｇ／体重ｋｇを超えない日用量、好ましくは投与経 路、症状、その他を考慮して用量は約１０μｇ／体重ｋｇからの日用量である。 本発明の配列は染色体同定用にも価値がある。この配列は殊に個人のヒト染色 体の特殊な場所を標的とするもので、そこにハイブリド化できる。さらに、最近 は染色体特定部位の同定への必要が存在する。染色体部位標識用に実際的な配列 データ（反復多型）に基づいて染色体を標識する試薬は現在ではまだ殆ど入手で きない。本発明に従う染色体へのＤＮＡ地図作成は疾患に関する遺伝子の配列を 関連付ける重要な第一段階である。 略述すれば、ＰＣＲプライマー（好ましくは１５〜２５ｂｐ）をｃＤＮＡから 製造することにより配列を染色体に配置できる。ｃＤＮＡのコンピューター分析 を使用して迅速にゲノムＤＮＡ中の増幅過程を複雑化するエクソン１個以上にわ たるプライマーでないプライマーを選択する。これらプライマーを使用して次に 各ヒト染色体を含む体細胞のハイブリッドをＰＣＲスクリーニングする。プライ マーに対応するヒトの遺伝子を含むハイブリッドのみが増幅した断片を得る。 体細胞ハイブリッドのＰＣＲ地図作成は特定染色体に特定のＤＮＡを割り当て る迅速な手段である。同じオリゴヌクレオチドプライマーで本発明を用いれば、 同様にして特定の染色体または大きなゲノムクローンのプールからの断片集団に ついてサブローカリゼーションを達成できる。同様に染色体地図作成に使用でき る他の地図作成方策は原位置ハイブリド化、標識したフロー選択染色体での前ス クリーニングおよび染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブ リッド化による前選択を包含する。 分裂中期染色体スプレッドへのｃＤＮＡクローンの螢光ｉｎ・ｓｉｔｕハイブ リダイゼーション（ＦＩＳＨ）は染色体上の厳密な配置を一段階で提供できる。 この技術は５００または６００塩基までの短さのｃＤＮＡで使用できるが、しか しながら、２０００ｂｐ以上のクローンは単一の検出について十分なシグナル強 度で独特な染色体位置への結合をする見込みが高い。ＦＩＳＨではＥＳＴが誘導 されたクローンの使用を必要とし、長い方がよい。例えば、２０００ｂｐは良い が、４０００ｂｐはさらに良く、時間の合理的百分率で良い結果を得るためには ４０００以上は必要ではない。この技術の綜説についてはＶｅｒｍａなど、「ヒ ト染色体：基礎技術便覧（Ｈｕｍａｎ・Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ａ・Ｍａｎｕ ａｌ・ｏｆ・Ｂａｓｉｃ・Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、ｐｅｒｇａｍｏｎ・ｐｒ ｅｓｓ社、Ｎｅｗ・Ｙｏｒｋ（１９８８年）を参照のこと。 ある配列が染色体上の精密な位置に配置されると、その配列の染色体上の物理 的な位置を遺伝子地図データと関連付けできる。そのようなデータは、例えば、 Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ、「ヒトでのメンデル的遺伝（Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ・Ｉｎ ｈｅｒｉｔａｎｃｅ・ｉｎ・Ｍａｎ）」（Ｊｏｈｎｓ・Ｈｏｐｋｉｎｓ・Ｕｎｉ ｖｅｒｓｉｔｙ・Ｗｅｌｃｈ・Ｍｅｄｉｃａｌ・Ｌｉｂｒａｒｙから購入可能） に見出される。同じ染色体領域に配置された遺伝子と疾患との間の関係は、連鎖 分析（物理的に隣接する遺伝子の共遺伝）によって確認される。 次に、患者と非患者との間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定する必要 がある。もし患者の一部か全部に突然変異が観察されるが、いずれの非患者でも 観察されなければ、その突然変異はその疾患の原因であると見込まれる。 物理的地図作成および遺伝子的地図作成技術の最近の解決法によれば、疾患に 関連ある染色体領域に精密に配置されたｃＤＮＡは可能性ある原因遺伝子５０個 と５００個との間の中の一つである。（これは１メガ塩基の地図作成分析および １遺伝子２０ｋｂと仮定している）。 患者と非患者との比較は一般に、まず、たとえば染色体スプレッドに見られる かまたはｃＤＮＡ配列に基づくＰＣＲを使用して検出される欠失または転座のよ うな、染色体中の構造変化を探す。究極的には突然変異の存在を確認し、および 突然変異を多形性から識別するためには、数人からの遺伝子を完全に配列決定す ることが必要である。 本発明はさらにアンチセンス技術の使用によって、ＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４、 およびＭＩＰ−１_γを生体内で阻害することを指向している。アンチセンス技術 はポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づいて、三重ラセン形成 か、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡか、の方法を通して遺伝子発現を制御する ために使用できる。例えば、本発明のポリペプチドをコードするそのポリヌクレ オチド配列の５’−コード部分を使用して、長さ約１０から４０塩基対のアンチ センスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは転写 に関与する遺伝子領域に相補的なように設計（三重ラセンについては、Ｌｅｅな ど、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、６巻：３０７３頁（１９７９年）；Ｃｏ ｏｎｅｙなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１巻：４５６頁（１９８８年）；およびＤ ｅｒｖａｎなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１巻：１３６０頁（１９９１年）を参照 のこと）し、ＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４、およびＭＩＰ−１_γの転写および生産を 予防する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは生体内でｍＲＮＡにハイブ リッド化して、ＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４、およびＭＩＰ−１_γへのｍＲＮＡ分子 の翻訳を阻害する（アンチセンスについては、Ｏｋａｎｏ，Ｊ．、Ｎｅｕｒｏｃ ｈｅｍ．、５６巻：５６０頁（１９９１年）；「遺伝子発現のアンチセンス阻害 剤としてのオリゴデオキシヌクレオチド（Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔ ｉｄｅｓ・ａｓ・Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ・Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ・ｏｆ・Ｇｅｎｅ ・Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」、ＣＲＣ・ｐｒｅｓｓ社、Ｂｏｃａ・Ｒａｔｏｎ、 ＦＬ（１９８８年）参照）。 その他に前記オリゴヌクレオチドは、前記の様式でＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４、 およびＭＩＰ−１_γの産生を阻止するため、生体内でアンチセンスＲＮＡまたは ＤＮＡが発現されうるような当分野の操作法によって細胞まで送達できる。 従って、ＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４およびＭＩＰ−１_γへのアンチセンス構築物 をＭＩＰが誘発するか強化するかいずれかの疾患、例えば動脈硬化症、たとえば 多発性硬化症およびインシュリン依存性糖尿病などのような自己免疫疾患、およ び慢性炎症および感染性疾患、ヒスタミン媒介性アレルギー反応、リュウマチ性 関節炎、珪肺症、類肉腫症、特発性肺線維症、その他の肺臓の慢性炎症疾患、特 発性好酸球過剰症候群、内毒素性ショック、ヒスタミン媒介アレルギー性反応、 プロスタグランジン−非依存性発熱、および再生不良性貧血、その他の骨髄不全 性疾患など、を処置するために使用できる。 これらポリペプチド、その断片またはその他の誘導体、または同族体、または これらを発現する細胞はそれらに対する抗体を生産するための免疫原として使用 できる。これら抗体は、例えばポリクローナルまたはモノクローナル抗体である ことができる。本発明はまたキメラ、単一鎖およびヒト化抗体、ならびにＦａｂ 断片またはＦａｂ発現ライブラリー生産物を包含する。そのような抗体と断片と の生産のためには当業界で公知の様々な操作法を使用しうる。 本発明の配列に対応するポリペプチドまたはその生体内受容体に対する抗体は そのポリペプチドを直接に動物に注射するかまたは動物、好ましくはヒト以外、 に投与することによって生産できる。こうして得た抗体はポリペプチドに結合す る。この様式で、そのポリペプチドの断片のみをコードする配列さえ全天然ポリ ペプチドを結合する抗体を発生させるために使用できる。そのような抗体を次に そのポリペプチドを発現する組織から、そのポリペプチドを分離するために使用 できる。 モノクローナル抗体を製造するには、連続的細胞系培養によって抗体を与える いかなる技術も使用できる。例にはハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌ ｓｔｅｉｎ、１９７５年、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５〜４９７頁）、トリ オーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒなど、１９８３年、 Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ・Ｔｏｄａｙ、４巻：７２頁）、およびヒトのモノクロー ナル抗体を生産するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅなど、１９８５ 年、「モノクローナル抗体および癌治療法（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ・Ａｎｔｉｂ ｏｄｉｅｓ・ａｎｄ・Ｃａｎｃｅｒ・Ｔｈｅｒａｐｙ）」、Ａｌａｎ・Ｒ．Ｌｉ ｓｓ社、中、７７〜９６頁）を包含する。 単鎖抗体の生産法について記載された技術（米国特許４９４６７７８号）は単 鎖抗体を生産するようにこの発明の免疫原性ポリペプチド生産物に適応できる。 本発明はまたポリペプチドの機能を阻止または除去する本発明のポリペプチド の拮抗剤／阻害剤をも指向する。 そこで、例えば、拮抗剤は本発明のポリペプチドに結合して、その機能を阻止 または除去する。この拮抗剤は、例えばこのポリペプチドまたは、場合によって はオリゴヌクレオチドに結合するポリペプチドに対する抗体であることができよ う。阻害剤の例は、ポリペプチドの触媒部位に結合し、占有して基質が触媒部位 に接近できなくして正常な生物学的活性を阻止するような低分子である。低分子 の例は、これに限定するものではないが、低分子のペプチドまたはペプチド様分 子である。 その他に、本発明のポリペプチドに対する拮抗剤には正常には本発明のポリペ プチドが結合する受容体に結合するものを採用しうる。この拮抗剤は、天然蛋白 質の受容体部位を認識し、結合するが、しかしながら、それらはポリペプチドの 不活性型であって受容体部位を占有するので、そこでＭＩＰ−３、ＭＩＰ−４、 およびＭＩＰ−１_γの活性を阻止するような、極めて近縁な蛋白質でありうる。 これらの方法にる、これら拮抗剤／阻害剤は白血球の誘引および活性化を予防 することによって抗炎症薬剤として使用しうる。それらはまた自己免疫性および 慢性炎症性および感染性疾患において、マクロファージおよびその前駆体および 好中球、好塩基球、Ｂリンパ球およびある種のＴ細胞サブセットの化学走化性お よび活性化を阻止するために；ＭＩＰ誘発性幹細胞および好塩基球の脱顆粒化を 阻止し、そこでヒスタミン媒介アレルギー反応を低下させるために；ＭＩＰが生 合成を刺激するＩＬ−１およびＴＮＦが一次的に起こす有害な過程を阻止するた めに；リュウマチ性関節炎；およびＭＩＰが駆動する主に好中球性炎症からマク ロファージが主役の病理へ移行して急性の消散する炎症的防御から慢性の究極的 には破壊的な、たとえば自己免疫疾患などの、機構への移行を阻止するために； 有用でありうる。 これら拮抗剤／阻害剤はまた珪肺症、類肉腫症、特発性肺線維症およびその他 の肺慢性炎症性疾患の処置；ＭＩＰ生産の上昇は好酸球生産および移動を悪化さ せるので特発性好酸球過剰性症候群の処置；内毒素に反応するＭＩＰ水準上昇に 起因する内毒素性ショックの処置；ＭＩＰ誘発性の幹細胞および好塩基球脱顆粒 化阻止によるヒスタミン媒介アレルギー反応の処置；ＭＩＰ−１αが誘発するプ ロスタグランジン非依存性発熱の阻止；および形成不全性貧血およびその他の骨 髄不全症例における過剰なＭＩＰ−１αによる抑制効果の予防；にも有用であり うる。 これら抗体はまた病状進行および治療的介入の効果を把握するための予後適用 および臨床スクリーニングにも有用であると思われる。常在性マクロファージは ＭＩＰｍＲＮＡを全くまたは殆ど生産しないので、これを検出できる診断用抗体 は自己免疫疾患および慢性炎症性および感染性病状の有用な指標であると思われ る。 この拮抗剤／阻害剤は、たとえば前記のような医薬的担体との組成物中に採用 しうる。 本発明をさらに下記実施例に照らして記載する。しかしながら、本発明はこれ ら実施例に限定されないことを理解すべきである。別段の指摘がない限り、比率 または量は重量による。 下記実施例の理解を促進するために頻繁に出現する方法および／または用語を いくつか記載しよう。 「プラスミド」は小文字のｐと、その前におよび／またはそれに続く、大文字 および／または数字とで示す。ここで出発プラスミドは商業的に購入可能である か、公衆が制限なしに入手しうるか、または出版された操作法に従って入手可能 なプラスミドから構築することができる。これに加え、前記のものと均等なプラ スミドは当業者に公知であり、通常の熟練者には明白となろう。 ＤＮＡの「消化」はＤＮＡ中でのある配列でのみ作用する制限酵素でのＤＮＡ の触媒的切断を示す。ここで使用する様々な制限酵素は商業的に購入可能で、そ れらの反応条件、補助因子およびその他の必要条件は通常の当業者に公知なよう にして使用されよう。分析目的のためには、典型的にはプラスミドまたはＤＮＡ 断片１μｇを酵素約２単位とともに緩衝液約２０μＬ中で使用する。プラスミド 構築のためにＤＮＡ断片を分離する目的のためには、典型的には５から５０μｇ のＤＮＡを２０から２５０単位の酵素でさらに大きい容積中で消化する。特定の 制限酵素用に適当な緩衝液および基質量は製造社が指定する。３７℃で約１時間 のインキュベーション時間が通常使用されるが、供給社の指示に従って変動しう る。消化後、反応物を直接にポリアクリルアミドゲル上で電気泳動して所期の断 片を分離する。 切断した断片のサイズ分離は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．など、Ｎｕｃｌｅｉｃ・ Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、８巻：４０５７頁（１９８０年）に記載の８％ポリアク リルアミドゲルを使用して実行する。 「オリゴヌクレオチド」は化学合成されたものでもよい一本鎖ポリデオキシヌ クレオチド１個か、相補二本鎖ポリデオキシヌクレオチドかのいずれかを示す。 そのような合成オリゴヌクレオチドは５’−ホスフェートを持たないので、キナ ーゼの存在下でもＡＴＰでホスフェートを付加しなければ、他のオリゴヌクレオ チドには結合しない。合成オリゴヌクレオチドは脱燐酸化していない断片に結合 する。 「結合（ｌｉｇａｔｉｏｎ）」は二本鎖核酸断片２個の間のホスホジエステル 結合形成の過程を示す（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．など、前出、１４６頁）。別段 の指摘がない限り、結合は約等モル量の結合すべき両ＤＮＡ断片０．５μｇにつ いてＴ４ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）１０単位とともに既知の緩衝液および 条件を使用して達成しうる。 別段の指摘がない限り、形質転換はＧｒａｈａｍ，Ｆ．とＶａｎ・ｄｅｒ・Ｅ ｂ，Ａ．、Ｖｌｒｏｌｏｇｙ、５２巻：４５６〜４５７頁（１９７３年）の方法 に記載されているようにして実行した。実施例１ ＭＩＰ−３の細菌での発現および精製 ＭＩＰ−３をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ＃７５６７６、は最初に５’お よびプロセッシングされたＭＩＰ−３蛋白質（マイナスシグナルペプチド配列） の配列およびＭＩＰ−３遺伝子の３’へのベクターの配列に対応するＰＣＲオリ ゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅する。ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩに対 応する付加的なヌクレオチドを５’および３’配列に各々付加した。５’−オリ ゴヌクレオチドプライマーは配列５’−ＴＣＡＧＧＡＴＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＡ ＧＡＴＧＣＡＧＡ−３’を持ち、ＢａｍＨＩ制限酵素部位とそれに続くプロセッ シングされた蛋白質コドンの推測上の末端アミノ酸から始まるＭＩＰ−３のコー ド配列１８ヌクレオチドを包含する。３’−配列である３’−ＣＧＣＴＣＴＡＧ ＡＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−５’はＸｂａＩ部位とＭＩＰ−３ＤＮ Ａ挿入物の３’に位置するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫベクター配列とへの相補 配列を包含する。これら両制限酵素部位は細菌発現ベクターＰＱＥ−９上の制限 酵素部位に対応する。（Ｑｉａｇｅｎ社、９２５９，Ｅｔｏｎ・Ａｖｅｎｕｅ、 Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ、９１３１１）。ＰＱＥ−９は抗生物質耐性（Ａｍ ｐ^r）、細菌の複製開始点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ制御可能プロモーターオペレー ター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、６−Ｈｉｓタグおよび制限酵 素部位をコードする。ｐＱＥ−９を次にＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化する。 増幅した配列をＰＱＥ−９に結合し、ヒスチジンタグおよびＲＢＳをコードする 配列を持つフレーム中に挿入する。図６はこの取合せの図式的表現を示す。次に 結合混合物を使用して商標Ｍ１５／ｒｅｐ・４の下にＱｉａｇｅｎ社から入手で きる大腸菌Ｍ１５／ｒｅｐ４株を形質転換する。Ｍ１５／ｒｅｐ４はｌａｃＩ抑 制因子を発現するプラスミドｐＲＥＰ４の多重コピーを含有し、カナマイシン耐 性（Ｋａｎ^r）も与える。形質転換体はＬＢプレート上で生育する能力により認 定し、アンピシリン／カナマイシン耐性のコロニーを選択する。プラスミドＤＮ Ａを分離し、制限分析により確認する。所期の構築物を含むクローンを一夜（Ｏ ／Ｎ）Ａｍｐ（１００μｇ／ｍＬ）およびＫａｎ（２５μｇ／ｍＬ）の双方を添 加したＬＢ培地中の液体培地中で生育させる。Ｏ／Ｎ培養物を使用して１：１０ ０から１：２５０の比率で大きな培地に植菌する。細胞を光学的密度６００（Ｏ ．Ｄ．⁶⁰⁰）が０．４から０．６までの間になるまで生育させる。次にＩＰＴＧ （「イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド」）を最終濃度１ｍＭにな るまで添加する。ＩＰＴＧはｌａｃＩ抑制因子を不活化して、遺伝子発現増加に 導くＰ／Ｏのクリアリングを誘発する。細胞をさらに３から４時間生育させる。 次に細胞を遠心分離により収穫する。細胞ペレットをカオトロープ剤６Ｍ−塩酸 グアニジン中に溶解する。稠明化後、溶解したＭＩＰ−３をこの溶液からニッケ ルキレートカラム上で６−Ｈｉｓタグを包含する蛋白質による強固な結合をさせ る条件下にクロマトグラフィーして精製する。Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅ．など、Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、４１１巻：１７７〜１８４頁（１９８４年）。 ＭＩＰ−３（純度９５％）はこのカラムから６Ｍ−塩酸グアニジンｐＨ５．０で 溶離し、再生のため３Ｍ−塩酸グアニジン、１００ｍＭ−燐酸ナトリウム、１０ ｍＭ−グルタチオン（還元型）および２ｍＭ−グルタチオン（酸化型）に調整す る。この溶液中で１２時間インキュベーション後、この蛋白質を１０ｍＭ−燐酸 ナトリウムに対して透析する。誘導後、１４ｋｄに対応する新蛋白質の存在はＭ ＩＰ−３の発現を証明する。実施例２ ＭＩＰ−４の細菌での発現および精製 ＭＩＰ−４をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ＃７５６７５、はまずプロセッ シングされたＭＩＰ−４蛋白質の５’−配列（マイナスシグナルペプチド配列） およびＭＩＰ−４遺伝子の３’へのｐＢＳＫベクター中の配列に対応するＰＣＲ オリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した。ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ に対応する付加的なヌクレオチドを５’および３’配列に各々付加した。５’− オリゴヌクレオチドプライマーは配列ＴＣＡＧＧＡＴＣＣＴＧＴＧＣＡＣＡＡＧ ＴＴＧＧＴＡＣＣを持ち、ＢａｍＨＩ制限酵素部位とそれに続くプロセッシング された蛋白質コドンの推測上の末端アミノ酸から始まるＭＩＰ−４のコード配列 １８ヌクレオチドを包含する；３’−配列ＣＧＣＴＣＴＡＧＡＧＴＡＡＡＡＣＧ ＡＣＧＧＣＣＡＧＴはＸｂａＩ部位およびＭＩＰ−４ＤＮＡ挿入物の３’に位置 するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫベクター配列への相補配列を包含する。これら 両制限酵素部位は細菌の発現ベクターｐＱＥ−９上の制限酵素部位に対応する。 （Ｑｉａｇｅｎ社、９２５９，Ｅｔｏｎ・ＡＶｅｎＵｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ 、ＣＡ、９１３１１）。ｐＱＥ−９は抗生物質耐性（Ａｍｐ^r）、細菌複製開始 点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ制御可能プロモーターオペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソ ーム結合部位（ＲＢＳ）、６−Ｈｉｓタグおよび制限酵素部位をコードする。ｐ ＱＥ−９を次にＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化した。増幅した配列をｐＱＥ− ９に結合し、ヒスチジンタグおよびＲＢＳをコードする配列を持つフレーム中に 挿入した。図６はこの取合せの図式的表現を示す。次に結合混合物を使用して商 標Ｍ１５／ｒｅｐ・４の下にＱｉａｇｅｎ社から入手できる大腸菌Ｍ１５／ｒｅ ｐ４株を形質転換した。Ｍ１５／ｒｅｐ４はｌａｃＩ抑制因子を発現するプラス ミドｐＲＥＰ４の多重コピーを含有し、カナマイシン耐性（Ｋａｎ^r）も与える 。形質転換体はＬＢプレート上で生育する能力により認定し、アンピシリン／カ ナマイシン耐性のコロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを分離し、制限分析に より確認した。所期の構築物を含むクローンを一夜（Ｏ／Ｎ）Ａｍｐ（１００μ ｇ／ｍＬ）およびＫａｎ（２５μｇ／ｍＬ）の双方を添加したＬＢ培地中の液体 培地中で生育させた。Ｏ／Ｎ培養物を使用して１：１００から１：２５０の比率 で大きな培地に植菌する。細胞を光学的密度６００（Ｏ．Ｄ．⁶⁰⁰）が０．４か ら０．６までの間になるまで生育させた。次にＩＰＴＧ（「イソプロピル−β− Ｄ−チオガラクトピラノシド」）を最終濃度１ｍＭになるまで添加した。ＩＰＴ ＧはｌａｃＩ抑制因子を不活化して、遺伝子発現増加に導くＰ／Ｏのクリアリン グを誘発する。細胞をさらに３から４時間生育させた。次に細胞を遠心分離によ って収穫した。細胞ペレットをカオトロープ剤６Ｍ−塩酸グアニジン中に溶解し た。稠明化後、溶解したＭＩＰ−４をこの溶液からニッケルキレートカラム上で ６−Ｈｉｓタグを包含する蛋白質による強固な結合をさせる条件下にクロマトグ ラフィ ーして精製した。Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅ．など、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ ｙ、４１１巻：１７７〜１８４頁（１９８４年）。ＭＩＰ−４（純度９５％）は このカラムから６Ｍ−塩酸グアニジンｐＨ５．０で溶離し、再生の目的で３Ｍ− 塩酸グアニジン、１００ｍＭ−燐酸ナトリウム、１０ｍＭ−グルタチオン（還元 型）および２ｍＭ−グルタチオン（酸化型）に調整した。この溶液中で１２時間 インキュベーション後、この蛋白質を１０ｍＭ−燐酸ナトリウムに対して透析し た。誘導後、１４ｋｄに対応する新蛋白質の存在がＭＩＰ−４の発現を証明した 。（図５）。実施例３ 組換えＭＩＰ−３のＣＯＳ細胞中での発現 プラスミドＣＭＸ−ＭＩＰ−３ＨＡの発現は１）ＳＶ４０複製開始点、２）ア ンピシリン耐性遺伝子、３）大腸菌複製開始点、４）ＣＭＶプロモーターとそれ に続くポリリンカー領域、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化部位を包含 するベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）から誘導する。 全ＭＩＰ−４前駆体をコードするＤＮＡ断片と３’−末端でフレームに融合する ＨＡタグとをベクターのポリリンカー領域にクローニングするため、組換え蛋白 質の発現はＣＭＶプロモーターに支配される。ＨＡタグはインフルエンザヘマグ ルチニン蛋白質から以前に報告されたようにして（Ｉ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ｈ．Ｎｉ ｍａｎ、Ｒ．Ｈｅｉｇｈｔｅｎ、Ａ．Ｃｈｅｒｅｎｓｏｎ、Ｍ．Ｃｏｎｎｏｌｌ ｙ、およびＲ．Ｌｅｒｎｅｒ、１９８４年、Ｃｅｌｌ、３７巻：７６７頁）誘導 されたエピトープに対応する。ＨＡタグをわれわれの標的蛋白質に注入したこと で、ＨＡエピトープを認識する抗体でのこの組換え蛋白質の検出が容易になる。 プラスミド構築の方策を次に記述する： ＭＩＰ−３をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ＃７５６７６はプライマー２個 を使用してクローニングした原ＥＳＴでのＰＣＲにより構築する。５’−プライ マー（５’ＧＧＡＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＧＴＧＧＣＴ−３’） はＨｉｎｄＩＩＩ部位とそれに続く開始コドンから出発するＭＩＰ−３のコード 配列１８ヌクレオチドとを包含し；３’配列（５’−ＣＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡ ＡＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＧＡＣＧＴＣＧＴＡＴＧＧＧＴＡＡＴＴＣＴＴＣＣＴ ＧＧＴＣＴＴＧＡＴＣＣ−３’）はＸｂａＩ部位の相補配列、翻訳停止コドン、 ＨＡタグおよびＭＩＰ−３のコード配列の最後の２０ヌクレオチド（停止コドン を含まない）を包含する。それ故、ＰＣＲ生成物はＨｉｎｄＩＩＩ部位、ＭＩＰ −３のコード配列とそれに続くフレームに融合したＨＡタグ、ＨＡタグに隣接す る翻訳終結停止コドンおよびＸｂａＩ部位を包含する。ＰＣＲで増幅したＤＮＡ 断片およびベクターｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐをＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限 酵素で消化し、結合する。結合混合物で大腸菌ＳＵＲＥ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ ｅ・Ｃｌｏｎｉｎｇ・Ｓｙｓｔｅｍｓ社、１１０９９・Ｎｏｒｔｈ・Ｔｏｒｒｅ ｙ・Ｐｉｎｅｓ・Ｒｏａｄ、Ｌａ・Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、９２０３７から入手可能 ）を形質転換して、形質転換体の培養物をアンピシリン培地プレートに播種し、 耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを形質転換体から分離し、制限分析 によって正しい断片の存在を調査する。組換えＭＩＰ−３の発現用に、ＤＥＡＥ デキストラン法によってこの発現ベクターをＣＯＳ細胞に遺伝子移入する（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、「分子クロー ニング：実験室便覧（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ・Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ・Ｐｒｅｓｓ社、（１９８９年））。ＭＩＰ−３−ＨＡ蛋白質の発現は放射能標 識および免疫沈降法により検出する。（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ、Ｄ．Ｌａｎｅ、「抗 体：実験室便覧（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕ ａｌ）」、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｐ ｒｅｓｓ社、（１９８８年））。遺伝子移入２日後に細胞を³⁵Ｓ−システインで ８時間標識する。次に培地を集め、細胞を界面活性剤（ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ ｍＭ−ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０、０．５％ ＤＯＣ、５０ｍＭ−トリス、ｐＨ７．５）（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．など、前出、３ ７巻：７６７頁（１９８４年））で溶解する。細胞溶解物および培地の双方をＨ Ａ特異的モノクローナル抗体で沈降させる。沈降した蛋白質を１５％ＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥ上で分析する。実施例４ 組換えＭＩＰ−４のＣＯＳ細胞中での発現 プラスミドＣＭＸ−ＭＩＰ−４ＨＡの発現は１）ＳＶ４０複製開始点、２）ア ンピシリン耐性遺伝子、３）大腸菌複製開始点、４）ＣＭＶプロモーターとそれ に続くポリリンカー領域、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化部位を包含 するベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）から誘導する。 全ＭＩＰ−４前駆体をコードするＤＮＡ断片と３’−末端でフレームに融合する ＨＡタグとをベクターのポリリンカー領域にクローニングするため、組換え蛋白 質の発現はＣＭＶプロモーターに支配される。ＨＡタグはインフルエンザヘマグ ルチニン蛋白質から以前に報告されたようにして（Ｉ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ｈ．Ｎｉ ｍａｎ、Ｒ．Ｈｅｉｇｈｔｅｎ、Ａ．Ｃｈｅｒｅｎｓｏｎ、Ｍ．Ｃｏｎｎｏｌｌ ｙ、およびＲ．Ｌｅｒｎｅｒ、１９８４年、Ｃｅｌｌ、３７巻：７６７頁）誘導 されたエピトープに対応する。ＨＡタグをわれわれの標的蛋白質に注入したこと で、ＨＡエピトープを認識する抗体でのこの組換え蛋白質の検出が容易になる。 プラスミド構築の方策を次に記述する： ＭＩＰ−４をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ＃７５６７５はプライマー２個 を使用してクローニングした原ＥＳＴでのＰＣＲにより構築する。５’−プライ マー（５’ＧＧＡＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＡＧＧＧＣＣＴＴＧＣＡＧＣＴＧＣＣ− ３’）はＨｉｎｄＩＩＩ部位とそれに続く開始コドンから出発するＭＩＰ−４の コード配列２０ヌクレオチドを包含し；３’配列（５’−ＣＧＣＴＣＴＡＧＡＴ ＣＡＡＢＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＧＡＣＧＴＣＧＴＡＴＧＧＧ-ＴＡＧＧＣＡＴＴ ＣＡＧＣＴＴＣＡＧＧＴＣ−３’）はＸｂａＩ部位の相補配列、翻訳停止コドン 、ＨＡタグおよびＭＩＰ−４のコード配列の最後の１９ヌクレオチド（停止コド ンを含まない）を包含する。それ故、ＰＣＲ生成物はＨｉｎｄＩＩＩ部位、ＭＩ Ｐ−４のコード配列とそれに続くフレームに融合したＨＡタグ、ＨＡタグに隣接 する翻訳終結停止コドンおよびＸｂａＩ部位を包含する。ＰＣＲ増幅したＤＮＡ 断片およびベクターｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐをＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限 酵素で消化し、結合する。結合混合物で大腸菌ＳＵＲＥ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ ｅ・Ｃｌｏｎｉｎｇ・Ｓｙｓｔｅｍｓ社、１１０９９・Ｎｏｒｔｈ・Ｔｏｒｒｅ ｙ・Ｐｉｎｅｓ・Ｒｏａｄ、Ｌａ・Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、９２０３７から入手可能 ）を 形質転換して、形質転換体の培養物をアンピシリン培地プレートに播種し、耐性 コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを形質転換体から分離し、制限分析によ って正しい断片の存在を調査する。組換えＭＩＰ−４の発現用に、この発現ベク ターをＤＥＡＥデキストラン法によってＣＯＳ細胞に遺伝子移入する（Ｊ．Ｓａ ｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、「分子クローニン グ：実験室便覧（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ・Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｐ ｒｅｓｓ社、（１９８９年））。ＭＩＰ−４−ＨＡ蛋白質の発現は放射能標識お よび免疫沈降法により検出する。（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ、Ｄ．Ｌａｎｅ、「抗体： 実験室便覧（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａｌ ）」、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｐｒｅ ｓｓ社、（１９８８年））。遺伝子移入２日後に、細胞を³⁵Ｓ−システインで８ 時間標識する。次に培地を集め、細胞を界面活性剤（ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍ Ｍ−ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０、０．５％Ｄ ＯＣ、５０ｍＭ−トリス、ｐＨ７．５）。（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．など、前出、３ ７巻：７６７頁（１９８４年））で溶解する。細胞溶解物と培地との双方をＨＡ 特異的モノクローナル抗体で沈降させる。沈降した蛋白質を１５％ＳＤＳ−ＰＡ ＧＥ上で分析する。実施例５ ヒト組織中でのＭＩＰ−３の発現パターン ノーザンブロット分析を実施してヒト組織中でのＭＩＰ−３の発現水準を調査 した。細胞の全ＲＮＡ標本はＲＮＡｚｏｌ（商標）Ｂシステム（Ｂｉｏｔｅｃｘ ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、６０２３・Ｓｏｕｔｈ・Ｌｏｏｐ・Ｅａｓｔ、 Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、７７０３３）で分離した。ヒトの各所定組織から分離し た全ＲＮＡ約１０μｇを１％アガロースゲル上で分離し、ナイロンフィルター上 で染色する（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉ ｓ、「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ）」、Ｃｏｌｄ ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｐｒｅｓｓ社、（１９ ８９年））。標識反応はＤＮＡ断片５０ｎｇについてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社の Ｐｒ ｉｍｅ−Ｉｔキットに従って行う。標識したＤＮＡはＳｅｌｅｃｔ−Ｇ−５０カ ラムで精製する（５・Ｐｒｉｍｅ−３・Ｐｒｉｍｅ社、５６０３・Ａｒａｐａｈ ｏｅ・Ｒｏａｄ、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ、８０３０３）。フィルターを次に０． ５Ｍ−ＮａＰＯ₄、ｐＨ７．４および７％ＳＤＳ中で、１００００００ｃｐｍ／ ｍＬで放射能標識した全長ＭＩＰ−３遺伝子と一夜６５℃でハイブリド化する。 室温で２回と６０℃で２回、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後に、フィ ルターを−７０℃で強化スクリーンに一夜露出する。実施例６ ヒト組織中でのＭＩＰ−４の発現パターン ノーザンブロット分析を実施してヒト細胞中でのＭＩＰ−４の発現水準を調査 した。細胞の全ＲＮＡ標本はＲＮＡｚｏｌ（商標）Ｂシステム（Ｂｉｏｔｅｃｘ ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、６０２３・Ｓｏｕｔｈ・Ｌｏｏｐ・Ｅａｓｔ、 Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、７７０３３）で分離した。ヒトの各所定組織から分離し た全ＲＮＡ約１０μｇを１％アガロースゲル上で分離し、ナイロンフィルター上 で染色した（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉ ｓ、「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ）」、Ｃｏｌｄ ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｐｒｅｓｓ社、（１９ ８９年））。標識反応はＤＮＡ断片５０ｎｇについてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社の Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔキットに従って行った。標識したＤＮＡはＳｅｌｅｃｔ−Ｇ− ５０カラムで精製した。（５・Ｐｒｉｍｅ−３・Ｐｒｉｍｅ社、５６０３・Ａｒ ａｐａｈｏｅ・Ｒｏａｄ、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ、８０３０３）。フィルターを 次に０．５Ｍ−ＮａＰＯ₄、ｐＨ７．４および７％ＳＤＳ中で、１００００００ ｃｐｍ／ｍＬで放射能標識した全長ＭＩＰ−４遺伝子と一夜６５℃でハイブリド 化した。室温で２回と６０℃で２回、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後 に、フィルターを−７０℃で強化スクリーンに一夜露出した。図６参照。実施例７ ＭＩＰ−１_γの細菌での発現および精製 ＭＩＰ−１_γをコードするＤＮＡ配列ＰＢＬＳＫＭＩＰ（ＡＴＣＣ＃７５５７ ２）はまずプロセッシングされたＭＩＰ−１_γ蛋白質（マイナスシグナルペプチ ド配列）の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー を使用して増幅し、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩに対応する付加的ヌクレオチドを ５’および３’配列に各々付加した。５’オリゴヌクレオチドプライマーは配列 ＧＣＣＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＣＴＣＡＣＧＧＧＧＡＣＣＴＴＡＣを持ち、Ｂａ ｍＨＩ制限酵素部位とそれに続くプロセッシングされた蛋白質コドンの推測上の 末端アミノ酸から始まるＭＩＰ−１_γコード配列１５ヌクレオチドを包含する。 ３’−配列ＧＣＣＴＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＡＡＧＣＡＧＧＧＡＡＧＣＴＣＣＡ ＧはＸｂａＩ部位の相補配列、翻訳停止コドンおよびＭＩＰ−１_γコード配列の 最後の２０ヌクレオチドを包含する。これら両制限酵素部位は細菌の発現ベクタ ーＰＱＥ−９上の制限酵素部位に対応する。（Ｑｉａｇｅｎ社、９２５９，Ｅｔ ｏｎ・Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ、９１３１１）。ＰＱＥ−９ は抗生物質耐性（Ａｍｐ^r）、細菌複製開始点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ制御可能プ ロモーターオペレター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、６−Ｈｉｓ タグおよび制限酵素部位をコードする。ｐＱＥ−９を次にＢａｍＨＩとＸｂａＩ とで消化した。増幅した配列をＰＱＥ−９に結合し、ヒスチジンタグおよびＲＢ Ｓをコードする配列を持つフレーム中に挿入した。図６はこの取合せの図式的表 現を示す。次に結合混合物を使用して、商標Ｍ１５／ｒｅｐ・４の下にＱｉａｇ ｅｎ社から入手できる大腸菌Ｍ１５／ｒｅｐ４株を形質転換した。Ｍ１５／ｒｅ ｐ４はｌａｃＩ抑制因子を発現するプラスミドｐＲＥＰ４の多重コピーを含有し 、カナマイシン耐性（Ｋａｎ^r）も与える。形質転換体はＬＢプレート上で生育 する能力により認定されるが、アンピシリン／カナマイシン耐性のコロニーを選 択した。プラスミドＤＮＡを分離して、制限分析により確認した。所期の構築物 を含むクローンを一夜（Ｏ／Ｎ）Ａｍｐ（１００μｇ／ｍＬ）およびＫａｎ（２ ５μｇ／ｍＬ）の双方を添加したＬＢ培地中の液体培地中で生育させた。Ｏ／Ｎ 培養物を使用して１：１００から１：２５０比の大きな培地に植菌する。細胞を 光学的密度６００（０．Ｄ．⁶⁰⁰）が０．４から０．６までの間になるまで生育 させた。次にＩＰＴＧ（「イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド」） を最終濃度１ｍＭになるまで添加した。ＩＰＴＧはｌａｃＩ抑制因子を不活化し て、遺伝子発現増加に導くＰ／Ｏのクリアリングを誘発する。細胞をさらに３か ら４時間生育させた。次に細胞を遠心分離によって収穫した。細胞ペレットをカ オトロープ剤６Ｍ−塩酸グアニジン中に溶解した。稠明化後、溶解したＭＩＰ− １_γをこの溶液からニッケルキレートカラム上で６−Ｈｉｓタグを含有する蛋白 質による強固な結合をさせる条件下にクロマトグラフィーして精製した。Ｈｏｃ ｈｕｌｉ，Ｅ．など、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、４１１巻：１７７〜 １８４頁（１９８４年）。ＭＩＰ−１_γ（純度９５％）はこのカラムから６Ｍ− 塩酸グアニジンｐＨ５．０で溶離し、再生の目的で３Ｍ−塩酸グアニジン、１０ ０ｍＭ−燐酸ナトリウム、１０ｍＭ−グルタチオン（還元型）および２ｍＭ−グ ルタチオン（酸化型）に調整した。この溶液中で１２時間インキュベーション後 、この蛋白質を１０ｍＭ−燐酸ナトリウムに対して透析した。誘導後、１４ｋｄ に対応する新蛋白質の存在はＭＩＰ−１_γの発現を証明した。（図３）。実施例８ 組換えＭＩＰ−１_γのＣＯＳ細胞中での発現 プラスミドＣＭＸ−ＭＩＰ−１_γＨＡの発現は１）ＳＶ４０複製開始点、２） アンピシリン耐性遺伝子、３）大腸菌複製開始点、４）ＣＭＶプロモーターとそ れに続くポリリンカー領域、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化部位を包 含するベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）から誘導する 。全ＭＩＰ−１_γ前駆体をコードするＤＮＡ断片と３’−末端でフレームに融合 するＨＡタグとをベクターのポリリンカー領域にクローニングしたので、組換え 蛋白質の発現はＣＭＶプロモーターに支配される。ＨＡタグはインフルエンザヘ マグルチニン蛋白質から以前に報告されたようにして（Ｉ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ｈ． Ｎｉｍａｎ、Ｒ．Ｈｅｉｇｈｔｅｎ、Ａ．Ｃｈｅｒｅｎｓｏｎ、Ｍ．Ｃｏｎｎｏ ｌｌｙ、およびＲ．Ｌｅｒｎｅｒ、１９８４年、Ｃｅｌｌ、３７巻：７６７頁） 誘導されたエピトープに対応する。ＨＡタグをわれわれの標的蛋白質に注入した のでＨＡエピトープを認識する抗体でのこの組換え蛋白質の検出が容易になる。 プラスミド構築の方策を次に記述する： ＭＩＰ−１_γをコードするＤＮＡ配列ｐＢＬＳＫＭＩＰ（ＡＴＣＣ＃７５５７ ２）はプライマー２個を使用してクローニングした原ＥＳＴでのＰＣＲにより構 築した。５’−プライマー（５’ＧＧＡＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＡＧＡＴＴＣＣＧ ＴＧＧＣＴＧＣ-３’）はＨｉｎｄＩＩＩ部位とそれに続く開始コドンから始ま るＭＩＰ−１_γコード配列２０ヌクレオチドを包含し；３’配列（５’ＣＧＣＴ ＣＴＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＧＡＣＧＴＣＧＴＡＴＧＧＧＴＡＧ ＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＴＧＴＣＣＴＴＧ-５’）はＸｂａＩ部位の相補配列、翻 訳停止コドン、ＨＡタグおよびＭＩＰ−１_γコード配列の最後の１９ヌクレオチ ド（停止コドンを含まない）を包含する。それ故、ＰＣＲ生成物はＨｉｎｄＩＩ Ｉ部位、ＭＩＰ−１_γコード配列とそれに続くフレームに融合したＨＡタグ、Ｈ Ａタグに隣接する翻訳終結停止コドンおよびＸｂａＩ部位を包含する。ＰＣＲで 増幅したＤＮＡ断片およびベクターｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐをＨｉｎｄＩＩＩおよ びＸｂａＩ制限酵素で消化し、結合した。結合混合物で大腸菌ＳＵＲＥ株（Ｓｔ ｒａｔａｇｅｎｅ・Ｃｌｏｎｉｎｇ・Ｓｙｓｔｅｍｓ社、１１０９９・Ｎｏｒｔ ｈ・Ｔｏｒｒｅｙ・Ｐｉｎｅｓ・Ｒｏａｄ、Ｌａ・Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、９２０３ ７から入手可能）を形質転換して、形質転換体の培養物をアンピシリン培地プレ ートに播種し、耐性コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを形質転換体から分 離し、制限分析により正しい断片の存在を調査した。組換えＭＩＰ−１_γの発現 用に、この発現ベクターをＣＯＳ細胞にＤＥＡＥデキストラン法（Ｊ．Ｓａｍｂ ｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、「分子クローニング： 実験室便覧（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ・Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｐｒｅ ｓｓ社、（１９８９年））によって遺伝子移入した。ＭＩＰ−１_γ−ＨＡ蛋白質 の発現は放射能標識と免疫沈降法とにより検出した。（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ、Ｄ． Ｌａｎｅ、「抗体：実験室便覧（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ・Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ・Ｐｒｅｓｓ社、（１９８８年））。遺伝子移入２日後に細胞を³⁵Ｓ − システインで８時間標識した。次に培地を集め、細胞を界面活性剤（ＲＩＰＡ緩 衝液（１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４ ０、０．５％ＤＯＣ、５０ｍＭ−トリス、ｐＨ７．５）。（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ． など、前出、３７巻：７６７頁（１９８４年））で溶解した。細胞溶解物および 培地の双方をＨＡ特異的モノクローナル抗体で沈降させた。沈降した蛋白質を１ ５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析した。実施例９ ヒト組織中でのＭＩＰ−１_γの発現パターン ノーザンブロット分析を実施してヒト組織中でのＭＩＰ−１_γの発現水準を調 査した。細胞全ＲＮＡ標本はＲＮＡｚｏｌ（商標）Ｂシステム（Ｂｉｏｔｅｃｘ ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、６０２３・Ｓｏｕｔｈ・Ｌｏｏｐ・Ｅａｓｔ、 Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、７７０３３）で分離した。ヒトの各所定組織から分離し た全ＲＮＡ約１０μｇを１％アガロースゲル上で分離し、ナイロンフィルター上 で染色した（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ）Ｅ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉ ｓ、「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ）」、Ｃｏｌｄ ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｐｒｅｓｓ社、（１９ ８９年））。標識反応はＤＮＡ断片５０ｎｇについてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社の Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔキットに従って行った。標識したＤＮＡはＳｅｌｅｃｔ−Ｇ− ５０カラムで精製した（５・Ｐｒｉｍｅ−３・Ｐｒｉｍｅ社、５６０３・Ａｒａ ｐａｈｏｅ・Ｒｏａｄ、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ、８０３０３）。フィルターを次 に０．５Ｍ−ＮａＰＯ₄、ｐＨ７．４および７％ＳＤＳ中で、１００００００ｃ ｐｍ／ｍＬで放射能標識した全長ＭＩＰ−１_γ遺伝子と一夜６５℃でハイブリド 化した。室温で２回と６０℃で２回、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後 に、フィルターを−７０℃で強化スクリーンに一夜露出した。ＭＩＰ−１_γ用の メッセージＲＮＡは脾臓、肺臓、肝臓に豊富であり、また、その他の組織ではそ れらより少なかった。（図５）。 前記の教示に照らせば本発明の修正および変化は無数に可能であり、それ故、 添付請求項の範囲内にあり、本発明は特定的に記載したものとは異なるようにも 実行しうるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＢＦ 9356−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 16/18 ＡＢＸ 7804−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 1/21 ＡＤＡ 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ ＡＤＵ 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ ＡＤＸ 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＢ 48/00 ＡＥＤ ＡＢＡ Ｃ０７Ｈ 21/04 ＡＤＸ Ｃ０７Ｋ 14/47 ＡＢＥ 16/18 ＡＢＦ Ｃ１２Ｎ 1/21 ＡＤＡ 5/10 ＡＢＸ Ｃ１２Ｐ 21/02 ＡＤＵ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＣＮ，ＪＰ，Ｋ Ｒ，ＮＺ (72)発明者 ローゼン，クレイグ・エイ アメリカ合衆国20882メリーランド、レイ トンズビル、ローリング・ヒル・ロード 22400番 (72)発明者 ルーベン，スティーブン・エム アメリカ合衆国20832メリーランド、オル ネイ、ヘリティッジ・ヒルズ・ドライブ 18528番 (72)発明者 アダムズ，マーク・ディー アメリカ合衆国20878メリーランド、ノー ス・ポトマック、ダフィーフ・ドライブ 15205番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）図１の演繹されたアミノ酸配列を持つＭＩＰ−３ポリペプチドまた はそのポリペプチドの断片、同族体または誘導体をコードするポリヌクレオチド ； （ｂ）ＡＴＣＣ寄託番号７５６７６が含有するｃＤＮＡがコードするアミノ酸 配列を持つＭＩＰ−３ポリペプチドまたはそのポリペプチドの断片、同族体また は誘導体をコードするポリヌクレオチド； （ｃ）図２の演繹されたアミノ酸配列を持つＭＩＰ−４ポリペプチドまたはそ のポリペプチドの断片、同族体または誘導体をコードするポリヌクレオチド； （ｄ）ＡＴＣＣ寄託番号７５６７５が含有するｃＤＮＡがコードするアミノ酸 配列を持つＭＩＰ−４ポリペプチドまたはそのポリペプチドの断片、同族体また は誘導体をコードするポリヌクレオチド； から構成される群から選択した分離されたポリヌクレオチド。 ２．ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項１のポリヌクレオチド。 ３．ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項１のポリヌクレオチド。 ４．ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡである請求項１のポリヌクレオチド。 ５．ポリヌクレオチドが図１の演繹されたアミノ酸配列を持つＭＩＰ−３を コードする請求項２のポリヌクレオチド。 ６．ポリヌクレオチドがＡＴＣＣ寄託番号７５６７６のｃＤＮＡがコードする ＭＩＰ−３ポリペプチドをコードする請求項２のポリヌクレオチド。 ７．ポリヌクレオチドが図２の演繹されたアミノ酸配列を持つＭＩＰ−４をコ ードする請求項２のポリヌクレオチド。 ８．ポリヌクレオチドがＡＴＣＣ寄託番号７５６７５のｃＤＮＡがコードする ＭＩＰ−４ポリペプチドをコードする請求項２のポリヌクレオチド。 ９．図１に示すＭＩＰ−３のコード配列を持つ請求項１のポリヌクレオチド。 １０．ＡＴＣＣ寄託番号７５６７６として寄託したＭＩＰ−３のコード配列を 持つ請求項２のポリヌクレオチド。 １１．図２に示すＭＩＰ−４のコード配列を持つ請求項１のポリヌクレオチド 。 １２．ＡＴＣＣ寄託番号７５６７５として寄託したＭＩＰ−４のコード配列を 持つ請求項２のポリヌクレオチド。 １３．請求項２のＤＮＡを含有するベクター。 １４．請求項１３のベクターで遺伝子的に処理された宿主細胞。 １５．請求項１４の宿主細胞からそのＤＮＡがコードするポリペプチドを発現 することを含むポリペプチドを生産する方法。 １６．請求項１３のベクターで細胞を遺伝子的に処理することを含むポリペプ チドを発現することができる細胞を調製する方法。 １７．請求項２のＤＮＡにハイブリッド化でき、ＭＩＰ−３活性を持つポリペ プチドをコードする分離されたＤＮＡ。 １８．請求項２のＤＮＡにハイブリッド化でき、ＭＩＰ−４活性を持つポリペ プチドをコードする分離されたＤＮＡ。 １９．（ｉ）図１の演繹されたアミノ酸配列を持つＭＩＰ−３ポリペプチドお よびその断片、同族体および誘導体；（ｉｉ）ＡＴＣＣ寄託番号７５６７６が含 有するｃＤＮＡがコードするＭＩＰ−３ポリペプチドおよびそのポリペプチドの 断片、同族体および誘導体；（ｉｉｉ）図２の演繹されたアミノ酸配列を持つＭ ＩＰ−４ポリペプチドおよびその断片、同族体および誘導体；（ｉｖ）ＡＴＣＣ 寄託番号７５６７５が含有するｃＤＮＡがコードするＭＩＰ−４ポリペプチドお よびそのポリペプチドの断片、同族体および誘導体；から構成される群から選択 したポリペプチド。 ２０．ポリペプチドが図１の演繹されたアミノ酸配列を持つＭＩＰ−３である 請求項１９のポリペプチド。 ２１．ポリペプチドが図２の演繹されたアミノ酸配列を持つＭＩＰ−４である 請求項１９のポリペプチド。 ２２．請求項１９のＭＩＰ−３ポリペプチドに対する抗体。 ２３．ＭＩＰ−３受容体に対する抗体。 ２４．ＭＩＰ−４受容体に対する抗体。 ２５．請求項１９のＭＩＰ−４ポリペプチドに対する抗体。 ２６．請求項１９のＭＩＰ−３ポリペプチドに対する拮抗剤／阻害剤。 ２７．請求項１９のＭＩＰ−４ポリペプチドに対する拮抗剤／阻害剤。 ２８．請求項１９のポリペプチドの治療的有効量を患者に投与することを含む ＭＩＰ−３を必要とする患者の処置方法。 ２９．請求項１９のポリペプチドの治療的有効量を患者に投与することを含む ＭＩＰ−４を必要とする患者の処置方法。 ３０．請求項２６の拮抗剤／阻害剤の治療的有効量を患者に投与することを含 むＭＩＰ−３を阻止することを必要とする患者の処置方法。 ３１．請求項２７の拮抗剤／阻害剤の治療的有効量を患者に投与することを含 むＭＩＰ−４を阻止することを必要とする患者の処置方法。 ３２．請求項１９のＭＩＰ−３ポリペプチドおよび医薬的に許容される担体を 含有する医薬的組成物。 ３３．請求項１９のＭＩＰ−４ポリペプチドおよび医薬的に許容される担体を 含有する医薬的組成物。 ３４．（ａ）図８の演繹されたアミノ酸配列を持つＭＩＰ−１_γポリペプチド またはそのポリペプチドの断片、同族体または誘導体をコードするポリヌクレオ チド； （ｂ）ＡＴＣＣ寄託番号７５５７２が含有するｃＤＮＡがコードするアミノ酸 配列を持つＭＩＰ−１_γポリペプチドまたはそのポリペプチドの断片、同族体ま たは誘導体をコードするポリヌクレオチド； から構成される群から選択した分離されたポリヌクレオチド。 ３５．ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項３４のポリヌクレオチド。 ３６．ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項３４のポリヌクレオチド。 ３７．ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡである請求項３４のポリヌクレオチド 。 ３８．ポリヌクレオチドが図８の演繹されたアミノ酸配列を持つＭＩＰ−１_γ をコードする請求項３５のポリヌクレオチド。 ３９．ポリヌクレオチドがＡＴＣＣ寄託番号７５５７２のｃＤＮＡがコードす るＭＩＰ−１_γポリペプチドをコードする請求項３５のポリヌクレオチド。 ４０．図８に示すＭＩＰ−１_γのコード配列を持つ請求項３４のポリヌクレオ チド。 ４１．ＡＴＣＣ寄託番号７５５７２として寄託したＭＩＰ−１_γのコード配列 を持つ請求項３５のポリヌクレオチド。 ４２．請求項３５のＤＮＡを含有するベクター。 ４３．請求項４２のベクターで遺伝子的に処理された宿主細胞。 ４４．請求項４３の宿主細胞からそのＤＮＡがコードするポリペプチドを発現 することを含むポリペプチドを生産する方法。 ４５．請求項４２のベクターで細胞を遺伝子的に処理することを含むポリペプ チドを発現することができる細胞を調製する方法。 ４６．請求項３５のＤＮＡにハイブリッド化でき、ＭＩＰ−１_γ活性を持つポ リペプチドをコードする分離されたＤＮＡ。 ４７．（ｉ）図８の演繹されたアミノ酸配列を持つＭＩＰ−１_γポリペプチド およびその断片、同族体または誘導体、および（ｉｉ）ＡＴＣＣ寄託番号７５５ ７２のｃＤＮＡがコードするＭＩＰ−１_γポリペプチドおよびそのポリペプチド の断片、同族体または誘導体、から構成される群から選択したポリペプチド。 ４８．ポリペプチドが図８の演繹されたアミノ酸配列を持つＭＩＰ−１_γであ る請求項１４のポリペプチド。 ４９．請求項４７のポリペプチドに対する抗体。 ５０．請求項４７のポリペプチドに対する拮抗剤／阻害剤。 ５１．請求項４７のポリペプチドの治療的有効量を患者に投与することを含む ＭＩＰ−１_γを必要とする患者の処置方法。 ５２．請求項５０の拮抗剤／阻害剤の治療的有効量を患者に投与することを含 むＭＩＰ−１_γを阻止することを必要とする患者の処置方法。 ５３．請求項４７のポリペプチドおよび医薬的に許容される担体を含有する医 薬的組成物。 ５４．ポリペプチドの治療的有効量が患者にそのポリペプチドをコードするＤ ＮＡを供給することおよびそのポリペプチドを生体内で発現することによって、 投与される請求項１８の方法。